CN112410290B - 一种大口黑鲈心肌成纤维细胞系及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物技术领域，特别涉及一种大口黑鲈心肌成纤维细胞系及应用。本发明针对大口黑鲈心脏组织细胞的特征，采用胶原酶I和胰酶联合消化法分离脑组织细胞，进行原代培养，继而成功构建了大口黑鲈心肌成纤维细胞系，已连续传至60代以上，可提供大量的大口黑鲈心脏来源细胞，且细胞能维持良好的生长状态，可以对其进行冷冻保存。大口黑鲈心肌成纤维细胞系对多种鱼类病毒具有敏感性，接毒后均出现细胞病变，可以直接应用于病原特性研究及疫苗研制，而且大口黑鲈心肌成纤维细胞系还可用于表达外源基因进行基因功能研究。

Description

一种大口黑鲈心肌成纤维细胞系及应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，特别涉及一种大口黑鲈心肌成纤维细胞系及应用。
背景技术
加州鲈学名大口黑鲈(large mouth bass,Micropterus salmoides)，隶属鲈形目(Perciformes)、太阳鱼科(Ceutrarchidae)、黑鲈属(Micropterus)，原产美国加利福尼亚州，为典型的肉食性淡水鱼类，是美国最重要的游钓鱼类之一。我国于20世纪80年代从国外引进，通过试养证明，该鱼具有生长快、病害少、耐低温、肉多刺少、味道鲜美、营养丰富等优点，已成为我国淡水养殖的主要鱼类品种之一,近年来更是被誉为“第五大家鱼”。加州鲈在我国大部分水域单养、混养都能获得高产高效，市场每千克售价都在25元以上，养殖经济效益较高，是调整淡水养殖结构、发展优质高产高效渔业的一个重要养殖对象。但是随着养殖密度的不断增加、水体环境恶化以及病原微生物的传播，加州鲈病害相关的报道越来越多，发病越来越严重，包括种类越来越多样的细菌病和病毒病。其中各种病毒病对大口黑鲈苗种和养殖危害最大，如虹彩病毒科(Iridoviridae)蛙病毒属(Ranavims)的大口黑鲈病毒(Large mouth Bass Vims，LMBV)、大口黑鲈溃疡病病毒(Large mouth Bass ulcerativedisease Vims，LMBUV)，虹彩病毒科细胞肿大病毒属(Megalocytivims)的传染性脾肾坏死病毒(Infectious spleen andKidney Necrosis Virus，ISKNV)，弹状病毒科(Rhabdoviridae)水泡病毒属(Vesiculovirus)的加州鲈弹状病毒(Large mouth bassrhabdovirus，LMBRV)以及神经坏死病毒(Nervous necrosis vims，NNV)等，这些病毒病虽然发病季节各不相同，但病毒病在全年都会发生，可感染鱼苗、幼鱼和成鱼，有时致死率最高可达90％以上，可通过水源、鱼卵、饵料鱼等进行水平传播，同时也存在通过亲鱼进行垂直传播的可能。
各种病害的频繁爆发，制约了大口黑鲈养殖业快速的发展和推广。尤其是各种病毒性疾病，严重影响了大口黑鲈养殖产业的发展，鱼类细胞系在鱼类病毒学研究中具有非常大的应用价值，是鱼类病毒学研究的重要工具和材料。鱼类细胞系可以用于病毒分离和鉴定，而且比活鱼实验更加便捷、经济，对于在体外研究病毒感染鱼体过程、病毒致病机理以及研制相应的诊断技术、抗病毒药物和疫苗有非常大的帮助。此外，细胞系还是进行基因功能分析的理想材料，而对鱼类免疫基因功能的发掘意义重大。鱼类是特异性免疫系统和非特异性系统并存的脊椎动物，在鱼类对外界刺激及病原生物侵袭的防御反应中，非特异性免疫起着重要作用。鱼类原代细胞系的建立目前是一种较为成熟的技术，但是要获得一株对病毒敏感的细胞系，具有偶然性和困难性，建立一株需要鱼类细胞系有效的途径是以数量对质量，即制备大批量的原代细胞系，从而筛选出敏感的细胞系。
