CN102206609A - 一种卵巢来源雌性生殖干细胞的分离培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种卵巢来源雌性生殖干细胞的分离培养方法，是以胎儿成纤维细胞作为饲养层，将取自家畜卵巢的表面上皮层的细胞分离、分散后接种，加入雌性生殖干细胞培养液进行分离培养后收集细胞得到雌性生殖干细胞。本发明提供的卵巢来源雌性生殖干细胞的分离培养方法，开辟了分离培养雌性生殖干细胞的新途径，从卵巢中分离培养雌性生殖干细胞成功率高。经PR-PCR检测到相关的干细胞标志物，而且所分离的雌性生殖干细胞具有可行性和有效性。
Description
技术领域
发明属于雌性生殖干细胞技术领域，涉及一种卵巢来源雌性生殖干细胞(female germline stem cells，FGSCs)的分离培养方法。
背景技术
生殖干细胞是各级生殖细胞发生、发育和分化的源泉。传统观点认为，女性和绝大多数雌性哺乳动物卵母细胞的产生仅发生在胎儿期，出生后卵母细胞数目不再增加，反而逐年减少，这意味着出生后卵巢无生殖干细胞存在。2004年，科学家发现幼鼠及成年鼠卵巢中包含具有有丝分裂活性的生殖细胞，并可持续更新卵泡池，即卵巢上有干细胞。美国德克萨斯州及中国中山大学研究者已从小鼠和人体卵巢中分离获得了生殖干细胞，并成功诱导为不同分化阶段的生殖细胞。2009年4月12日，国际著名期刊Nature Cell Biology网络版公布了上海交通大学吴际教授研究团队的一项研究成果，该研究证明，卵巢中的干细胞能在器皿中繁殖，干细胞转移到卵巢后，能够发展成自行发育的卵子，产生后代。这一惊人发现改变了人们的传统观点，开辟出一个崭新的研究领域。该研究成果能为动物生物技术和人类提供卵母细胞新来源，对通过性细胞途径制作转基因动物、开发优良动物品种、濒危动物的保存、动物繁殖等都具有重要意义。
发明内容
本发明解决的问题在于提供一种卵巢来源雌性生殖干细胞的分离培养方法，开辟了分离培养雌性生殖干细胞的新途径，本方法从卵巢中分离培养雌性生殖干细胞成功率高。
本发明是通过以下技术方案来实现：
一种卵巢来源雌性生殖干细胞的分离培养方法，包括以下步骤：
将成年家畜卵巢的表面上皮层剪碎后置于HBSS液中，依次用IV型胶原酶、胰蛋白酶在37℃孵育消化，待细胞分散开后，加入胎牛血清终止消化，离心去除上清液，重悬沉淀物(卵巢表面上皮层细胞，含有雌性生殖干细胞)后过滤去掉细胞团，将分离获得的细胞以4～6×102个细胞/mL的浓度接种于含有胎儿成纤维细胞饲养层的培养板中，加入雌性生殖干细胞培养液，于37℃、5％CO2的饱和湿度培养箱中培养；
每2～3d更换一次培养液，当培养板铺满单层细胞时，吸弃培养液，加入细胞分离无酶缓冲液，待全部细胞脱壁后，再反复吹吸，使细胞尽量分散；收集细胞悬液，离心去除上清，收集细胞得到雌性生殖干细胞；
所述的雌性生殖干细胞培养液是以MEM α-medium为基础培养基，还包括以下组分：体积分数10～20％的胎牛血清、1～2mmol/L丙酮酸钠、1～2mmol/L非必需氨基酸、2～5mmol/L L-谷氨酰胺、0.1～1mmol/L β-巯基乙醇、10～50ng/mL人重组白血病抑制因子、6～10μg/mL胰岛素-转铁蛋白-硒钠、10～50ng/mL表皮生长因子、40～100ng/mL胶质细胞源性神经营养因子、1～2ng/mL碱性成纤维细胞生长因子和15～50mg/L青霉素
所述的胎儿成纤维细胞饲养层为：用终浓度为15～20mg/L的丝裂霉素C处理传代培养3代以内的胎儿成纤维细胞2～3h后，再用PBS洗涤胎儿成纤维细胞完全去除丝裂霉素C，然后加入胰蛋白酶液孵育消化，待细胞收缩变圆后终止消化，离心后收集细胞，再用胎儿成纤维细胞培养液重悬细胞；调整细胞密度为2.5～5×105细胞/孔种植于经明胶包被的培养板中，置37℃、5％CO2恒温培养箱培养24h后，作为饲养层细胞；
所述的胎儿成纤维细胞培养液是以高糖DMEM为基础培养基，还包括以下组分：体积分数10％的胎牛血清、100IU/mL青霉素、100μg/mL链霉素和1ng/mL碱性成纤维细胞生长因子。
