CN116836912B - 一种大口黑鲈吻端细胞系及其构建方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种大口黑鲈吻端细胞系及其构建方法和应用；所述细胞系的保藏编号为CCTCC NO：C2023121；该细胞系的染色体为56条，为永久细胞系，可以无限增殖，并可对其进行冷冻保存；而且YL03‑S细胞对大口黑鲈易感的LMBV、ISKNV、MSRV均非常敏感，用此细胞系扩增这三种病毒的增殖量显著高于大口黑鲈心肌细胞系、鳜鱼脑细胞系CPB，可以用于大口黑鲈易感病毒疫苗的研发中；还可用于表达外源基因进行基因功能的研究；该细胞系的建立在丰富大口黑鲈细胞库的同时可为水产动物病毒性疾病的病原分离、培养、检测提供保障，还可为开展大口黑鲈易感病毒的感染途径、感染机理以及研制病毒疫苗等提供了便利。

Description

一种大口黑鲈吻端细胞系及其构建方法和应用
技术领域
本发明属于水生生物细胞领域，具体涉及一种大口黑鲈吻端细胞系及其构建方法和应用。
背景技术
大口黑鲈(Micropterus salmoides)，俗称加州鲈。一直以来，大口黑鲈成鱼养殖主要采用冰冻海水杂鱼投喂，冰鲜小杂鱼易带致病菌，已报道的大口黑鲈诺卡氏病等重大疾病都与此有关，由于受外部环境因素影响较大，冰鲜小杂鱼在品质方面不易监控，难以保证养殖产品的质量安全。再一方面，绝大多数大口黑鲈个体养殖户需要每天购买冰鲜小杂鱼，并通过人工或半机械化切碎，整个成鱼养殖过程中投入的人力成本大，这些因素制约了大口黑鲈养殖业的可持续健康发展。
大口黑鲈“优鲈3号”(品种登记号：GS-01-001-2018)由中国水产科学研究院珠江水产研究所、广东梁氏水产种业有限公司、南京帅丰饲料有限公司联合选育，是以大口黑鲈“优鲈1号”与大口黑鲈北方亚种引进群体作为亲本，经过连续4年群体选育的新品种。“优鲈1号”是2011年培育出的大口黑鲈选育品种，生长速度比普通大口黑鲈快17.8％～25.3％,但"优鲈1号”对人工配合饲料的适应性还有待改良。而在相同养殖条件下，摄食人工配合饲料的“优鲈3号”的生长速度比“优鲈1号”平均提高17.1％，“优鲈3号”易驯食人工配合饲料，驯化时间明显缩短，驯食成功率显著提高，对大口黑鲈养殖产业转型升级具有重大意义，也是我国水产养殖业绿色发展的必然要求。
大口黑鲈是国内重要的经济性淡水养殖品种，因其产量高，近年来更是被誉为“第五大家鱼”。随着集约化养殖程度的提高及水体环境恶化，在大口黑鲈养殖的全链条过程中，病害频发，严重阻碍了大口黑鲈产业的可持续发展。其中，病毒性病害尤为严重。在苗种和养成期，影响大口黑鲈的主要病毒为大口黑鲈虹彩病毒(LMBV))、传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)大口黑鲈弹状病毒(MSRV)。这三种病毒可以单独感染大口黑鲈，亦可两种或以上协同感染，致死率可高达90％以上。病毒性疾病无有效的治疗药物，疫苗防控是唯一有效的方法，鱼类细胞系是鱼类病毒性疫苗制备的基础。此外，细胞系还是进行基因功能分析的理想材料，对鱼类免疫机制的研究意义重大。
目前源于大口黑鲈的细胞系不多，报道的仅有大口黑鲈心肌细胞系(MSMF)，“优鲈3号”作为一个标志性的新品种，其细胞系的建立不仅为大口黑鲈病毒性疾病疫苗的研发提供基础材料，更为“优鲈3号”种质资源的保护提供了实体材料。
发明内容
本发明第一方面的目的，在于提供一种大口黑鲈吻端细胞系。
本发明第二方面的目的，在于提供上述大口黑鲈吻端细胞系的构建方法。
本发明第三方面的目的，在于提供上述大口黑鲈吻端细胞系的应用。
本发明第四方面的目的，在于提供一种培养病毒的方法。
本发明第五方面的目的，在于提供一种制备疫苗的方法。
本发明第六方面的目的，在于提供一种疫苗。
本发明所采取的技术方案是：
本发明的第一方面，提供一种大口黑鲈吻端细胞系，所述细胞系的保藏编号为CCTCC NO：C2023121。
本发明的第二方面，提供本发明第一方面所述细胞系的构建方法；将大口黑鲈吻端组织放入复合蛋白酶消化，收集消化后的细胞进行原代培养和传代培养即可获得大口黑鲈吻端细胞系。
