CN108617638B - 组织和/或细胞冻存保护液及其制备与应用 - Google Patents

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Abstract

本申请提供了组织和/或细胞冻存保护液及其制备和应用，所述组织和/或细胞冻存保护液包含渗透性保护剂和非渗透性保护剂，其中所述冻存保护液还包含血小板裂解物。此外，本申请还提供了使用本申请的组织和/或细胞冻存保护液冻存组织和/或细胞的方法，以及冻存的组织和/或细胞和它们的用途。

Description

组织和/或细胞冻存保护液及其制备与应用
发明领域
本申请大体涉及生物医学领域，具体而言，本申请涉及组织和/或细胞冻存保护液及其制备方法。
发明背景
目前组织和/或细胞的冻存主要有快速冻存法(即玻璃化法)和慢速冻存法(即程序降温法)。
快速降温法是以易形成玻璃化态的低温保存液为介质，利用快速降温的方法保存细胞或组织。玻璃化冻存保护液主要由易于形成玻璃化态的渗透性试剂和使细胞脱水的非渗透性试剂组成，并且通常其试剂浓度非常高，总浓度通常达到50％以上。但是由于高浓度的渗透性试剂本身对细胞活性就有较大影响，同时快速降温的玻璃化低温保存液试剂的高浓度导致细胞脱水量非常大，在组织和/或细胞复苏时需逐渐稀释，因而给临床应用带来极大的不便。此外由于高浓度试剂极易在组织中残留，其对应用于人体的组织、细胞具有潜在危险。
慢速冻存法是利用低温保存液和程序性降温设备，以一定的速率把需要冻存的组织和器官降至所需温度(通常为-80℃左右)，再于恒定温度的冰柜或液氮中长期保存。但是传统的低温保存液易于对细胞造成破坏，因主要来自细胞内高渗透压导致溶质性损伤，由胞内冰晶造成机械性损伤。
由于组织和/或细胞的冻存在临床应用以及实验室研究中的重要性，急需新型的组织和/或细胞冻存保护液。
发明概述
第一方面，本申请提供了组织和/或细胞冻存保护液，其包含渗透性保护剂和非渗透性保护剂，其中所述冻存保护液还包含血小板裂解物。
在可选的实施方案中，所述非渗透性保护剂包括白蛋白、聚乙烯吡咯烷酮、葡聚糖和/或双糖。
在可选的实施方案中，上述细胞冻存保护液还包含血清。
第二方面，本申请提供了制备第一方面所述的组织和/或细胞冻存保护液的方法，包括：
将非渗透性冷冻保护剂、血小板裂解物以及任选的血清混合，得到第一混合物；
向所述第一混合物中加入渗透性冷冻保护剂，得到第二混合物；
将所述第二混合物冷藏，得到组织和/或细胞冻存保护液；
可选地，将所述组织和/或细胞冻存保护液离心，并将上清过滤，以除颗粒除菌；
优选地，所述非渗透性保护剂包括白蛋白、聚乙烯吡咯烷酮、葡聚糖和/或双糖。
在第一方面所述的组织和/或细胞冻存保护液或第二方面所述的方法的一些实施方案中，渗透性保护剂占所述保护液总量的体积比为5％-15％v/v，非渗透性保护剂的浓度为40-80mg/ml，血小板裂解物占所述保护液总量的体积比为0.5％-5％v/v，任选地，血清占所述保护液总量的体积比为4％-70％v/v。
在第一方面所述的组织和/或细胞冻存保护液或第二方面所述的方法的一些实施方案中，非渗透性保护剂中的白蛋白的浓度为2-50mg/ml，聚乙烯吡咯烷酮的浓度为5-25mg/ml，葡聚糖的浓度为5-20mg/ml，以及双糖的浓度为5-30mg/ml。
在第一方面所述的组织和/或细胞冻存保护液或第二方面所述的方法的一些实施方案中，所述葡聚糖为葡聚糖-40，和/或所述双糖为蔗糖或D-海藻糖。
在第一方面所述的组织和/或细胞冻存保护液或第二方面所述的方法的一些实施方案中，所述渗透性保护剂选自二甲基亚砜、甘油、乙二醇、丙二醇、乙酰胺、甲醇。在一些实施方案中，所述血清选自人AB血清、牛血清、马血清等。在一些实施方案中，所述血小板裂解物为SuperGrow。
