CN103275925B

CN103275925B - 鳜鱼脑细胞系的构建方法

Info

Publication number: CN103275925B
Application number: CN201310202902.9A
Authority: CN
Inventors: 付小哲; 李宁求; 吴淑勤; 罗霞; 赖迎迢; 石存斌
Original assignee: Pearl River Fisheries Research Institute CAFS
Current assignee: Pearl River Fisheries Research Institute CAFS
Priority date: 2013-05-27
Filing date: 2013-05-27
Publication date: 2014-10-15
Anticipated expiration: 2033-05-27
Also published as: CN103275925A

Abstract

本发明公开了鳜鱼脑细胞系的构建方法，针对鳜鱼脑组织细胞的特征，采用含血清胶原酶消化法分离脑组织细胞，进行原代培养，继而成功构建了鳜鱼脑细胞系，可提供大量的鳜鱼脑来源细胞，且传代细胞能维持良好的生长状态。本发明所构建的脑细胞系的构建方法重复性强，为分子细胞水平上开展鱼类病毒感染途径、感染机理以及研制病毒疫苗等研究提供了便利。

Description

鳜鱼脑细胞系的构建方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及一种鳜鱼脑细胞系的构建方法。

背景技术

鳜（Siniperca chuatsi），又名桂花鱼，肉质细嫩、味道鲜美，在国际水产品市场中有“淡水石斑”之称，是我国优质淡水鱼消费和出口创汇的重要品种之一。随着鳜鱼养殖规模的逐年扩大和养殖密度的提高，鳜鱼疾病繁多，病原包括病毒、细菌、寄生虫等，尤其是由传染性脾肾坏死病毒（ISKNV）引起的病毒病最为严重，发病率普遍达60%以上，死亡率50%以上，严重时发病塘鳜鱼死亡率达90%，甚至全部死亡，每年因其造成的经济损失达十亿元以上，严重影响了鳜鱼养殖业的可持续发展。查清病毒的感染途径及病毒与细胞相互作用机理是从根本上预防和解决鳜鱼等鱼类病毒病的关键。细胞系作为一种体外培养系统，因其成本低、可重复性好、条件可控等优点，被广泛应用于病毒学、免疫学、毒理学、发育生物学、生理学、肿瘤学、基因组学、蛋白组学、遗传学等领域，尤其是在研究病毒感染途径、感染机理以及研制病毒疫苗方面是重要的研究工具。

前期研究发现，就ISKNV敏感性而言，鳜鱼脑细胞比鳜鱼鳍条细胞、吻端细胞、肾脏细胞、肝脏细胞更敏感。而成熟鱼体大脑组织细胞很多已经分裂不旺盛或者不分裂，且目前采用的鱼类细胞系构建方法中，快速剪碎组织法会产生机械剪切力，会对脑细胞产生很大影响，使脑原代细胞难以正常贴壁并增殖，而胰蛋白酶消化分离法会使大量的脑细胞在胰蛋白酶消化过程中缺氧死亡，因此需要研究一种有效的鳜鱼脑细胞系的构建方法，建立鳜鱼脑细胞系，为在细胞水平上研究病毒致病机理、研制抗病毒药物及抗病毒疫苗奠定基础。迄今为止，有文献报道采用胰蛋白酶消化分离法建立了一株鳜鱼幼鱼细胞系（中山大学，董传甫，Virus Research，2008，135：273–281），但仍未见脑来源细胞系的报道。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种鳜鱼脑细胞系的构建方法。

本发明所采取的技术方案是：

鳜鱼脑细胞系的构建方法，包括以下步骤：

1)脑组织的处理：取鲜活鳜鱼，无菌条件下剖取鳜鱼脑组织，剪成50～100立方毫米的组织块；

2)原代培养：将组织块放入含血清的胶原酶消化液中消化4～6小时，离心收集经消化处理的组织细胞悬液，加入鳜鱼脑细胞专用增殖培养液重悬后，于25～28℃培养箱中培养，每3～5天半量更换培养液一次；

