CN105779377A - 一种分离鸡胚血来源的原始生殖干细胞的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种分离鸡胚血液来源原始生殖细胞的方法。其在制备微量玻璃针采血装置的基础上，利用玻璃细针虹吸原理快速有效的从血液分离鸡原始生殖细胞。包括以下步骤：微量玻璃针采血装置的制备；14HH鸡胚血液的采集；采集的14HH鸡胚血液置入含有BRL‑3A细胞饲养层和PGCs完全培养液的培养体系中培养，原代培养10‑15d即可纯化细胞；将纯化后PGCs重新置入含有完全培养基的BRL‑3A饲养层细胞上进行体外培养扩增；对体外培养扩增的PGCs进行间接免疫荧光检测，包括SSEA‑1和DAZL表面标记；对体外培养扩增的PGCs进行RT‑PCR鉴定。经鉴定，通过本发明方法获得的细胞为阳性原始生殖细胞，且该细胞具有较好的体外增殖能力。本方明方法具有简便、快速、获取的细胞多等特点。

Description

一种分离鸡胚血来源的原始生殖干细胞的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种分离鸡胚血来源的原始生殖干细胞的方法。

背景技术

鸡原始生殖干细胞(Primordial germ cells,PGCs)是配子的祖先细胞，起源于X期胚盘上胚层，随着原条期的形成，由上胚层中心向下胚层迁移，再迁移到生殖新月区，之后随着鸡胚内血管的发育，进人血管中，并顺着血管分布于胚体的心脏、大血管和头部间充质中，最后迁移到生殖嵴，与生殖嵴共同组成了未分化的性腺。PGCs具有发育的多潜能性，在胚胎发育基础研究、转基因禽类生产、药物筛选、家禽育种等方面具有巨大应用前景。由于禽类在转基因方面具有独特优势，如产蛋可获得大量重组蛋白、性成熟快以及无盶病毒感染危险等，鸡PGCs作为转基因载体而备受关注。鸡PGCs应用的关键是如何更便捷、更大量从鸡胚获得PGCs以及体外培养方法。

在哺乳动物体中PGCs只出现于原肠胚早期。与哺乳动物不同，禽类胚胎中的PGCs经过由血管向性腺迁移，并最终在性腺中转变为精子和卵子。在鸡胚发育的第3d(15HH)前，它们迁移到胚外的生殖新月区，然后开始在接下来的48h内从生殖新月通过血液逐渐聚集到未来的生殖器官中。因此，在禽类中可以从早期胚胎的血液中分离到迁移中的PGCs。根据PGCs独特的迁移途径，目前主要从下4个部位分离禽类原始生殖细胞：(1)从5-8HH期胚胎生殖新月区分离；(2)从17HH期胚胎血液中分离；(3)从25HH期生殖腺中分离。分离方法的不同直接影响分离的效果。目前已有一些PGCs分离的方法，常用的是Ficoll密度梯度离心法和酶解离法。Ficoll密度梯度离心法虽能获得较高纯度的PGCs，但得到的细胞量较少，直接影响PGCs后续的培养、研究和应用。酶解离法亦可获得大量的细胞，但会对细胞造成损伤，影响后期细胞培养。

PGCs的体外培养环境精确而复杂，因此维持其未分化的状态是体外培养技术的关键。饲养层细胞和多种细胞因子在PGCs体外培养体系中起着至关重要的作用。PGCs培养的饲养层细胞组要有小鼠胚胎成纤维细胞(STO)、小鼠成纤维细胞(MEF)、鸡胚胎成纤维细胞(CEF)、大鼠肝细胞(BRL-3A)和性腺基质细胞(SCs)等。饲养层细胞一方面可以促进PGCs的附着，另一方面可以分泌一些促进细胞增殖、抑制分化的细胞因子。维持PGCs体外存活的必需生长因子包括干细胞生长因子(SCF)、白血病抑制因子(LIF)、碱性成纤维生长因子(bFGF)和胰岛素样生长因子-1(IGF-1)能够增强PGCs的增殖并保持其发育全能性。除饲养层和细胞因子之外，PGCs培养体系中还需要添加谷氨酰胺、非必需氨基酸、核苷和β-巯基乙醇等。

