CN105255817A - 一种大菱鲆肝脏组织细胞体外构建方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种大菱鲆肝脏组织细胞体外构建方法及其应用，其特征是以大菱鲆肝脏组织为实验材料，使用Ⅱ型胶原酶酶解法启动鱼类肝脏细胞的原代培养，并在24℃生化培养箱中使用添加有一定浓度胎牛血清和各种生长因子等营养成分的新型L-15复合培养基培养。经脂质体转染发现，本发明所提供的大菱鲆肝脏组织原代培养细胞可被报告质粒如pIRES2-EGFP成功转染。本发明具有方法简便易行、重复性好、成本低和细胞生长迅速的优点，可为鱼类营养代谢的分子细胞生物学研究提供有效的体外细胞模型。

Description

一种大菱鲆肝脏组织细胞体外构建方法及其应用

技术领域

本发明属于细胞培养技术领域，具体涉及一种大菱鲆肝脏组织细胞的体外构建方法及其在鱼类营养代谢的分子细胞生物学研究中的应用。

背景技术

大菱鲆作为一种肉食性鱼类，在人工养殖过程中，其饲料中需要添加鱼油。随着水产饲料工业的迅猛发展，鱼油短缺的问题日益突出。植物油以其稳定的供应量、较高的多不饱和脂肪酸含量和相对低廉的价格成为较理想的替代脂肪源，但植物油替代鱼油的比例过高会影响鱼体的健康和品质。近年来在植物油替代鱼油的研究上已有了一定进展，但在大菱鲆饲料中还未能实现以植物油完全替代鱼油而不影响其代谢和健康。

为进一步阐释植物油替代鱼油影响大菱鲆代谢和免疫的分子机理，亟需构建大菱鲆肝脏细胞体外模型。之前虽有大菱鲆肝脏组织细胞原代培养的报道，但存在重复性差、细胞迁出和生长缓慢的缺点。

发明内容

本发明的目的是构建一种大菱鲆肝脏组织细胞体外构建方法，并将其应用于鱼类营养代谢的分子细胞生物学研究中，从而弥补现有技术的不足。

本发明首先提供一种细胞培养基，是添加有20％的胎牛血清、0.5％补体灭活的花鲈血清、10μg/L的碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、10μg/L表皮样生长因子(EGF)、1mmol/L丙酮酸钠、2mmol/L的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的L-15培养基。

所述的补体灭活的花鲈血清，是对花鲈静脉取血后，将血液经56℃水浴30min后，再经0.22μm过滤除菌制成的；

上述的细胞培养基中还添加有抗生素，作为实施例的优选，为100000IU/L青霉素和100mg/L链霉素。

本发明提供的细胞培养基用于体外培养大菱鲆肝脏组织细胞；

本发明一方面涉及一种大菱鲆肝脏组织原代培养细胞的分离和培养方法，具体是利用Ⅱ型胶原酶消化液处理剪碎的大菱鲆肝脏组织小块获得解离的大菱鲆肝脏组织小块，然后将解离的大菱鲆肝脏组织小块接种到细胞培养瓶中，用上述的细胞培养基培养形成细胞单层。

上述Ⅱ型胶原酶消化液的配制方法：是将Ⅱ型胶原酶溶解于汉克斯平衡盐溶液(HBSS)中制备的；作为实施例的优选，其中Ⅱ型胶原酶质量分数为0.1％的溶液。

上述的细胞培养瓶进行预处理，具体是吸取纤连蛋白溶液加入到细胞培养瓶中，均匀浸润瓶底，然后吸除多余纤连蛋白溶液，用PBS冲洗后，再用上述的细胞培养基冲洗，备用。

上述纤连蛋白溶液是将纤连蛋白溶解于HBSS中制备的。

本发明培养的大菱鲆肝脏组织细胞在鱼类营养代谢的分子细胞生物学研究上的应用。将报告基因表达质粒(如PIRES2-eGFP)转染到体外培养大菱鲆肝脏组织细胞中，可观察到绿色荧光蛋白在细胞中的成功表达，证明所构建的大菱鲆肝脏组织细胞体外模型可用于鱼类营养代谢的分子细胞生物学研究。

本发明优化了培养基的配方，添加了花鲈血清、丙酮酸钠和L-丙氨酰-L-谷氨酰胺，为细胞的迅速、大量迁出提供了更为全面、充足的营养；调整了Ⅱ型胶原酶的配制方法、浓度和酶解时间，既减小了胶原酶对肝脏组织细胞的损伤，同时又充分酶解肝脏组织小块，促进肝脏细胞的迁出。本发明所涉及的大菱鲆肝脏组织细胞体外模型的构建方法，具有简便易行、重复性好、成本低和细胞生长迅速的优点。而且，本发明所提供的大菱鲆肝脏组织原代培养细胞可成功用于报告基因如绿色荧光蛋白基因的脂质体转染，表明该体外细胞模型可用于鱼类营养代谢的分子细胞生物学研究。