所述的雌性生殖干细胞培养液是以MEM α-medium为基础培养基，还包括以下组分：体积分数10％的胎牛血清、1mmol/L丙酮酸钠、1mmol/L非必需氨基酸、2mmol/L L-谷氨酰胺、0.1mmol/L β-巯基乙醇、10ng/mL人重组白血病抑制因子、6μg/mL胰岛素-转铁蛋白-硒钠、10ng/mL表皮生长因子、40ng/mL胶质细胞源性神经营养因子、1ng/mL碱性成纤维细胞生长因子和15mg/L青霉素。
雌性生殖干细胞的扩增培养为：用雌性生殖干细胞培养液将雌性生殖干细胞稀释制成1～5×103个细胞/mL的细胞悬浮液，将细胞悬浮液加入到培养板中，在37℃、5％CO2恒温培养箱中扩增培养。
所述的依次用IV型胶原酶、胰蛋白酶在37℃孵育消化为：
将剪碎后的卵巢的表面上皮层先置于含1mg/mL IV型胶原酶的HBSS液中，于37℃孵育消化10～15min后，然后用HBSS液冲洗2～4次，再置于含有1mmol/L EDTA和0.05％胰酶的HBSS液中，于37℃孵育10～15min。
所述的胎儿成纤维细胞的传代培养为：用胎儿成纤维细胞培养液将分离自30～40d家畜胎儿皮肤组织的成纤维细胞调整为3～5×105个/mL的细胞悬液，将细胞悬液加入到明胶处理过的培养板中，置于37℃、5％CO2、饱和湿度条件下培养并传代；
所述的明胶处理培养板为：将购自sigma终浓度为2％的明胶，室温下放置20～30分钟后变成液态，以包被密度为5～10μg/cm2进行包被。明胶包被培养板或培养瓶24小时后，将明胶倒掉，用培养基冲洗，就可以接种细胞了。
所述的胎儿成纤维细胞完全去除丝裂霉素C之后加入的胰蛋白酶液包含0.5g/L胰蛋白酶和质量分数为0.02％的EDTA。
所述的家畜为猪或山羊。
所述的卵巢表面上皮层与胎儿成纤维细胞取自同一种家畜。
与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：
本发明提供的卵巢来源雌性生殖干细胞的分离培养方法，开辟了分离培养雌性生殖干细胞的新途径，从卵巢中分离培养雌性生殖干细胞成功率高。
从猪或山羊卵巢当中所分离到的雌性生殖干细胞，经PR-PCR检测到相关的干细胞标志物，而且所分离的雌性生殖干细胞具有可行性和有效性，雌性生殖干细胞在体外培养后出现了卵母样细胞，细胞逐渐长大后部分发育出透明带样结构。
附图说明
图1为猪卵巢来源的雌性生殖干细胞的显微视图，及其表面标志RT-PCR产物电泳结果；其中：
Za为：20×的猪卵巢来源雌性生殖干细胞显微视图；
Zb为：40×的猪卵巢来源雌性生殖干细胞显微视图；
Zc为：作为阳性对照的β-Actin检测结果；
Zd～Zf分别为：猪卵巢雌性生殖干细胞表面标志Nanog、Sox2和Oct4的RT-PCR产物电泳结果，其中采用50bp DNA梯度标记作为Marker，分别检测到了161bp、131bp和213bp的目的条带。
图2为山羊卵巢来源雌性生殖干细胞的显微视图，及其表面标志RT-PCR产物电泳结果；其中：
Sa为：20×的山羊卵巢来源雌性生殖干细胞显微视图；
Sb为：40×的山羊卵巢来源雌性生殖干细胞显微视图；
Sc为：作为阳性对照的GAPDH检测结果；
Sd～Sg分别为：山羊卵巢来源雌性生殖干细胞表面标志Nanog，Sox2，Oct4和Hesl的RT-PCR产物电泳结果，其中采用50bp DNA梯度标记作为Marker，分别检测到了208bp、445bp、100bp和343bp的目的条带。
具体实施方式
本发明提供的卵巢来源雌性生殖干细胞的分离培养方法，是以胎儿成纤维细胞作为饲养层，将取自家畜卵巢的表面上皮层的细胞分离、分散后接种，加入雌性生殖干细胞培养液进行分离培养后收集细胞得到雌性生殖干细胞。下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。
实施例1 猪卵巢来源雌性生殖干细胞的分离培养
1.1猪卵巢来源雌性生殖干细胞的分离培养
1)胎儿成纤维细胞饲养层的制备