目前还未见大口黑鲈的细胞系建立的相关报道，不同的病毒敏感细胞系是不一样的，目前对大口黑鲈危害较大的病毒包括虹彩病毒肿大属和虹彩病毒蛙病毒属、弹状病毒、神经坏死病毒等，常用来分离这些病毒的细胞主要是鲤鱼上皮细胞(EPC)，胖头鱥肌肉细胞系 (FHM)等种属差异较大的鱼类细胞系，虽然鲈鱼源的一些病毒可以在这些细胞上复制并产生CPE，但是敏感性不够，病毒滴度不高，这对于病毒的分离、鉴定、病原学研究及疫苗开发都及其不利；此外，中国水产科学研究院珠江水产研究所和中山大学分别建立了鳜鱼脑组织细胞系(CPB)和鳜鱼仔鱼细胞系(MFF-1)，这两种细胞均显示对鲈鱼源的几种主要病毒较为敏感。但由于CPB和MFF-1当时建立的目的都是用于鳜鱼病毒性疾病的疫苗开发，其它鱼来源的细胞系对于鲈鱼来说也是一种外源物质，所以用其它来源的细胞系来生产疫苗，会产生非特异性免疫应答，从而影响疫苗的免疫效果，所以疫苗研究和生产的时候都尽量用来自本宿主的细胞系。截止目前为止，仍未见大口黑鲈心肌成纤维细胞系的报道，本发明建立的大口黑鲈心肌成纤维细胞系的建立为后期建立鲈鱼其他组织细胞系和进行病毒研究奠定扎实的基础。
发明内容
本发明的目的在于提供一种大口黑鲈心肌成纤维细胞系(MSMF)，所述细胞系的保藏编号为CCTCC NO:C2020211。
本发明的另一个目的在于提供了大口黑鲈心肌成纤维细胞系的培养方法。
本发明的最后一个目的在于提供了大口黑鲈心肌成纤维细胞系的应用。
为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：
一种大口黑鲈心肌成纤维细胞系的获得：
将大口黑鲈心脏肌肉组织放入胶原酶I消化，再加入胰酶消化，加入M199细胞培养液培养，放入胰酶中进行消化，收集消化后的细胞进行原代培养和传代培养，通过对稳定性、不同水生动物病毒的敏感性进行筛选，最终获得了一个大口黑鲈心肌成纤维细胞系，该细胞系已于2020年10月23日保存于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:C2020211，分类命名：鲈鱼心脏成纤维细胞MSMF，地点：中国武汉武汉大学。
一种大口黑鲈心肌成纤维细胞系的培养方法，包括：在含有10-20％胎牛血清的M199 或L-15培养基中，26-28℃培养。
大口黑鲈心肌成纤维细胞系的应用，包括利用该细胞系用于不同病毒的培养、检测、或制备成药物筛选模型，所述病毒为所述的病毒为传染性脾肾坏死病毒(Infectionspleen and kidney necrosis)、大口黑鲈虹彩病毒(Largemouth bass ranavirus，)大口黑鲈鱼弹状病毒 (Micropterus salmoides，rhabdovirus)、鳜鱼弹状病毒(Sinipercachuatsi rhabdovirus)、基因I型草鱼呼肠孤病毒(Grass carp reovirus genotype I)或鲤春病毒血症病毒(Spring viremia of carp virus)；或是用于表达外源蛋白。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
本发明大口黑鲈心肌成纤维细胞系首次在体外成功培养，采用胰酶和胶原酶共同消化分离心脏肌肉组织细胞，培养7天时，明显出现延伸生长；12天后铺满培养皿，进行消化后，具有较强的繁殖能力，呈现典型的成纤维细胞形态；细胞连续传代培养8个月已传至50代，仍然保持成纤维细胞形态特点、生长特性；甚至连续培养60代仍保持较强的生长特性和增殖特性，可提供大量的大口黑鲈来源细胞。