附图说明

图1:原代培养48小时、72小时、120小时和7天大菱鲆肝脏组织原代培养细胞的光镜照片，比例尺＝100μm；

图2：报告质粒PIRES2-eGFP转染大菱鲆肝脏组织原代培养细胞的荧光显微镜照片，比例尺＝100μm；

具体实施方式

目前，鱼类肝脏细胞原代培养主要采用组织块和胰酶消化的方法进行，但实验发现，组织块法中的大菱鲆肝脏组织，细胞难以迁出，而0.25％胰酶酶解法中细胞成活率较低。较高浓度和较长作用时间的胶原酶处理，也会损伤大菱鲆肝脏组织细胞。为更好地满足实验要求，本发明调整了大菱鲆肝脏组织细胞原代培养完全培养基的配方，优化了Ⅱ型胶原酶的配制方法、浓度和酶解时间。为更好地解释本发明，以下结合实例进一步阐释本发明的主要内容：

实施例1一种大菱鲆肝脏组织细胞原代培养方法。

步骤如下：

(1)培养基的制备，其步骤如下：

L-15液体培养基购于Sigma公司，100×青链霉素溶液和100×丙酮酸钠溶液购于索莱宝公司，胎牛血清购于Gibco公司，L-丙氨酰-L-谷氨酰胺购于Life公司，生长因子购于Peprotech公司；

花鲈血清的制备方法：2kg左右花鲈尾静脉取血，56℃水浴30min后经0.22μm滤器过滤除菌制成；

生长因子bFGF和EGF溶液的制备：分别溶解于0.1％牛血清白蛋白溶液中，制成10mg/ml的母液，分装后-20℃保存。

基础培养基制备：每100mlL-15液体培养基中，加入100×青链霉素溶液1ml，用高压灭菌过的1M氢氧化钠溶液调节pH到7.4。

完全培养基制备：将占完全培养基总体积20％的胎牛血清、0.5％补体灭活花鲈血清以及终浓度为10μg/L碱性成纤维细胞生长因子、10μg/L表皮样生长因子、1mmol/L丙酮酸钠及2mmol/LL-丙氨酰-L-谷氨酰胺加入到基础培养基中，抽滤除菌，制成大菱鲆肝脏组织细胞完全培养基。

(2)细胞培养瓶的纤连蛋白包被处理，具体步骤：吸取1ml25μg/ml纤连蛋白溶液，加入到T25细胞培养瓶中，均匀浸润瓶底，45min后吸除多余纤连蛋白溶液，备用。

上述25μg/ml纤连蛋白溶液的配制方法为：将1mg纤连蛋白溶解于40mlHBSS中。

(3)原代培养具体步骤包括：

①实验鱼的选取：选取体重约为10g的健康大菱鲆幼鱼；

②实验鱼的暂养：用含1000IU/ml青霉素和1000IU/ml链霉素的无菌海水暂养实验鱼10小时；

③肝脏组织分离：

将实验鱼用抄网捞出，在灭菌培养皿中用碘伏(1％)擦拭三次，后转移至超净台中再用70％酒精擦拭三次；在灭菌纱布上用解剖工具解剖试验鱼并无菌分离肝脏组织；注意，解剖鱼体外表及内脏的解剖工具不能混用，以减少染菌几率。

④肝脏组织的清洗：

将分离得到的肝脏组织用镊子夹取，置于70％酒精中涮洗15s后在装有PBS的青霉素小瓶中涮洗2次，再用基础培养基涮洗2次，最后暂存于完全培养基中；此步骤的目的在于清洗肝脏组织块表面的血渍和其他杂质。

⑤肝脏组织细胞的分离及接种：

用眼科剪将肝脏组织剪成1mm³的组织块，其间不断用基础培养基冲洗，直至澄清；清洗的目的在于去除肝脏中的血细胞和脂肪等杂质。室温下，用Ⅱ型胶原酶消化肝脏组织块10min后500r/min离心5min，加入完全培养基重悬，用一次性巴氏吸管吸取大约0.5ml悬浊液接种于T25细胞培养瓶中，倒置培养于24℃生化培养箱中。

⑥原代培养：接种6小时后，将培养瓶中培养液吸出，加入2.5ml新鲜培养基，正置放于24℃生化培养箱中。培养18小时后吸出培养液及未贴壁组织块，加入新鲜完全培养基5ml，隔天观察细胞贴壁及迁出情况，以后隔天更换完全培养液的1/2。