发明内容

本发明克服了现有技术中的缺点，提供了一种分离鸡胚血来源的原始生殖干细胞的方法，提取高效纯净，旨在从17HH期胚胎血液中分离PGCs，为PGCs的体外培养、建系和应用奠定基础。

为了解决上述技术问题，本发明是通过以下技术方案实现的：

一种分离鸡胚血来源的原始生殖干细胞的方法，包括以下步骤：

(1)微量玻璃针采血装置的制备；

(2)14HH鸡胚血液的采集；

(3)采集的14HH鸡胚血液置入含有BRL-3A细胞饲养层和PGCs完全培养液的培养体系中培养，原代培养10-15d即可纯化细胞；

(4)将纯化后PGCs重新置入含有完全培养基的BRL-3A饲养层细胞上进行体外培养扩增；

(5)对体外培养扩增的PGCs进行间接免疫荧光检测，包括SSEA-1和DAZL表面标记；

(6)对体外培养扩增的PGCs进行RT-PCR鉴定，鉴定的基因包括Nanog、PouV、SOX 2、DAZL、CVH。

进一步，该微量玻璃针采血装置由1ml微量注射器、r3603软管和微量毛细玻璃管三部分组成，微量注射器和微量毛细玻璃管由r3603软管相连接，在无菌条件下，将微量毛细玻璃管在酒精灯外焰上快速拉丝。

进一步，所述微量玻璃针采血装置的制备包括以下步骤：

(1)将熔点毛细管放入试管内，高压灭菌；

(2)在净化工作台中，两手捏住熔点毛细管两端，将熔点毛细管中间部位放入酒精灯火焰外焰，当看到弯曲熔化现象出现时，快速从火焰上撤离并向两端抽拉熔点毛细管；

(3)将细丝在中间折断，细针要在4cm左右方可，将微量玻璃针插在海绵薄垫上备用；

(4)在注射器上安装r3603软管，r3603软管插入微量玻璃针备用。

进一步，所述14HH鸡胚血液的采集包括以下步骤：无菌条件下打开蛋壳，将鸡蛋置于无菌培养皿中用眼科镊子夹断胚胎背主动脉，使用上述微量玻璃针采血装置，使用微量玻璃针置于胚胎背主动脉断口处，利用虹吸作用吸取血液，再向外抽动注射器，抽取剩余的血液。

