CN109601527A - 一种牙周膜干细胞冻存液及其冻存方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及干细胞冻存技术领域，特别涉及一种牙周膜干细胞冻存液及其冻存方法。该牙周膜干细胞冻存液包括海藻糖、乙酰胺、DMSO和基础培养基；所述牙周膜干细胞冻存液中各组分的浓度为：海藻糖：500～2000mg/L；乙酰胺：5vt％～20vt％；DMSO：5vt％～15vt％；基础培养基：补足。与常规的细胞冻存液相比，本发明所述冻存液在细胞冻存过程中对细胞损伤作用较小，细胞活率较高，表明本发明所述冻存液冻存效果明显优于常规细胞冻存液。本发明一方面可以在一定程度上降低细胞冻存的成本，另一方面可以避免异源性物质的引入，具有更高的临床安全性。

Description

一种牙周膜干细胞冻存液及其冻存方法

技术领域

本发明涉及干细胞冻存技术领域，特别涉及一种牙周膜干细胞冻存液及其冻存方法。

背景技术

牙周炎主要是由局部因素引起的牙周支持组织的慢性炎症。发病年龄以35岁以后较为多见，如龈炎未能及时治疗，炎症可由牙龈向深层扩散到牙周膜、牙槽骨和牙骨质而发展为牙周炎。由于早期多无明显自觉症状而易被忽视，待有症状时已较严重，甚至已不能保留牙齿。牙周膜干细胞是来源于牙周膜的成体干细胞，具有自我复制的能力，能产生不同种类的具有特定表型和功能的成熟细胞，能够维持牙周膜的功能的稳定，发挥生理细胞更新和组织修复组织损伤的作用，在维持正常的牙周组织更新和牙周炎组织损伤修复中起到重要的作用。

在细胞使用前通常需要冻存和复苏。冻存的程序为：选择处于对数生长期的细胞，在冻存前一天最好换液。将多个培养瓶中的细胞培养液去掉，用0.25％胰蛋白酶消化。适时去掉胰蛋白酶，加入少量新培养液。用吸管吸取培养液反复吹打瓶壁上的细胞，使其成为均匀分散的细胞悬液。悬浮生产细胞则不要消化处理，然后将细胞收集于离心管中离心(1000r/min，10分钟)，去上清液，加入完全培养基，于4℃预冷15分钟后，逐滴加入已无菌的DMSO或甘油，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，细胞浓度为3×106～1×107/mL之间，将上述细胞分装于专用冷冻塑料管中，冷冻管要将盖子盖紧，并标记好细胞名称和冻存日期，同时作好登记(日期、细胞种类及代次、冻存支数)。

目前常用的细胞冻存液或市售的细胞冻存液中通常是由胎牛血清或者血清替代物以及二甲基亚砜等物质组成的，但胎牛血清属于异源性物质，成分复杂，并存在引入污染和过敏原的风险，而血清替代物成分也不明确且价格昂贵，不适合于临床应用，特别是在细胞治疗中，异源性蛋白的存在，可能会引起未知的不良反应，严重影响治疗结果。因此，需要提供一种临床安全性高，同时又能很好保持冻存细胞活性的细胞冻存液，用于冻存牙周膜干细胞。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种牙周膜干细胞冻存液及其冻存方法。该牙周膜干细胞冻存液在细胞冻存过程中对牙周膜干细胞损伤作用较小，细胞活率较高，同时可以避免异源性物质的引入，具有更高的临床安全性。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种牙周膜干细胞冻存液，其特征在于，包括海藻糖、乙酰胺、DMSO和基础培养基；所述牙周膜干细胞冻存液中各组分的浓度为：

