CN116445395A - 一种用于胚胎移植前培养的胚胎培养液 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于胚胎移植前培养的胚胎培养液。本发明提供的用于胚胎或囊胚的体外培养的培养液，包括：层粘连蛋白、纤粘连蛋白和表皮生长因子；培养液中，层粘连蛋白的浓度为10‑300μg/mL、纤粘连蛋白的浓度为10‑100μg/mL，表皮生长因子的浓度为10‑100ng/mL。本发明还保护所述培养液在体外培养胚胎或囊胚中的应用。在进行胚胎移植前先采用本发明提供的培养液进行体外培养，可以显著增加胚胎的着床率。本发明对于生殖医学领域具有重大的应用推广价值。
Description
技术领域
本发明属于生殖医学领域，具体涉及一种用于胚胎移植前培养的胚胎培养液，可显著提高胚胎着床率。
背景技术
试管婴儿是体外受精－胚胎移植技术的俗称，是指采用人工方法让卵细胞和精子在体外受精，并进行早期胚胎发育，然后移植到母体子宫内发育而诞生的婴儿。“试管婴儿”可以简单地理解成由实验室的试管代替了输卵管的功能而称为“试管婴儿”。尽管体外受精原用于治疗由输卵管阻塞引起的不孕症，现已发现体外受精对由于宫内膜异位症(endometriosis)，精子异常(数目异常或形态异常)引起的不孕症，甚至原因不明性不孕症都有所帮助。
体外授精：将精子进行预处理，将精液经过洗涤后去除精浆中的杂质，将精子放入培养箱中进行上游，然后将上游到培养液中的精子加入到含有卵子的培养基内；卵子受精后形成一个新细胞即受精卵，然后继续培养；分裂至8～10个细胞的胚胎或囊胚时，将胚胎或囊胚移植至女性子宫腔底部，一般距离宫底1.5cm左右。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于胚胎移植前培养的胚胎培养液，可显著提高胚胎着床率。
本发明提供了一种用于胚胎或囊胚的体外培养的培养液，包括：层粘连蛋白、纤粘连蛋白和表皮生长因子；所述培养液中，层粘连蛋白的浓度为10-300μg/mL、纤粘连蛋白的浓度为10-100μg/mL，表皮生长因子的浓度为10-100ng/mL。
所述培养液中，层粘连蛋白的浓度为80μg/mL、纤粘连蛋白的浓度为40μg/mL，表皮生长因子的浓度为20ng/mL。
所述培养液中，还包括基础培养液。
所述培养液中，余量为基础培养液。
所述培养液由基础培养液、层粘连蛋白、纤粘连蛋白和表皮生长因子组成。
所述基础培养液可为进行胚胎培养或囊胚培养的基础培养液。
所述基础培养液可为进行胚胎培养或囊胚培养的市售培养液。
所述基础培养液可为进行胚胎培养或囊胚培养的常规培养液。
所述基础培养液具体可为囊胚培养液。
所述囊胚培养液具体可为：G-2TM plus。
G-2TM plus：Vitrolife Sweden AB；产品目录号为10132。
本发明还保护所述培养液在体外培养胚胎中的应用。
所述胚胎为体外受精的胚胎。
所述胚胎为移植到母体子宫前的胚胎。
所述胚胎为体外受精且移植到母体子宫前的胚胎。
所述胚胎为体外受精－胚胎移植中移植到母体子宫前的胚胎。
本发明还保护所述培养液在体外培养囊胚中的应用。
所述囊胚为体外受精的囊胚。
所述囊胚为移植到母体子宫前的囊胚。
所述囊胚为体外受精且移植到母体子宫前的囊胚。
所述囊胚为体外受精－胚胎移植中移植到母体子宫前的囊胚。
本发明还保护一种体外培养胚胎的方法，包括如下步骤：采用所述培养液体外培养胚胎。
所述胚胎为体外受精的胚胎。
所述胚胎为移植到母体子宫前的胚胎。
所述胚胎为体外受精且移植到母体子宫前的胚胎。
所述胚胎为体外受精－胚胎移植中移植到母体子宫前的胚胎。
所述体外培养的条件可为：采用37℃、5％CO2的培养箱。
本发明还保护一种体外培养囊胚的方法，包括如下步骤：采用所述培养液体外培养囊胚。
所述囊胚为体外受精的囊胚。
所述囊胚为移植到母体子宫前的囊胚。
所述囊胚为体外受精且移植到母体子宫前的囊胚。
所述囊胚为体外受精－胚胎移植中移植到母体子宫前的囊胚。
所述体外培养的条件可为：采用37℃、5％CO2的培养箱。
本发明还保护所述培养液在体外受精－胚胎移植(试管婴儿)中的应用。
本发明还保护所述培养液在制备用于体外培养胚胎的试剂中的应用。
本发明还保护所述培养液在制备用于体外培养囊胚的试剂中的应用。