进一步，所述14HH鸡胚胚血的采集包括以下步骤：

(1)新鲜种蛋孵化到14-17HH，酒精棉球消毒蛋壳，无菌条件下平放鸡蛋，小心打开蛋壳，将鸡蛋置于无菌培养皿中；

(2)用眼科镊夹断胚体背主动脉，血液会流出至胚体表面；

(3)将连有注射器的微量玻璃针置于血液中，微量玻璃针通过虹吸作用将从血管中涌出的血液吸入微量玻璃针中，一段时间后向外抽动注射器，抽取剩余的血液；

(4)推动注射器将微量玻璃针中的血液轻轻注射到含PGCs完全培养液的BRL-3A饲养层中，每枚鸡胚取5-10μl血液置于饲养层中。

进一步，所述BRL-3A细胞饲养层的制备包括以下步骤：

(1)取冻存的BRL-3A细胞迅速置入37℃的水浴锅中，不断摇晃冻存管，使其在1min钟内融化，加入培养基稀释至4倍左右；

(2)1000rpm离心5min，弃上清。用含10％血清1％双抗的培养基重悬细胞，转移至细胞培养皿中，37℃，5％CO2，培养箱培养；

(3)选择生长状况良好、80％-90％汇合的细胞，吸出培养液，用PBS洗涤2次加入含丝裂霉素-C(10μg/mL)的细胞培养液，37℃孵育2h；

(4)去掉培养液，用PBS洗涤4-6次，以彻底去除丝裂霉素-C；

(5)胰酶消化，使细胞变成单细胞悬液。调整细胞密度为5×10⁵个/mL，接种于6孔板中，置37℃，5％CO2，培养箱中培养，24h后可使用；

(6)观察细胞生长情况，发现细胞过稀则补加丝裂霉素-C处理过的细胞，以保证细胞铺成单层，能连成一片而没有间隙；

(7)制备好的饲养层放放入培养箱中备用，使用前换为PGCs培养液；一般制备好的饲养层在5d内使用。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

(1)本发明所使用微量玻璃针采血装置对胚血几乎达到了完全吸取，无浪费，可为后期实验提供大量的PGCs。

(2)本发明中的PGCs来源于鸡胚血中，而且14-17HH血液中PGCs含量较高，而且血液来源的PGCs比28HH生殖腺中PGCs具有更好的增殖能力和维持更高水平的多能性。

(3)本发明利用微量玻璃针采血装置从血液中分离PGCs，操作简单，重复性好，从血液中获得杂细胞较少和无污染的纯净PGCs。

(4)本发明以BRL-3A作为PGCs培养的饲养层细胞，BRL-3A是一种稳定细胞系，可以为ES细胞提供条件培养基，可见其具有很强的分泌功能，而且经丝裂霉素-C处理后的BRL-3A不具增殖能力但保持生长活力，可以为PGCs的生长提供分泌因子，又不与PGCs竞争培养基中的营养成分。培养体系中的细胞因子bFGF、LIF、和SCF可以更好的维持PGCs的未分化状态和自我更新。此外，还要在培养基中添加谷氨酰胺、非必需氨基酸、核苷来保证PGCs增殖所需的营养成分。

(5)本发明可获得大量具有增殖能力强和多能性好的PGCs，可用于后续的PGCs体外建系、显微注射、转基因研究、嵌合体鸡的制备等研究打下良好的基础。

附图说明

附图用来提供对本发明的进一步理解，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制，在附图中：

图1微量玻璃针采血装置制作流程图。其中A图为微量玻璃针采血装置的3个组成部分；B图为微量玻璃针制作过程中的毛细管中间部位放入酒精灯外焰燃烧过程；C图为微量玻璃针制作过程中的毛细管出现弯曲熔化后，快速从火焰上撤离并向两端抽，形成细丝；D图为制作好的微量玻璃针插在海绵薄垫上备用；E图为微量玻璃针采血装置组装过程；F图为组装好的微量玻璃针采血装置。

图2为PGCs细胞形态图。其中A图为14HH期鸡胚形态图；B图为原代培养的PGCs，内含有大量血细胞；C图为原代后的单个PGCs；D图为单个PGCs培养2d后所形成的PGCs细胞克隆。

图3为PGCs SSEA-1免疫荧光染色鉴定。

图4为PGCs DAZL免疫荧光染色鉴定。

图5为PGCs特异性基因的RT-PCR鉴定。泳道M为DNA Marker DL2000，泳道1～6依次对应Nanog、PouV、SOX 2、CVH、DAZL和β-ACTIN基因的扩增产物。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。

