CN110800733A

CN110800733A - 一种脐带间充质干细胞用冻存液及试剂盒

Info

Publication number: CN110800733A
Application number: CN201911145902.3A
Authority: CN
Inventors: 姚惟琦; 董腾云
Original assignee: Wuhan Optics Valley Zhongyuan Xiehe Cell Gene Technology Co Ltd
Current assignee: Wuhan Optics Valley Zhongyuan Xiehe Cell Gene Technology Co Ltd
Priority date: 2019-11-21
Filing date: 2019-11-21
Publication date: 2020-02-18

Abstract

本发明涉及一种脐带间充质干细胞用冻存液及试剂盒，冷冻液包括渗透性低温保护剂和非渗透性低温保护剂，渗透性低温保护剂包括聚天冬氨酸和聚乙烯吡咯烷酮。本发明的冻存液成分简单，可适用于脐带间充质干细胞的冻存保藏，解冻复苏后，存活率高。

Description

一种脐带间充质干细胞用冻存液及试剂盒

技术领域

本发明属于生物医用材料技术领域，具体涉及一种脐带间充质干细胞用冻存液及试剂盒。

背景技术

间充质干细胞是来源于发育早期的中胚层和外胚层的成体干细胞，具有高度自我更新和多向分化潜能，存在于骨髓、脂肪等多种结缔组织和器官间质中。间充质干细胞因其组织工程、造血干细胞移植以及基因治疗领域的巨大潜力成为干细胞领域的研究热点。脐带来源的间充质干细胞具有非常高的分化潜能，可以定向诱导分化为骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经等多个组织，并且免疫原性低，取材方便，伦理学争议小，相比于骨髓等其他来源的间充质干细胞，具有更加广泛的应用前景。

间充质干细胞具有可以大量扩增的特点，人脐带间充质干细胞过度传代会出现明显的衰老和凋亡，长期体外培养会导致多分化潜能降低，黏附能力下降，细胞凋亡率增加。所以，对脐带间充质干细胞冷冻保存使其保持良好的分化潜能是脐带间充质干细胞研究和临床应用的重要环节。

现有的间充质干细胞冻存通常是使用二甲基亚砜(DMSO)等冷冻保护剂、胎牛血清、以及干细胞培养基配制成细胞冻存液。但是，血清容易导致动物性污染，并可能引起异种蛋白的免疫反应；DMSO有一定的细胞毒性，会导致细胞存活率降低。

中国专利CN101919379A公开了一种用于长期冻存脐带间充质干细胞的冻存液，其采用脐带血浆和DMSO按比例混合，作为脐带间充质干细胞冻存液。该配方避免了使用胎牛血清。但是脐带血浆仍存在病毒污染和免疫原性等缺陷。

发明内容

为改善上述问题，本发明目的在于提供一种适合于干细胞尤其是脐带间充质干细胞的冷冻保存液，可以显著提高干细胞冷冻保存的存活率，并保持细胞活性。

为解决上述问题，本发明采用如下方案：

本发明首先提供一种冻存液，其成分以冻存液的总质量计，包括质量百分数5％-15％的非渗透性低温保护剂，质量百分数10％-30％的渗透性低温保护剂，1-5％的还原性谷胱甘肽，缓冲液余量，所述非渗透性低温保护剂是聚天冬氨酸和聚乙烯吡咯烷酮的组合，所述聚天冬氨酸和聚乙烯吡咯烷酮的质量比为(0.5-2):1。

优选地，所述非渗透性低温保护剂含量为8％-13％，渗透性低温保护剂12％-25％，还原性谷胱甘肽含量为1.5-2.5％，缓冲液余量。

根据本发明的实施方案，所述聚天冬氨酸聚合度≥10，优选聚合度为10～20；所述聚乙烯吡咯烷酮的K值为15-30(Fikentscher K值)。

在一个实施方案中，所述渗透性低温保护剂包括链状多元醇和海藻糖，链状醇选自二元醇或三元醇，例如乙二醇、丙三醇或丙二醇中的至少一种；优选丙二醇，丙二醇与只含羟基的乙二醇等种类相比，丙二醇既有甲基又有羟基，甲基与甲基之间没有相互作用，只与水键合，从而减弱了羟基与羟基自身的键合作用，实现良好的低温保护效果。多元醇和海藻糖的质量比为1:(0.5-2)。以冻存液总质量计，多元醇质量百分比可以为10-20％，海藻糖的质量百分比为5-20％，优选丙二醇与海藻糖的组合。

根据本发明，所述缓冲液可选自本领域常用的缓冲液，例如DPBS缓冲液。

特别地，所述冻存液不含有任何形式的血清，例如不包括胎牛血清或者任何来源的血清白蛋白。

本发明还提供上述冻存液的制备方法，包括如下步骤：分别用部分缓冲液溶解聚天冬氨酸、聚乙烯吡咯烷酮混合后加入渗透性低温保护剂，再加入还原性谷胱甘肽，用缓冲液定容至预定体积。