本发明还保护所述培养液在制备用于体外受精－胚胎移植(试管婴儿)的试剂中的应用。
以上任一所述胚胎为人胚胎。
以上任一所述囊胚为人囊胚。
以上任一所述胚胎为囊胚期的胚胎。
以上任一所述胚胎为发育处于4-5期的胚胎。
以上任一所述囊胚为发育处于4-5期的囊胚。
在进行胚胎移植前先采用本发明提供的培养液进行体外培养，可以显著增加胚胎的着床率。本发明对于生殖医学领域具有重大的应用推广价值。
附图说明
图1为囊胚粘附于子宫内膜细胞(体外着床模型)的原理示意图。
图2为实验组囊胚粘附于子宫内膜细胞并扩展的过程照片。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。如无特殊说明，以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。如无特殊说明，实施例中所用的基础培养液为市售囊胚培养液(G-2TMplus；Vitrolife Sweden AB；产品目录号为10132)。实施例中的细胞培养均采用37℃、5％CO2的培养箱。
囊胚包括囊胚腔、内细胞团和滋养层，分别进行评分。根据囊胚腔是否孵化以及大小将囊胚的发育分为六个时期：1期：早期有腔室囊胚，囊胚腔小于胚胎总体积的1/2；2期：囊胚腔体积大于或等于胚胎总体积的1/2；3期：完全扩张囊胚，囊胚腔完全占据了胚胎的总体积；4期:扩张囊胚，囊胚腔完全充满胚胎，胚胎总体积变大，透明带变薄；5期：正在孵出的囊胚，囊胚的一部分从透明带中逸出；6期：孵出的囊胚，囊胚全部从透明带中逸出。内细胞团评分标准：A级：细胞数目多，结合紧密；B级：细胞数目偏少，结合尚紧密；C级：细胞数目较少，结合较松散；D级：细胞数目极少。滋养层评分标准：A级，细胞数目多，囊胚四周均有细胞分布；B级：细胞数目尚可，囊胚四周均有细胞分布；C级：细胞数目较少，上皮细胞较松散；D级：细胞数目极少。4DD-5DD的囊胚指的是满足如下三个条件的囊胚：囊胚发育处于4-5期，内细胞团评分为D级，滋养层评分为D级。通常，3CC以上的囊胚为优质囊胚，4DD-5DD的囊胚为废弃囊胚。
实施例1、胚胎培养液的制备
培养液甲由基础培养液和添加物组成，添加物及其在培养液甲中的浓度见表1。
表1
层粘连蛋白(重组人层粘连蛋白-521，GibcoTM)：赛默飞世尔科技(中国)有限公司，货号A29249。纤粘连蛋白(Fibronectin Human Protein,Plasma，GibcoTM)：赛默飞世尔科技(中国)有限公司，货号33016015。表皮生长因子(Human EGF Recombinant Protein)：赛默飞世尔科技(中国)有限公司，货号PHG0311L。
培养液乙：基础培养液。
实施例2、胚胎培养液的应用效果比较
一、制备子宫内膜细胞悬液
子宫内膜组织为取自黄体期的人子宫内膜，活检取样(取样对象已知情同意)。
子宫内膜细胞的原代培养：(1)将获得的新鲜的子宫内膜组织在无菌离心管中用基础培养液洗涤(以去除杂质及血液)，然后剪成1mm×1mm×1mm的小块，肉眼观察为糊状；(2)加入0.1％I型胶原酶，37℃消化约30min(每5min吹打以促使消化充分)，然后加入等体积含10％胎牛血清的DMEM/F12培养基终止消化；(3)吹打细胞液，然后1500r/min离心5min，弃上清，用基础培养液洗涤沉淀；(4)用DMEM/F12培养基重悬细胞沉淀，调整细胞密度至1×106个细胞/ml，接种于细胞培养皿中，然后培养至80～90％融合(每48小时更换新的DMEM/F12培养基)。
子宫内膜细胞的传代培养：(1)取原代培养的细胞培养皿，吸弃培养基，用基础培养液洗涤贴壁细胞；(2)加入0.25％胰酶，37℃消化5min(此时，显微镜下观察到细胞收缩、变圆变亮，细胞之间不再连接成片)，用吸管反复轻柔吹打皿底细胞，直至成单细胞悬液；(3)迅速加入含10％胎牛血清的DMEM/F12培养基终止消化，1500r/m离心5min，弃上清；(4)用基础培养液洗涤细胞沉淀；(5)用DMEM/F12培养基重悬细胞沉淀，调整细胞密度至1×106个细胞/ml，接种于新的细胞培养皿中，然后培养至对数生长期。
