CN108603168B - 从卵泡抽提物中获得雌性生殖干细胞的方法 - Google Patents

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Abstract

提供一种从卵泡抽提物中获得雌性生殖干细胞的方法。

Description

从卵泡抽提物中获得雌性生殖干细胞的方法
技术领域
本发明属于不育以及生育力保存领域；更具体地，本发明涉及一种从卵泡抽提物中获得雌性生殖干细胞的方法。
背景技术
流行病学统计发现全球每年约有4,850万对夫妇面临着不孕不育问题(Mascarenhas,M.N.,S.R.Flaxman,T.Boerma,et al.,National,Regional,and GlobalTrends in Infertility Prevalence Since 1990:A Systematic Analysis of277Health Surveys.PLoS Med,2012.9(12):p.e1001356.)，不孕不育已经成为一个主要的健康和社会问题。生殖干细胞可以用于研究不育症的发病机制。发明人在国际上首次发现出生后小鼠卵巢中存在雌性生殖干细胞(FGSC)。使用C端DDX4抗体从出生后小鼠卵巢中磁珠分选生殖细胞，经体外培养后能建立FGSC细胞系。将FGSC移植到不育小鼠卵巢中能够产生有功能的卵母细胞和后代(Zou,K.,Z.Yuan,Z.Yang,et al.,Production of offspringfrom a germline stem cell line derived from neonatal ovaries.Nat Cell Biol,2009.11(5):p.631-636)。随后，White等人使用相同的抗体从育龄妇女卵巢中流式分选出人类FGSC(White,Y.A.R.,D.C.Woods,Y.Takai,et al.,Oocyte formation bymitotically active germ cells purified from ovaries of reproductive-agewomen.Nat Med,2012.18(3):p.413-421)。越来越多的研究发现小鼠、大鼠和人类卵巢中存在FGSC。值得一提的是，最新的临床研究发现将人类FGSC的线粒体注射到患者自身的卵子中能提高卵子质量，增加体外受精(IVF)的成功率(Fakih,M.H.,M.E.Shmoury,J.Szeptycki,et al.,The AUGMENTSM Treatment:Physician Reported Outcomes of theInitial Global Patient Experience.JFIV Reprod Med Genet 2015.3(3):p.154)。
FGSC具有多种临床应用价值，包括治疗女性不育症，保存女性生育力和推迟女性更年期等。然而，临床上卵巢组织仅能通过三种途径获得：在剖腹产过程中获得；在不孕症检查中通过腹腔镜手术获得以及对各种妇科疾病进行卵巢切除过程中获得。由于卵巢位于腹腔中，获取卵巢组织主要通过开腹手术和腹腔镜手术。制约着FGSC的临床应用。
人类FGSC为推迟女性绝经期、治疗女性不育症以及提供生育力保存方法开辟了新的思路。辅助生殖技术(ART)是一项被广泛应用的医疗技术，ART国际监督委员会报道全球每年至少实施100万例，其目的在于帮助不孕不育的夫妇获得后代。阴道超声引导下卵泡穿刺抽吸术是ART中用于采集卵子的常用技术，卵泡抽提物是在该操作过程中产生的。待挑拣完成熟卵子后它们经常被丢弃，造成了很严重的临床资源浪费。之前的报道发现从卵泡抽提物中能够获得腔前卵泡，经体外培养后能够获得卵子(Wu,J.,L.Z.Zhang and P.Liu,Anew source of human oocytes:preliminary report on the identification andmaturation of human preantral follicles from follicular aspirates.HumanReproduction,1998.13(9):p.2561-2563.)。然而，目前没有文献报道卵泡抽提物中含有能够获得FGSCs的卵巢组织。