优选地，所述方法具体包括以下步骤：
S1：将大口黑鲈吻端组织块切成小组织块后加复合蛋白酶进行消化；然后加入完全培养液进行原代培养；
S2：原代培养细胞汇合度达80％～90％时进行传代培养。
优选地，所述复合蛋白酶包括胰蛋白酶、I型胶原酶、VI型胶原酶中的至少一种。
优选地，所述消化的步骤包括：使用低浓度胰蛋白酶冷消化后再用包含I型胶原酶、VI型胶原酶的混合胶原酶热消化。
优选地，所述冷消化的条件为2～6℃过夜消化；所述过夜优选为10～18h。
优选地，所述热消化的条件为35～39℃消化10～15min。
优选地，所述胰蛋白酶的浓度为0.1～0.2％。
优选地，所述I型胶原酶的浓度为0.05～0.15％。
优选地，所述VI型胶原酶的浓度为0.05～0.15％。
优选地，所述混合胶原酶中I型胶原酶和VI型胶原酶的比例为1:0.5～1.5。
优选地，原代培养中每3～5天换液。
优选地，所述完全培养液包含胎牛血清、基础培养基。
优选地，所述基础培养基为L-15和/或M199。
优选地，所述基础培养基的PH值为7.2-7.4。
优选地，所述胎牛血清的浓度为10～20％。
优选地，所述完全培养液还包含18～22ng/L碱性成纤维样生长因子、0.5～1.5ng/mL的表皮生长因子、80～120U/mL青霉素、80～120μg/mL链霉素、0.2～0.3μg/mL两性霉素B。
优选地，所述传代培养的具体步骤包括：当细胞长满培养瓶底时，用胰酶-EDTA将细胞消化至细胞变圆时，吸弃胰酶，加入新鲜培养液终止消化；用吸管轻吹后收集悬浮细胞，接种于培养瓶内，加入完全培养液进行传代培养。
优选地，所述传代培养中的胰酶浓度为0.2～0.3％。
优选地，所述传代比例为以1：2～3。
优选地，所述培养的温度为22～27℃。
优选地，所述大口黑鲈的品种为优鲈3号。
本发明的第三方面，提供本发明第一方面所述的细胞系在以下至少一项中的应用：
(1)培养病毒；
(2)制备培养病毒的产品；
(3)分离病毒；
(4)制备分离病毒的产品；
(5)非诊断治疗目的的检测病毒；
(6)制备检测病毒的产品。
优选地，所述病毒包括水产动物病毒。
优选地，所述水产病毒包括大口黑虹彩病毒(LMBV)、传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)、大口黑鲈鱼弹状病毒(MSRV)中的至少一种。
本发明第一方面所述的细胞系在制备药物中的应用，所述药物为用于预防和/或治疗病毒感染所致的疾病的药物。
优选地，所述药物包括疫苗。
优选地，所述病毒包括水产病毒。
优选地，所述水产病毒包括大口黑虹彩病毒(LMBV)、传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)、大口黑鲈鱼弹状病毒(MSRV)中的至少一种。
本发明第一方面所述的细胞系在以下至少一项中的应用：
(1)表达外源蛋白；
(2)制备表达外源蛋白的产品；
(3)构建细胞库；
(4)作为研究水产动物病毒的宿主细胞；
(5)基因筛选和功能分析。
本发明的第四方面，提供一种培养病毒的方法，将病毒接种至本发明第一方面所述的大口黑鲈吻端细胞系，培养。
优选地，所述病毒包括水产病毒。
优选地，所述水产病毒包括大口黑虹彩病毒(LMBV)、传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)、大口黑鲈鱼弹状病毒(MSRV)中的至少一种。
本发明的第五方面，提供一种制备疫苗的方法，将病毒接种至本发明第一方面所述的大口黑鲈吻端细胞系，培养，灭活，得到病毒疫苗。
优选地，所述病毒包括水产病毒。
优选地，所述水产病毒包括大口黑虹彩病毒(LMBV)、传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)、大口黑鲈鱼弹状病毒(MSRV)中的至少一种。
本发明的第六方面，提供一种疫苗，通过本发明第五方面所述的方法制备得到。
本发明的有益效果是：