制备细胞悬液：(1)取传代培养的细胞培养皿，吸弃培养基，用基础培养液洗涤贴壁细胞；(2)加入0.25％胰酶，37℃消化5min，用吸管反复轻柔吹打皿底细胞，直至成单细胞悬液；(3)迅速加入含10％胎牛血清的DMEM/F12培养基终止消化，1500r/m离心5min，弃上清；(4)用PBS缓冲液洗涤细胞沉淀；(5)用DMEM/F12培养基重悬细胞沉淀，调整细胞密度至1×106个细胞/ml，即为细胞悬液。
二、采用培养液培养并考量效果
取96孔板，加入步骤一制备的细胞悬液(每孔10μl)和含10％(体积比)胎牛血清的DMEM/F12培养基(每孔90μl)，然后37℃培养24小时；然后吸弃上清，加入供试培养液，37℃培养4小时；然后每孔加入1个囊胚，37℃培养24小时；然后，观察囊胚着床率，计算囊胚的贴附率及粘附面积。
供试培养液为实施例1制备的培养液甲时作为实验组。
供试培养液为实施例1的培养液乙时作为对照组。
每种供试培养液测试20个囊胚。
囊胚均为4DD-5DD的囊胚(废弃的人囊胚，提供者知情同意)。
粘附面积即滋养层团粘附面积，胚胎着床时滋养层细胞与子宫内膜细胞接触并粘附于子宫内膜细胞，在相同的时间内，粘附面积越大表明胚胎着床效果越好。
囊胚粘附于子宫内膜细胞(体外着床模型)的原理示意图见图1。
实验组囊胚粘附于子宫内膜细胞并扩展的过程照片见图2。
囊胚的贴附率和粘附面积的结果见表2。结果表明，采用本发明提供的培养液甲进行囊胚培养，可以极其显著的提高贴附率和粘附面积，从而有助有胚胎着床、提高胚胎着床率。
表2
| 实验组 | 对照组 | P值 | |
| 贴附率 | 90％(18/20) | 60％(12/20) | ＜0.05 |
| 粘附面积(μm2) | 83670±9447 | 49190±1026 | ＜0.05 |
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
Claims (9)
1.一种用于胚胎或囊胚的体外培养的培养液，包括：层粘连蛋白、纤粘连蛋白和表皮生长因子；所述培养液中，层粘连蛋白的浓度为10-300μg/mL、纤粘连蛋白的浓度为10-100μg/mL，表皮生长因子的浓度为10-100ng/mL。
2.如权利要求1所述的培养液，其特征在于：所述培养液中，层粘连蛋白的浓度为80μg/mL、纤粘连蛋白的浓度为40μg/mL，表皮生长因子的浓度为20ng/mL。
3.如权利要求1或2所述的培养液，其特征在于：所述培养液由基础培养液、层粘连蛋白、纤粘连蛋白和表皮生长因子组成。
4.权利要求1至3中任一所述培养液在体外培养胚胎或囊胚中的应用。
5.一种体外培养胚胎或囊胚的方法，包括如下步骤：采用权利要求1至3中任一所述培养液体外培养胚胎或囊胚。
6.权利要求1至3中任一所述培养液在体外受精－胚胎移植中的应用。
7.权利要求1至3中任一所述培养液在制备用于体外培养囊胚的试剂中的应用。
8.权利要求1至3中任一所述培养液在制备用于体外培养胚胎的试剂中的应用。
9.权利要求1至3中任一所述培养液在制备用于体外受精-胚胎移植的试剂中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210012419.3A CN116445395A (zh) | 2022-01-06 | 2022-01-06 | 一种用于胚胎移植前培养的胚胎培养液 |
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| CN202210012419.3A CN116445395A (zh) | 2022-01-06 | 2022-01-06 | 一种用于胚胎移植前培养的胚胎培养液 |
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| CN116445395A true CN116445395A (zh) | 2023-07-18 |
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ID=87128914
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2022
- 2022-01-06 CN CN202210012419.3A patent/CN116445395A/zh active Pending
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