发明内容
本发明的目的在于提供一种从卵泡抽提物中获得雌性生殖干细胞的方法。较佳地，所述的雌性生殖干细胞为人类雌性生殖干细胞。
在本发明的第一方面，提供一种从卵泡抽提物中分离雌性生殖干细胞的方法，所述方法包括：
(1)从卵泡抽提物中分离出卵巢组织或细胞团块，进行细胞分散以获得单细胞；
(2)将步骤(1)获得的细胞接种到灭活的饲养层细胞上培养，从经过培养的细胞中分选出雌性生殖干细胞标志物阳性细胞。
在一个优选例中，所述的卵泡抽提物是来自至少一位提供者的卵泡抽提物。
在另一个优选例中，所述的卵泡抽提物是临床废弃的卵泡抽提物。
在另一个优选例中，所述的方法还包括步骤：(3)将步骤(2)获得的雌性生殖干细胞标志物阳性细胞在饲养层细胞上，进行增殖培养或传代培养；较佳地，使用干细胞培养液培养。
在另一个优选例中，步骤(1)中，从卵泡抽提物中分离出卵巢组织或细胞团块的方法包括：使用30-100μm孔径的细胞筛网过滤卵泡抽提物，滞留于筛网上的固体作为卵巢组织或细胞团块。
在另一个优选例中，将滞留于筛网上的固体作为卵巢组织或细胞团块从筛网上分离下来(较佳地，利用无菌PBS缓冲液冲刷筛网)，通过离心的方法从卵泡抽提物中分离出卵巢组织或细胞团块。
在另一个优选例中，通过300g离心5分钟，弃上清，收集固相的团块。
在另一个优选例中，步骤(1)中，在进行细胞分散之前，还包括：对获得的卵巢组织或细胞团块，还进行处理以去除红细胞。
在另一个优选例中，在利用细胞筛网过滤卵泡抽提物的时候，对于滤网上滞留的固体进行冲洗，从而去除红细胞；或者，采用红细胞裂解液将红细胞裂解去除。
在另一个优选例中，对于滤网上滞留的固体进行冲洗时，采用PBS缓冲液作为冲洗液；较佳地，冲洗至无肉眼可见的血细胞。
在另一个优选例中，步骤(1)中，采用选自下组的一种或几种酶进行细胞分散(即将组织或细胞团块消化为单细胞)：胶原酶IV，胰酶，胰酶替代物(TrypleETM Express)或AcutaseTM。
在另一个优选例中，采用胶原酶IV、胰酶和EDTA进行细胞分散；较佳地，将所述的卵巢组织或细胞团块置于含有1±0.5mg/mL胶原酶IV的PBS中，然后放在37±1℃水浴锅中缓慢振荡5±3分钟；300g离心5分钟后用PBS缓冲液清洗，再离心；向离心管中添加含有0.5mM EDTA和0.05％胰酶的PBS中，37±1℃水浴锅中缓慢振荡2-3分钟；当大部分细胞分散后，使用血清终止胰酶作用。
在另一个优选例中，步骤(2)中，所述的饲养层细胞包括：STO细胞，MEF细胞或SNL细胞。
在另一个优选例中，步骤(2)中，所述的灭活的饲养层细胞是：经丝裂霉素C灭活的饲养层细胞；或步骤(2)中，在饲养层细胞上培养的时间为10-18天。
在另一个优选例中，步骤(2)中，将特异性抗雌性生殖干细胞标志物的抗体与磁珠偶联，与经过饲养层细胞培养的细胞进行孵育，分选出雌性生殖干细胞标志物阳性细胞。
在另一个优选例中，所述的灭活的饲养层细胞如下获得：饲养层细胞用丝裂霉素C处理(较佳地为10μg/mL处理2.5±0.5小时)，清洗后，消化成单细胞，接种到明胶包被的细胞培养板上。
在另一个优选例中，所述的雌性生殖干细胞标志物包括：DDX4(DEAD boxpolypeptide 4，DEAD框肽4)，IFITM3(interferon-induced transmembrane protein 3，干扰素诱导的跨膜蛋白3)；较佳地，为DDX4。
在本发明的另一方面，提供一种获得卵巢组织或细胞团块的方法，所述方法包括：从卵泡抽提物中分离卵巢组织或细胞团块。