3)传代培养：原代培养细胞长成单层后，加入胰蛋白酶消化，然后用鳜鱼脑细胞专用增殖培养液悬起细胞，按1瓶传2瓶的方式进行传代培养。

优选的，所述的含血清的胶原酶消化液为含有10～20v/v%胎牛血清、0.1～0.2w/v%Ⅰ型胶原酶、200～400U/ml青霉素、200～400μg/ml链霉素、0.5～1.0μg/ml两性霉素B的L-15培养液。

优选的，所述的鳜鱼脑细胞专用增殖培养液为含有20v/v%胎牛血清、10～20ng/ml人表皮生长因子、10～20ng/ml人碱性成纤维生长因子、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素、0.25μg/ml两性霉素B，pH值为7.0～7.4的L-15培养液。

优选的，当细胞传代培养至5代后，所用鳜鱼脑细胞专用增殖培养液中不再添加人表皮生长因子、人碱性成纤维生长因子及抗生素，胎牛血清浓度降至10v/v%。

优选的，步骤1）中，首先将鲜活幼鳜用70～75v/v%酒精浸泡消毒2～3分钟，擦除体表粘液，然后在无菌条件下解剖取下脑组织，在1×HBSS平衡液中将脑组织剪成50～100立方毫米的组织块，500～600转/分离心收集组织块，离心2～3次。

优选的，步骤2）中，将组织块放入含血清的胶原酶消化液中，25～30℃下进行消化。

优选的，步骤2）中，1200～2200转/分离心5～10分钟，收集经消化处理的组织细胞悬液。

优选的，步骤3）中，待鳜鱼脑细胞长成单层后，吸出培养瓶中的培养液，用HBSS平衡液洗涤2～3次，向培养瓶中加入浓度为0.1～0.25w/v%的胰蛋白酶溶液，室温静置消化1～2分钟后，吸去胰蛋白酶溶液，然后加入鳜鱼脑细胞专用增殖培养液，制成细胞悬液；从每个培养瓶中分别取出一半的脑细胞悬液，分别加入到新的培养瓶中；待脑细胞再次长成单层后，仍以上述相同方法进行传代培养，至细胞系建立。

本发明的有益效果是：

本发明针对鳜鱼脑组织细胞的特征，采用含血清胶原酶消化法分离脑组织细胞，进行原代培养，继而成功构建了鳜鱼脑细胞系，已连续传至142代，可提供大量的鳜鱼脑来源细胞，且传代细胞能维持良好的生长状态，并可对其进行冷冻保存。

本发明所构建的脑细胞系为分子细胞水平上开展鱼类病毒感染途径、感染机理以及研制病毒疫苗等研究提供了便利。

本发明鳜鱼脑细胞系的构建方法重复性强，该方法还可适用于构建其他鱼类脑组织来源的细胞系。

附图说明

图1为相差显微镜下传代培养的鳜鱼脑细胞系：A为第22代鳜鱼脑细胞系；B为第64代鳜鱼脑细胞系。

图2为第69代鳜鱼脑细胞系的生长曲线。

图3为鳜鱼脑细胞系的染色体数目分布：A为第5代细胞系的染色体数目分布；B为第62代细胞系的染色体数目分布。

图4为鳜鱼脑细胞系感染ISKNV后的图片：A为细胞感染病毒之前；B为细胞感染病毒1天；C为细胞感染病毒3天；D为细胞感染病毒5天；E、F、G为感染病毒的细胞电镜切片图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明内容。

鳜鱼脑细胞系的构建方法，包括以下步骤：

优选的，所述的含血清的胶原酶消化液为含有10～20v/v%胎牛血清、0.1～0.2w/v%Ⅰ型胶原酶、200～400U/ml青霉素、200～400μg/ml链霉素、0.5～1.0μg/ml两性霉素B的L-15培养液。更优选的，含血清的胶原酶消化液为含有10v/v%胎牛血清、0.1w/v%的Ⅰ型胶原酶、200U/ml的青霉素、200μg/ml链霉素、0.5μg/ml两性霉素B的L-15培养基。