本发明细胞系特性稳定，目前传至60代，且细胞能维持良好的生长状态，可以对其进行冷冻保存。本发明大口黑鲈心肌成纤维细胞系对多种鱼类病毒具有敏感性，接毒后均出现细胞病变，可以直接应用于病原研究。
附图说明
图1为相差显微镜下的大口黑鲈心肌成纤维细胞系的形态；
其中：A为大口黑鲈心肌成纤维原代细胞；B为20代大口黑鲈心肌成纤维细胞；C为50代大口黑鲈心肌成纤维细胞；D为60代大口黑鲈心肌成纤维细胞。
图2为大口黑鲈心肌成纤维细胞系的最适培养条件筛选示意图；
A为培养基筛选：B为血清浓度优化；C为培养温度优化。
图3为大口黑鲈心肌成纤维细胞染色体示意图；
其中A为大口黑鲈心肌成纤维原代细胞染色体；B为大口黑鲈心肌成纤维细胞P50代染色体；
图4为大口黑鲈心肌成纤维细胞P50代染色体核型分布图。
图5为大口黑鲈心肌成纤维细胞病毒敏感性示意图。
其中NC为未感染病毒的空白对照；NNV为神经坏死病毒；SCRV为鳜鱼弹状病毒；SMRV为大口黑鲈鱼弹状病毒；ISKNV为传染性脾肾坏死病；LBMV为大口黑鲈虹彩病毒；GCRV-Ⅰ为基因I型草鱼呼肠孤病毒；SVCV为鲤春病毒血症病毒。
图6为大口黑鲈心肌成纤维细胞的病毒感染PCR电泳图；
其中泳道M：DNA分子量标准；泳道ISKNV：感染ISKNV的MSMF细胞；泳道LBMV：感染LBMV的MSMF细胞；泳道SCRV：感染SCRV的MSMF细胞；泳道SMRV：感染SMRV的MSMF细胞；泳道SVCV：感染SVCV的MSMF细胞；泳道NNV：感染NNV的 MSMF细胞；泳道GCRV-I：感染基因I型GCRV的MSMF细胞；泳道NC为未感染病毒的 MSMF细胞空白对照(加PBS组)。
图7为MSMF细胞转染外源基因GFP的表达结果；
其中A为未转染外源基因的MSMF细胞空白对照，B为转染GFP的MSMF细胞。
具体实施方式
本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案；所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。
实施例1：
大口黑鲈心肌成纤维细胞系的获得：
1)实验材料和试剂：
实验动物：15g-20g的大口黑鲈(经过反复鉴定未感染常见病原菌和病毒的健康大口黑鲈)。
实验器具：解剖刀、眼科剪刀、眼科镊子和纱布等。
2)培养基和相关试剂
青霉素-链霉素-两性霉素B三抗溶液浓度为10000u/ml；
培养基：含有浓度为100U/ml青霉素-链霉素-两性霉素B三抗和20﹪胎牛血清(Gibco 公司)的M199培养基(gibco公司)；
胰酶消化液：磷酸氢二钠2.3g，磷酸二氢钾0.1g，氯化钠8.0g，氯化钾0.2g，
EDTA 0.2g，胰酶0.6g，水1000ml；医用酒精；
0.01M的PBS缓冲液(NaCl 80g，Na2HPO4·12H2O 29g，KH2PO4 2g，KCl 25 2g，水1000ml)。
检测健康的大口黑鲈，在实验室内暂养14天，无其他疾病，开始实验。
3)细胞系的构建和筛选
(1)取大口黑鲈在医用酒精中浸泡5min，在无菌条件下，分别剪取大口黑鲈的肝脏、肾脏、脾脏、脑、肠道、肌肉、尾鳍、心脏、吻端和鱼鳔组织，将大口黑鲈剪碎的无菌的各组织器官分别放入浓度为200u/ml的青霉素-链霉素-两性霉素B三抗溶液中泡5min；
(2)剪成小块(约1mm3)，然后0.1％的胶原酶I消化10-15min，用培养基重悬，离心，弃掉上清液，加0.25％胰酶消化液，消化10-15min，离心去上清，最后加入原代细胞培养液，重悬混匀成细胞悬液；
(3)将细胞悬液移入培养瓶，放入到28℃培养箱中培养；
(4)待培养2天后观察细胞贴壁情况，适当加入原代细胞培养液(保证培养液pH7.2-7.6)。待细胞铺板到1/3的时候(3～4天)，更换新鲜的培养液一次；