海藻糖：500～2000mg/L；

乙酰胺：5vt％～20vt％；

DMSO：5vt％～15vt％；

基础培养基：补足。

作为优选，牙周膜干细胞冻存液中各组分的浓度为：

海藻糖：500～1500mg/L；

乙酰胺：10vt％～20vt％；

DMSO：10vt％；

基础培养基：补足。

优选地，牙周膜干细胞冻存液中各组分的浓度为：

海藻糖：1000～1500mg/L；

乙酰胺：10vt％～20vt％；

DMSO：10vt％；

基础培养基：补足。

优选地，牙周膜干细胞冻存液中各组分的浓度为：

海藻糖：1500mg/L；

乙酰胺：10vt％～20vt％；

DMSO：10vt％；

基础培养基：补足。

更为优选地，牙周膜干细胞冻存液中各组分的浓度为：

海藻糖：1500mg/L；

乙酰胺：10vt％；

DMSO：10vt％；

基础培养基：补足。

更为优选地，牙周膜干细胞冻存液中各组分的浓度为：

海藻糖：1500mg/L；

乙酰胺：20vt％；

DMSO：10vt％；

基础培养基：补足。

作为优选，基础培养基为DMEM/F12培养基。

本发明还提供了一种牙周膜干细胞的冻存方法，包括：将牙周膜干细胞冻存于上述牙周膜干细胞冻存液中。

作为优选，冻存的密度为(0.1～10)×10⁶cell/mL。

优选的，冻存的密度为1×10⁶cell/mL。

作为优选，冻存的程序为：将牙周膜干细胞置于牙周膜干细胞冻存液中，4℃放置2h，液氮口放置30min后放入液氮中冻存。

在本发明中，冻存后还包括复苏的步骤。

作为优选，复苏的温度为37℃。

本发明提供了一种牙周膜干细胞冻存液及其冻存方法。该牙周膜干细胞冻存液包括海藻糖、乙酰胺、DMSO和基础培养基；所述牙周膜干细胞冻存液中各组分的浓度为：海藻糖：500～2000mg/L；乙酰胺：5vt％～20vt％；DMSO：5vt％～15vt％；基础培养基：补足。本发明具有的技术效果为：

与常规的细胞冻存液相比，本发明所述冻存液在细胞冻存过程中对细胞损伤作用较小，细胞活率较高。表明本发明所述冻存液冻存效果明显优于常规细胞冻存液。

本发明采用海藻糖、乙酰胺与二甲基亚砜混合进行细胞冻存，一方面可以在一定程度上降低细胞冻存的成本，另一方面可以避免异源性物质的引入，具有更高的临床安全性。

附图说明

图1示牙周膜干细胞增殖情况；

图2示牙周膜干细胞的成骨效果；

图3示牙周膜干细胞表面标志物的表达情况。

具体实施方式

本发明公开了一种牙周膜干细胞冻存液及其冻存方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

术语解释：

海藻糖(Trehalose)，又名覃糖，是由两个吡喃环葡萄糖分子以α,α-1,1键连接而成的双糖，化学名为α-D-吡喃葡糖基α-D-吡喃葡糖苷，分子式为C₁₂H₂₂O₁₁·2H₂O，分子量378.133。海藻糖理论上存在有三种不同的正位异构体(Anomers)，即α,α-型、α,β-型和β,β型。但在自然界中广泛存在的只有α,α-型异构体，也就是通常所说的海藻糖(Trehalose)，也被称作蘑菇糖(Mycose,Mushroom sugar)，其余两种很少见，仅在蜂蜜和王浆中发现了少量的α,β-型海藻糖(新海藻糖,Neotrehatose)；另一种β,β型也被称作异海藻糖(Isotrehalose)。

乙酰胺是乙酸中的羟基被氨基取代而生成的化合物。分子式CH₃CONH₂，无色晶体，熔点82.3℃，沸点221.2℃，相对密度0.9986(85/4℃)。溶于水和乙醇。极纯的乙酰胺没有气味，是制造药物和杀菌剂的原料。