优选的，所述的鳜鱼脑细胞专用增殖培养液为含有20v/v%胎牛血清、10～20ng/ml人表皮生长因子、10～20ng/ml人碱性成纤维生长因子、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素、0.25μg/ml两性霉素B，pH值为7.0～7.4的L-15培养液。更优选的，鳜鱼脑细胞专用增殖培养液的配方为含有20v/v%胎牛血清、10ng/ml人表皮生长因子、10ng/ml人碱性成纤维生长因子、100U/ml的青霉素、100μg/ml链霉素、0.25μg/ml两性霉素B，pH值为7.0～7.4的L-15培养液。

优选的，步骤2）中，将组织块放入含血清的胶原酶消化液中，25～30℃下进行消化。更优选的，28℃下进行消化。

更优选的，步骤3）中，待鳜鱼脑细胞长成单层后，吸出培养瓶中的培养液，用HBSS平衡液洗涤2～3次，向培养瓶中加入浓度为0.25w/v%的胰蛋白酶溶液，室温静置消化1～2分钟后，吸去胰蛋白酶溶液，然后加入鳜鱼脑细胞专用增殖培养液，制成细胞悬液；从每个培养瓶中分别取出一半的脑细胞悬液，分别加入到新的培养瓶中；待脑细胞再次长成单层后，仍以上述相同方法进行传代培养，至细胞系建立。

以下实施例中所用鳜鱼来源于广东清远某养殖场；L-15培养液、胎牛血清、胶原酶、胰蛋白酶消化液、HBSS平衡盐液均购于GIBICO公司。

实施例1

1)脑组织的处理：首先将鲜活鳜鱼用75%酒精浸泡消毒2分钟，用纱布擦除体表粘液，置于超净工作台中解剖取下脑组织，在装有HBSS平衡液的小玻璃瓶中将脑组织粗剪成50～100立方毫米的组织块，600转/分离心收集组织块，反复离心3次。

2)原代培养：将组织块放入含血清胶原酶消化液（消化液配方为含有10v/v%胎牛血清、0.1w/v%的Ⅰ型胶原酶、200U/ml的青霉素、200μg/ml链霉素、0.5μg/ml两性霉素B的L-15培养基）中28℃消化6小时，当消化结束后，1200转/分离心5分钟，收集经消化处理的组织细胞悬液，加5毫升鳜鱼脑细胞专用增殖培养液（培养液配方为含有20v/v%胎牛血清、10ng/ml人表皮生长因子、10ng/ml人碱性成纤维生长因子、100U/ml的青霉素、100μg/ml链霉素、0.25μg/ml两性霉素B，pH值为7.0～7.4的L-15培养液）重悬，将细胞悬液转至25毫升细胞培养瓶中，28℃培养箱中培养。每隔3～5天，吸出2.5毫升上述25毫升培养瓶中的培养液，以去除未贴壁的组织和死细胞，加入2.5毫升新鲜的鳜鱼脑细胞专用培养液。

3)传代培养：待鳜鱼脑细胞长成单层后，吸出培养瓶中的培养液，1×HBSS平衡液洗涤2次，向每个培养瓶中加入0.5毫升浓度为0.25w/v%的胰蛋白酶溶液，室温静置消化2分钟；吸去胰蛋白酶溶液，加入10毫升鳜鱼脑细胞专用增殖培养液，用滴管吹打培养瓶底制成细胞悬液；从每个培养瓶中分别取出5毫升脑细胞悬液，分别加入到新的25毫升培养瓶中，待脑细胞再次长成单层后，仍以上述的相同方法进行传代培养，至细胞系建立。当传代培养至5代后，鳜鱼脑细胞专用增殖培养液中不再添加人表皮生长因子、人碱性成纤维生长因子及抗生素，胎牛血清浓度降至10v/v%。