(5)待细胞铺满培养皿底(6-7天)，用胰酶消化液初步消化细胞后，将消化的细胞放入原代细胞培养液进行传代培养，传代比率为1:1-1:2；原代细胞培养液：包括终浓度为100 u/ml的青霉素-链霉素-两性霉素B三抗溶液，20﹪胎牛血清的M199培养基，pH为7.2～7.6。
传代的细胞每隔3代均冻存保留，同时每代细胞分为多批次进行传代并进行冻存；对能持续往下传代的细胞，每各5代分别接种神经坏死病毒(NNV)、鳜鱼弹状病毒(SCRV)、大口黑鲈弹状病毒(MSRV)、传染性脾肾坏死病病毒(ISKNV)、大口黑鲈虹彩病毒(LBMV)、基因I型草鱼呼肠孤病毒(GCRV-Ⅰ)和鲤春病毒血症病毒(SVCV)的测试各种细胞不同代次的敏感性，通过观察细胞CPE产生情况及qPCR测试各种病毒的含量来确定其敏感性。最后能持续往下传代20代以上的细胞只有心肌成纤维细胞、尾鳍细胞和脑细胞，且这3种细胞在传至第30代之后，其细胞形态、大小及生长速度均比较稳定，其中心肌成纤维细胞的生长速度最快，平均每2天就可以按1:4的比例传代一次，而尾鳍细胞和脑细胞则需要3-4 天以1:3的比例传代一次。心肌成纤维细胞、尾鳍细胞和脑细胞分别感染SCRV、MSRV、 ISKNV、LBMV、GCRV-Ⅰ和SVCV均可产生明显的CPE，而感染NNV都不能产生CPE，但NNV能在心脏细胞和脑细胞中复制增值，而不能在尾鳍细胞中复制。其中GCRV-Ⅰ和 SVCV在心肌成纤维细胞和脑细胞中的增值能力差不多，其病毒滴度均可达到 2.0×108TCID50/mL，SCRV、MSRV、ISKNV和LBMV在不同代次和批次的心肌成纤维细胞中的病毒滴度在1.0×107-1.0×109TCID50/mL之间，而在不同代次尾鳍细胞和脑细胞中的病毒滴度在1.0×105-1.0×108TCID50/mL之间。可见，心肌成纤维细胞对所分析的几种水生动物病毒的敏感性最高，同时还发现，即便同属于心肌成纤维细胞，其敏感度还因不同批次而异；申请人最终选择心肌成纤维细胞进行持续传代，并且持续选择传代最为稳定和敏感度最高的批次进行传代和纯化，最终获得的细胞系上述病毒的滴度均可维持在108-109 TCID50/mL。
通过持续的传代和病毒敏感性试验最终获得了一株对多种水生动物病毒较为敏感、传代稳定的大口黑鲈心肌成纤维细胞系，细胞连续传代培养8个月已传至50代，仍然保持成纤维细胞形态特点、生长特性；甚至连续培养60代仍保持较强的生长特性和增殖特性，可提供大量的大口黑鲈来源细胞。
该细胞系的第40代已于2020年10月23日保存于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:C2020211，分类命名：鲈鱼心脏成纤维细胞MSMF，地点：中国武汉武汉大学。本发明将该细胞系称为大口黑鲈心肌成纤维系或MSMF细胞。
细胞形态：图1为相差显微镜下的不同代数的大口黑鲈心肌成纤维细胞的形态示意图，该细胞系呈现典型的成纤维样细胞形态，具备悬浮特性，细胞均一性好，直径大多为10-18 微米。
第50代大口黑鲈心肌成纤维细胞于对数生长期加入终浓度为8μg/mL的秋水仙素，27℃处理16h后收集细胞，用0.075mol/L的KCl低渗处理20min，加入1mL预冷的卡诺固定液，1000r/min离心5min去上清后，用预冷的卡诺固定液固定3次，每次15min。冷滴片法滴片，干燥后，用5％的Giemsa染色25min。镜检，分别选择100个分裂相进行核型分析和统计。
结果显示(图4)，第50代的大口黑鲈心肌成纤维细胞43％的染色体为2n＝64，而大口黑鲈体细胞的染色体为2n＝46。
4)大口黑鲈心肌成纤维系的传代培养和冻存保种
胰酶消化液：磷酸氢二钠2.3g，磷酸二氢钾0.1g，氯化钠8.0g，氯化钾0.2g，