本发明首次公开了大口黑鲈吻端细胞系的制备方法，该制备方法简单方便；使用该方法可成功制备大口黑鲈吻端细胞系，名称为YL03-S，保藏编号为CCTCC NO：C2023121；该细胞系的染色体为56条，为永久细胞系，可以无限增殖，并可对其进行冷冻保存；而且YL03-S细胞对大口黑鲈易感的三种病毒(大口黑鲈虹彩病毒LMBV、传染性脾肾坏死病毒ISKNV、大口黑鲈弹状病毒MSRV)均非常敏感，用此细胞系扩增三种病毒的增殖量显著高于大口黑鲈心肌细胞系MSMF，对ISKNV的增殖量均极显著高于鳜鱼脑细胞系CPB，可以用于大口黑鲈易感病毒疫苗的研发中；还可用于表达外源基因进行基因功能的研究；该细胞系的建立在丰富大口黑鲈细胞库的同时可为水产动物病毒性疾病的病原分离、培养、检测提供保障，还可为开展大口黑鲈易感病毒的感染途径、感染机理以及研制病毒疫苗等提供了便利。
附图说明
图1为大口黑鲈吻端细胞(YL03-S)形态观察。其中A为原代细胞；B为第五代YL03-S细胞；C为第30代YL03-S细胞；D为第60代YL03-S细胞。
图2为大口黑鲈吻端细胞(YL03-S)最佳培养条件的确定。其中A为温度优化实验；B为基础培养液优化实验；C为胎牛血清浓度优化实验。
图3为第60代大口黑鲈吻端细胞染色体分析图。其中A为核型分析统计；B为核型分析检测结果。
图4为YL03-S细胞转染外源基因GFP的表达结果。
图5为大口黑鲈吻端细胞系(YL03-S)对三种大口黑鲈易感病毒感染性分析。
其中A为正常YL03-S细胞；B为接种LMBV病毒的YL03-S细胞；C为接种ISKNV病毒的YL03-S细胞；D为接种MSRV病毒的YL03-S细胞；E为感染LMBV病毒的YL03-S细胞电镜切片图；F为E的放大图；G为感染MSRV病毒的YL03-S细胞电镜切片图；H为感染ISKNV病毒的YL03-S细胞电镜切片图；I为H的放大图。
图6为间接免疫荧光检测结果。
A1-C1：对照；A2-C2：感染ISKNV、LMBV、MSRV的YL03-S细胞PI核染结果；A3-C3：感染ISKNV、LMBV、MSRV的YL03-S细胞IFA鉴定结果；A4-C4：感染ISKNV、LMBV、MSRV的YL03-S细胞核染和荧光合并结果。
图7为大口黑鲈吻端细胞系(YL03-S)与鳜鱼脑细胞系CPB和大口黑鲈心肌细胞系MSMF对三种大口黑鲈易感病毒感染性比较；其中A-C分别为ISKNV、LMBV、MSRV。
具体实施方式
以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。
实施例1
1、大口黑鲈—“优鲈3号”吻端细胞原代培养
鲜活“优鲈3号”于75％酒精中浸泡1～2min，置于超净台中无菌取下吻端组织，用PBS漂洗2遍后，置于5mL的无菌青霉素小瓶中(含5％胎牛血清的M199培养液)，用手术剪将其剪成约1mm3碎块，加入5mL PBS收集至15mL离心管，1000rpm离心3分钟，离心收集组织块后弃去上清，重复一次。加入约10倍体积的0.125％胰蛋白酶，4℃过夜消化。去掉消化液，加入约5倍体积的0.1％胶原酶I和0.1％胶原酶VI的混合液(1:1)，37℃下消化10-15min。去掉消化液，PBS洗两次，用200目尼龙纱网过滤至新的一次性培养皿中，加入5mL细胞培养液冲洗纱网再过滤一次，将滤过液收集至15mL离心管中，离心去上清，收集细胞。纱网上的组织块可以再重复消化，过滤。用含20％FBS的L-15完全培养液充分悬浮细胞，均匀接种于25cm2的培养瓶中，培养条件为27℃。吻端细胞迁出后，每隔3～5天换液一次，以去除未贴壁的组织和死细胞；细胞在完全培养液中生长状态良好，增殖明显；
完全培养基配方：20％胎牛血清、20ng/L碱性成纤维样生长因子(bFGF)、1ng/mL的表皮生长因子(EGF)、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素、0.25μg/mL两性霉素B，PH值为7.2-7.4的L-15培养液。
2、传代培养