在屠宰场收集家畜(山羊、猪等)胎儿，在无菌条件下快速运回。选取30～40d左右的胎儿，剪去头部、四肢和尾部，并清除内脏器官。把胎儿剩余部分用PBS(Phosphate buffer saline，磷酸盐缓冲液)清洗后剪碎，将组织碎块转移到10mL离心管中，加入5mL细胞消化液[0.25％胰蛋白酶+0.04％EDTA(Ethylene Diamine Tetraacetic Acid，乙二胺四乙酸)]，37℃下振荡20～30min。吹打并过滤后用成纤维细胞培养液将细胞浓度调整为3×105～5×105个/mL的细胞悬液。
明胶包被培养板备用：将购自sigma终浓度为2％的明胶，室温下放置20～30分钟后变成液态，以包被密度为5～10μg/cm2进行包被。明胶包被培养板或培养瓶24小时后，将明胶倒掉，用培养基冲洗，就可以接种细胞了。
在明胶包被过的6孔板每孔加入1～2mL细胞悬液，置于37℃、5％CO2、饱和湿度条件下培养并传代。取3代内胎儿成纤维细胞，吸去原培养基，加入终浓度为15mg/L的丝裂霉素C处理细胞2h。弃去液体，用PBS(Phosphate buffer saline，磷酸盐缓冲液)洗涤细胞3遍，完全去除丝裂霉素C，然后加入2mL消化液[0.5g/L胰蛋白酶+0.02％EDTA]37℃孵育消化，待细胞收缩变圆并从瓶底脱落后，加入等量DMEM(Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium)培养液(含10％胎牛血清)终止消化。
收集细胞至离心管，1000r/min离心3min后去除上清，用成纤维细胞培养液重悬细胞，调整细胞密度为2.5×105细胞/孔种植于经明胶包被的6孔培养板中，置37℃、5％CO2恒温培养箱培养24h后可用作生殖干细胞饲养层细胞。
所述的成纤维细胞培养液为：以高糖DMEM(High Glucose Dulbecco′s Modified Eagle Medium，Invitrogen公司产品)为基础培养基，还包括以下组分：体积分数10％的胎牛血清(Fetal Bovine Serum，FBS)、100IU/mL青霉素、100μg/mL链霉素和1ng/mL碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)。
2)卵巢来源雌性生殖干细胞分离培养
从屠宰场采集成年猪的卵巢，剪取卵巢表面上皮(ovarian surface epithelium，OSE)层，将其剪碎后置于HBSS液(Hank’s balanced salt solution，未添加Ca2+或Mg2+，含有1mg/mL IV型胶原酶)中，于37℃孵育15min(期间不时轻轻摇动)后，用HBSS液冲洗2～4次，再置于含有1mmol/L EDTA和0.05％胰酶的HBSS液中，于37℃孵育10min。当大多数细胞分散开后，加入10％FBS终止消化。将悬浮液1000r/min离心5min。去除上清液，用雌性生殖干细胞培养液重悬沉淀物(卵巢表面上皮层细胞，含有雌性生殖干细胞)，再用70-μm尼龙细胞滤器过滤，去掉细胞团。将分离获得的细胞接种于含有成纤维细胞饲养层的24孔板(终浓度为4～6×102个细胞/mL)，每孔加500μL雌性生殖干细胞培养液，于37℃、5％CO2的饱和湿度培养箱中培养；
所述的雌性生殖干细胞培养液为：以Minimum Essential Medium(MEM)α-medium(1×)(Gibco，Invitrogen，Cat.No.32561-037)为基础培养基，再添加体积分数10％的FBS(Fetal Bovine Serum胎牛血清)、1mmol/L丙酮酸钠、lmmol/L非必需氨基酸(Gibco)、2mmol/L L-谷氨酰胺、0.1mmol/L β-巯基乙醇(β-mercaptoethanol)、10ng/mL人重组白血病抑制因子(Leukemia Inhibitory Factor，recombinant human，LIF)、6μg/mL胰岛素-转铁蛋白-硒钠(Insulin-Transferrin-Selenium，ITS)、10ng/mL表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)、40ng/mL胶质细胞源性神经营养因子(glial cell line-derived neurotrophic factor，human GDNF)、1ng/mL碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)和15mg/L青霉素。