在一个优选例中，所述方法包括：使用30-100μm孔径的细胞筛网过滤卵泡抽提物，滞留于筛网上的固体作为卵巢组织或细胞团块。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1、IVF中心经阴道穿刺获取卵母细胞的模式图，显示腔前卵泡和FGSC能与成熟卵母细胞一同获得。
COC，卵丘-卵母细胞复合体；
OSE，卵巢表面上皮。
图2、卵泡抽提物外观及其组分。
A、从IVF中心获得的卵泡抽提物外观；
B、卵泡抽提物经30-μm细胞筛网过滤后黏附在尼龙网上的细胞或组织团块。右图是红框区域的放大图。
图3、卵泡抽提物中含有卵巢组织和颗粒细胞团。
A、从卵泡抽提物中能获得卵巢组织(左图和中图)和颗粒细胞团块(右图)，它们具有不同的形态和大小。
B、两家IVF中心获得卵巢组织的比例。
图4、从卵泡抽提物中分离雌性生殖干细胞(FGSC)。
A、卵泡抽提物中少量卵巢组织经消化并体外培养2周后分选的DDX4+细胞。白色箭头指示磁珠。
B、使用免疫细胞化学染色以确认分选的细胞是DDX4+细胞。
图5、体外培养FGSC的形态。
A、分裂期的FGSC。
B、第4代(p4)FGSC的细胞形态。
C、第30代(p30)FGSC的细胞形态。
图6、对人类卵巢组织(28岁)、FGSC细胞系(1#和2#)和从手术切除的卵巢中获得的FGSC(srFGSC)的RT-PCR分析。
图7、FGSC细胞系中DDX4，OCT4，IFITM3，BLIMP-1和DAZL蛋白的免疫荧光染色。
图8、FGSC细胞系中BrdU和DDX4双免疫荧光染色。
图9、对FGSC细胞系做的G分带核型分析，显示正常的核型(46，XX)，以及其比例(右图)。n＝59。
具体实施方式
雌性生殖干细胞(FGSC)是一种存在于卵巢中的生殖干细胞，具有多种临床应用价值。本发明人在研究中首次发现，卵泡抽提物中包括卵巢组织或细胞团块，并可从中获得雌性生殖干细胞。
如本文所用，所述的“卵泡抽提物”是临床上卵泡穿刺抽吸产生的卵泡抽提物。通常，在进行临床卵泡穿刺抽吸(如经阴道卵巢穿刺取卵)后，可以获得含有卵子的抽提物，本发明的“卵泡抽提物”通常是挑拣完成熟卵子后剩余的卵泡抽提物。卵泡抽提物也可以是使用阴道超声引导下卵泡穿刺抽吸术治疗良性卵巢囊肿时产生的废弃物(Katayama,K.P.,M.Roesler,C.Gunnarson,et al.,Ultrasound-guided transvaginal needle aspirationof follicles for in vitro fertilization.Obstetrics and Gynecology,1988.72(2):p.271-274；Nikolaou,M.,G.Adonakis,P.Zyli,et al.,Transvaginal ultrasound-guidedaspiration of benign ovarian cysts.Journal of Obstetrics and Gynaecology,2014.34(4):p.332-335)。也可以是超声引导下卵巢穿刺打孔术(Ultrasound-guidedtransvaginal ovarian needle drilling，UTND)治疗多囊卵巢综合症(polycystic ovarysyndrome，PCOS)时产生的废弃物(Badawy,A.,M.Khiary,A.Ragab,et al.,Ultrasound-guided transvaginal ovarian needle drilling(UTND)for treatment of polycysticovary syndrome:a randomized controlled trial.Fertility and Sterility,2009.91(4):p.1164-1167)。