本发明还提供一种冻存试剂盒，所述试剂盒含有如上所述的冻存液。

根据本发明，所述冻存试剂盒还含有干细胞培养基，例如DMEM培养基，所述干细胞培养基是市售的干细胞培养基。

本发明进一步提供一种脐带间充质干细胞的冷冻方法，所述方法采用上述冻存液或冻存试剂盒对脐带间充质干细胞进行冷冻。

作为本发明的一个实施方案，所述冷冻方法包括：脐带间充质干细胞放入干细胞培养基中平衡5-10分钟，然后离心弃上清，将冻存液预冷至4-6℃后加入离心管底部，使细胞分散，然后将带有干细胞的冷冻液置于液氮中冻存。

作为本发明的一个实施方案，所述冻存温度为-80℃--90℃。

有益效果

本发明提供的冻存液以聚天冬氨酸和聚乙烯吡咯烷酮为非渗透性低温保护剂，来源广泛，生物相容性好。本发明的发明人发现，聚天冬氨酸与天然抗冻蛋白结构类似，具有优异的低温保护效果；而且聚乙烯吡咯烷酮，可减少细胞内冰晶形成，对细胞膜具有保护作用，并且可以维持细胞内外电解质平衡，减少溶质损伤，与聚天冬氨酸的抗冻性能结合可以实现优异的玻璃化冷冻效果，减小细胞毒性。本发明采用丙二醇，相比于常用的乙二醇和丙三醇，由于其含有甲基和羟基，在本发明的冻存液体系中具有更加优异的抑制冰晶生长的效果，海藻糖可以起到稳定蛋白质和细胞膜的作用，还原性谷胱甘肽可以清除氧自由基，保持细胞膜的完整性。并且发明人惊讶的发现，在冷冻前采用干细胞培养基平衡，不需再加入成分复杂的血清仍可维持干细胞良好的生物学特性和分化潜能。原料来源方便，成本低廉。

附图说明

图1为实施例1冷冻一周后的脐带间充质干细胞贴壁培养的显微镜照片；

图2为实施例2冷冻一周后的脐带间充质干细胞贴壁培养的显微镜照片；

图3为实施例1冷冻一周后的脐带间充质干细胞悬浮液的染色照片。

具体实施方式

下文将结合具体实施例对本发明的制备方法做更进一步的详细说明。应当理解，下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明，而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的试剂、材料等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

本实施例所用的脐带间充质干细胞采用如下方法制备：

取足月剖宫产胎儿脐带约15mL(脐带来源于湖北省妇幼保健院妇产科，获得产妇知情同意并对样品进行匿名化处理)，无菌条件下用PBS反复冲洗，去除残留血迹。在RPMIMEDIUM 1640培养基中用无菌剪刀将其剪成长约1.0cm的组织块，去除其血管并尽量剪碎，组织块置于50mL离心管中以RPMI MEDIUM 1640培养基充分混合振荡后离心，离心机速度为2000转/分钟，离心5分钟弃去上清，重复3遍，离心后得到约20ml的脐带组织碎块沉淀，将离心沉淀部分与MesenCult-XFMediums完全培养基混合震荡均匀种植于细胞培养皿中，并置于37℃，5％CO₂培养箱中。培养第5天，将组织块全部吸出弃去，补加培养基，且显微镜下观察到贴壁的梭形或多边形的细胞(图1)，之后每隔3天更换一次培养基。培养第15天左右，细胞约80％融合，按1∶3传代，之后每3天传一代，最终得到充足的间充质干细胞。

实施例制备冷冻保存液：

聚天冬氨酸聚合度为15，聚乙烯吡咯烷酮、1,2丙二醇、丙三醇和海藻糖均购自阿拉丁试剂；DMEM培养基来源于赛默飞。所有试剂均为医用级。

将聚天冬氨酸溶解于15mLDPBS缓冲液中，将聚乙烯吡咯烷酮加入另外15mL DPBS缓冲液中，搅拌溶解，将两种溶液混合并加入其他成分，再加入剩余的磷酸盐缓冲液，至总体积100mL。