第三方面，本申请提供了使用第一方面所述的组织和/或细胞冻存保护液冻存组织和/或细胞的方法，包括：
向组织碎块和/或细胞中加入所述冻存液，得到混合物；以及
将上述混合物于低温下保存。
第四方面，本申请提供了使用第三方面所述的方法获得的冻存组织和/或细胞。
在一些实施方案中，所述组织为皮肤组织，优选地为人皮肤组织。在一些实施方案中，所述细胞为成纤维细胞。
第五方面，本申请提供了第四方面所述的冻存组织和/或细胞在用于美容或组织修复的原料中的用途。
附图简要说明
图1显示了用1-5号冻存液冻存后的组织和新鲜组织培养第7天的细胞状态，其中A-E分别为显示1-5号冻存液冻存后的组织培养第7天的细胞状态的图，图F是新鲜组织培养第7天的细胞状态的图。
图2显示了利用流式细胞仪测定细胞纯度的结果。
图3显示了培养的细胞的免疫荧光结果。
图4显示了本申请的冻存保护液与不含血小板裂解物的冻存保护液冻存细胞效果的比较，其中*表示p值小于0.05。
发明详述
本申请的发明人通过对组织和/或细胞冻存保护液的大量研究和探索，开发出了新的组织和/或细胞冻存液。其能够高效冻存组织和/或细胞，特别是人皮肤组织和/或细胞，同时细胞的生物学性质变化小，可用于多种临床和实验室应用。
除非另外指明，否则本申请中所用的术语具有本领域技术人员通常所理解的含义。
第一方面，本申请提供了组织和/或细胞冻存保护液，其包含渗透性保护剂和非渗透性保护剂，其中所述冻存保护液还包含血小板裂解物。
在一些实施方案中，血小板裂解物可以是本领域常用的那些。在具体的实施方案中，血小板裂解物是SuperGrow。
SuperGrow细胞培养添加物是一种适用于淋巴细胞体外培养的血清替代物，富含细胞生长所需生长因子，是免疫细胞扩增培养的天然营养物。在一些实施方案中，用于本申请的SuperGrow购自深圳市达科为生物工程有限公司，货号为DKW34+SM20025。
本申请发明人证实，本申请的冻存保护液相比不含血小板裂解物的冻存保护液(例如包含其他血清替代物的冻存保护液)，能够更好地保护冻存的细胞和/或组织不受明显损伤，冻存的细胞的活力和活率明显较高，并且本申请的冻存液对于原代之后培养的细胞的活率无影响，细胞活率未降低。在示例性实施方案中，与包含Ultroser G作为血清替代物的冻存保护液相比，本申请的冻存保护液对多种类型细胞具有更好的冻存效果，细胞存活率更高，这表明冻存保护液中包含血小板裂解物比包含其他血清替代物能够为冻存的细胞提供更好的保护作用。
此外，本申请的冻存液相比现有无血清冻存液(如：
Figure BDA0001251887510000041
DMSO Free GMP grade)能够更好地保护成纤维细胞，提高细胞存活率，并且成分简单，配制方便，成本低，更适于商业推广。
冷冻保护剂是可以保护细胞免受冷冻损伤的物质，一般分为渗透性冷冻保护剂和非渗透性冷冻保护剂。渗透性冷冻保护剂主要为小分子物质，大多易溶于水，与水分子结合的能力强，易穿透细胞膜进入细胞内部。渗透性冷冻保护剂主要通过下述机制发挥细胞保护作用：在细胞内降低细胞的冰点，提高细胞膜对水的通透性，减少冰晶形成；复苏时促进细胞外水分进入细胞，缓解渗透性肿胀引起的损伤；稀释未结冰溶液中电解质的浓度，减少溶质损伤。常用的渗透性冷冻保护剂包括但不限于：甘油、二甲基亚砜(DMSO)、丙二醇、乙二醇。
在一些实施方案中，渗透性保护剂选自二甲基亚砜、甘油、乙二醇、丙二醇、乙酰胺、甲醇等。
非渗透性冷冻保护剂大部分为大分子聚合物，其不能渗透到细胞内部。其具备以下至少一种优点，即，通过稀释胞外电解质的浓度，减少溶质损伤和结合水分子；降低胞外自由水的含量；减少冰晶损伤，而达到保护细胞的目的。常用的非渗透性冷冻保护剂包括但不限于：双糖例如蔗糖、海藻糖等，聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，聚乙二醇(PEG)，葡聚糖(dextran)，白蛋白及羟乙基淀粉等。
