CN105925523B - 一种赤眼鳟鳍条细胞系及其建立方法与应用 - Google Patents
一种赤眼鳟鳍条细胞系及其建立方法与应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN105925523B CN105925523B CN201610277718.4A CN201610277718A CN105925523B CN 105925523 B CN105925523 B CN 105925523B CN 201610277718 A CN201610277718 A CN 201610277718A CN 105925523 B CN105925523 B CN 105925523B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- cell
- cell line
- squaliobarbus curriculus
- culture
- fin ray
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 241001275832 Squaliobarbus curriculus Species 0.000 title claims abstract description 44
- 238000000034 method Methods 0.000 title abstract description 8
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 5
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 abstract description 80
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 abstract description 22
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 abstract description 7
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 abstract description 5
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 abstract description 3
- 231100000027 toxicology Toxicity 0.000 abstract description 2
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 abstract 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 21
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 16
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 14
- 239000012930 cell culture fluid Substances 0.000 description 13
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 11
- 241000252230 Ctenopharyngodon idella Species 0.000 description 7
- 108050007372 Fibroblast Growth Factor Proteins 0.000 description 7
- 102000018233 Fibroblast Growth Factor Human genes 0.000 description 7
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 7
- 229940126864 fibroblast growth factor Drugs 0.000 description 7
- 102000009024 Epidermal Growth Factor Human genes 0.000 description 6
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 6
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 6
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 6
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 6
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 5
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 5
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000004965 Hartree-Fock calculation Methods 0.000 description 4
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 4
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 4
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 4
- 230000001186 cumulative effect Effects 0.000 description 4
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 4
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 3
