CN110684722A - 来源于胎盘绒毛膜板组织的间充质干细胞制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种来源于胎盘绒毛膜板组织的间充质干细胞制备方法，属于细胞生物学技术领域。该方法包括以下步骤：组织分离：取胎盘组织样本，分离出绒毛膜组织，以组织清洗液洗至绒毛膜组织呈半透明态；组织冻存：将上述绒毛膜组织置于冻存液中，按照预定程序降温后冻存；组织处理：取出冻存的绒毛膜组织，以酒精溶液浸泡，剔除杂质后，剪碎，得组织块；细胞培养：将上述组织块置于培养瓶中，加入间充质干细胞选择培养基，置于CO2培养箱中培养，待细胞融合度达到80±10％时对细胞进行传代，传代细胞继续扩大培养和/或冻存。该方法使胎盘绒毛膜板组织及分离制备得到的间充质干细胞都可以在液氮环境中长期储存，再次复苏之后仍保持细胞活性。
Description
技术领域
本发明涉及细胞生物学技术领域，特别是涉及一种来源于胎盘绒毛膜板组织的间充质干细胞制备方法。
背景技术
间充质干细胞(MSC)是一类来源于中胚层的具有高度自我更新和多向分化能力的多能干细胞，广泛存在于全身多种组织中，可以在体外条件下进行培养扩增。在特定的条件下，分化为骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肌肉细胞等。MSC作为多能干细胞的代表，具有“横向分化”或“跨系分化”的能力，可以在不同的诱导条件下，分化成为多种组织细胞。MSC具有广阔的临床应用前景，是细胞替代治疗和组织工程的首选种子细胞，是移植领域和自身性免疫疾病治疗的研究热点。
间充质干细胞最早来源于骨髓，但骨髓中的间充质干细胞含量较少，无法满足目前疾病治疗及研究的需求。在科学逐步的探索中，也发现了很多其他来源的间充质干细胞，例如脐带、脐血、胎盘、牙髓、骨髓、脂肪、肌肉、牙周质等。其中胎盘来源间充质干细胞与其他多种间充质干细胞相比，MSC的含量充足，来源于新生儿的附属组织，免疫原性较低且无社会伦理争议。这多种优点使得胎盘来源的MSC具有更好的临床应用前景。
胎盘是母体与胎儿间进行物质交换的器官，是胚胎与母体组织的结合体，在胎儿的发育、营养摄取和免疫耐受方面起着关键作用。足月胎盘是一个较大的组织(500-750g)，可在胎儿分娩后无菌采集，对供者无风险，易于获得。与骨髓间充质干细胞相比，胎盘间充质干细胞来源广泛、采集方便、免疫原性低、无侵入性操作以及无伦理争议等，具有广阔的临床应用前景。胎盘组织结构复杂，包括胎儿侧的羊膜、绒毛膜以及母体侧的蜕膜等。因此，胎盘来源的间充质干细胞又有很多种，包括羊膜MSC、绒毛膜MSC、蜕膜MSC等。
其中，人胎盘绒毛膜间充质干细胞是典型的成纤维细胞形态。细胞表达表面标记CD13、CD26、CD29、CD54、CD73、CD90、CD105和CD166，不表达CD1α、CD3、CD14、CD31、CD34、CD45。在不同的条件培养基及诱导剂存在的状态下，细胞可以向成骨、成脂及成软骨方向进行分化。另外，对比其他多种间充质干细胞，胎盘绒毛膜MSCs的HGF和VCAM-1分泌量最高，而VCAM-1即为血管细胞黏附分子1，在发挥免疫调节和促进血管新生的功能中具有非常重要的作用。胎盘绒毛膜MSCs的这一显著功能引起众多研究学者的关注并开始开展基础及临床研究，是未来临床疾病治疗更为理想的种子细胞。