如本文所用，所述的“雌性生殖干细胞标志物”是指雌性生殖干细胞表面表达(包括跨膜结构)的特异性分子，可通过特异性结合该标志物的抗体来鉴定或分选雌性生殖干细胞。本发明中，所述的“雌性生殖干细胞标志物”包括但不限于：DDX4，IFITM3。最为优选地，选择DDX4作为进行雌性生殖干细胞分选的标志物。
如本文作用，所述的“雌性生殖干细胞(FGSC)”是哺乳动物的雌性生殖干细胞；较佳地是人类雌性生殖干细胞或非人灵长类动物的雌性生殖干细胞。
本发明提供了一种从卵泡抽提物中分离雌性生殖干细胞的方法，所述方法包括：(1)从卵泡抽提物中分离出卵巢组织或细胞团块，进行细胞分散以获得单细胞；(2)将步骤(1)获得的细胞接种到灭活的饲养层细胞上培养，从经过培养的细胞中分选出雌性生殖干细胞标志物阳性细胞。
所述的卵泡抽提物可以是临床废弃的卵泡抽提物，例如一些IVF中心经阴道穿刺、取卵后(如图1)获得的废弃的卵泡抽提物。也即，所述的卵泡抽提物可以是一种从IVF中心产生的副产品。本发明中已证实，卵泡抽提物中含有少量卵巢组织，而且这些组织能够用于获得雌性生殖干细胞。
所述的卵泡抽提物可以来源于一个提供者，也可以来源于多名提供者，例如可以是1-100位提供者，包括2位、5位、10位、20位、40位、60位等等。
可以采用适当孔径的细胞筛网来过滤卵泡抽提物，从所述的卵泡抽提物中获得有价值的卵巢组织或细胞团块。作为本发明的优选方式，采用30-100μm孔径的细胞筛网过滤卵泡抽提物，滞留于筛网上的固体作为卵巢组织或细胞团块。例如，细胞筛网的孔径可以是30μm，40μm，50μm，60μm，70μm，80μm，90μm等。
为了获得相对较纯的细胞，避免杂细胞的干扰，在采用筛网过滤的同时或之后，还包括去除卵泡抽提物中的红细胞的步骤。去除卵泡抽提物中的红细胞可以采用一些常用的冲洗溶液(如缓冲液)进行冲洗去除，也可以使用红细胞裂解液将红细胞裂解去除。若选择进行冲洗以去除红细胞，可以在筛网过滤的同时进行冲洗。
对从筛网上分离下来的、较佳地还去除了红细胞的卵巢组织或细胞团块，进一步进行离心，去除上清，收集离心管底部的卵巢组织或细胞团块，备用于后续进行细胞分散。
获得的卵巢组织或细胞团块，进行细胞分散，以获得可以进行培养的单细胞。细胞分散可以应用本领域公知的进行细胞分散的各种物理或化学方法。作为本发明的优选方式，采用选自下组的一种或几种酶进行细胞分散：胶原酶，胰酶，胰酶替代物(TrypleETMExpress)或AcutaseTM。作为本发明的最优选方式，采用两步酶消化法将所述的卵巢组织消化成单细胞，所述的两步酶消化法依次包括：第一步、胶原酶IV消化；第二步、胰酶-EDTA消化。胶原酶全称为胶原蛋白水解酶(Collagenase)，它能特异性地水解天然胶原蛋白的三维螺旋结构，而不损伤其它蛋白质和组织。胶原酶IV包含至少7种蛋白酶成分，分子量从68-130KD不等。胰酶是一种蛋白酶，通过在特定位置上降解蛋白，使细胞间结合处蛋白降解，这时细胞由于自身内部细胞骨架的张力作用下成为球形，从而使细胞分开。EDTA是非酶性消化物，其作用机理一般认为是：一些细胞的贴附和生长必须有Ca2+的存在，而EDTA能与Ca2+形成螯合物，能促进细胞的分离。
获得的单细胞接种到灭活的饲养层细胞上培养。作为本发明的优选方式，所述的灭活的饲养层细胞是经丝裂霉素C灭活的饲养层细胞。作为本发明的优选方式，所述饲养层细胞可以包括：STO细胞，MEF细胞或SNL细胞等。
在饲养层细胞上培养的时间一般在10-18天，例如可以是12天、14天或16天。之后，从经过培养的细胞中分选出雌性生殖干细胞标志物阳性细胞。
所述的雌性生殖干细胞标志物是雌性生殖干细胞表面表达(包括跨膜结构)的特异性分子，可通过特异性结合该标志物的抗体来鉴定或分选雌性生殖干细胞。所述的特异性抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体。可用所述的雌性生殖干细胞标志物免疫动物，如家兔，小鼠，大鼠等来生产多克隆抗体；多种佐剂可用于增强免疫反应，包括但不限于弗氏佐剂等。与之相似的，表达所述的雌性生殖干细胞标志物或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。所单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备。