各实施例配方如下：

实施例1：聚天冬氨酸8g，聚乙烯吡咯烷酮(K30)5g，1,2-丙二醇10g，海藻糖10g，还原性谷胱甘肽1.5g，DPBS缓冲液定容至100mL。

实施例2：聚天冬氨酸5g，聚乙烯吡咯烷酮(K30)7g，1,2-丙二醇15g，海藻糖10g，还原性谷胱甘肽1.7g，DPBS缓冲液定容至100mL。

实施例3：聚天冬氨酸9g，聚乙烯吡咯烷酮(K15)5g，1,2-丙二醇10g，海藻糖17g，还原性谷胱甘肽3g，DPBS缓冲液定容至100mL。

实施例4：聚天冬氨酸9g，聚乙烯吡咯烷酮(K15)5g，乙二醇10g，蔗糖10g，还原性谷胱甘肽3g，DPBS缓冲液定容至100mL。

实施例5：聚天冬氨酸8g，聚乙烯吡咯烷酮(K15)7g，丙三醇14g，蔗糖10g，还原性谷胱甘肽1.7g，DPBS缓冲液定容至100mL。

对比例1：

总体积100mL，含有15mL的DMSO，15mL的人血清白蛋白，余量为DMEM培养基。

对比例2：

在实施例3的基础上，不加入聚天冬氨酸，其他组分不变。

应用例：

采用上述实施例1-5和对比例1-2的配方分别进行人脐带充间质干细胞的冷冻保存。

将培养皿上的人脐带间充质干细胞用25％胰蛋白酶和0.05％的EDTA消化5分钟后，放入10倍于消化液体积的DMEM培养基中，平衡5分钟，取1mL细胞培养液于离心管，1000r离心3分钟，去除上清，将10μL冻存液加入离心管底部，吹打使干细胞团分散，取样对细胞密度计数，使细胞密度大约为4×10³个/μL，将此10μL带有干细胞悬浮液-80℃冻存一周，解冻复苏后，台盼蓝染色后在显微镜下查看并计算其细胞回收率和存活率，结果如表1所示，每一配方进行5组平行试验取平均值。

细胞回收率＝复苏的细胞数/冻存的细胞数×100％；

存活率＝台盼蓝染色的活细胞数/总细胞数×100％

表1人脐带充间质干细胞冷冻保存存活率

编号	存活率	细胞回收率
			实施例1	94.10％	93.2％
实施例2	90.40％	85.1％
			实施例3	91.60％	91.8％
实施例4	85.21％	82.0％
			实施例5	83.10％	80.4％
对比例1	62.30％	77.3％
			对比例2	74.10％	72.5％

表1中，各实施例和对比例的存活率数据均为重复实验5组所得存活率的平均值，其中细胞数量是通过在显微镜下计数所得。图1和图2分别为实施例1和实施例2中第一次实验时所采用的干细胞冷冻前、冷冻后复苏的贴壁培养的图片，图3为实施例1第一次实验解冻后的细胞悬浮液照片。

表1的数据表明，本发明的冷冻保存液进行人脐带充间质干细胞冷冻保存时，干细胞存活率和细胞回收率均可达80％以上，表明该冷冻用试剂可以有效的冷冻人脐带间充质干细胞，避免冷冻过程对细胞生物活性和分化功能的破坏，可以达到良好的冷冻保存效果。而且，选用丙二醇和海藻糖作为渗透性保护剂时，由于其特殊的分子结构，具有更好保存效果。

以上，对本发明的实施方式进行了说明。但是，本发明不限定于上述实施方式。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种冻存液，其成分以冻存液的总质量计，包括质量百分数5％-15％的非渗透性低温保护剂，质量百分数10％-30％的渗透性低温保护剂，1-5％的还原性谷胱甘肽，缓冲液余量，所述非渗透性低温保护剂是聚天冬氨酸和聚乙烯吡咯烷酮的组合，所述聚天冬氨酸和聚乙烯吡咯烷酮的质量比为(0.5-2):1。

2.根据权利要求1所述的冻存液，所述非渗透性低温保护剂含量为8％-13％，渗透性低温保护剂12％-25％，还原性谷胱甘肽含量为1.5-2.5％，缓冲液余量。

3.根据权利要求1或2所述的冻存液，所述聚天冬氨酸聚合度≥10；所述聚乙烯吡咯烷酮的K值为15-30(Fikentscher K值)。

4.根据权利要求1-3任一项所述的冻存液，所述渗透性低温保护剂包括丙二醇和海藻糖，所述丙二醇和海藻糖的质量比为1:(0.5-2)。

5.如权利要求1-4任一项所述的冻存液的制备方法，包括如下步骤：分别用部分缓冲液溶解聚天冬氨酸、聚乙烯吡咯烷酮，混合后加入渗透性低温保护剂和还原性谷胱甘肽，再加入剩余的缓冲液至预定体积。

6.一种冻存试剂盒，所述试剂盒含有如权利要求1-4任一项所述的冻存液。

7.根据权利要求6所述的冻存试剂盒，所述冻存试剂盒还含有干细胞培养基。

8.一种脐带间充质干细胞的冷冻方法，所述方法采用权利要求1-4任一项所述冻存液或权利要求6-7任一项所述的冻存试剂盒对脐带间充质干细胞进行冷冻。

9.根据权利要求8所述的冷冻方法，所述冷冻方法包括：脐带间充质干细胞放入干细胞培养基中平衡5-10分钟，然后放入离心管中离心，弃上清，将冻存液加入离心管底部，使细胞分散，然后将带有干细胞的冷冻液冻存。