每2～3d换液一次，当培养板铺满单层细胞时，吸弃培养孔中培养液，每孔加入200μL细胞分离无酶缓冲液(Cell Dissociation Buffer，enzyme free，PBS-based Invitrogen，Catalog No.13151-014)，并用吸管吸取培养孔中细胞分离无酶缓冲液反复吹打细胞，待全部细胞脱壁后，再用吸管反复吹吸，使细胞尽量分散；收集细胞悬液至离心管，1000r/min离心3min后去除上清，收集的细胞为雌性生殖干细胞(female germline stem cells，FGSCs)；猪卵巢来源的雌性生殖干细胞的显微视图如图1当中的Za、Zb所示。
用雌性生殖干细胞培养液稀释雌性生殖干细胞，制成1×103个细胞/mL的细胞悬浮液，将细胞悬浮液接种于6孔培养板，每孔加入2mL细胞悬浮液，在37℃、5％CO2培养箱中扩增培养。
1.2猪卵巢来源雌性生殖干细胞表面标志的检测
利用RT-PCR(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction)技术检测猪卵巢来源雌性生殖干细胞的表面标志Nanog、Sox2和Oct4，内参照用管家基因β-Actin。操作步骤简述如下：
用Trizol试剂(Invitrogen)提取待测细胞的总RNA；紫外吸收定量后，进行RT-PCR(反转录PCR)反应，采用Superscript III(Gibco BRL)试剂盒反转录成cDNA；以cDNA为模板，表面标志的扩增引物如表1所示，按照以下程序进行PCR扩增：95℃变性5min，94℃变性30s，退火温度(引物不同退火温度亦不同，具体如表1所示)退火15s，72℃延伸45s，循环40次后，72℃延伸5min。
表1表面标志RT-PCR检测用引物序列及退火温度
将PCR产物以1.5％的琼脂糖凝胶进行分离，溴化乙锭染色后在紫外凝胶成像系统下分析产物条带，照相。结果如图1所示，其中，Zc为作为阳性对照的β-Actin检测结果，Zd～Zf分别为表面标志Nanog、Sox2和Oct4的RT-PCR产物电泳结果，其中采用50bp DNA梯度标记作为Marker，可以看到分别检测到了161bp、131bp和213bp的目的条带，表明所分离培养的雌性生殖干细胞细胞具有Oct4、Nanog和Sox2表面标志物；而且将获得的猪卵巢来源雌性生殖干细胞体外培养至第6天出现了卵母样细胞。
实施例2 山羊卵巢来源雌性生殖干细胞的分离培养
2.1山羊卵巢来源雌性生殖干细胞的分离培养
1)胎儿成纤维细胞饲养层的制备
在屠宰场收集山羊的胎儿，在无菌条件下快速运回。选取30～40d左右的胎儿，剪去头部、四肢和尾部，并清除内脏器官。把胎儿剩余部分用PBS(Phosphate buffer saline，磷酸盐缓冲液)清洗后剪碎，将组织碎块转移到10mL离心管中，加入5mL细胞消化液[0.25％胰蛋白酶+0.04％EDTA(Ethylene Diamine Tetraacetic Acid，乙二胺四乙酸)]，37℃下振荡20～30min。吹打并过滤后用成纤维细胞培养液将细胞浓度调整为3×105～5×105个/mL的细胞悬液。
在明胶处理过的6孔板每孔加入1～2mL细胞悬液，置于37℃、5％CO2、饱和湿度条件下培养并传代。取3代内胎儿成纤维细胞，吸去原培养基，加入终浓度为15mg/L的丝裂霉素C处理细胞2h。弃去液体，用PBS(Phosphate buffer saline，磷酸盐缓冲液)洗涤细胞3遍，完全去除丝裂霉素C，然后加入2mL消化液[0.5g/L胰蛋白酶+0.02％EDTA]37℃孵育消化，待细胞收缩变圆并从瓶底脱落后，加入等量DMEM(Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium)培养液(含10％胎牛血清)终止消化。
收集细胞至离心管，1000r/min离心3min后去除上清，用成纤维细胞培养液重悬细胞，调整细胞密度为2.5×105细胞/孔种植于经明胶包被的6孔培养板中，置37℃、5％CO2恒温培养箱培养24h后可用作生殖干细胞饲养层细胞。