在一些发明方案中，分选雌性生殖干细胞使用的抗体可以是C端DDX4(例如获自Abcam，ab13840)抗体，也可以使用IFITM3(例如获自Abcam；ab15592)抗体。
DDX4或IFITM3是雌性生殖干细胞的标志物，也是卵母细胞的标志物。因此，事实上，利用DDX4或IFITM3进行细胞分选的时候，分离获得的细胞中也含有卵母细胞。但是，本发明人观察到，卵母细胞在后续培养过程中无法长期生存及增殖，会逐渐消失。卵母细胞的消失在本发明的实施例2中也有证明，所培养获得的FGSC细胞系不表达卵母细胞相关基因C-KIT，FIGLA，GDF9，GJA4，ZP1，ZP2和ZP3。因此，本领域技术人员可以理解，DDX4或IFITM3可以作为分选标志物应用于本发明的方法中，本发明的方法也能够获得较为纯的FGSC细胞系。
将特异性抗雌性生殖干细胞标志物的抗体与磁珠偶联，与经过饲养层细胞培养的细胞进行孵育，分选出雌性生殖干细胞标志物阳性细胞。分选雌性生殖干细胞使用的磁珠可以是直径为2.8μm的磁珠(例如获自Dynabeads，112.03D)，也可以使用直径为50nm的磁珠(例如获自Miltenyi Biotec,130-048-602)。
体外扩增雌性生殖干细胞的培养液可以采用本领域已知的培养液。作为本发明的优选方式，所述的培养液可以是含有10％胎牛血清，1mM丙酮酸钠，1mM非必需氨基酸，2mML-谷氨酰胺，0.1mMβ-巯基乙醇，10ng/mL白血病抑制因子，20μg/ml转铁蛋白，5μg/ml胰岛素，60μM腐胺，10ng/mL表皮生长因子，40ng/mL胶质细胞源性神经营养因子，1ng/mL碱性成纤维生长因子和15mg/L青霉素的MEMα。上述各组分的配方可以进行适当的上下浮动(例如上下浮动30％；较佳地上下浮动20％；更佳地上下浮动10％；更佳地上下浮动5％)，这是本领域技术人员易于操作的。
为本发明的优选方式，也可以将雌性生殖干细胞培养在10％胎牛血清，1mM丙酮酸钠，1mM非必需氨基酸，1X浓度的青霉素-链霉素-谷氨酰胺溶液，0.1mMβ-巯基乙醇，1X浓度的N-2添加物，103units/ml白血病抑制因子，10ng/ml表皮生长因子，1ng/ml碱性成纤维生长因子和40ng/ml胶质细胞源性神经营养因子的MEMα中。上述各组分的配方可以进行适当的上下浮动(例如上下浮动30％；较佳地上下浮动20％；更佳地上下浮动10％；更佳地上下浮动5％)，这是本领域技术人员易于操作的。
本发明人在本领域中首次发现卵泡抽提物中包含有卵巢组织或细胞团块。基于本发明人的该新发现，本发明还提供了一种获得卵巢组织或细胞团块的方法，其包括：从卵泡抽提物中分离卵巢组织或细胞团块。作为本发明的优选方式，所述方法包括：使用30-100μm孔径的细胞筛网过滤卵泡抽提物，滞留于筛网上的固体作为卵巢组织或细胞团块。
本发明的优异效果在于：
(1)首次发现卵泡抽提物中可以分离到雌性生殖干细胞，并且提供了较为优选的雌性生殖干细胞分离和培养方法。
(2)从卵泡抽提物中获取雌性生殖干细胞既降低了手术风险，又充分利用了临床资源，为雌性生殖干细胞的来源提供了新的途径。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1、从IVF中心产生的卵泡抽提物中获得少量人类卵巢组织
1、人类卵泡抽提物的获得
签署知情同意书后，从两家IVF中心获得卵泡抽提物，患者年龄介于30-35岁。待卵子挑拣后，2-6位病人产生的卵泡抽提物收集于无菌的50mL离心管中，在两小时内室温运送至实验室。该研究得到同济大学附属第一妇幼保健院和湖南省郴州市第一人民医院的伦理委员会批准。