细胞冻存：细胞冻存是细胞保存的主要方法之一。利用冻存技术将细胞置于-196℃液氮中低温保存，可以使细胞暂时脱离生长状态而将其细胞特性保存起来，这样在需要的时候再复苏细胞用于实验。而且适度地保存一定量的细胞，可以防止因正在培养的细胞被污染或其他意外事件而使细胞丢种，起到了细胞保种的作用。除此之外，还可以利用细胞冻存的形式来购买、寄赠、交换和运送某些细胞。细胞冻存时向培养基中加入保护剂--终浓度5％-15％的甘油或二甲基亚砜(DMSO)，可使溶液冰点降低，加之在缓慢冻结条件下，细胞内水分透出，减少了冰晶形成，从而避免细胞损伤。采用"慢冻快融"的方法能较好地保证细胞存活。标准冷冻速度开始为-1到-2℃/min，当温度低于-25℃时可加速，到-80℃之后可直接投入液氮内(-196℃)。

本发明中，细胞冻存液的组成为：混合物+DMSO(10％)+分散剂；混合物由海藻糖和乙酰胺组成；

海藻糖：固态，在体系中为质量分数，单位是mg/L；

乙酰胺：液体，在体系中为体积分数，单位是％；

分散剂：DMEM/F12培养基。

空白对照：DMSO(10％)+分散剂(90％)。

阳性对照：FBS(90％)+DMSO(10％)。

本发明提供的牙周膜干细胞冻存液及其冻存方法中所用试剂或仪器均可由市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1、混合物配比

(1)海藻糖工作浓度：500mg/L、1000mg/L、1500mg/L；

(2)乙酰胺工作浓度：10％、20％；

实验组为A：海藻糖+乙酰胺+DMEM/F12+DMSO+细胞；

对照组为B：DMEM/F12+DMSO+细胞；或者FBS+DMSO+细胞。

具体组成如下表：

表1冻存液中各组分浓度配比

实施例2、采用实施例1的参数冻存细胞后复苏细胞并测定细胞相关状态

冻存细胞的终密度为10⁶cell/mL，冻存量为1.0mL/管，按照以下程序进行冻存：4℃放置2h，液氮口放置30min后放入液氮中。

细胞冻存4周后进行复苏，每个组复苏3支，从液氮中取出冻存管直接放入37℃温水中，并不时摇动使其在短时间内尽快融化，融化后离心，弃上清，每支管中加入1mL培养液，计数并计活取平均值。活率分布如下：

表2牙周膜干细胞冻存复苏后细胞活率

上表可看出，海藻糖和乙酰胺的加入明显增加了复苏细胞的活率。

生长曲线的绘制：取12孔培养板，每孔以10000cell/孔的密度将复苏后的细胞各接种于孔中，每孔加入含10％FBS的DMEM/F12液1mL，置于37℃，5％CO₂培养箱中培养，每三天换液一次。从第3天开始(刚刚复苏的细胞需要约24h适应环境)，每隔24h取出板，随机选择3孔，吸弃旧培养液并用PBS清洗，加胰酶消化细胞，终止消化后，制备单细胞悬液，吹匀，取10μL细胞悬液与10μL 0.4％台盼蓝混匀后加样到血细胞计数板上，10倍镜下计数计数板四角大方格内细胞的数量，以时间为横轴，细胞数为纵轴绘制细胞生长曲线。结果见表3、图1。

表3牙周膜干细胞增殖情况

由上述实验结果可以看出，经含有海藻糖和乙酰胺的冻存液冻存、复苏后得到的牙周膜干细胞，在相同时间下明显生长速度快于常规冻存液，而最终细胞数量也多于常规培养基。而最优的比例是A5。

实施例3、成骨能力鉴定

取A5组培养得到的P5细胞，以5×10⁴个/孔密度接种于6孔板，分为成骨诱导组和对照组，完全培养基培养。成骨诱导组贴壁细胞生长融合后更换成骨诱导培养基(含500ng/mL BMP-2、10％FBS、100nmol/L地塞米松、20mmol/Lβ-甘油磷酸钠、10mg/L维生素C的L-DMEM)，对照组继续以完全培养基培养和常规诱导培养基(10％FBS、100nmol/L地塞米松、20mmol/Lβ-甘油磷酸钠、10mg/L维生素C的L-DMEM)。每3天更换培养基，至4周时行茜素红染色鉴定。成骨效果见图2。