I材料

熔点毛细管(0.9-1.1×100mm)购于上海申立玻璃仪器销售有限公司；

1mL注射器(连粉色针头)均购于广东康尔美医疗器械有限公司；

法国Saint-Gobain原装tygon r3603软管；

新鲜种蛋(麻黄鸡)购于广东省佛山市南海种禽有限公司；

胰酶，胎牛血清，鸡血清均购于HyClone公司；

SCF、LIF、bFGF细胞因子均购于PeproTech公司；

RNA抽提试剂盒、DNA Marker、AMV反转录试剂盒、Ex-Taq酶均购于TaKaRa公司；

Anti-DAZL抗体、FIHC标记的山羊抗兔IgG购于ProteinTech公司；

Anti-SSEA-1抗体购于SANTA CRUZ公司；

FIHC标记的山羊抗鼠IgG购于碧云天公司。

Ⅱ具体制备过程

一、微量玻璃针采血装置的制备及胚血的采集

1.微量玻璃针采血装置的制备

(1)将熔点毛细管放入试管内，高压灭菌；

(2)在净化工作台中，两手捏住熔点毛细管两端，将熔点毛细管中间部位放入酒精灯火焰外焰，当看到弯曲熔化现象出现时，快速从火焰上撤离并向两端抽拉熔点毛细管；

(3)将细丝在中间折断，细针要在4cm左右方可，将微量玻璃针插在海绵薄垫上备用；

(4)在注射器上安装r3603软管，r3603软管插入微量玻璃针备用。

2.14HH鸡胚胚血的采集

(1)新鲜种蛋孵化到14-17HH(55-70h)，酒精棉球消毒蛋壳，无菌条件下平放鸡蛋，小心打开蛋壳，将鸡蛋置于无菌培养皿中；

(2)用眼科镊夹断胚体背主动脉，血液会流出至胚体表面；

(3)将连有注射器的微量玻璃针置于血液中，微量玻璃针通过虹吸作用将从血管中涌出的血液吸入微量玻璃针中，一段时间后向外抽动注射器，抽取剩余的血液；

(4)推动注射器将微量玻璃针中的血液轻轻注射到含PGCs完全培养液的BRL-3A饲养层中，每枚鸡胚取5-10μl血液置于饲养层中。

二、PGCs的培养

1.BRL-3A细胞饲养层的制备

(1)取冻存的BRL-3A细胞迅速置入37℃的水浴锅中，不断摇晃冻存管，使其在1min钟内融化，加入培养基稀释至4倍左右；

(2)1000rpm离心5min，弃上清。用含10％血清1％双抗的培养基重悬细胞，转移至细胞培养皿中，37℃，5％CO2，培养箱培养；

(3)选择生长状况良好、80％-90％汇合的细胞，吸出培养液，用PBS洗涤2次加入含丝裂霉素-C(10μg/mL)的细胞培养液，37℃孵育2h；

(4)去掉培养液，用PBS洗涤4-6次，以彻底去除丝裂霉素-C；

(5)胰酶消化，使细胞变成单细胞悬液。调整细胞密度为5×10⁵个/mL，接种于6孔板中，置37℃，5％CO2，培养箱中培养，24h后可使用；

(6)观察细胞生长情况，发现细胞过稀则补加丝裂霉素-C处理过的细胞，以保证细胞铺成单层，能连成一片而没有间隙；

(7)制备好的饲养层放入培养箱中备用，使用前换为PGCs培养液；一般制备好的饲养层在5d内使用。

2.PGCs完全培养液的配制，PGCs完全培养液的配方为：

3.血液来源PGCs的体外培养

(1)将吸取的背主动脉血移入铺有BRL-3A细胞饲养层的6孔板上，并以PGCs完全培养液，置于37.5℃、含5％CO2的培养箱中进行原代培养。每隔3d进行一次半量换液，每次换液前先静置细胞板10min，待悬浮细胞静置后再沿液面边缘慢慢吸去原培养液，加入新培养液；

(2)原代培养10-15d后，血细胞基本死去，收集培养液(含有悬浮的cPGCs)，1000rpm/min离心5min，弃上清，用完全培养液重新悬浮细胞。调整细胞密度，重新置于新饲养层上进行传代培养；