所述的成纤维细胞培养液为：以高糖DMEM(High Glucose Dulbecco′s Modified Eagle Medium，Invitrogen公司产品)为基础培养基，还包括以下组分：体积分数10％的胎牛血清(Fetal Bovine Serum，FBS)、100IU/mL青霉素、100μg/mL链霉素和1ng/mL碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)。
2)卵巢来源雌性生殖干细胞分离培养
从屠宰场采集成年山羊的卵巢，剪取卵巢表面上皮(ovarian surface epithelium，OSE)层，将其剪碎后置于HBSS液(Hank’s balanced salt solution，未添加Ca2+或Mg2+，含有1mg/mL IV型胶原酶)中，于37℃孵育15min(期间不时轻轻摇动)后，用HBSS液冲洗2～4次，再置于含有1mmol/L EDTA和0.05％胰酶的HBSS液中，于37℃孵育10min。当大多数细胞分散开后，加入10％FBS终止消化。将悬浮液1000r/min离心5min。去除上清液，重悬沉淀物(细胞颗粒)，再用70-μm尼龙细胞滤器过滤，去掉细胞团。将分离获得的细胞接种于含有成纤维细胞饲养层的24孔板(终浓度为4～6×102个细胞/mL)，每孔加500μL雌性生殖干细胞培养液，于37℃、5％CO2的饱和湿度培养箱中培养；
所述的雌性生殖干细胞培养液为：以Minimum Essential Medium(MEM)α-medium(1×)(Gibco，Invitrogen，Cat.No.32561-037)为基础培养基，再添加体积分数15％的FBS(Fetal Bovine Serum胎牛血清)、1.5mmol/L丙酮酸钠、2mmol/L非必需氨基酸、3mmol/L L-谷氨酰胺、0.2mmol/L β-巯基乙醇(β-mercaptoethanol)、20ng/mL人重组白血病抑制因子(Leukemia Inhibitory Factor，recombinant human，LIF)、8μg/mL胰岛素-转铁蛋白-硒钠(Insulin-Transferrin-Selenium，ITS)、20ng/mL表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)、50ng/mL胶质细胞源性神经营养因子(glial cell line-derived neurotrophic factor，human GDNF)、2ng/mL碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)和20mg/L青霉素。
每2～3d换液一次，当培养板铺满单层细胞时，吸弃培养孔中培养液，每孔加入200μL细胞分离无酶缓冲液(Cell Dissociation Buffer，enzyme free，PBS-based Invitrogen，Catalog No.13151-014)，并用吸管吸取培养孔中细胞分离无酶缓冲液反复吹打细胞，待全部细胞脱壁后，再用吸管反复吹吸，使细胞尽量分散；收集细胞悬液至离心管，1000r/min离心3min后去除上清，收集的细胞为雌性生殖干细胞(female germline stem cells，FGSCs)；山羊卵巢来源的雌性生殖干细胞的显微视图如图2当中的Sa、Sb所示。
用雌性生殖干细胞培养液稀释雌性生殖干细胞，制成1×103个细胞/mL的细胞悬浮液，将细胞悬浮液接种于6孔培养板，每孔加入2mL细胞悬浮液，在37℃、5％CO2培养箱中扩增培养。
2.2猪卵巢来源雌性生殖干细胞表面标志的检测
利用RT-PCR(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction)技术检测猪卵巢来源雌性生殖干细胞的表面标志Nanog、Sox2、Oct4和Hes1，内参照用管家基因GAPDH。操作步骤简述如下：