⑦实验结果：

大菱鲆肝脏组织细胞原代培养启动后48小时，绝大部分组织块贴于瓶底，仅有少量漂浮在培养液中，组织块边缘模糊，有少量梭形细胞迁出(图1A)；原代培养启动后72小时，组织块周围有大量梭形细胞迁出，呈放射状，细胞折光性良好(图1B)；原代培养启动后120小时，组织块体积减小，从组织块迁出的细胞集落相互汇合形成部分单细胞层，细胞形状均一，生长状态良好，汇合率约70％(图1C)；原代培养启动后7天，组织块开始脱落，细胞汇合形成单层，汇合率约100％，使用台盼蓝染色法镜检其存活率≥85％(图1D)。

本实验优化了培养基的配制，发现添加花鲈血清、丙酮酸钠和L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的培养基比不添加上述三种添加物的培养基细胞汇合率达到100％的时间要缩短2-3天。

本实验比较了不同溶液(HBSS和PBS)配制的胶原酶对肝脏组织块消化效果发现：采用HBSS配制的胶原酶效果好于PBS，相同作用时间采用HBSS配制的胶原酶消化效果更佳，原因是HBSS中含有的Na⁺和K⁺有助于胶原酶酶活的发挥。

本实验还比较了胶原酶不同作用时间和浓度对原代培养的影响发现：采用浓度为0.1％，作用时间为10min的效果要好于浓度为0.2％，作用时间为5min，较高浓度和较长时间的胶原酶会对本实施例细胞造成损伤。

此外，本实验对比了本实施例和文献报导的两步酶消化法的区别，证明本本实施例优于其他法，以下是结果：

实施例2：大菱鲆肝脏组织原代培养细胞的报告质粒转染。

大菱鲆肝脏组织细胞原代培养启动后72小时，将PIRES2-eGFP报告质粒转染该体外培养细胞，24小时后，可观察到绿色荧光蛋白的成功表达，证明所构建的大菱鲆肝脏组织细胞的体外模型可用于鱼类的分子细胞生物学研究。

具体步骤：

(1)大菱鲆肝脏组织细胞原代培养，具体步骤如前所述。

(2)原代培养启动后72小时，PIRES2-eGFP报告质粒转染该体外培养细胞。

具体转染包括：

①将大菱鲆肝脏组织细胞以10⁶/孔的密度接种到6孔板中，培养于24℃生化培养箱中，待细胞贴壁稳定后用无血清培养基代替旧的培养基。

②吸取500μl无血清培养基加入5μl(3μg)质粒于1.5ml离心管中，混匀；

③在上述离心管中依次加入PLUS试剂和LTX试剂混匀后分别静置5min和30min；

④在混好的转染试剂逐滴加入到6孔板中；

⑤4小时后加入含有血清的培养基。

(3)24小时后，荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达。

实验结果表明细胞生长状态良好，无明显凋亡现象，通过NikonTS100荧光倒置显微镜下可以观察到绿色荧光蛋白表达发出的荧光，证明PIRES2-eGFP报告质粒成功转染该体外培养细胞(图2)。

Claims (10)

1.一种细胞培养基，其特征在于，所述的培养基是添加有20％的胎牛血清、0.5％补体灭活的花鲈血清、10μg/L的碱性成纤维细胞生长因子、10μg/L表皮样生长因子、1mmol/L丙酮酸钠、2mmol/L的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的L-15培养基。

2.如权利要求1所述的细胞培养基，其特征在于，所述的补体灭活的花鲈血清，是对花鲈静脉取血后，将血液经56℃水浴30min后，再经0.22μm过滤除菌制成的。

3.权利要求1或2所述的细胞培养基，其特征在于，所述的细胞培养基中还添加有抗生素。

4.如权利要求3所述的细胞培养基，其特征在于，所述的抗生素为100000IU/L青霉素和100mg/L链霉素。

5.权利要求1-4任一项所述的细胞培养基在体外培养大菱鲆肝脏组织细胞中的应用。

6.一种大菱鲆肝脏组织原代培养细胞的分离和培养方法，其特征在于，所述的方法是利用Ⅱ型胶原酶消化液处理剪碎的大菱鲆肝脏组织小块获得解离的大菱鲆肝脏组织小块，然后将解离的大菱鲆肝脏组织小块接种到细胞培养瓶中，用权利要求1-4任一项所述的细胞培养基培养形成细胞单层。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的Ⅱ型胶原酶消化液的配制方法：是将Ⅱ型胶原酶溶解于汉克斯平衡盐溶液HBSS中制备的。

8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的细胞培养瓶进行预处理，是吸取纤连蛋白溶液加入到细胞培养瓶中，均匀浸润瓶底，然后吸除多余纤连蛋白溶液，用PBS冲洗后，再用上述的细胞培养基冲洗。

9.一种大菱鲆肝脏组织细胞系，其特征在于，所述的大菱鲆肝脏组织细胞系是用权利要求6-8任一项所述的方法制备的。

10.权利要求9所述的方法在鱼类营养代谢的分子细胞生物学研究上的应用。