- 238000005138 cryopreservation Methods 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 3
- IAKHMKGGTNLKSZ-INIZCTEOSA-N (S)-colchicine Chemical compound C1([C@@H](NC(C)=O)CC2)=CC(=O)C(OC)=CC=C1C1=C2C=C(OC)C(OC)=C1OC IAKHMKGGTNLKSZ-INIZCTEOSA-N 0.000 description 2
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000581364 Clinitrachus argentatus Species 0.000 description 2
- 241000252210 Cyprinidae Species 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 2
- APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N amphotericin B Chemical compound O[C@H]1[C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H]1/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](C)OC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)CC[C@@H](O)[C@H](O)C[C@H](O)C[C@](O)(C[C@H](O)[C@H]2C(O)=O)O[C@H]2C1 APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000012286 potassium permanganate Substances 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 2
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 2
- 229930183010 Amphotericin Natural products 0.000 description 1
- QGGFZZLFKABGNL-UHFFFAOYSA-N Amphotericin A Natural products OC1C(N)C(O)C(C)OC1OC1C=CC=CC=CC=CCCC=CC=CC(C)C(O)C(C)C(C)OC(=O)CC(O)CC(O)CCC(O)C(O)CC(O)CC(O)(CC(O)C2C(O)=O)OC2C1 QGGFZZLFKABGNL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- APKFDSVGJQXUKY-KKGHZKTASA-N Amphotericin-B Natural products O[C@H]1[C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H]1C=CC=CC=CC=CC=CC=CC=C[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](C)OC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)CC[C@@H](O)[C@H](O)C[C@H](O)C[C@](O)(C[C@H](O)[C@H]2C(O)=O)O[C@H]2C1 APKFDSVGJQXUKY-KKGHZKTASA-N 0.000 description 1
- 208000019838 Blood disease Diseases 0.000 description 1
- 244000025254 Cannabis sativa Species 0.000 description 1
- 101800003838 Epidermal growth factor Proteins 0.000 description 1
- 241000609060 Grass carp reovirus Species 0.000 description 1
- 208000032843 Hemorrhage Diseases 0.000 description 1
- 239000012097 Lipofectamine 2000 Substances 0.000 description 1
- 108010067035 Pancrelipase Proteins 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 229960000583 acetic acid Drugs 0.000 description 1
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 1
- 229940009444 amphotericin Drugs 0.000 description 1
- 229960003942 amphotericin b Drugs 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000009360 aquaculture Methods 0.000 description 1
- 208000024754 bloodshot eye Diseases 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 210000002230 centromere Anatomy 0.000 description 1
- 229960001338 colchicine Drugs 0.000 description 1
- 230000008602 contraction Effects 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 229940116977 epidermal growth factor Drugs 0.000 description 1