该鳜鱼脑细胞系已传140多代，细胞能稳定增值，可定为细胞系。该细胞系主要细胞类型为成纤维样细胞，如图1所示。图1为相差显微镜下传代培养的鳜鱼脑细胞系：A为第22代鳜鱼脑细胞系；B为第64代鳜鱼脑细胞系。

对比例

1)脑组织的处理：方法同实施例1的步骤1）。

2)原代培养：将组织块放入2毫升0.25%胰蛋白酶消化液中室温消化30分钟，消化液过100目网筛，收集细胞悬液，1200转/分离心5分钟，弃上清后，加5毫升鳜鱼脑细胞专用增殖培养液重悬，将细胞悬液转至25毫升细胞培养瓶中，28℃培养箱中培养。培养后第三天细胞大部分死亡，待第7天，细胞全部死亡。

鳜鱼脑细胞系的鉴定：

1.细胞的冻存与复苏

(1)细胞的冻存：选取生长旺盛、处于指数生长期的、细胞密度90%以上的75毫升培养瓶培养细胞1瓶，加入1ml0.25%胰蛋白酶消化2分钟，吸去消化液，用5ml冻存液（含10v/v%二甲基亚砜、20v/v%胎牛血清的L-15培养基）悬浮细胞，移至冻存管，将冻存管放入程序降温盒内，移至-70℃冰箱过夜，次日早上移至液氮中保存。

(2)细胞的复苏：自液氮中取出保存的冻存管，迅速置于37℃水浴中融化，1200rpm离心5分钟，弃上清，加入1ml鳜鱼脑细胞专用增殖培养液悬起细胞，转移至已含有4ml鳜鱼脑细胞专用增殖培养液的25ml培养瓶中，放置于培养箱中28℃培养，待细胞贴壁后弃上清，加入5ml新的细胞培养液。

2.细胞生长曲线的绘制：

为了分析鳜鱼脑来源细胞系的生长情况，取第69代细胞接种于6孔板，每孔1.9×10⁵个细胞，在接种后的第2、3、4、5、6天各取三孔细胞，以0.25%胰蛋白酶消化，countstar细胞计数仪计数。以培养时间为横坐标，以每ml细胞数量为纵坐标，绘制生长曲线，如图2所示。

3.染色体分析：

分别将第5代和第62代鳜鱼脑来源细胞系以1×10⁵个/瓶的密度接种于25cm²的培养瓶中，28℃分别培养48h、24h后，加入终浓度20μg/ml的秋水仙素，4h后，消化收集细胞，离心后的细胞沉淀以0.075mol/L的KCl溶液室温处理25分钟后加入1ml的卡诺固定液（体积比甲醇：乙酸=3：1），预固定20分钟，离心后细胞沉淀再次用卡诺固定液固定15分钟。最后离心，细胞重悬于0.5ml的卡诺固定液中，-20℃保存过夜。第二天，细胞悬液以冷滴法滴片，风干，用5%吉姆萨染色25分钟，干燥后用Nikon显微镜观察。在观察的100个分裂相细胞中，第5代鳜鱼脑组织来源细胞的染色体众数为48条，而第62代鳜鱼脑组织来源细胞的染色体数目在28～56之间，其中染色体众数为36、48和54条（如图3所示）。

4.病毒感染实验：

以第69代鳜鱼脑组织来源细胞系为对象，检测该细胞对传染性脾肾坏死病毒（ISKNV）的敏感程度。细胞接种48小时后，将病毒溶液加入细胞培养瓶中，1小时后，移去病毒溶液，更换新鲜细胞培养液(含3v/v%胎牛血清的L-15培养基)，继续培养，约24小时后观察到细胞病变效应（CPE）（参见图4中的A～D）。将病变72小时后的细胞做电镜切片观察，透射电镜结果显示，在鳜鱼脑来源细胞系中观察到ISKNV病毒粒子（参见图4中的E、F、G）。