EDTA 0.2g，胰酶0.6g，水1000ml。
冻存液：含10﹪DMSO、25﹪的胎牛血清的M199培养基。
待细胞生长至90﹪时，弃掉旧的培养基，加入0.5ml胰酶消化液进行消化；待细胞邹缩变圆并从瓶壁上脱落时，加入2ml的MSMF细胞培养液，以终止胰酶的作用，轻轻晃动，使细胞混匀，计数。1000rpm，离心5min，去除培养液，加入1.5ml细胞冻存液，重悬细胞。收集细胞到冻存管中，于冻存管上注明细胞的名称、细胞数和冻存日期。
一个月后，按照常规细胞复苏的方法，进行细胞复苏，细胞增殖能力仍然很强，状态良好。
实施例2：
大口黑鲈心肌成纤维细胞系培养方法：
1)试剂
胰酶消化液：磷酸氢二钠2.3g，磷酸二氢钾0.1g，氯化钠8.0g，氯化钾0.2g，EDTA0.2g，胰酶0.6g，水1000ml。
培养基：不同浓度的胎牛血清的M199、DMEM、MEM、L-15培养基。
2)实验方法
1大口黑鲈心肌成纤维细胞最佳培养基的确定
选择DMEM、M199、MEM、L-15四种细胞培养基，并添加终浓度为10％的FBS制备细胞培养液。调整细胞密度为3×105mL-1，四种培养基各按2.5mL/孔的量接种于6孔板，于27℃的培养箱中培养。每1天从每个实验组里取出3孔细胞，用Trypsin-EDTA消化法收集细胞并计数，共培养7天，连续计数7次，绘制其生长曲线。
结果：确定大口黑鲈心肌成纤维细胞的最适培养基为M199或L-15培养基(图3中A)。
M199培养基，根据Medium 199培养基(含Earle’s平衡盐溶液)说明书要求，在容器中加入1L水，并将容器放到磁力搅拌器上，边搅拌便加入Medium 199培养基(含Earle’s 平衡盐溶液)干粉。当充分搅匀和溶解后，加入10％的胎牛血清。用粉状NaHCO3调节培养液的pH至7.2～7.6。尽快过滤除菌，分装后，-20℃保存。
L-15培养基，根据Leibovitz's L-15培养基(含L-谷氨酰胺)说明书要求，在容器中加入1L水，并将容器放到磁力搅拌器上，边搅拌便加入L-15培养基(含L-谷氨酰胺)干粉。当充分搅匀和溶解后，加入10％的胎牛血清。用粉状NaHCO3调节培养液的pH至7.2～7.6。尽快过滤除菌，分装后，-20℃保存。
2大口黑鲈心肌成纤维细胞最适血清浓度的确定
分别配制含有胎牛血清FBS浓度为5％、10％、15％、20％的培养液。调整细胞密度为 2×105mL-1。将四种血清浓度培养基各按2.5mL/孔的量接种于6孔板，于27℃的培养箱中培养。每1天从每个实验组里取出3孔细胞，用Trypsin-EDTA消化法收集细胞并计数，共培养7天，连续计数7次，绘制其生长曲线。
结果：发现FBS浓度为10％～20％均适合大口黑鲈心肌成纤维细胞的培养(图3中B)。
3大口黑鲈心肌成纤维细胞最适培养温度的确定
选择15℃、22℃、28℃、32℃四个不同培养温度，使用添加10％FBS的M199培养液，调整细胞密度为2×105mL-1，细胞悬液按2.5mL/孔的量接种于6孔板并置于于四个不同培养温度培养箱里。每1d从每个实验组里取出3孔细胞，用Trypsin-EDTA消化法收集细胞并计数，共培养7天，连续计数7次，绘制其生长曲线，发现22℃、28℃均适合罗非鱼脑细胞的培养(图3中C)。收集细胞并计数，共培养7天，连续计数7次，绘制其生长曲线。
实验结果：大口黑鲈心肌成纤维细胞最适培养条件为：在含有10％胎牛血清的M199 培养基中，28℃下培养。
实施例3：
大口黑鲈心肌成纤维细胞系对不同水生动物病毒的感染实验
将生长状况良好的一瓶大口黑鲈心肌成纤维细胞进行传代，传代比率为1:6，充分混匀后分装至六个25cm2细胞培养瓶中，当细胞刚刚长满培养瓶底部时，也就是铺满瓶底80-90％时，吸弃培养基，HBSS缓冲液清洗两次，分别接入1mL稀释好的鱼类病毒，感染复数MOI 为6。