- 210000002615 epidermis Anatomy 0.000 description 1
- 239000013505 freshwater Substances 0.000 description 1
- 239000012362 glacial acetic acid Substances 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 208000014951 hematologic disease Diseases 0.000 description 1
- 208000018706 hematopoietic system disease Diseases 0.000 description 1
- 208000031169 hemorrhagic disease Diseases 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 239000005457 ice water Substances 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000008774 maternal effect Effects 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 1
- 230000000926 neurological effect Effects 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 1
- 201000005111 ocular hyperemia Diseases 0.000 description 1
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 1
- 239000002574 poison Substances 0.000 description 1
- 231100000614 poison Toxicity 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000012601 sigmoid curve-fitting method Methods 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N uroanthelone Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C(C)C)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
- C12N5/0654—Osteocytes, Osteoblasts, Odontocytes; Bones, Teeth
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
- C12N2501/11—Epidermal growth factor [EGF]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2509/00—Methods for the dissociation of cells, e.g. specific use of enzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2720/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsRNA viruses
- C12N2720/00011—Details
- C12N2720/12011—Reoviridae
- C12N2720/12051—Methods of production or purification of viral material
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
- Immunology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Virology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
一种赤眼鳟鱼鳍条细胞系及其建立方法与应用，该赤眼鳟鱼鳍条细胞系的保藏号为CCTCC NO：C201642，是赤眼鳟的尾鳍经过原代培养、传代培养所得，所用的培养基为Leibovitz’sl‑15培养所制得。所述赤眼鳟鱼鳍条细胞系的生物学特性包括：细胞为成纤维样细胞，细胞在含有20％体积分数的胎牛血清的Leibovitz’sl‑15培养基在25℃恒温培养箱中呈最适状态。在此生长条件下复苏后的细胞经胎盼蓝染色，细胞的成活率达82.5％，细胞呈成纤维样，生长旺盛，其特征染色体数目为48条。另外，将质粒pEGFP‑N1转入该细胞系中表达显示荧光。本发明的细胞系能应用于支持草鱼出血病病毒的生长与复制中，不仅可以用于外源基因的表达，还可以运用于毒理学。
Description
技术领域
本发明涉及动物细胞技术领域，具体涉及一种赤眼鳟鳍条细胞系，同时涉及该细胞系的建立方法与应用。
背景技术
草鱼属鲤形目鲤科雅罗鱼亚科草鱼属，是中国主要淡水养殖对象。然而草鱼在养殖过程中，草鱼出血病一直非常突出，已严重影响了草鱼的养殖产量。赤眼鳟(Squaliobarbus curriculus)在分类学上属于鲤形目鲤科雅罗鱼亚科赤眼鳟属，俗称红眼鱼，是优质的经济鱼，其分布广泛，几乎遍布全中国各大水系。赤眼鳟因其病害少、肉质鲜美、适应性强，常用以研究。通常研究是以赤眼鳟为母本、草鱼为父本进行远缘杂交试验，对抗病机理进行分析。该赤眼鳟细胞系的建立可以为研究遗传学提供材料，还可以运用毒理学。
发明内容
本发明的主要目的是，基于上述问题，提供一种赤眼鳟鳍条细胞系SCF及其建立方法与应用。
上述赤眼鳟鳍条细胞系SCF，保藏号为CCTCC NO：C201642，于2016年3月16日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉武汉大学。
本发明还提供上述赤眼鳟鳍条细胞系SCF的建立方法，该方法包括以下步骤：