用Trizol试剂(Invitrogen)提取待测细胞的总RNA；紫外吸收定量后，进行RT-PCR(反转录PCR)反应，采用Superscript III(Gibco BRL)试剂盒反转录成cDNA；以cDNA为模板，表面标志的扩增引物如表1所示，按照以下程序进行PCR扩增：95℃变性5min，94℃变性30s，退火温度(引物不同退火温度亦不同，具体如表2所示)退火15s，72℃延伸45s，循环40次后，72℃延伸5min。
表2表面标志RT-PCR检测用引物序列及退火温度
将PCR产物以1.5％的琼脂糖凝胶进行分离，溴化乙锭染色后在紫外凝胶成像系统下分析产物条带，照相。结果如图2所示，其中，Sc为作为阳性对照的GAPDH检测结果，Sd～Sg分别为表面标志Nanog、Sox2、Oct4和Hes1的RT-PCR产物电泳结果，其中采用50bp DNA梯度标记作为Marker，可以看到分别检测到了208bp、445bp、100bp和343bp的目的条带，表明所分离培养的雌性生殖干细胞细胞具有Oct4、Nanog和Sox2表面标志物；而且将获得的猪卵巢来源雌性生殖干细胞体外培养至第5天出现了卵母样细胞。
Claims (8)
1.一种卵巢来源雌性生殖干细胞的分离培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
将成年家畜卵巢的表面上皮层剪碎后置于HBSS液中，依次用IV型胶原酶、胰蛋白酶在37℃孵育消化，待细胞分散开后，加入胎牛血清终止消化，离心去除上清液，用雌性生殖干细胞培养液重悬沉淀物后过滤去掉细胞团，将分离获得的细胞以4～6×102个细胞/mL的浓度接种于含有胎儿成纤维细胞饲养层的培养板中，加入雌性生殖干细胞培养液，于37℃、5％CO2的饱和湿度培养箱中培养；
每2～3d更换一次培养液，当培养板铺满单层细胞时，吸弃培养液，加入细胞分离无酶缓冲液，待全部细胞脱壁后，再反复吹吸，使细胞尽量分散；收集细胞悬液，离心去除上清，收集细胞得到雌性生殖干细胞；
所述的雌性生殖干细胞培养液是以MEM α-medium为基础培养基，还包括以下组分：体积分数10～20％的胎牛血清、1～2mmol/L丙酮酸钠、1～2mmol/L非必需氨基酸、2～5mmol/L L-谷氨酰胺、0.1～1mmol/L β-巯基乙醇、10～50ng/mL人重组白血病抑制因子、6～10μg/mL胰岛素-转铁蛋白-硒钠、10～50ng/mL表皮生长因子、40～100ng/mL胶质细胞源性神经营养因子、1～2ng/mL碱性成纤维细胞生长因子和15～50mg/L青霉素；
所述的胎儿成纤维细胞饲养层为：用终浓度为15～20mg/L的丝裂霉素C处理传代培养3代以内的胎儿成纤维细胞2～3h后，再用PBS洗涤胎儿成纤维细胞完全去除丝裂霉素C，然后加入胰蛋白酶液孵育消化，待细胞收缩变圆后终止消化，离心后收集细胞，再用胎儿成纤维细胞培养液重悬细胞；调整细胞密度为2.5～5×105细胞/孔种植于经明胶包被的培养板中，置37℃、5％CO2恒温培养箱培养24h后，作为饲养层细胞；
所述的胎儿成纤维细胞培养液是以高糖DMEM为基础培养基，还包括以下组分：体积分数10％的胎牛血清、100IU/mL青霉素、100μg/mL链霉素和1ng/mL碱性成纤维细胞生长因子。
2.如权利要求1所述的卵巢来源雌性生殖干细胞的分离培养方法，其特征在于，所述的雌性生殖干细胞培养液是以MEM α-medium为基础培养基，还包括以下组分：体积分数10％的胎牛血清、1mmol/L丙酮酸钠、1mmol/L非必需氨基酸、2mmol/L L-谷氨酰胺、0.1mmol/L β-巯基乙醇、10ng/mL人重组白血病抑制因子、6μg/mL胰岛素-转铁蛋白-硒钠、10ng/mL表皮生长因子、40ng/mL胶质细胞源性神经营养因子、1ng/mL碱性成纤维细胞生长因子和15mg/L青霉素。
3.如权利要求1所述的卵巢来源雌性生殖干细胞的分离培养方法，其特征在于，雌性生殖干细胞的扩增培养为：用雌性生殖干细胞培养液将雌性生殖干细胞稀释制成1～5×103个细胞/mL的细胞悬浮液，将细胞悬浮液加入到培养板中，在37℃、5％CO2恒温培养箱中扩增培养。
4.如权利要求1所述的卵巢来源雌性生殖干细胞的分离培养方法，其特征在于，依次用IV型胶原酶、胰蛋白酶在37℃孵育消化为：