在本申请的一些实施方案中，所用的非渗透性保护剂为白蛋白、聚乙烯吡咯烷酮、葡聚糖和/或双糖。
白蛋白合成于肝脏，是脊椎动物血浆中含量最丰富的蛋白质。白蛋白具有结合和运输外源性与内源性物质，维持血液胶体渗透压等生理功能，在生命过程中有重要意义。实验证实大量的白蛋白可以在细胞或组织的表面形成一层蛋白保护膜，降低在冻存过程中形成的冰晶对细胞造成损伤。
在本申请的一些实施方案中，白蛋白为人血清白蛋白。
聚乙烯吡咯烷酮为非离子型高分子化合物，其具有水溶性高分子化合物的一般性质：胶体保护作用、成膜性、粘结性、吸湿性、增溶或凝聚作用。聚乙烯吡咯烷酮用于组织或细胞冻存可以防止结晶的形成，降低对细胞的损伤。
葡聚糖是由数个葡萄糖分子聚合而成的同型多糖。作为一种大分子聚合物，葡聚糖不能渗透到细胞内部，但可以通过稀释胞外电解质的浓度，减少溶质损伤和结合水分子，降低胞外自由水的含量，减少冰晶对细胞损伤。在本申请的一些实施方案中，所使用的葡聚糖为葡聚糖-40。
在本申请的一些实施方案中，所使用的双糖为海藻糖。在具体的实施方案中，所使用的双糖为D-海藻糖。作为一种大分子聚合物，海藻糖不能渗透至细胞内部，但是能够稳定生物膜和蛋白质结构，并具有抗干燥的作用，其还可用于保存研究用生物制品如酶类、细胞膜、抗体、抗原、细胞器等。
在一些实施方案中，组织和/或细胞冻存保护液还包含血清。
在一些实施方案中，血清可以是本领域常用的那些，例如牛血清、马血清或人血清。在具体的实施方案中，血清是人AB血清。
在优选实施方案中，组织和/或细胞冻存保护液不含异种动物源成分。
在一些实施方案中，本申请的组织和/或细胞冻存保护液为人组织和/或人细胞冻存保护液。
在优选实施方案中，用于人组织和/或人细胞冻存保护液的血清为人源血清。在更具体的实施方案中，用于人组织和/或人细胞冻存保护液的血清为人AB血清。
在一些实施方案中，所述渗透性保护剂以体积比计为5％-15％v/v，所述非渗透性保护剂的浓度为40-80mg/ml。
在一些实施方案中，非渗透保护剂中的白蛋白的浓度为2-50mg/ml，聚乙烯吡咯烷酮的浓度为5-25mg/ml，葡聚糖的浓度为5-20mg/ml，以及双糖的浓度为5-30mg/ml。发明人证实，包含具有所述浓度的非渗透保护剂的冻存液能够有效地维持冻存组织中的细胞活性，与新鲜组织相比，不影响目标细胞(例如成纤维细胞)的培养。
在一些具体实施方案中，组织和/或细胞冻存保护液包含渗透性保护剂、非渗透性保护剂、血清和血小板裂解物或由渗透性保护剂、非渗透性保护剂、血清和血小板裂解物组成。在更具体的实施方案中，所述渗透性保护剂以体积比计占所述保护液总量的5％-15％v/v，所述非渗透性保护剂的浓度为40-80mg/ml，血小板裂解物以体积比计占所述保护液总量的0.5％-5％v/v，和血清以体积比计占所述保护液总量的4％-92.5％v/v。
在一些具体实施方案中，渗透性保护剂：血清白蛋白：聚乙烯吡咯烷酮：葡聚糖-40：D-海藻糖：SuperGrow：血清的体积配比为10:10:20:5:30:2.5:22.5(其中非渗透保护剂的母液浓度为0.1g/ml)。在一些具体实施方案中，渗透性保护剂：血清白蛋白：聚乙烯吡咯烷酮：葡聚糖-40：D-海藻糖：SuperGrow：血清的体积配比为12:30:5:15:10:0.5:27.5(其中非渗透保护剂的母液浓度为0.1g/ml)。在一些具体实施方案中，渗透性保护剂：血清白蛋白：聚乙烯吡咯烷酮：葡聚糖-40：D-海藻糖：SuperGrow：血清的体积配比为8:2:15:10:20:5:40(其中非渗透保护剂的母液浓度为0.1g/ml)。