实施例4、表面标记物鉴定

取第3代采用A5组培养的生长良好的牙周膜干细胞，消化后清洗3次，制成细胞悬液，加入抗体，流式细胞仪检测分析CD73、CD90、CD105、CD11b、CD19、CD34、CD45、HLA-DR的表达情况。试验结果见表4、图3。

表4牙周膜干细胞表面标志物的表达情况

上述检测结果表明该细胞是牙周膜干细胞。

实施例5、效果对比试验

实验组：A5组；

对照组：命名为C组，为DMEM/F12+DMSO+单一因子。

表5试验组和对照组冻存液中各组分浓度配比

	海藻糖	乙酰胺	DMEM/F12	DMSO	细胞
						A5	1500mg/L	10％	80％	10％	10<sup>6</sup>
C1	/	10％	80％	10％	10<sup>6</sup>
						C2	1500mg/L	/	90％	10％	10<sup>6</sup>

试验方法：分别采用上述3种冻存液冻存牙周膜干细胞。取12孔培养板，每孔以10000cell/孔的密度将复苏后的牙周膜干细胞各接种于孔中，每孔加入含10％FBS的DMEM/F12液1mL，置于37℃，5％CO₂培养箱中培养，每三天换液一次。从第2天开始(刚刚复苏的细胞需要约24h适应环境)，每隔24h取出板，随机选择3孔，吸弃旧培养液并用PBS清洗，加胰酶消化细胞，终止消化后，制备单细胞悬液，吹匀，取10μL细胞悬液与10μL0.4％台盼蓝混匀后加样到血细胞计数板上，10倍镜下计数计数板四角大方格内细胞的数量，以时间为横轴，细胞数为纵轴绘制细胞生长曲线。试验结果见表5。

表6牙周膜干细胞增殖情况

由上述结果可以看出，经含有海藻糖和乙酰胺的冻存液冻存、复苏后得到的牙周膜干细胞，在相同时间下明显生长速度快于加了单一因子的冻存液组，而最终细胞数量也显著多于加了单一因子的冻存液组。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种牙周膜干细胞冻存液，其特征在于，包括海藻糖、乙酰胺、DMSO和基础培养基；所述牙周膜干细胞冻存液中各组分的浓度为：

海藻糖：500～2000mg/L；

乙酰胺：5vt％～20vt％；

DMSO：5vt％～15vt％；

基础培养基：补足。

2.根据权利要求1所述的牙周膜干细胞冻存液，其特征在于，所述牙周膜干细胞冻存液中各组分的浓度为：

海藻糖：500～1500mg/L；

乙酰胺：10vt％～20vt％；

DMSO：10vt％；

基础培养基：补足。

3.根据权利要求1所述的牙周膜干细胞冻存液，其特征在于，所述牙周膜干细胞冻存液中各组分的浓度为：

海藻糖：1000～1500mg/L；

乙酰胺：10vt％～20vt％；

DMSO：10vt％；

基础培养基：补足。

4.根据权利要求1所述的牙周膜干细胞冻存液，其特征在于，所述牙周膜干细胞冻存液中各组分的浓度为：

海藻糖：1500mg/L；

乙酰胺：10vt％～20vt％；

DMSO：10vt％；

基础培养基：补足。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的牙周膜干细胞冻存液，其特征在于，所述基础培养基为DMEM/F12培养基。

6.一种牙周膜干细胞的冻存方法，其特征在于，包括：将牙周膜干细胞冻存于权利要求1至5中任一项所述牙周膜干细胞冻存液中。

7.根据权利要求6所述的冻存方法，其特征在于，所述冻存的密度为(0.1～10)×10⁶cell/mL。

8.根据权利要求6所述的冻存方法，其特征在于，所述冻存的程序为：将牙周膜干细胞置于牙周膜干细胞冻存液中，4℃放置2h，液氮口放置30min后放入液氮中冻存。

9.根据权利要求6所述的冻存方法，其特征在于，所述冻存后还包括复苏的步骤。

10.根据权利要求9所述的冻存方法，其特征在于，所述复苏的温度为37℃。