然而，胎盘绒毛膜组织位于脐带和胎盘连接处，属于较薄且透明的组织，在进行组织分离的过程中，容易夹杂有上皮组织的成分，进而在细胞培养过程中混有大量的上皮细胞，影响绒毛膜MSCs的纯度。对细胞后期的使用造成不便甚至影响细胞的使用效果。另外，关于胎盘绒毛膜MSCs的分离、制备及冻存方法目前没有固定，很难保证不同批次的细胞的分离效率、细胞存活率及细胞复苏之后的活性等。
发明内容
基于此，有必要针对上述问题，提供一种来源于胎盘绒毛膜板组织的间充质干细胞制备方法，该方法主要是应用于胎盘与脐带连接处的胎盘绒毛膜板组织的分离、冻存及间充质干细胞的制备，使胎盘绒毛膜板组织及分离制备得到的间充质干细胞都可以在液氮环境中长期储存，再次复苏之后仍保持细胞活性。
一种来源于胎盘绒毛膜板组织的间充质干细胞制备方法，包括以下步骤：
组织分离：取胎盘组织样本，以组织清洗液清洗，分离出绒毛膜组织，再次以组织清洗液洗至绒毛膜组织呈半透明态；
组织冻存：将上述绒毛膜组织置于冻存液中，按照预定程序降温后冻存；
组织处理：取出冻存的绒毛膜组织，以酒精溶液浸泡，随后用组织清洗液清洗，洗去残留的酒精和血液，去除绒毛膜板上附着的胎盘小叶组织、绒毛干、血管和血管内的血凝块，得剔除杂质后组织，剪碎，得组织块；
细胞培养：将上述组织块置于培养瓶中，加入间充质干细胞选择培养基，置于CO2培养箱中培养，待细胞融合度达到80±10％(优选80±5％)时对细胞进行传代，传代细胞继续扩大培养和/或冻存。
本发明人在工作中发现，常规方法难以保证不同批次的细胞的分离效率、细胞存活率及细胞复苏之后的活性，原因在于绒毛膜组织本身较轻、较薄，且与上皮组织连接紧密，不易分开，在取下绒毛膜组织块的过程中，容易夹杂有上皮组织，组织剪碎之后，培养的细胞中会夹杂有上皮细胞。而且，组织块的剪碎程度不够，容易导致组织块的浪费，从而导致细胞的浪费。
从上述研究基础出发，本发明主要通过以下几个方面来完善绒毛膜组织间充质干细胞的制备及保存：首先，在进行绒毛膜板组织的冻存过程中，将绒毛膜组织置于组织冻存液中，采用程序降温仪对冻存组织进行逐步降温处理，最后置于液氮中储存。通过组织冻存液及程序性降温装置的使用，最大限度的保护了胎盘绒毛膜组织细胞在冻存过程中不受损伤，活性不受影响。并且，调整组织剪裁的时间及力度，将绒毛膜组织剪碎至小块(如最大面积为2-3mm2)，分离出组织块中大部分的间充质干细胞，其中也包含有上皮细胞，然后再通过使用间充质干细胞选择性培养基来提高绒毛膜间充质干细胞的生长速度，使绒毛膜间充质干细胞对比上皮细胞具有显著的生长优势，再经过2-3次的细胞传代后即可得到相对纯净的绒毛膜间充质干细胞。
在其中一个实施例中，所述组织清洗液包括：生理盐水、25±5μg/ml的硫酸庆大霉素和5±1μg/ml的两性霉素B。
在其中一个实施例中，所述冻存液包括：右旋糖酐系蔗糖、非必需氨基酸、海藻糖、二甲基亚砜、人血白蛋白、无血清培养基。
在其中一个实施例中，所示非必需氨基酸包括：丙氨酸(0.3wt％)、天冬氨酸(0.8wt％)、半胱氨酸(0.5wt％)、脯氨酸(0.4wt％)。
上述成分中，海藻糖联合二甲基亚砜(DMSO)有利于保护冻存组织的生物活性；右旋糖酐系蔗糖作为一种血浆代用品，有助于改善微循环，防止细胞聚集及血栓的形成；多种非必须氨基酸有利于组织及细胞冻存之后的再复苏；5％人血白蛋白的使用使经过冻存之后的细胞或组织保持活性。
在其中一个实施例中，所述冻存液中，右旋糖酐系蔗糖浓度为5±0.5％，非必需氨基酸浓度为2±0.2％、海藻糖浓度为0.2±0.02mol/L、二甲基亚砜浓度为10±1％、人血白蛋白浓度为5±0.5％。以上述冻存液进行冻存，复苏之后可以保持最佳细胞活性。