(3)待PGCs原代培养5-7d后会形成PGCs克隆，克隆形成即可进行细胞传代。

三、PGCs的鉴定

1.PGCs的间接免疫荧光检测

取第3代的PGCs进行SSEA-1和DAZL免疫荧光染色鉴定。

(1)取生长良好的PGCs，吸出培养液，PBS清洗2次；

(2)加入固定液4％多聚甲醛室温下固定30min，去掉固定液，PBS(含5％FBS)清洗3次；

(3)加入透化剂(0.2％Triton X100)，冰上孵育20min，PBS(含5％FBS)清洗3次；

(4)加入封闭液(10％FBS，PBS)封闭30min，PBS(含5％FBS)清洗3次；

(5)分别加入一抗(鼠抗SSEA-1、兔抗DAZL)4℃孵育过夜，PBS(含5％FBS)清洗3次；

(6)分别加入FIHC-Ig标记的二抗,室温避光孵育1h，PBS(含5％FBS)清洗；

(7)加入DAPI避光复染5min，PBS(含5％FBS)清洗；

(8)加入抗荧光淬灭剂，相差显微镜下观察并拍照。

2、PGCs的RT-PCR鉴定

(1)PGCs特异性基因引物的合成。根据GenBank中报道的鸡的基因序列，用Primer5.0软件设计引物，送至上海生工生物工程技术服务有限公司合成，引物序列如下所示。

POUV:

F:5'-GTTGTCCGGGTCTGGTTCT-3'

R:5'-GTGGAAAGGTGGCATGTAGAC-3'

NANOG:

F:5'-TGGTTTCAGAACCAACGAATGAAG-3'

R:5'-TGCACTGGTCACAGCCTGAAG-3'

SOX 2:

F:5'-GAAGATGCACAACTCGGAGATCAG-3'

R:5'-GAGCCGTTTGGCTTCGTCA-3'

DAZL:

F:5'-CGTCAACAACCTGCCAAGGA-3'

R:5'-TTCTTTGCTCCCCAGGAACC-3'

CVH:

F:5'-GTCTGCCTGTGCAGCATGACATTG-3'

R:5'-CTTTGCCCAAAGATGCCAGGAACTC-3'

β-ACTIN:

F:5'-ATTGTCCACCGCAAATGCTTC-3'

R:5'-AAATAAAGCCATGCCAATCTCGTC-3'

(2)参照RNA抽提试剂盒采用Trizol法从PGCs中提取总RNA。

a.选用第2代的PGCs，放入1.5mL EP管中，加入750μL预冷的RNAiso Plus；

b.将样品吹打剧烈混匀后，室温静置5min；

c.加入250μL氯仿，剧烈振荡使液体充分混匀呈乳白状，在室温静置5min；

d.12 000rpm 4℃离心15min；

e.转移上清液到另一离心管中，加入等体积的异丙醇，上下颠倒离心管充分混匀，室温静置10min；

f.12 000rpm 4℃离心15min，倒掉上清液；

g.沿离心管壁缓慢加入1mL75％乙醇洗涤，12 000rpm 4℃离心10min，弃去乙醇；

h.室温干燥沉淀5min，用20μL RNase-free水溶解RNA，-20℃短期保存，或直接用于反转录。

(3)参照TaKaRa公司的AMV逆转录酶使用说明进行反转录。

反应体系为：

离心混匀后，42℃作用1h，获得cDNA。

(4)以获得的cDNA为模板，应用上述(1)引物进行PCR扩增，反应体系(25μL)：

在PCR管中依次加入：

如下反应条件进行PCR反应：

取5μLPCR产物用1％的琼脂糖凝胶电泳检测，利用凝胶成像系统扫描进行初步鉴定。

最后应说明的是：以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换，但是凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种分离鸡胚血来源的原始生殖干细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)微量玻璃针采血装置的制备；