在一些具体实施方案中，渗透性保护剂：血清白蛋白：聚乙烯吡咯烷酮：葡聚糖-40：D-海藻糖：SuperGrow：血清的体积配比为6:20:25:5:20:1.5:22.5(其中非渗透保护剂的母液浓度为0.1g/ml)。在一些具体实施方案中，渗透性保护剂：血清白蛋白：聚乙烯吡咯烷酮：葡聚糖-40：D-海藻糖：SuperGrow：血清的体积配比为12:50:5:20:5:3.5:4.5(其中非渗透保护剂的母液浓度为0.1g/ml)。在一些实施方案中，非渗透性保护剂可以溶于本领域常用的溶剂中，例如PBS、DPBS和水。在一些实施方案中，与新鲜组织相比，上述配比的冻存保护液能够有效地保护组织在冻存时不受明显损伤。用上述冻存液冻存组织之后不影响目标细胞(例如成纤维细胞)的培养。在一些实施方案中，组织为皮肤组织。在一些实施方案中，组织优选为人皮肤组织。
本申请所述的组织和/或细胞冻存保护液可用于多种组织和/或细胞的冻存。在一些实施方案中，将本申请的组织和/或细胞冻存保护液用于人皮肤组织的冻存。
第二方面，本申请提供了制备第一方面所述的组织和/或细胞冻存保护液的方法，包括：
将非渗透性冷冻保护剂、血小板裂解物以及任选的血清混合，得到第一混合物；
向所述第一混合物中加入渗透性冷冻保护剂，得到第二混合物；
将所述第二混合物冷藏，得到组织和/或细胞冻存保护液；
可选地，将所述组织和/或细胞冻存保护液离心，并将上清过滤，以除颗粒除菌；
优选地，所述非渗透性保护剂包括白蛋白、聚乙烯吡咯烷酮、葡聚糖和/或双糖。
在一些实施方案中，在混合之前将非渗透性冷冻保护剂、血小板裂解物以及任选的血清置于2-6℃下预冷。
在一些实施方案中，将第二混合物置于2-8℃下冷藏30min以上。
将混合物混合完之后由于血清的存在，可能会存在絮状物。因此，可将得到的冻存保护液离心将所述组织和/或细胞冻存保护液离心。在一些实施方案中，将得到的冻存保护液在2,000rpm离心5min。
在一些实施方案中，将得到的冻存保护液进行过滤除菌。
除非另外说明，第二方面的细节特征可以与第一方面相同。
第三方面，本申请提供了使用第一方面的组织和/或细胞冻存保护液冻存组织和/或细胞的方法，包括：
向组织碎块和/或细胞中加入冻存液，得到混合物；
将上述混合物于低温下保存。
对于细胞而言，可在细胞消化之后直接加入冻存液。对于待冻存的组织而言，通常在冻存之前进行物理破碎的步骤。本文所用的术语“物理破碎”指利用工具将组织处理为物理学形态更小的碎块的步骤。该步骤可以利用多种器具完成，例如小型镊子、剪刀等。
在具体实施方案中，将用冻存液悬浮后的组织和/或细胞放入室温平衡的冻存盒中，随后放入-80℃冻存。在具体实施方案中，所述冻存盒含有异丙醇，其降温速率为-1℃/min。在具体实施方案中，将置于-80℃的冻存的组织和/或细胞于次日放入液氮中保存。
在一些实施方案中，本文涉及的利用组织和/或细胞冻存保护液冻存组织和/或细胞的方法中所述细胞的培养方法包括：将组织剪碎经胶原酶消化后，用含有血小板裂解物的基础培养基将其悬浮后静置培养，待长出细胞后将细胞传代，扩大培养。
第四方面，本申请提供了使用第三方面所述的方法获得的冻存组织和/或细胞。
在一些实施方案中，所述组织为皮肤组织，在一些实施方案中，所述组织优选为人皮肤组织。在一些实施方案中，所述细胞为成纤维细胞。
第五方面，本申请提供了第四方面的冻存组织和/或细胞在作为用于美容或组织修复的原料中的用途。
在上述方面的一些实施方案中，由组织培养细胞的方法包括：将组织经胶原酶消化后，用含有血小板裂解物的基础培养基将其悬浮后静置培养，待长出细胞后将细胞传代，扩大培养。