将剪碎后的卵巢的表面上皮层先置于含1mg/mL IV型胶原酶的HBSS液中，于37℃孵育消化10～15min后，然后用HBSS液冲洗2～4次，再置于含有1mmol/L EDTA和0.05％胰酶的HBSS液中，于37℃孵育10～15min。
5.如权利要求1所述的卵巢来源雌性生殖干细胞的分离培养方法，其特征在于，所述的胎儿成纤维细胞的传代培养为：用胎儿成纤维细胞培养液将分离白30～40d家畜胎儿的成纤维细胞调整为3～5×105个/mL的细胞悬液，将细胞悬液加入到明胶包被过的培养板中，置于37℃、5％CO2、饱和湿度条件下培养并传代。
6.如权利要求1所述的卵巢来源雌性生殖干细胞的分离培养方法，其特征在于，胎儿成纤维细胞完全去除丝裂霉素C之后加入的胰蛋白酶液包含0.5g/L胰蛋白酶和质量分数为0.02％的EDTA。
7.如权利要求1所述的卵巢来源雌性生殖干细胞的分离培养方法，其特征在于，所述的家畜为猪或山羊。
8.如权利要求1所述的卵巢来源雌性生殖干细胞的分离培养方法，其特征在于，所述的卵巢表面上皮层与胎儿成纤维细胞取自同一种家畜。
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| CN 201110107772 CN102206609A (zh) | 2011-04-27 | 2011-04-27 | 一种卵巢来源雌性生殖干细胞的分离培养方法 |
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| CN 201110107772 CN102206609A (zh) | 2011-04-27 | 2011-04-27 | 一种卵巢来源雌性生殖干细胞的分离培养方法 |
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Cited By (4)
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|---|---|---|---|---|
| CN102925408A (zh) * | 2012-10-31 | 2013-02-13 | 川北医学院第二临床医学院 | 诱导的多潜能干细胞分化为软骨细胞的方法 |
| CN104328082A (zh) * | 2013-10-16 | 2015-02-04 | 苏州大学 | 小鼠卵巢表面上皮细胞体外恶性转化培养方法 |
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| CN114990051A (zh) * | 2022-06-15 | 2022-09-02 | 深圳市中医院 | 一种改良的小鼠卵巢生殖干细胞的分离培养方法 |
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|---|---|---|---|---|
| CN101505796A (zh) * | 2006-06-20 | 2009-08-12 | 伊西康公司 | 使用干细胞产物进行软组织修复和再生 |
| CN101638633A (zh) * | 2009-09-04 | 2010-02-03 | 西北农林科技大学 | 一种山羊雄性生殖干细胞的体外分离及培养方法 |
-
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Patent Citations (2)
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| CN108603168A (zh) * | 2016-02-04 | 2018-09-28 | 上海交通大学 | 从卵泡抽提物中获得雌性生殖干细胞的方法 |
| CN108603168B (zh) * | 2016-02-04 | 2021-11-09 | 上海交通大学 | 从卵泡抽提物中获得雌性生殖干细胞的方法 |
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