(1)制备细胞培养液：以Leibovitz’sl-15培养基为基础培养基，于其中加入表皮生长因子、成纤维细胞生长因子及胎牛血清配置成细胞培养液；该细胞培养液中，胎牛血清占该细胞培养液总体积的25％，表皮生长因子的终浓度为10ng/ml，成纤维细胞生长因子的终浓度为10ng/ml；
(2)原代培养：取健康的赤眼鳟，于20mg/ml的高锰酸钾液中浸泡30min，然后用75％质量浓度的酒精喷洒鱼体后擦干，在超净工作台内，剪取鱼体的尾鳍组织，转移至含有0.25％胰蛋白酶的培养皿中培养15min，用灭菌剪刀将尾鳍 组织块剪成大小为1.5mm3的小块，剪成的组织小块先用含有500IU/ml的青霉素、500ug/ml的链霉素及12.5ug/ml的两性霉素B的磷酸缓冲液洗3次，再用含有500IU/ml的青霉素、500ug/ml的链霉素及12.5ug/ml两性霉素B的Leibovitz’sl-15培养液洗1次；将漂洗过的组织小块均匀接种在没有加任何培养基的25cm2细胞培养瓶中，于25℃培养箱倒置干贴5h；再于该细胞培养瓶中加入原代培养所需的前述制备的细胞培养液1ml，前20d每天更换该细胞培养液；
(3)传代培养：待原代细胞单层铺满细胞培养瓶时，取出组织小块，将组织小块用磷酸缓冲液清洗一次，再用1ml 0.25％胰蛋白酶对细胞静止消化，待细胞开始收缩变圆成单个细胞时，加入2ml新鲜的细胞培养液中和终止消化，吸出加入的胰蛋白酶溶液和细胞培养液，再加入5ml新鲜的细胞培养液，吹打制成细胞悬液，于25℃恒温培养箱中培养，待细胞再次形成单层时，进行下一次传代。
按照步骤(3)的过程传代，10代后所用培养基为含有20％血清的Leibovitz’sl-15培养基。该赤眼鳟鳍条细胞于20％血清的Leibovitz’sl-15培养基中25℃下呈现最适生长。
上述赤眼鳟鳍条细胞系可以运用于外源基因的表达，质粒pEGFP-N1在该细胞系中表达显示荧光。
本发明同时提供所述赤眼鳟鳍条细胞系SCF在支持草鱼出血病病毒(GCRV)的生长和复制中的应用。
本发明的优点：在组织块制备时，用0.25％胰蛋白酶除去多余的组织，有利于较快的获得成纤维细胞，减小杂质细胞对所要获得细胞的影响；用含有抗生素的磷酸缓冲液漂洗三次后，用含有抗生素的Leibovitz’sl-15漂洗一次，使组织块获得一定营养，延长倒置干贴的时间，使其贴壁率上升。本发明的优点在于可以较快获得大量成纤维细胞；本赤眼鳟鳍条细胞系不仅能运用于外源基因的表达，还能用于病毒学、毒理学、遗传学等。
附图说明
图1是显微镜下本发明赤眼鳟鳍条细胞的原代培养图。
图2是显微镜下本发明赤眼鳟鳍条细胞的传代培养图。
图3是赤眼鳟鳍条细胞在不同血清浓度下的生长曲线图。
图4是赤眼鳟鳍条细胞在不同培养基类型的生长曲线图。
图5是质粒pEGFP-N1在赤眼鳟鳍条细胞中表达显示的荧光图。
图6是接种草鱼出血病病毒后，赤眼鳟鳍条细胞系的形态图。
图7是赤眼鳟鳍条细胞染色体图，右图显示48条染色体。
具体实施方式
下面将结合附图对本发明提供的具体的实施方式作详细的说明。
实施例1本发明赤眼鳟鳍条细胞系的建立
(1)制备细胞培养液
以Leibovitz’sl-15培养基为基础，于其中加入表皮生长因子、成纤维细胞生长因子及胎牛血清，配置成细胞培养液。该培养液中，胎牛血清占该细胞培养液总体积的25％，表皮生长因子的终浓度为10ng/ml，成纤维细胞生长因子的终浓度为10ng/ml，配制成的细胞培养液于4℃保存。
(2)原代培养
取健康的赤眼鳟，于20mg/ml的高锰酸钾液中浸泡30min，然后用70％质量浓度的酒精喷洒鱼体后擦干，在超净工作台内，剪取鱼体的尾鳍组织，转移至含有0.25％胰蛋白酶的培养皿中培养15min，用灭菌剪刀镊子刮去多余的组织，并用剪刀将组织块剪成大小为1.5mm3的小块，剪成的组织小块先用含有500IU/ml的青霉素、500ug/ml的链霉素及12.5ug/ml的两性霉素B的磷酸缓冲液洗3次，再用含有500IU/ml的青霉素、500ug/ml的链霉素及12.5ug/ml两性霉素B的Leibovitz’sl-15培养液洗1次。将漂洗过的组织小块均匀接种在25cm2细胞培养瓶(该培养瓶未加任何培养液)中，于25℃培养箱倒置干贴5h。于该细胞培养瓶中加入原代培养所需的前面步骤(1)制得的细胞培养液1ml，前20d每天更换该细胞培养液观察(结合参见图1)。
(3)传代培养
待原代细胞单层铺满细胞培养瓶时，移出细胞培养瓶中的细胞培养液，取 出组织小块用磷酸缓冲液清洗一次，再用1ml的0.25％胰蛋白酶对细胞静止消化，待细胞开始收缩变圆成单个细胞时，用2ml前述制备的新鲜的细胞培养液中和终止消化，吸出液体(液体是指细胞培养瓶中加入的胰蛋白酶溶液和细胞培养液)，再加入5ml前述制备的新鲜的细胞培养液，吹打制成细胞悬液，于25℃恒温培养箱中培养(结合参见图2)。待细胞再次形成单层时，进行下一次传代。
实施例2细胞的保存与复苏
A液和B液的配置：
A液：按体积比由40％胎牛血清、20％二甲基亚砜及40％Leibovitz’sl-15培养基配制而成。取1ml A液放入冻存管中，并在冻存管上标记冻存日期、细胞名称、培养基类型、血清浓度。
B液：常规的Leibovitz’sl-15培养液(不含有胎牛血清)。
细胞的保存：取生长旺盛的赤眼鳟鳍条细胞，用磷酸缓冲液洗一次后，用1ml0.25％胰蛋白酶消化，待细胞收缩快成单个时，吸出胰蛋白酶。用2ml专用培养基(该专用培养基中胎牛血清占该培养基总体积的20％)中和，再吸出专用培养基。用1ml B液吹悬细胞加入上述含有A液的冻存管底部。将冻存管放入东村盒中，置于-80℃超低温冰箱过夜，最后放入液氮中长期保存。
细胞的复苏：取液氮中保存的细胞，在37℃水浴锅中解冻，待细胞即将融化完全时转入离心管中，加入3ml专用培养基(该培养基中胎牛血清占该培养基总体积的20％)，1000rpm/min离心5min，弃上清液，用专用培养基重悬细胞，在25℃恒温培养箱中培养24h后，更换专用培养基，继续培养。同时，取少量的解冻细胞，加入台盼蓝(Trypan Blue),用血球计数法计数，活的细胞为白色，死的为蓝色。计算细胞的存活率。复苏细胞的存活率为82.5％左右，细胞呈成纤维样，生长旺盛。
实施例3细胞最适生长条件的确定