例如，本申请通过提供冻存的皮肤组织或冻存的成纤维细胞能够提供用于皮肤美容或皮肤组织修复的原料。本领域已知，成纤维细胞是真皮组织的主要效应细胞，能产生胶原、纤维粘连蛋白等多种细胞外基质，成纤维细胞及其所产生的细胞外基质、基质所保持的水分是维持皮肤弹性的物质基础。而且，皮肤成纤维细胞是创伤愈合过程中主要的修复细胞之一。正常条件下，其处于相对静止状态，当皮肤组织受损后，成纤维细胞应答损伤刺激游走浸润至伤口局部，并被激活进入增殖及代谢旺盛期，同时产生多种组织修复因子。而人成纤维细胞最直接最便捷的来源是皮肤组织。
应当理解，以上详细描述仅为了使本领域技术人员更清楚地了解本申请的内容，而并非意图在任何方面加以限制。本领域技术人员能够对所述实施方案进行各种改动和变化。
实施例
提供以下实施例仅仅是对本申请的一些实施方案进行举例说明，没有任何限制的目的或性质。
实施例1
组织冻存保护液的制备
非渗透性冷冻保护剂的准备：
人血清白蛋白HAS(购自索莱宝，货号：A8230)(10％，w/v)：取1.3g HSA用人AB血清溶解至终体积13ml，混匀溶解。
聚乙烯吡咯烷酮PVP(购自索莱宝，货号：P8290)(10％，w/v)：取1g PVP用人AB血清溶解至终体积10ml，混匀溶解。
葡聚糖Dextran-40(购自索莱宝，货号：G8570)(10％，w/v)：取1g Dextran-40用人AB血清溶解至终体积10ml，混匀溶解。
D-海藻糖(购自上海生工，货号：DB0374)(10％，w/v)：取1.2g D-海藻糖溶于12ml人AB血清，混匀溶解。
冻存液的配制：
以下皆为体积比：总份是100份，括号中的数字表示该组分所占份数。其中SuperGrow购自深圳市达科为生物工程有限公司(货号为DKW34-SM20025，规格为25ml/瓶)，人AB血清购自深圳市达科为生物工程有限公司。以下五种冻存液分别命名为1-5号冻存液。
①DMSO(10)：HSA(10)：PVP(20)：Dextran-40(5)：D-海藻糖(30)：SuperGrow(2.5)：AB血清(22.5)
②DMSO(12)：HSA(30)：PVP(5)：Dextran-40(15)：D-海藻糖(10)：SuperGrow(0.5)：AB血清(27.5)
③DMSO(8)：HSA(2)：PVP(15)：Dextran-40(10)：D-海藻糖(20)：SuperGrow(5)：AB血清(40)
④DMSO(6)：HSA(20)：PVP(25)：Dextran-40(5)：D-海藻糖(20)：SuperGrow(1.5)：AB血清(22.5)
⑤DMSO(12)：HSA(50)：PVP(5)：Dextran-40(20)：D-海藻糖(5)：SuperGrow(3.5)：AB血清(4.5)
冻存保护液的具体制备步骤：
A)将SuperGrow、非渗透性冷冻保护剂和人AB血清置于2-6℃下预冷，然后将其混合、摇匀；
B)向步骤A)得到的混合物中加入渗透性冷冻保护剂DMSO，摇匀；
C)将步骤B)所得混合物置于2-8℃下冷藏30min以上，即得人皮肤组织冻存保护液。
将获得的人皮肤组织冻存保护液2,000rpm离心5min，将上清依次过0.45um、0.22um滤膜，除颗粒除菌。
新鲜皮肤组织的处理
收集医院的医疗废手术弃物，将无菌条件下取回的12例新鲜包皮组织放入无菌培养皿内，用4℃预冷的生理盐水洗涤3次，同时用无菌的眼科手术剪和镊子配合刮出组织中残留的血液，并剪去多余的皮下组织。然后将组织块剪碎(约1mm大小)，以利于组织的冻存。
将剪碎组织混合后称重，按重量每份0.25g，共计称量21份。
新鲜皮肤组织冻存
将15份剪碎组织用1-5号冻存液悬浮混匀后(每种冻存液做3份重复)，放入室温平衡的冻存盒(异丙醇，降温速率-1℃/min)中，随后放入-80℃冻存，次日取出放入液氮中保存。
新鲜组织培养