当细胞长满培养瓶底时，用吸管除去旧培养液，PBS洗两次，用0.25％胰酶-EDTA将细胞消化至细胞变圆时，吸弃胰酶，加入新鲜培养基终止消化。用吸管轻吹后收集悬浮细胞，以1：2的比率接种于培养瓶内，加入完全培养液至5mL/瓶，放入27℃培养箱中进行传代培养；待吻端细胞再次长成单层时，仍以上述相同方法传代培养。现已传至60代，传代比率为1：3；命名为大口黑鲈“优鲈3号”吻端细胞系YL03-S(Micropterus salmoides snoutcell,YL03-S)，其形态图见图1，于2023年5月30日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为：中国.武汉.武汉大学；保藏编号为CCTCC NO：C2023121。
3、YL03-S细胞的冻存与复苏
3.1细胞冻存：用胰酶消化法收集1瓶处于对数生长期、细胞密度90％以上的大口黑鲈吻端细胞，1000g离心5min后弃去上清，用1mL冻存保护液(含20％FBS和10％DMSO的M199培养液)将细胞重悬后置于冻存管中，将冻存管置于程序降温盒中于-70℃过夜，最后投入液氮(-196℃)中长期保存，并做好记录。
3.2细胞的复苏：自液氮中取出保存的冻存管，迅速置于40℃水浴中融化，1000g离心5min，弃掉上清液，加入培养液5mL清洗细胞，1000r/min离心5min，以除去残留的冻存保护液。收集细胞后接种于25cm2的培养瓶中，放入27℃，5％CO2培养箱中进行培养，培养24h后更换培养液，继续培养。
4、YL03-S的培养条件研究
4.1YL03-S最佳培养基的确定
选择DMEM、M199、MEM、L-15四种细胞培养基，并添加终浓度为10％的FBS制备细胞培养液。调整细胞密度为4×105mL-1，四种培养基各按2.5mL/孔的量接种于6孔板，于27℃的培养箱中培养。每1d从每个实验组里取出3孔细胞，用Trypsin-EDTA消化法收集细胞并计数，共培养7d，连续计数7次，绘制其生长曲线。
4.2YL03-S最适血清浓度的确定
分别配制FBS浓度为5％、10％、15％、20％的培养液，调整细胞密度为4×105mL-1，四种血清浓度培养基各按2.5mL/孔的量接种于6孔板，于27℃的培养箱中培养。每1d从每个实验组里取出3孔细胞，用Trypsin-EDTA消化法收集细胞并计数，共培养7d，连续计数7次，绘制其生长曲线。
4.3YL03-S最适培养温度的确定
选择15℃、22℃、27℃、32℃四个不同培养温度，使用添加10％FBS的DMEM培养液，调整细胞密度为4×105mL-1，细胞悬液按2.5mL/孔的量接种于6孔板并置于于四个不同培养温度培养箱里。每1d从每个实验组里取出3孔细胞，用Trypsin-EDTA消化法收集细胞并计数，共培养7d，连续计数7次，绘制其生长曲线。
根据统计结果图2可以看出，YL03-S细胞最佳培养条件为，27℃条件下，含10％胎牛血清的L-15/或M199完全培养基。
5、YL03-S细胞染色体测定
第60代YL03-S于对数生长期加入终浓度为5μg/mL的秋水仙素，27℃处理4h后收集细胞，用0.075mol/L的KCl低渗处理25min，加入1mL预冷的卡诺固定液，1000r/min离心5min去上清后，用预冷的卡诺固定液固定3次，每次15min。冷滴片法滴片，干燥后，用5％的Giemsa染色25min。镜检，分别选择100个分裂相进行核型分析和统计。结果显示(图3)，第60代的大口黑鲈吻端细胞43％的染色体为2n＝56，正常大口黑鲈体细胞染色体为2n＝48。这预示该细胞已经发生突变，为永久细胞系，可以无限增殖。
6、pEGFP-N1质粒稳定转染细胞
转染采用的质粒是带有绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的pEGFP-N1质粒(Clontech,美国)。取第60代细胞，均匀的接种到12孔板中，接种密度为4×105个/mL。细胞贴壁生长到对数期后，用PBS冲洗3遍，按转染试剂盒说明书操作，进行转染。27℃培养箱中继续培养，4～5h后，将转染试剂吸弃换成L-15 10％FBS完全培养液。24h后倒置荧光显微镜下观察荧光表达情况(图4)，说明YL03-S可以用于外源基因的表达。
实施例2YL03-S对三种大口黑鲈易感病毒感染性分析