最适血清浓度的确定：将初始密度为20×106个/ml的赤眼鳟鳍条细胞分别种植在含有体积分数分别为5％、10％、15％、20％的FBS的Leibovitiz，sl-15培 养基(该培养基中还添加有表皮生长因子和成纤维细胞生长因子，该培养基中表皮生长因子的终浓度为10ng/ml，成纤维细胞生长因子的终浓度为10ng/ml，)的25cm2培养瓶中。在第2、4、6、8、10、12天分别用0.25％胰蛋白酶消化细胞，在血球计数板计数并绘制生长曲线。结果参见图3，细胞生长速度随着FBS浓度的增加而加快，在该含有FBS的Leibovitiz，sl-15培养基中，FBS的体积分数为20％时细胞生长速度最快。表明：本发明所建立的赤眼鳟鳍条细胞在含20％体积分数的胎牛血清的Leibovitz’sl-15培养基中最适生长。
最适培养基类型的确定：将初始密度为20×106个/ml的赤眼鳟鳍条细胞分别种植在含20％体积分数的FBS的Leibovitiz，sl-15(简称L-15)培养基、M199培养基、R-1640培养基和MEM培养基的25cm2培养瓶中。在第2、4、6、8、10、12天分别用0.25％胰蛋白酶消化，在血球计数板计数并绘制生长曲线。结果见图4，细胞在含20％体积分数的FBS的L-15培养基中明显高于其他培养基；在含20％体积分数的FBS的MEM培养基中生长缓慢，直至死亡。
实施例4细胞的转染
将质粒pEGFP-N1转入赤眼鳟鳍条细胞中的步骤如下：将赤眼鳟鳍条细胞接种到6孔板中，第二天，待细胞密度达到80％以上时，进行细胞的转染实验。将10ul pEGFP-N1加入到含有240ul常规Leibovitz’sl-15培养液的管中，将5ul Lipofectamine2000加入到含有245ul常规Leibovitz’sl-15培养液的另一管中。5min后，将上述两管溶液混合，室温放置20min，再于25℃培养5h，然后将混合溶液中的培养液替换为专用培养基(该培养基中含有20％体积分数的胎牛血清)，24h后，在显微镜下观察显示荧光，结果参见图5，质粒pEGFP-N1转入赤眼鳟鳍条细胞，显示荧光。说明赤眼鳟鳍条细胞系能用于外源基因的表达。
实施例5病毒的敏感性
病毒按照梯度稀释，取10个EP管依次标上编号，在第一个EP管中加入1ml的草鱼出血病病毒，后面9个EP管都加900ul常规L-15培养基(不含有胎牛血清)，第二个EP管从第一个EP管中吸取100ul的病毒，后面的EP管依次从前一 个EP管中吸取100ul的病毒液，使得病毒按照100、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9的梯度稀释。取96孔板作上标记，以2组只含常规L-15培养基的为对照组，后10组依次从浓度低的加入到96孔板中，每一排加入100ul的病毒液。从用有专用培养基培养赤眼鳟鳍条细胞的培养瓶中吸出专用培养基，将吸出的专用培养基放入离心管中以3000r/min离心5min，而该培养瓶中加入1ml 0.25％胰蛋白酶消化成单个细胞，轻拍使得细胞从培养瓶脱落，再于该培养瓶中加入2ml前述离心后的上清液中和，吸出上清液，将上清液放入离心管中以1000r/min离心5min，弃掉离心后的上清液，再用含有2％体积分数的胎牛血清的Leibovitz’sl-15培养基吹悬细胞，再将吹悬的细胞加在上述作有标记的96孔板中，每孔滴加1滴的细胞悬液，用封口膜封口，放入25℃培养观察。细胞出现病变效应，测得TCID50＝10-8.52/0.1ml。表明：本赤眼鳟鳍条细胞系对草鱼出血病病毒有易感性。
实施例6染色体分析
赤眼鳟鳍条细胞传代培养24h后，向培养瓶加入终浓度为1ug/ml的秋水仙素，置于25℃恒温培养箱继续培养14h，然后用1ml 0.25％胰蛋白酶消化，再用2ml专用培养基中和终止消化，将消化为单个的细胞转入离心管，以1500rpm/min离心5min，收集细胞。用冰的双蒸水低渗，然后用固定液(固定液按体积比甲醇：冰乙酸为3:1配置)固定20min，重复3次后滴片，自然干燥后用Giemsa染液染色。
显微镜下观察拍照，染色体数目计数，根据染色体的着丝点位置、臂长等特征对染色体进行分组、配对，显示染色体数目为48条，见图7。
本文中的0.25％胰蛋白酶购置于Solarbio公司。
本文中提及的专用培养基是以Leibovitz’sl-15培养基为基础培养基，于其中加入表皮生长因子、成纤维细胞生长因子及胎牛血清配置成，其中，胎牛血清占该培养基总体积的20％，表皮生长因子的终浓度为10ng/ml，成纤维细胞生长因子的终浓度为10ng/ml。
Claims (3)
1.一种赤眼鳟鳍条细胞系SCF，保藏号为CCTCC NO：C201642。
2.权利要求1所述的赤眼鳟鳍条细胞系SCF在支持草鱼出血病病毒的生长与复制中的应用。
3.权利要求1所述的赤眼鳟鳍条细胞系SCF在外源基因的表达中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201610277718.4A CN105925523B (zh) | 2016-04-29 | 2016-04-29 | 一种赤眼鳟鳍条细胞系及其建立方法与应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201610277718.4A CN105925523B (zh) | 2016-04-29 | 2016-04-29 | 一种赤眼鳟鳍条细胞系及其建立方法与应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN105925523A CN105925523A (zh) | 2016-09-07 |
| CN105925523B true CN105925523B (zh) | 2017-07-14 |
Family
ID=56837728
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201610277718.4A Expired - Fee Related CN105925523B (zh) | 2016-04-29 | 2016-04-29 | 一种赤眼鳟鳍条细胞系及其建立方法与应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN105925523B (zh) |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107629996A (zh) * | 2017-08-29 | 2018-01-26 | 中国水产科学研究院珠江水产研究所 | 一株草鱼胸鳍细胞系的构建方法 |