2、从卵泡抽提物中收集少量卵巢组织
使用一个30μm孔径的细胞筛网过滤卵泡抽提物，用无菌的PBS缓冲液冲洗数次至无肉眼可见的血细胞。将细胞筛网倒扣在细胞培养皿或离心管上，用无菌的PBS缓冲液将黏附在尼龙网(30μm孔径的细胞筛网)上的组织块冲刷下来。然后将筛网置于解剖显微镜下观察是否收集干净，如有残留，可用镊子收集组织块。300g离心5分钟，弃上清，收集于离心管底部的组织块用于后续实验。
3、结果
临床上，患者卵巢标本的匮乏制约着FGSC的基础研究和临床应用。之前的研究发现卵泡抽提物中含有腔前卵泡，经体外培养后能获得成熟的卵子。
本发明人从两家IVF中心获得废弃的卵泡抽提物。由于卵泡抽提物含有多种体细胞，为了去除这些细胞的污染，本发明人使用30μm孔径筛网去除这些细胞。在操作过程中，发现过滤后筛网上有很多组织或细胞团块(图2)。
将这些组织或细胞团块置于显微镜下观察，发现它们含有小块卵巢组织和颗粒细胞团(图3A)。统计发现两个IVF中心来源的样本中都能检测到卵巢组织，能够检测到卵巢组织的样本分别占总样本的91.7％和100％(图3B)。
综上所述，这些结果证明，卵泡抽提物中含有少量卵巢组织块。
实施例2、从卵泡抽提物中的少量卵巢组织中分离并鉴定FGSC
1、STO饲养层的制备
STO细胞经解冻后接种到培养皿中进行培养，其培养液成分为：含有1mM非必需氨基酸(NEAA；Life Technologies)，10％胎牛血清(Hyclone)和6mg/L青霉素(Sigma))的DMEM(Life Technologies)。制备饲养层时，STO细胞用10μg/mL的丝裂霉素C(Sigma)处理2-3小时，经PBS清洗数次后，用胰酶消化成单细胞接种到0.1％(w/v)明胶包被的细胞培养板上，使用STO培养液进行培养。
2、FGSC的分离
将前一实施例中收集的卵巢组织块置于含有1mg/mL胶原酶IV的PBS中，然后放在37℃水浴锅中缓慢振荡5分钟。300g离心5分钟后用PBS缓冲液洗一次，再离心。向离心管中添加含有0.5mM EDTA和0.05％胰酶的PBS，37℃水浴锅中缓慢振荡2-3分钟。当细胞基本分散后，添加10％胎牛血清终止胰酶作用。300g离心5分钟后小心去除上清。加入培养液重悬并接种到经丝裂霉素C灭活的STO单细胞饲养层上，使用干细胞培养液培养两周并进行磁珠分选。磁珠分选时，按照说明书将羊抗兔IgG偶联的磁珠(Dynabeads，112.03D)与兔多抗DDX4抗体(Abcam；ab13840)孵育，然后再将包被好的磁珠与细胞孵育，使用磁珠架分选阳性细胞。
3、FGSC培养
FGSC的培养体系需用到灭活的STO饲养层。FGSC的培养液成分为：含有10％胎牛血清(Front)，1mM丙酮酸钠(Sigma)，1mM非必需氨基酸，2mM L-谷氨酰胺(Sigma)，0.1mMβ-巯基乙醇(Sigma)，10ng/mL人类白血病抑制因子(LIF；Santa Cruz Biotechnology，sc-4377)，10ng/mL人类表皮生长因子(EGF；Peprotech，AF-100-15)，40ng/mL人类胶质细胞源性神经营养因子(GDNF；Peprotech，450-10)，10ng/mL人类碱性成纤维生长因子(bFGF；Peprotech，AF-100-18B)和6mg/L青霉素的MEMα。
经磁珠分选后的细胞(大约500个)接种到含有STO饲养层的24孔板中的一个孔中，加入干细胞培养液进行培养。
培养液每2-3天更换一次，并用分散酶II(Roche)每5-8天按照1：1～1：3的比例传代。所有细胞都培养在含有5％CO2的37℃恒温培养箱中。
4、免疫荧光染色