在其中一个实施例中，所述组织冻存步骤中，按照以下程序降温，温度降低过程如下：4℃保持40min，-20℃保持50min，-40℃保持30min，-80℃保持12h，然后将绒毛膜组织置于液氮罐中，进行深低温保存。
在其中一个实施例中，所述组织处理过程中，以75％的酒精浸泡1±0.5min。以酒精浸泡，起到对组织杀菌消毒的作用。
在其中一个实施例中，所述组织处理过程中，将组织剪碎为最大面积为1-2mm2的组织块。可达到充分利用组织、细胞的目的，剪的过程中可不停转动容器，使组织块的剪裁更彻底，更均匀。
在其中一个实施例中，所述间充质干细胞选择培养基包括：间充质干细胞无血清培养基，5±0.5％的人血白蛋白，15±5ng/ml的bFGF，10±1％的转化生长因子。采用无血清培养基，可避免动物源血清可能带来的污染风险及不良反应；其中人血白蛋白(HSA)、bFGF(碱性成纤维细胞生长因子)、转化生长因子(TGF-β)等多种组分的加入保证细胞的生长速度及状态。
在其中一个实施例中，所述组织分离步骤之前，还包括组织采集步骤，所述组织采集步骤中，采集胎盘组织，检测微生物及病毒，合格胎盘在组织保护液存在条件下0-4℃保存和/或运输。在胎盘组织样本采集后，采用低温冷藏装置对样本进行的暂时保存，并采用人体组织保护液对胎盘组织进行预处理，保证组织样本的保持其活性及无菌性。
在其中一个实施例中，所述组织保护液包括：生理盐水，25μg/ml的硫酸庆大霉素和5μg/ml的两性霉素B。确保运输过程中无细菌和真菌污染。
在其中一个实施例中，所述细胞培养步骤中，检测传代培养得到的胎盘绒毛膜间充质干细胞表型，但CD73、CD90、CD105阳性率均≥95％，CD34、CD45阳性率均≤5％，停止传代，收获细胞，即得。证明所得胎盘绒毛膜间充质干细胞纯度符合要求。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明的一种来源于胎盘绒毛膜板组织的间充质干细胞制备方法，通过以下几个方面来完善绒毛膜组织间充质干细胞的制备及保存：首先，在进行绒毛膜板组织的冻存过程中，将绒毛膜组织置于组织冻存液中，采用程序降温仪对冻存组织进行逐步降温处理，最后置于液氮中储存。通过组织冻存液及程序性降温装置的使用，最大限度的保护了胎盘绒毛膜组织细胞在冻存过程中不受损伤，活性不受影响。并且，调整组织剪裁的时间及力度，将绒毛膜组织剪碎至小块(如最大面积为2-3mm2)，分离出组织块中大部分的间充质干细胞，其中也包含有上皮细胞，然后再通过使用间充质干细胞选择性培养基来提高绒毛膜间充质干细胞的生长速度，使绒毛膜间充质干细胞对比上皮细胞具有显著的生长优势，再经过2-3次的细胞传代后即可得到相对纯净的绒毛膜间充质干细胞。
并且，通过对其中各步骤的具体方法和参数范围的优选，使本发明得到的绒毛膜间充质干细胞具有较好的复苏活性。
附图说明
图1为实施例1中培养所得细胞镜下(×20倍)视图；
图2为实施例1中细胞表型分析结果。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
以下实施例所用原料，如非特别说明，均为市售购得。
实施例1
一种来源于胎盘绒毛膜板组织的间充质干细胞制备方法，包括以下步骤：
一、组织采集
在医院采集足月胎儿胎盘组织，并签署客户知情同意书，同时对胎盘济母血样本进行病毒因子及微生物的检测，符合检测标准的组织才会进行下一步的操作。
对于检测合格的胎盘组织置于特殊的组织采集袋中，并加入组织保护液，在4℃冷藏装置的环境下运抵实验室。
其中加入的组织保护液是为了保护绒毛膜组织在运抵实验室的过程中保持其生物学活性，它的主要成分是：生理盐水+25μg/ml的硫酸庆大霉素和5μg/ml的两性霉素B配制，确保运输过程中无细菌和真菌污染。