感染的鱼类病毒分别为：大口黑鲈弹状病毒(Micropterus SalmoidesRhabdovirus,MSRV)、鳜鱼弹状病毒(Siniperca Chuatsi Rhabdovirus,SCRV)大口黑鲈虹彩病毒(largemouthbass ranavirus,LMBV)，传染性脾肾坏死病毒(Infectious spleenand kidney necrosis virus,ISKNV)、神经坏死病毒(Nervous Necrosis Virus，NNV)基因I型草鱼呼肠孤病毒(Grass Carp Reovirus, GCRV)，鲤春病毒血症病毒(Spring viremiaof carp virus,SVCV)。PBS作为空白对照组，根据培养温度不同，分别设立空白对照。
病毒孵育1h后，弃病毒液，加入5mL细胞维持液(含5％FBS的M199培养基)，接入SVCV的细胞培养瓶置于22℃恒温培养箱，接入另外5种病毒的细胞瓶放置28℃的培养箱。空白对照放置28℃培养。每天观察细胞生长以及细胞病变效应CPE，一旦出现CPE病变，在细胞未完全脱落之前收集细胞悬液，并进行RNA或DNA提取，然后进行PCR或 RT-PCR检测。未出现病变的接毒组盲传3代后，收集样本进行PCR或RT-PCR实验，通过检测病毒转录本分析病毒是否在MSMF细胞中增殖。
收集样本时将培养瓶取出，放置于-20℃冰箱过夜，后取出待培养基融化后，用力敲打培养瓶，使细胞完全脱落。吹打混匀冻融后，取出200μL细胞悬液于离心管中进行RNA或DNA提取并进行PCR检测。琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物。
结果：MSMF细胞分别接种6种水生动物病毒后，如图5。除NNV外，其它5种病毒在细胞内出现明显的细胞病变(CPE)。在接种第5天收集各病毒悬液200μL提取RNA 或DNA。根据PCR及凝胶电泳实验结果，接种不同种病毒的细胞中，均可检测到目的条带 (图6)，说明大口黑鲈心肌成纤维细胞系能够增殖以下病毒SMRV、LBMV、ISKNV、GCRV、 SVCV、NNV，为水生动物的研究提供了有力的材料。
实施例4：
细胞色素B和细胞色素C氧化酶Ⅰ基因测序和比对分析
取适量第30代SMSF细胞，参照Tissue DNA Kit试剂盒的操作说明，提取细胞的基因组DNA。引物设计参考Hebert等(2003)线粒体基因组DNA COⅠ(cytochrome oxidasesubunitⅠ,COⅠ)基因引物和细胞色素B(cytochrome b,Cyb)基因引物，引物序列分别如下：COⅠF1： 5'-CACAAAGACATTGGCACCCT-3'；COⅠR1：5'-CCTCCTGCAGGGTCAAAGAA-3'；Cyb-F： 5'CCG CCT TCT CAT CCG T 3'，Cyb-R:5'AAT TGA GGC GAG TAG GGC TAA 3'。将提取的基因组DNA 4℃保存备用。PCR反应体系总体积为50μL，其中上、下游引物(10mg/mL) 各2μL，模板DNA(70.5ng/μL)2μL，2×TaqMaster Mix 25μL，加RNA-Free水至50μL。 PCR反应条件为：94℃预变性3min；，然后35个循环包括：94℃变性1min，57℃退火 1min，72℃延伸1min；最后在72℃延伸10min。取2μL PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测(U＝5V/cm)。PCR产物送上海生工生物公司测序，待测序结果返回后通过NCBI 的BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov)。通过对SMSF细胞测序所得到的序列与大口黑鲈 Cyb序列(GenBank No.HM070910.1)和线粒体COⅠ序列(GenBank No.KU1944290.1)进行比对，发现序列的同源性在99％以上，结果说明SMSF细胞系的来源是大口黑鲈。