| CN107541484A (zh) * | 2017-09-30 | 2018-01-05 | 湖南师范大学 | 二倍体红鲫尾鳍细胞系2nFC及其构建方法和应用 |
| CN107641612A (zh) * | 2017-09-30 | 2018-01-30 | 湖南师范大学 | 三倍体湘云鲫尾鳍细胞系3nFC及其构建方法和应用 |
| CN108624553B (zh) * | 2018-04-03 | 2020-06-09 | 华中农业大学 | 一种青鳉肌肉细胞系 |
| CN108546672B (zh) * | 2018-04-20 | 2021-06-25 | 上海海洋大学 | 一种异育银鲫尾鳍细胞系的构建方法及其应用 |
| CN109207422B (zh) * | 2018-09-26 | 2020-08-21 | 福建省农业科学院生物技术研究所 | 一种欧洲鳗鲡肾脏细胞系ek及其应用 |
| CN111751178A (zh) * | 2020-06-09 | 2020-10-09 | 中国长江三峡集团有限公司中华鲟研究所 | 一种长江鲟染色体制备方法 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1006178A2 (en) * | 1998-12-03 | 2000-06-07 | National Science Council | An immortal cell line derived from grouper Epinephelus coioides and its applications |
| CN102399743A (zh) * | 2011-12-16 | 2012-04-04 | 中国水产科学研究院长江水产研究所 | 一种锦鲤鳍条组织细胞系及构建方法 |
-
2016
- 2016-04-29 CN CN201610277718.4A patent/CN105925523B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1006178A2 (en) * | 1998-12-03 | 2000-06-07 | National Science Council | An immortal cell line derived from grouper Epinephelus coioides and its applications |
| CN102399743A (zh) * | 2011-12-16 | 2012-04-04 | 中国水产科学研究院长江水产研究所 | 一种锦鲤鳍条组织细胞系及构建方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 大菱鲆（Scophthalus maximus）鳍细胞系的建立;耿晓芬;《中国优秀硕士学位论文全文数据库（基础科学辑）》;20090215(第2期);A006-123，参见摘要、第4页末段-第5页首段、第12页末段-14页首段、第23页第6段及第24页第6段-末段 * |
| 感染GCRV草鱼和赤眼鳟miRNA的鉴定与分析;彭慧珍;《中国博士学位论文全文数据库（农业科技辑）》;20160415(第4期);D052-14，参见摘要 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN105925523A (zh) | 2016-09-07 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN105925523B (zh) | 一种赤眼鳟鳍条细胞系及其建立方法与应用 | |
| CN103275925B (zh) | 鳜鱼脑细胞系的构建方法 | |
| CN104560870B (zh) | 一种制备蜕膜间充质干细胞的方法 | |
| CN105969720B (zh) | 一种人类血管内皮细胞培养液及其培养方法 | |
| CN106754674A (zh) | 从人胎盘羊膜制备羊膜间充质干细胞的方法及其应用 | |
| CN105713871A (zh) | 一种人绒毛膜间充质干细胞的分离培养方法 | |
| CN104560869B (zh) | 一种制备绒毛膜间充质干细胞的方法 | |
| CN103667176A (zh) | 鲤疱疹病毒ⅱ型敏感的异育银鲫脑组织细胞系及其建立方法和应用 | |
| CN108148803A (zh) | 一株草鱼肌肉组织细胞系及应用 | |
| CN107746829A (zh) | 一种分离与原代培养犬胎盘来源的间充质干细胞的方法 | |
| CN107164319A (zh) | 一种原代培养犬脐带来源的间充质干细胞的方法 | |
| CN108504625A (zh) | 一种小鼠成纤维细胞及其用途 | |
| CN109294974A (zh) | 一种异育银鲫脊髓组织细胞系及其构建方法与其应用 | |
| CN104974977B (zh) | 一种鞍带石斑鱼肾组织细胞系及其构建方法 | |
| CN104152403B (zh) | 一种建立鹅胚上皮细胞系的方法及建立的鹅胚上皮细胞系 | |
| CN102719394B (zh) | 山羊真皮成纤维细胞系的构建方法 | |
| CN107629996A (zh) | 一株草鱼胸鳍细胞系的构建方法 | |
| CN105420185A (zh) | 一种从脐带外层羊膜组织中分离提取hUC-MSC的方法 | |
| CN104818241B (zh) | 鞍带石斑鱼皮肤组织细胞系及其构建方法 | |
| CN107354130A (zh) | 一种人胎盘绒毛膜间充质干细胞分离方法 | |
| CN104450610B (zh) | 一种人羊膜间充质干细胞传代培养方法 | |
| CN108865985A (zh) | 一种干细胞源外泌体干预上皮-间质转化的方法 | |
| CN105441386A (zh) | 一种猪极小胚胎样干细胞培养与鉴定方法 | |
| CN109207422B (zh) | 一种欧洲鳗鲡肾脏细胞系ek及其应用 | |
| CN104774802B (zh) | 银鲫鱼背鳍细胞系 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20170714 |