二、组织分离
胎盘组织样本运抵实验室中后采用预冷至4℃的组织清洗液对组织进行清洗3次，洗去组织上残存的血液及组织保护液。
然后采用手术镊分离出绒毛膜组织，再次使用组织清洗液对分离得到的绒毛膜组织进行清洗，洗至绒毛膜组织呈半透明薄膜状态。
上述组织清洗液为：生理盐水+25ug/ml的硫酸庆大霉素+5ug/ml的两性霉素B。
三、组织冻存
1、首先配制绒毛膜组织冻存液：组分主要包括右旋糖酐系蔗糖、多种非必需氨基酸、海藻糖、10％二甲基亚砜(DMSO)、5％人血白蛋白、友康无血清培养基。
2、在组织冻存管中加入配制好的冻存液及剪碎的绒毛膜组织，然后进行程序性降温，温度降低过程如下：4℃40min，-20℃50min，-40℃30min，-80℃12h，然后将冻存组织置于液氮罐中，进行深低温保存。
四、组织处理
1、从胎盘与脐带连接处剪下胎盘绒毛膜板组织。
2、将胎盘绒毛膜板组织用75％酒精浸泡1min，然后立即用组织清洗液对胎盘绒毛膜板组织进行清洗，去除组织块上残存的酒精及血液。
3、用剪刀和镊子去除绒毛膜板上附着的胎盘小叶组织、绒毛干、血管和血管内的血凝块，得剔除杂质后组织。
4、称取洁净组织5g，置于50mL离心管中，用手术剪将其剪碎至面积为1-2mm2的小块，剪的过程中不停转动离心管，使组织块的剪裁更彻底，更均匀。
五、细胞培养
1、将剪碎的绒毛膜组织置于一个T175的培养瓶中，并加入30ml间充质干细胞选择培养基，摇晃培养瓶，使组织小块均匀的分布于培养瓶的底部，然后将培养瓶置于细胞CO2培养箱中正常培养。
选择性培养基组分：无血清培养基(友康恒业生物科技(北京)有限公司，间充质干细胞无血清培养基，产品货号：NC0103)+5％人血白蛋白(HSA)+15ng/ml的bFGF+10％的转化生长因子(TGF-β)。
2、绒毛膜组织培养10-15天之后细胞的汇合度达到80％，对细胞进行传代培养，传代之后的细胞称为P1代细胞。然后细胞继续培养，均在细胞汇合度达到80％左右进行细胞传代，进行细胞的扩大培养或者细胞冻存。此时所得细胞见图1，从图1中可以看出，P0代、P1代、P2代细胞形态正常，符合间充质干细胞的成纤维细胞形态；生长状态良好，可以稳定传代。
选择P2代的胎盘绒毛膜间充质干细胞进行细胞表型的分析，表面标记物分析，检测CD73、CD90、CD105、CD34、CD45几种分子标记，结果如下表和图2所示。
表1.细胞表面标记物分析结果
| CD分子 | CD34 | CD45 | CD73 | CD90 | CD105 |
| 阳性率 | 0.61％ | 0.54％ | 98.8％ | 100.0％ | 95.2％ |
其结果显示为CD73、CD90、CD105阳性率≥95％，CD34、CD45阳性率≤5％，证明此胎盘绒毛膜间充质干细胞纯度符合要求。
实施例2
一种来源于胎盘绒毛膜板组织的间充质干细胞制备方法，与实施例1的方法基本相同，区别仅在于，在本实施例中所用的冻存液为：无血清培养基+非必需氨基酸(2％)+海藻糖(0.2mol/L)+二甲基亚砜(10％)+人血白蛋白(5％)。
在本实施例中，细胞的制备方法与实施例1大致相同，只是在原有的基础上调整了冻存液的组分，此实施例中没有添加右旋糖酐系蔗糖。通过上述操作，分离制备出间充质干细胞。而对于冻存的细胞，有部分细胞团块的聚集。
实施例3
一种来源于胎盘绒毛膜板组织的间充质干细胞制备方法，与实施例1的方法基本相同，区别仅在于，在本实施例中所用的冻存液为：无血清培养基+右旋糖酐系蔗糖(5％)+非必需氨基酸浓度为2％+海藻糖(0.2mol/L)+二甲基亚砜(10％)。