(2)14HH鸡胚血液的采集；

(3)采集的14HH鸡胚血液置入含有BRL-3A细胞饲养层和PGCs完全培养液的培养体系中培养，原代培养10-15d即可纯化细胞；

(4)将纯化后PGCs重新置入含有完全培养基的BRL-3A饲养层细胞上进行体外培养扩增；

(5)对体外培养扩增的PGCs进行间接免疫荧光检测，包括SSEA-1和DAZL表面标记；

(6)对体外培养扩增的PGCs进行RT-PCR鉴定，鉴定的基因包括Nanog、PouV、SOX 2、DAZL、CVH。

2.根据权利要求1所述一种分离鸡胚血来源的原始生殖干细胞的方法，其特征在于，该微量玻璃针采血装置由1ml微量注射器、r3603软管和微量毛细玻璃管三部分组成，微量注射器和微量毛细玻璃管由r3603软管相连接，在无菌条件下，将微量毛细玻璃管在酒精灯外焰上快速拉丝。

3.根据权利要求2所述一种分离鸡胚血来源的原始生殖干细胞的方法，其特征在于，所述微量玻璃针采血装置的制备包括以下步骤：

(1)将熔点毛细管放入试管内，高压灭菌；

(2)在净化工作台中，两手捏住熔点毛细管两端，将熔点毛细管中间部位放入酒精灯火焰外焰，当看到弯曲熔化现象出现时，快速从火焰上撤离并向两端抽拉熔点毛细管；

(3)将细丝在中间折断，细针要在4cm左右方可，将微量玻璃针插在海绵薄垫上备用；

(4)在注射器上安装r3603软管，r3603软管插入微量玻璃针备用。

4.根据权利要求1所述一种分离鸡胚血来源的原始生殖干细胞的方法，其特征在于，所述14HH鸡胚血液的采集包括以下步骤：无菌条件下打开蛋壳，将鸡蛋置于无菌培养皿中用眼科镊子夹断胚胎背主动脉，使用上述微量玻璃针采血装置，使用微量玻璃针置于胚胎背主动脉断口处，利用虹吸作用吸取血液，再向外抽动注射器，抽取剩余的血液。

5.根据权利要求4所述一种分离鸡胚血来源的原始生殖干细胞的方法，其特征在于，所述14HH鸡胚胚血的采集包括以下步骤：

(1)新鲜种蛋孵化到14-17HH，酒精棉球消毒蛋壳，无菌条件下平放鸡蛋，小心打开蛋壳，将鸡蛋置于无菌培养皿中；

(2)用眼科镊夹断胚体背主动脉，血液会流出至胚体表面；

(3)将连有注射器的微量玻璃针置于血液中，微量玻璃针通过虹吸作用将从血管中涌出的血液吸入微量玻璃针中，一段时间后向外抽动注射器，抽取剩余的血液；

(4)推动注射器将微量玻璃针中的血液轻轻注射到含PGCs完全培养液的BRL-3A饲养层中，每枚鸡胚取5-10μl血液置于饲养层中。

6.根据权利要求1所述一种分离鸡胚血来源的原始生殖干细胞的方法，其特征在于，所述BRL-3A细胞饲养层的制备包括以下步骤：

(1)取冻存的BRL-3A细胞迅速置入37℃的水浴锅中，不断摇晃冻存管，使其在1min钟内融化，加入培养基稀释至4倍左右；

(2)1 000rpm离心5min，弃上清。用含10％血清1％双抗的培养基重悬细胞，转移至细胞培养皿中，37℃，5％CO2，培养箱培养；

(3)选择生长状况良好、80％-90％汇合的细胞，吸出培养液，用PBS洗涤2次加入含丝裂霉素-C(10μg/mL)的细胞培养液，37℃孵育2h；

(4)去掉培养液，用PBS洗涤4-6次，以彻底去除丝裂霉素-C；

(5)胰酶消化，使细胞变成单细胞悬液。调整细胞密度为5×10⁵个/mL，接种于6孔板中，置37℃，5％CO2，培养箱中培养，24h后可使用；

(6)观察细胞生长情况，发现细胞过稀则补加丝裂霉素-C处理过的细胞，以保证细胞铺成单层，能连成一片而没有间隙；

(7)制备好的饲养层放放入培养箱中备用，使用前换为PGCs培养液；一般制备好的饲养层在5d内使用。