以第60代YL03-S为对象，检测细胞对大口黑鲈虹彩病毒(LMBV)、传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)、大口黑鲈弹状病毒(MSRV)的敏感程度。细胞接种24小时后，分别将病毒拷贝为103copies/uL三种病毒溶液加入细胞培养瓶中，孵育1-1.5h后，去除病毒溶液，更换细胞维持液，27℃继续培养，约2天后，LMBV开始出现细胞病变效应(CPE)，ISKNV和MSRV在接种病毒后第3天出现CPE，将接种三种病毒的YL03-S细胞做电镜切片观察。透射电镜结果显示，在YL03-S细胞中均观察到三种病毒典型的病毒粒子(图5)；说明YL03-S对LMBV、ISKNV和MSRV均非常敏感。
实施例3间接免疫荧光鉴定病毒感染YL03-S
接种YL03-S细胞至48孔板中，待细胞长至90％时，每孔分别加入病毒拷贝为103copies/μL三种病毒液(LMBV、ISKNV和MSRV)各100μL，每种病毒液分别加6个孔，阴性对照加PBS，在27℃培养箱中孵育1.5h，吸弃病毒液和PBS，加入3％FBS的培养基，27℃培养箱中培养，直至出现典型CPE；除去培养液，加入预冷的(-20℃)甲醇：丙酮(1:1)混合液，在室温下固定10min，用PBS洗3次；加入0.5％Triton进行透化处理10min，用PBS洗3次；加5％脱脂奶粉37℃封闭1h，用PBS洗3次；分别加入鼠抗LMBV、鼠抗ISKNV和鼠抗MSRV作为一抗，37℃孵育1h，用PBS洗3次；加入异硫氰酸荧光素(FITC)标记的羊抗鼠二抗，37℃孵育1h，用PBS洗3次；PI染核后，倒置荧光显微镜下观察，结果见图6，进一步说明了LMBV、ISKNV和MSRV可以感染YL03-S。
实施例4比较三种大口黑鲈易感病毒在不同细胞中增殖量
将103copies/uL浓度的LMBV、ISKNV和MSRV病毒接种于YL03-S和鳜鱼脑细胞系CPB及大口黑鲈心肌细胞系MSMF，5d后，提取病毒核酸，用FQ-PCR方法检测病毒含量，并对各细胞中同一毒株的病毒增殖量进行显著性分析，如图7和表1，结果显示，对三种病毒增殖最多的细胞是YL03-S，极显著高于大口黑鲈心肌细胞系MSMF(p＜0.01)，对ISKNV的增殖量均极显著高于鳜鱼脑细胞系CPB(p＜0.01)。
表1三种病毒在不同细胞中病毒增殖量
(注：本表中所有的数据分析P<0.01)。
上述具体实施方式对本发明作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

Claims (7)

1.一种大口黑鲈吻端细胞系，所述细胞系的保藏编号为C2023121。
2.权利要求1所述的细胞系在以下至少一项中的应用：
（1）培养病毒；
（2）制备培养病毒的产品；
（3）分离病毒；
（4）制备分离病毒的产品；
（5）非诊断治疗目的的检测病毒；
（6）制备检测病毒的产品；
所述病毒为水产动物病毒；
所述水产动物病毒为大口黑鲈虹彩病毒、传染性脾肾坏死病毒、大口黑鲈弹状病毒中的至少一种。
3.权利要求1所述的细胞系在制备药物中的应用，所述药物为用于预防和/或治疗病毒感染所致的疾病的药物；所述病毒为水产动物病毒，所述水产动物病毒为大口黑鲈虹彩病毒、传染性脾肾坏死病毒、大口黑鲈弹状病毒中的至少一种。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述药物包括疫苗。
5.权利要求1所述的细胞系在以下至少一项中的应用：
（1）表达外源蛋白；
（2）制备表达外源蛋白的产品；
（3）构建细胞库；
（4）作为研究水产动物病毒的宿主细胞；
（5）基因筛选和功能分析。
6.一种培养病毒的方法，将病毒接种至权利要求1所述的大口黑鲈吻端细胞系，培养，所述病毒为水产动物病毒。
7.一种制备疫苗的方法，将病毒接种至权利要求1所述的大口黑鲈吻端细胞系，培养，灭活，得到疫苗，所述病毒为水产动物病毒，所述水产动物病毒为大口黑鲈虹彩病毒、传染性脾肾坏死病毒、大口黑鲈弹状病毒中的至少一种。
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