细胞用4％PFA室温固定20分钟，PBS洗两次，用封闭液(含有10％山羊血清的PBS)37℃封闭10分钟。然后将细胞4℃孵育在稀释后的其中一种一抗[1：500稀释的DDX4抗体(Abcam；ab13840)；1：100稀释的OCT4抗体(Santa Cruz Biotechnology；sc-9081)；1：100稀释的IFITM3抗体(Abcam；ab15592)；1：100稀释的BLIMP-1抗体(ABGENT Crown；AP14521a)或1:100稀释的DAZL抗体(Abcam；ab128238)；1：150稀释的BrdU(Thermo scientific；cloneBRD.3)]中过夜。
第二天，用PBS洗两次，然后将细胞避光37℃孵育在1：150稀释的TRITC偶联的羊抗兔IgG(ProteinTech，识别DDX4，OCT4，IFITM3，BLIMP-1和DAZL)或羊抗鼠IgG(ProteinTech，识别BrdU)的二抗中30分钟，然后DAPI复染20分钟。加入荧光抗淬灭剂照相。
5、RT-PCR
从组织和细胞中抽提总RNA，使用
Figure GDA0003192335800000122
II Q RT SuperMix(+gDNA wiper)试剂盒(Vazyme，R223-01)按照说明书进行反转录。使用Taq聚合酶(Takara,R10T1M)进行RT-PCR，引物见表1，进行35个循环。PCR扩增的GAPDH基因用作内参。使用2％琼脂糖凝胶进行电泳，DNA条带用溴化乙锭(EB)染色。获得PCR产物，通过测序确定该条带是否为相应的基因。
表1.用于分析人类FGSC和卵巢组织基因表达情况的PCR引物
Figure GDA0003192335800000121
Figure GDA0003192335800000131
Figure GDA0003192335800000141
#，F：正向引物；R：反向引物。
6、FGSC的冻存与复苏
FGSC经胰酶消化后与含有10％DMSO(Sigma)的FGSC培养液混匀，然后置于2ml冻存管中。将冻存管置于异丙醇冻存盒(Mr.Frosty)内并放在-80℃冰箱中过夜。第二天，将冻存管置于液氮中长期保存。复苏细胞时，将冻存管迅速置于37℃水浴锅内融化，300g离心5分钟，弃上清。细胞培养在FGSC的培养液中。
7、结果
使用两步酶消化法将上述少量卵巢组织消化成单细胞，然后将细胞接种到经丝裂霉素C灭活的STO饲养层上，在体外进行培养。两周后，使用C端DDX4抗体进行磁珠分选。分选后的细胞呈圆形或卵圆形，细胞直径8-15μm，有较大的细胞核，每个细胞周围与1-3个不等的磁珠结合(图4A)。
为了鉴定这些细胞是否表达生殖系标志物，本发明人采用免疫细胞化学检测DDX4的表达。如图4B所示，分选出的细胞表达DDX4。
DDX4+的细胞随后接种到饲养层上进行后续培养。在培养早期，本发明人能观察到细胞的聚集生长，细胞呈串状缓慢生长(图5A)。随后细胞生长速度快而平稳，每5-7天需进行一次传代(图5B)。依照上述方式培养，细胞经冻存-解冻后仍能稳定生长(图5C)。
本发明人通过RT-PCR从mRNA水平检测了FGSC两个细胞系(1#和2#)和从手术切除的卵巢中获得的FGSC(srFGSC)细胞系的基因表达情况，以确定细胞特征。以28岁育龄期妇女(卵巢囊肿患者)卵巢总cDNA为阳性对照，以没有反转录的mRNA为阴性对照，检测上述细胞/组织中DDX4，IFITM3，OCT4，STELLA，DAZL，BLIMP-1，STRA8，SYCP3，C-KIT，FIGLA，GDF9，GJA4，ZP1，ZP2，ZP3，NANOG，SOX2和REX-1的表达情况。如图6所示，FGSC两个细胞系(1#和2#)和srFGSC表达DDX4，IFITM3，OCT4，STELLA，DAZL，BLIMP-1和REX-1。而不表达减数分裂特异表达基因STRA8和SYCP3；不表达卵母细胞相关基因C-KIT，FIGLA，GDF9，GJA4，ZP1，ZP2和ZP3；不表达多潜能性基因NANOG和SOX2。因此可以判定本发明人所建立的细胞系是未分化的生殖干细胞。