在本实施例中细胞的制备方法与实施例1大致形同，在原有实验的基础上调整冻存液的组分，此实施例没有添加人血白蛋白，冻存之后的细胞容易出现细胞死亡现象。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (10)
1.一种来源于胎盘绒毛膜板组织的间充质干细胞制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
组织分离：取胎盘组织样本，以组织清洗液清洗，分离出绒毛膜组织，再次以组织清洗液洗至绒毛膜组织呈半透明态；
组织冻存：将上述绒毛膜组织置于冻存液中，按照预定程序降温后冻存；
组织处理：取出冻存的绒毛膜组织，以酒精溶液浸泡，随后用组织清洗液清洗，洗去残留的酒精和血液，去除绒毛膜板上附着的胎盘小叶组织、绒毛干、血管和血管内的血凝块，得剔除杂质后组织，剪碎，得组织块；
细胞培养：将上述组织块置于培养瓶中，加入间充质干细胞选择培养基，置于CO2培养箱中培养，待细胞融合度达到80±10％时对细胞进行传代，传代细胞继续扩大培养和/或冻存。
2.根据权利要求1所述的来源于胎盘绒毛膜板组织的间充质干细胞制备方法，其特征在于，所述组织清洗液包括：生理盐水、25±5μg/ml的硫酸庆大霉素和5±1μg/ml的两性霉素B。
3.根据权利要求1所述的来源于胎盘绒毛膜板组织的间充质干细胞制备方法，其特征在于，所述冻存液包括：右旋糖酐系蔗糖、非必需氨基酸、海藻糖、二甲基亚砜、人血白蛋白、无血清培养基。
4.根据权利要求3所述的来源于胎盘绒毛膜板组织的间充质干细胞制备方法，其特征在于，所述冻存液中，右旋糖酐系蔗糖浓度为5±0.5％，非必需氨基酸浓度为2±0.2％、海藻糖浓度为0.2±0.02mol/L、二甲基亚砜浓度为10±1％、人血白蛋白浓度为5±0.5％。
5.根据权利要求8所述的来源于胎盘绒毛膜板组织的间充质干细胞制备方法，其特征在于，所述组织冻存步骤中，按照以下程序降温，温度降低过程如下：4℃保持40min，-20℃保持50min，-40℃保持30min，-80℃保持12h，然后将绒毛膜组织置于液氮罐中，进行深低温保存。
6.根据权利要求1所述的来源于胎盘绒毛膜板组织的间充质干细胞制备方法，其特征在于，所述组织处理过程中，以75％的酒精浸泡1±0.5min。
7.根据权利要求1所述的来源于胎盘绒毛膜板组织的间充质干细胞制备方法，其特征在于，所述组织处理过程中，将组织剪碎为最大面积为1-2mm2的组织块。
8.根据权利要求1所述的来源于胎盘绒毛膜板组织的间充质干细胞制备方法，其特征在于，所述间充质干细胞选择培养基包括：间充质干细胞无血清培养基，5±0.5％的人血白蛋白，15±5ng/ml的bFGF，10±1％的转化生长因子。
9.根据权利要求1所述的来源于胎盘绒毛膜板组织的间充质干细胞制备方法，其特征在于，所述组织分离步骤之前，还包括组织采集步骤，所述组织采集步骤中，采集胎盘组织，检测微生物及病毒，合格胎盘在组织保护液存在条件下0-4℃保存和/或运输。
10.根据权利要求1所述的来源于胎盘绒毛膜板组织的间充质干细胞制备方法，其特征在于，所述细胞培养步骤中，检测传代培养得到的胎盘绒毛膜间充质干细胞表型，但CD73、CD90、CD105阳性率均≥95％，CD34、CD45阳性率均≤5％，停止传代，收获细胞，即得。
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