实施例5：
MSMF细胞可通过转染表达外源基因：
将第50代MSMF细胞以5×105/孔的初始密度接种在6孔培养板中，24h后吸弃旧培养基，PBS清洗一遍，每孔加入2mL含10％FBS的无双抗(青链霉素混合液)的M199培养基。用250μL Opti-MEM(Gibco,美国)分别稀释10μL脂质体LipofectamineTM2000 (Invitrogen,美国)和5μg含有增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein，EGFP) 的pEGFP-N3质粒，5min后将两者混匀，孵育20min后加入到6孔培养板一孔中，28℃培养6h后更换为M199培养基，继续培养24～72h，倒置荧光显微镜下观察荧光的表达情况。通过脂质体法(LipofectamineTM 2000)将pEGFP-N3质粒成功转入MSMF细胞中。结果显示，在转染后48h后观察到荧光信号(图7)，转染效率约为20％，证明MSMF细胞系有表达外源基因的能力，这对于基因分析以及病毒蛋白在细胞内的表达、定位和相互作用研究有重要的价值。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 广东富伦德生物科技有限公司
<120> 一种大口黑鲈心肌成纤维细胞系及应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cacaaagaca ttggcaccct 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cctcctgcag ggtcaaagaa 20
<210> 3
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ccgccttctc atccgt 16
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
aattgaggcg agtagggcta a 21

Claims (6)

1.一种大口黑鲈心肌成纤维细胞系，所述细胞系的保藏编号为CCTCC NO: C2020211。
2.权利要求1所述的细胞系在培养病毒中的应用；所述的病毒为传染性脾肾坏死病毒（Infection spleen and kidney necrosis）、大口黑鲈虹彩病毒（Largemouth bassranavirus，）大口黑鲈鱼弹状病毒（Micropterus salmoides，rhabdovirus ）、鳜鱼弹状病毒（Siniperca chuatsi rhabdovirus）、基因I型草鱼呼肠孤病毒（Grass carp reovirusgenotype I ）或鲤春病毒血症病毒（Spring viremia of carp virus）。
3.权利要求1所述的细胞系在检测病毒中的应用；所述的病毒为鲈鱼源传染性脾肾坏死病毒、鲈鱼弹状病毒、鲈鱼源蛙虹彩病毒、基因I型草鱼呼肠孤病毒或鲤春病毒病病毒。
4.权利要求1所述的细胞系在制备病毒药物筛选模型中的应用；所述的病毒为鲈鱼源传染性脾肾坏死病毒、鲈鱼弹状病毒、鲈鱼源蛙虹彩病毒、基因I型草鱼呼肠孤病毒或鲤春病毒病病毒。
5.权利要求1所述的细胞系在表达外源蛋白中的应用。