本发明针对鳜鱼脑组织细胞的特征，采用含血清胶原酶消化法分离脑组织细胞，进行原代培养，继而成功构建了鳜鱼脑细胞系，已连续传至142代以上，可提供大量的鳜鱼脑来源细胞，且细胞能维持良好的生长状态，可以对其进行冷冻保存。

本发明所构建的脑细胞系为分子细胞水平上开展鱼类病原特性及其致病机理的研究、疫苗的研制以及功能基因研究等提供了便利。

本发明鳜鱼脑细胞系的构建方法重复性强，该方法可适用于构建其他鱼类脑组织来源的细胞系，具有极大的应用价值。

Claims

1.鳜鱼脑细胞系的构建方法，包括以下步骤：

1）脑组织的处理：取鲜活鳜鱼，无菌条件下剖取鳜鱼脑组织，剪成50～100立方毫米的组织块；

2）原代培养：将组织块放入含血清的胶原酶消化液中消化4～6小时，离心收集经消化处理的组织细胞悬液，加入鳜鱼脑细胞专用增殖培养液重悬后，于25～28℃培养箱中培养，每3～5天半量更换培养液一次；

3）传代培养：原代培养细胞长成单层后，加入胰蛋白酶消化，然后用鳜鱼脑细胞专用增殖培养液悬起细胞，按1瓶传2瓶的方式进行传代培养；

所述的含血清的胶原酶消化液为含有10～20v/v%胎牛血清、0.1～0.2w/v%Ⅰ型胶原酶、200～400U/ml青霉素、200～400μg/ml链霉素、0.5～1.0μg/ml两性霉素B的L-15培养液；

所述的鳜鱼脑细胞专用增殖培养液为含有20v/v%胎牛血清、10～20ng/ml人表皮生长因子、10～20ng/ml人碱性成纤维生长因子、100 U/ml青霉素、100μg/ml链霉素、0.25μg/ml两性霉素B，pH值为7.0～7.4 的L-15培养液。

2.根据权利要求1所述的鳜鱼脑细胞系的构建方法，其特征在于：当细胞传代培养至5代后，所用鳜鱼脑细胞专用增殖培养液中不再添加人表皮生长因子、人碱性成纤维生长因子及抗生素，胎牛血清浓度降至10v/v%。

3.根据权利要求1所述的鳜鱼脑细胞系的构建方法，其特征在于：步骤1）中，首先将鲜活幼鳜用70～75v/v%酒精浸泡消毒2～3分钟，擦除体表粘液，然后在无菌条件下解剖取下脑组织，在1×HBSS平衡液中将脑组织剪成50～100立方毫米的组织块，500～600转/分离心收集组织块，离心2～3次。

4.根据权利要求1所述的鳜鱼脑细胞系的构建方法，其特征在于：步骤2）中，将组织块放入含血清的胶原酶消化液中，25～30℃下进行消化。

5.根据权利要求4所述的鳜鱼脑细胞系的构建方法，其特征在于：步骤2）中，1200～2200转/分离心5～10分钟，收集经消化处理的组织细胞悬液。

6.根据权利要求2所述的鳜鱼脑细胞系的构建方法，其特征在于：步骤3）中，待鳜鱼脑细胞长成单层后，吸出培养瓶中的培养液，用HBSS平衡液洗涤2～3次，向培养瓶中加入浓度为0.1～0.25w/v%的胰蛋白酶溶液，室温静置消化1～2分钟后，吸去胰蛋白酶溶液，然后加入鳜鱼脑细胞专用增殖培养液，制成细胞悬液；从每个培养瓶中分别取出一半的脑细胞悬液，分别加入到新的培养瓶中；待脑细胞再次长成单层后，仍以上述相同方法进行传代培养，至细胞系建立。