随后，本发明人从蛋白水平上检测生殖细胞标志物。如图7所示，FGSC表达生殖系特异标志物DDX4，OCT4，IFITM3，BLIMP-1和DAZL蛋白。从蛋白水平上证实了本发明人培养的细胞系是生殖细胞来源的。
BrdU(5-溴脱氧尿嘧啶核苷)是胸腺嘧啶T的类似物，在DNA复制的过程中可以被掺入到基因组中去，利用抗体抗原反应能检测其在细胞中的掺入情况，从而反映其增殖能力；DDX4是生殖细胞特异性标志物。通过BrdU和DDX4双标记免疫荧光细胞化学可以鉴定增殖的生殖细胞。如图8所示，培养的细胞具有增殖活性。
然后，本发明人通过对FGSC进行G分带核型分析判断其核型是否正常。如图9所示，83％的FGSC染色体数目为46条，属于二倍体细胞。
综上所述，表明FGSC能够从卵泡抽提物中获得。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (12)

1.一种从卵泡抽提物中分离雌性生殖干细胞的方法，其特征在于，所述方法包括：
(1) 从卵泡抽提物中分离出卵巢组织或细胞团块，进行细胞分散以获得单细胞；其中，从卵泡抽提物中分离出卵巢组织或细胞团块的方法包括：使用30-100μm孔径的细胞筛网过滤卵泡抽提物，滞留于筛网上的固体作为卵巢组织或细胞团块；
(2) 将步骤(1)获得的细胞接种到灭活的饲养层细胞上培养，从经过培养的细胞中分选出雌性生殖干细胞标志物阳性细胞。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的方法还包括步骤：
(3) 将步骤(2)获得的雌性生殖干细胞标志物阳性细胞在饲养层细胞上，进行增殖培养或传代培养。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，进行增殖培养或传代培养时，使用干细胞培养液培养。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，用缓冲液将滞留于筛网上的固体作为卵巢组织或细胞团块从筛网上冲刷下来，通过离心的方法从中分离出卵巢组织或细胞团块。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，在进行细胞分散之前，还包括：对获得的卵巢组织或细胞团块进行处理以去除红细胞。
6.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，采用选自下组的一种或几种酶进行细胞分散：胶原酶IV，胰酶，胰酶替代物，或Acutase。
7.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的饲养层细胞包括：STO细胞，MEF细胞或SNL细胞。
8.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的灭活的饲养层细胞是：经丝裂霉素C灭活的饲养层细胞。
9.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，在饲养层细胞上培养的时间为10-18天。
10.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，将特异性抗雌性生殖干细胞标志物的抗体与磁珠偶联，与经过饲养层细胞培养的细胞进行孵育，分选出雌性生殖干细胞标志物阳性细胞。
11.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的灭活的饲养层细胞如下获得：饲养层细胞用丝裂霉素C处理，清洗后，消化成单细胞，接种到明胶包被的细胞培养板上。
12.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的雌性生殖干细胞标志物包括：DDX4，IFITM3。
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