将另外3份剪碎组织分别用5ml胶原酶(Ⅰ型胶原酶：REF:17100-017，Gibico；Ⅳ型胶原酶：Ref:17104-019，Gibico)(0.1％Ⅰ：0.1％Ⅳ＝1：1)混匀，37℃消化4h。随后用DMEM培养基稀释至15ml，混匀。2000rpm离心5min，弃上清。用5ml培养液(DMEM+5％SUPERGROW)分别将沉淀重悬后，转入6cm培养皿中，将培养皿转入细胞培养箱中静置培养。
冻存组织培养
将液氮冻存的用1-5号冻存液保存的人皮肤组织样品，从液氮取出后立刻放入37℃水浴中，并不断震荡，待冻存液刚好融化，将组织转移至装有20ml DMEM培养基的离心管中，混匀后2000rpm离心5min，弃上清。用5ml胶原酶(0.1％Ⅰ：0.1％Ⅳ＝1：1)重悬后，37℃消化4h。随后用DMEM培养基稀释至15ml，混匀。2000rpm离心5min，弃上清。用5ml培养液(DMEM+5％SUPERGROW)分别将沉淀重悬后，转入6cm培养皿中，将培养皿转入细胞培养箱中静置培养。
细胞传代培养
待组织培养3天后将培养皿中的培养液更换成新鲜的培养液(DMEM+5％SUPERGROW)，并观察记录细胞生长状况，以后隔一天观察一次并拍照记录细胞的生长状况。
待细胞贴壁生长至细胞贴壁面积占培养瓶培养面积的50％-60％时，对贴壁细胞进行传代处理。采用胰蛋白酶将贴壁的细胞进行消化，并将消化后的细胞按照1:2的比例进行传代。
当P1代细胞生长达到贴壁80％左右(细胞贴壁面积占培养瓶培养面积的比例)时，无菌条件下消化、收集细胞，用培养液将细胞悬浮，将细胞按1：3传代。
当P2代细胞生长达到贴壁80％左右(细胞贴壁面积占培养瓶培养面积的比例)时，无菌条件下消化、收集细胞，用培养液将细胞悬浮，将细胞按1：3传代。
当P3代细胞生长达到贴壁80％左右(细胞贴壁面积占培养瓶培养面积的比例)时，无菌条件下消化、收集细胞，用培养液将细胞悬浮。
实施例2.细胞形态观察与细胞活率计算
在P1代细胞、P2代细胞以及P3代细胞生长达到贴壁80％左右(细胞贴壁面积占培养瓶培养面积的比例)时，无菌条件下消化、收集细胞，用培养液将细胞悬浮，并吸取少量悬液，台盼蓝染色、计数。
原代细胞培养第7天的细胞状态如图1所示。从图1中的结果可以看出，1-5号冻存液组均能够显著保护细胞的活力，这说明本申请的冻存液可以用于组织的冻存。
细胞计数和活率计算结果如表1所示。细胞活率计算公式为：活细胞率(％)＝活细胞总数/(活细胞总数+死细胞总数)×100％。
表1细胞培养过程中的细胞数量与活率
Figure BDA0001251887510000121
由表1可知，1～5号冻存液中冻存的皮肤组织，在将其P2、P3代培养7天后测得的P2和P3代细胞活率均高于98％，与新鲜组织P2和P3代培养7天后测得的细胞活率相当。可见，本申请的冻存液对于原代之后培养的细胞的活率无影响，细胞活率未降低。
实施例3.流式细胞术测定细胞纯度
用4％的多聚甲醛固定细胞30min(4℃)，PBS洗涤3次，3500rpm离心3min。然后用0.4％Triton X-100将细胞室温透化10min，PBS洗涤3次，3500rpm离心3min。用200μl PBS重悬细胞，分成2等份，其中一份加入1μl抗波形蛋白FITC(货号：11-9897，eBioscience)，混匀后避光冰浴放置30min，另外一份作为对照组。将样品用PBS洗涤1次，3500rpm离心3min，随后流式细胞仪测定细胞纯度。
流式细胞仪的检测结果如图2所示。从图2中的结果可以看出，1-5号冻存液组相对新鲜组织组，成纤维细胞的纯度能够达到100％，说明用本申请的冻存液冻存之后不影响目标细胞(成纤维细胞)的培养。
实施例4.培养细胞的免疫荧光
当P3代细胞生长达到贴壁80％左右(细胞贴壁面积占培养瓶培养面积的比例)时，无菌条件下消化、收集细胞，用培养液将细胞悬浮，同时将细胞进行爬片。