6.权利要求1所述的细胞系的培养方法，包括：在含有10-20%胎牛血清的M199或L-15培养基中，26-28℃培养。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113025574B (zh) * 2021-04-02 2022-07-26 华中农业大学 一种大口黑鲈脑细胞系及其应用
CN113249308B (zh) * 2021-05-14 2022-02-15 中国水产科学研究院南海水产研究所 花鲈动脉球细胞系及其应用和培养方法
CN113804522B (zh) * 2021-08-20 2024-05-28 北京英诺特生物技术股份有限公司 制备细胞基片的方法、制备试剂盒的方法及联检方法
CN113755438B (zh) * 2021-10-11 2023-08-08 浙江省淡水水产研究所 一种鳜鱼脊髓组织细胞系及其构建方法与应用
CN117904032A (zh) * 2024-03-12 2024-04-19 华南农业大学 一株海鲈鳍条细胞系及其应用

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103719071A (zh) * 2012-10-11 2014-04-16 吴江市长漾渔业生态科技发展有限公司 一种大口黑鲈精子超低温冷冻保存及复苏方法
CN105255817A (zh) * 2015-11-12 2016-01-20 中国海洋大学 一种大菱鲆肝脏组织细胞体外构建方法及其应用
CN110295137A (zh) * 2019-07-11 2019-10-01 中国水产科学研究院珠江水产研究所 一种乌斑鳢肾细胞系及其构建方法和应用
CN110551689A (zh) * 2019-08-13 2019-12-10 中国水产科学研究院珠江水产研究所 一种乌斑鳢脑细胞系及其构建方法和应用
CN111073983A (zh) * 2020-01-20 2020-04-28 中国水产科学研究院珠江水产研究所 与大口黑鲈北方亚种和佛罗里达亚种鉴定相关的snp标记及其应用

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103719071A (zh) * 2012-10-11 2014-04-16 吴江市长漾渔业生态科技发展有限公司 一种大口黑鲈精子超低温冷冻保存及复苏方法
CN105255817A (zh) * 2015-11-12 2016-01-20 中国海洋大学 一种大菱鲆肝脏组织细胞体外构建方法及其应用
CN110295137A (zh) * 2019-07-11 2019-10-01 中国水产科学研究院珠江水产研究所 一种乌斑鳢肾细胞系及其构建方法和应用
CN110551689A (zh) * 2019-08-13 2019-12-10 中国水产科学研究院珠江水产研究所 一种乌斑鳢脑细胞系及其构建方法和应用
CN111073983A (zh) * 2020-01-20 2020-04-28 中国水产科学研究院珠江水产研究所 与大口黑鲈北方亚种和佛罗里达亚种鉴定相关的snp标记及其应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
一株大口黑鲈(Micropterus salmoides)虹彩病毒(Iridoviridae)的分离及鉴定;许峰;鲁建飞;魏永伟;苗亮;陈炯;;海洋与湖沼(第01期);全文 *
大口黑鲈肝脾肿大病病原研究;马冬梅;邓国成;白俊杰;李胜杰;江小燕;杨小静;;中国水产科学(第03期);全文 *

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