将培养皿中爬好的细胞(或爬好细胞的盖玻片)，用PBS洗涤3次，每次3min。然后用4％多聚甲醛固定细胞30min，PBS洗涤3次，每次3min。随后用0.4％Triton X-100将细胞室温透化10min，PBS洗涤3次，每次3min。用封闭液(5％BSA)室温封闭30min，PBS洗涤3次，每次3min。之后与抗波形蛋白FITC避光孵育90min，PBS洗涤3次，每次3min。DAPI复染，室温避光孵育8min，PBS洗涤3次，每次5min。吸干液体，滴一滴抗荧光淬灭封片液，盖上盖玻片，尽量避免气泡。荧光显微镜下观察细胞样品，并记录结果。
细胞免疫荧光的结果如图3所示。从图3中的细胞免疫荧光结果可以看出，1-5号冻存液组相对新鲜组织组，成纤维细胞的纯度能够达到100％，说明用本申请的冻存液冻存之后不影响目标细胞(成纤维细胞)的培养。
实施例5.含有SuperGrow的冻存保护液与含有Ultroser G的冻存保护液的细胞冻存效果比较
1.含有SuperGrow的冻存保护液与含有Ultroser G的冻存保护液的的配制
冻存保护液的组成：
以下皆为体积比，总份是100份，括号中的数字表示该组分所占份数。
含有SuperGrow的冻存保护液：DMSO(10)：HSA(10)：PVP(20)：Dextran-40(5)：D-海藻糖(30)：SuperGrow(2.5)：AB血清(22.5)
含有Ultroser G的冻存保护液：DMSO(10)：HSA(10)：PVP(20)：Dextran-40(5)：D-海藻糖(30)：Ultroser G(2.5)：AB血清(22.5)
如实施例1中所述准备非渗透性保护剂。然后按下述步骤制备冻存保护液：
A)将SuperGrow、Ultroser G分别和非渗透性保护剂以及人AB血清置于2-6℃下预冷，然后将其混合、摇匀，分别得到含血小板裂解物的非渗透性混合物和不含血小板裂解物的非渗透性混合物。
B)向步骤A)得到的两种混合物中分别加入渗透性保护剂DMSO，摇匀；
C)将步骤B)得到的两种混合物置于2-8℃温度条件下冷藏30min以上；
D)由于混合物中存在絮状物(主要来源于AB血清)，使步骤C)获得的两种混合物在2000rpm下离心5min，随后将上清依次过0.45um、0.22um滤膜，以除颗粒除菌，即得含血小板裂解物的冻存保护液(在本实施例中为含SuperGrow的冻存保护液)和不含血小板裂解物的冻存保护液(在本实施例中为含Ultroser G的冻存保护液)。
2.细胞冻存处理
收集培养结束的人成纤维细胞(hFib)、鼠成纤维细胞(mFib)、293T细胞、HT1080细胞，计数后分别用含血小板裂解物的冻存保护液和不含血小板裂解物的冻存保护液冻存以上四种细胞，每种细胞冻存3支，冻存密度为5×106个细胞/ml/支。将待冻存的细胞放入室温平衡的冻存盒(异丙醇，降温速率-1℃/min)中，随后放入-80℃冻存，次日取出放入液氮中保存。
3.细胞复苏以及细胞活率比较
分别将液氮中保存的用含SuperGrow的冻存保护液和含Ultroser G的冻存保护液冻存的细胞样品从液氮中取出，随后立刻放入37℃水浴中，并不断震荡，待冻存液刚好融化，将细胞转移至盛有10ml DMEM培养基的离心管中，混匀后1500rpm离心5min，去掉上清，用5ml培养液(DMEM+5％Supergrow)分别将细胞重悬后计总细胞数和活细胞数。利用台盼蓝染色进行计数。
细胞活率的计算公式为：细胞活率＝活细胞数/总细胞数×100％。
用含SuperGrow的冻存保护液和含Ultroser G的冻存保护液冻存的人成纤维细胞(hFib)、鼠成纤维细胞(mFib)、293T细胞、HT1080细胞的细胞活率的计算结果分别如表2和图4所示。
表2.冻存液冻存的细胞复苏后的细胞活率
Figure BDA0001251887510000151
由表2和图4可知，本申请的冻存保护液在细胞冻存效果方面优于含Ultroser G作为血清替代物的冻存保护液。利用本申请冻存保护液冻存的细胞的活率相比利用含Ultroser G的冻存保护液冻存的细胞的活率具有显著的统计学差异。
上述实验结果表明，本申请的含血小板裂解物的冻存保护液相比含其它类型的血清替代物的冻存液能够为冻存的细胞提供更好的保护作用。
在不偏离本申请公开的实质和范围的情况下，可对本申请公开的各实施方案进行多种改变和用等同替换。除非上下文中另有说明，否则本公开的实施方案的任何特征、步骤或实施方案都可以与任何其他特征、步骤或实施方案组合使用。

Claims (12)

1.皮肤组织和/或细胞冻存保护液，其包含渗透性保护剂、非渗透性保护剂、血小板裂解物和血清，其中所述非渗透性保护剂包括白蛋白、聚乙烯吡咯烷酮、葡聚糖和双糖，所述渗透性保护剂为二甲基亚砜，所述渗透性保护剂占所述保护液总量的体积比为5％-15％v/v，所述非渗透性保护剂的浓度为40-80mg/ml，血小板裂解物占所述保护液总量的体积比为0.5％-5％v/v，血清占所述保护液总量的体积比为4％-70％v/v。
2.如权利要求1所述的皮肤组织和/或细胞冻存保护液，其中白蛋白的浓度为2-50mg/ml，聚乙烯吡咯烷酮的浓度为5-25mg/ml，葡聚糖的浓度为5-20mg/ml，以及双糖的浓度为5-30mg/ml。
3.如权利要求1所述的皮肤组织和/或细胞冻存保护液，其中所述白蛋白为人血清白蛋白，所述葡聚糖为葡聚糖-40，和/或所述双糖为蔗糖或D-海藻糖。
4.如权利要求1所述的皮肤组织和/或细胞冻存保护液，其中所述血清选自人AB血清、牛血清和马血清，和/或所述血小板裂解物为SuperGrow细胞培养添加物。
5.制备皮肤组织和/或细胞冻存保护液的方法，包括：
将非渗透性保护剂、血小板裂解物以及血清混合，得到第一混合物；
向所述第一混合物中加入渗透性保护剂，得到第二混合物；以及
将所述第二混合物冷藏，得到组织和/或细胞冻存保护液；
其中所述非渗透性保护剂包括白蛋白、聚乙烯吡咯烷酮、葡聚糖和双糖，所述渗透性保护剂为二甲基亚砜，所述渗透性保护剂占所述保护液总量的体积比为5％-15％v/v，所述非渗透性保护剂的浓度为40-80mg/ml，血小板裂解物占所述保护液总量的体积比为0.5％-5％v/v，血清占所述保护液总量的体积比为4％-70％v/v。
6.如权利要求5所述的方法，其中将所述皮肤组织和/或细胞冻存保护液离心，并将上清过滤，以除颗粒除菌。
7.如权利要求5所述的方法，其中白蛋白的浓度为2-50mg/ml，聚乙烯吡咯烷酮的浓度为5-25mg/ml，葡聚糖的浓度为5-20mg/ml，以及双糖的浓度为5-30mg/ml。
8.如权利要求5所述的方法，其中所述白蛋白为人血清白蛋白，所述葡聚糖为葡聚糖-40，和/或所述双糖为蔗糖或D-海藻糖。
9.如权利要求5所述的方法，其中所述血清选自人AB血清、牛血清和马血清，和/或所述血小板裂解物为SuperGrow细胞培养添加物。
10.冻存皮肤组织和/或细胞的方法，包括：
向皮肤组织碎块和/或细胞中加入权利要求1-4中任一项所述的皮肤组织和/或细胞冻存保护液，得到混合物；以及
将上述混合物于低温下保存。
11.如权利要求10所述的方法，其中所述细胞的培养方法包括：
将组织经胶原酶消化后，用含有血小板裂解物的基础培养基将其悬浮后静置培养，待长出细胞后将细胞传代，扩大培养。
12.如权利要求10所述的方法，其中所述皮肤组织为人皮肤组织；以及所述细胞为成纤维细胞。
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