KR20120120157A - 생식줄기세포 보관 시스템 - Google Patents

생식줄기세포 보관 시스템 Download PDF

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파리보르츠 이자디아르
조엘 마르흐
채드 마키
제이슨 파치아로티
토마스 라모스
킬레 하우어튼
제이드린드 웅
마르니에 올름스테드
조니 융-치옹 초우
콘스탄스 유엔
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조니 융-치옹 초우
프라임젠 바이오테크 엘엘씨
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Abstract

인간 생식줄기세포 및 생식샘 조직의 단리, 특징규명, 냉동보존 및 보관 방법 및 시스템이 제공된다. 냉동보존된 세포를 이식하여 불임 생식 기관에서 재증식시키는 방법도 개시된다.

Description

생식줄기세포 보관 시스템{GERMLINE STEM CELL BANKING SYSTEM}
관련 출원에 대한 상호-참조
본원은 그의 전체 내용이 본원에 참고로 도입되어 있는, 2009년 11월 5일자로 출원된 미국 가출원 제61/258,535호에 대한 이익을 미국 특허법(35 U.S.C.) 제119조(e) 하에 주장한다.
본 발명의 기술분야
본 발명은 생식줄기세포에 대한 손상으로 인해 불임의 위험에 있는 환자의 생식줄기세포를 보관하고 추후에 상기 환자의 생식능력(fertility potential)을 회복시키는 시스템에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 생식줄기세포의 수집 및 단리, 상기 세포의 가공 및 냉동보존 및 상기 세포의 생식능력의 측정에 관한 것이다. 상기 생식줄기세포가 단리된 환자에서 생식능력을 회복시키는 방법도 개시되어 있다.
생식줄기세포는 생식 기관, 즉 난소 및 정소에 존재하고 포유동물 신체에서 가장 중요하고 보호된 줄기세포 부류 중 하나를 잠재적으로 대표한다. 유전적 보존 및 높은 텔로머라제(telomerase) 활성뿐만 아니라 염색질 염색체 변형을 가진 광범위한 DNA 변형도 이들 조직들로부터 유래된 줄기세포에서 보고되었다. 과학자들은 어떠한 유형의 줄기세포들이 성체 생식 조직에 존재하는지에 대해서뿐만 아니라 분화에 있어서 이들의 잠재력에 대해서도 의견을 달리한다.
화학요법 및 방사선 치료는 암세포뿐만 아니라 빠르게 분열하는 세포도 표적화한다. 정소에서, 빠르게 분열하는 줄기세포는 이들 노출에 대해 매우 민감하다. 사춘기전 정소에서, 생식줄기세포는 유사하게 민감하고 방사선 노출 후 급격하게 투여량 의존적으로 고갈된다. 낮은 투여량의 세포독성 약물 또는 방사선조사는 분화하는 정조세포를 고갈시키지만, 덜 민감한 정조줄기세포뿐만 아니라 정모세포 및 정자세포는 생존할 수 있다. 분화하는 줄기세포들은 정자세포로의 그들의 성숙을 계속할 수 있고 생존하는 줄기세포 집단으로부터 발생된 줄기세포들과 함께 정세관에서 재콜로니화될 수 있다.
그러나, 심각한 고갈의 경우, 정자형성은 극소수의 정세관에서만 회복될 수 있으므로 생식능력을 제한한다. 환자들은 정소 줄기세포의 완전한 고갈 후 영구적으로 불임이 될 것이다. 정자형성에 대한 영향은 사춘기에 또는 사춘기 전에 가장 급격하게 나타나는데, 이는 정자가 사춘기후 남성에서와 같이 전형적으로 수득되어 냉동보존될 수 없기 때문이다. 정자형성을 재개시할 충분한 시간이 주어진 경우 심지어 소수의 줄기세포가 정세관에서 재콜로니화될 수 있다.
최근까지, 인간을 포함하는 대다수의 포유동물 종의 암컷 생식샘(gonad)이 각각의 월경 주기 동안 배란시 방출된 난자의 축적물로서 작용하는 원시난포 내에 봉입된 한정된 수의 감수분열적으로 정지된 생식세포(난모세포)를 수용한다고 생각되었다. 난모세포의 수는 궁극적으로 생식세포의 난소 불임을 야기하는 것으로 널리 인식되어 있는 아폽토시스를 수반하는 기작을 통해 출생 후 계속 감소한다. 인간에서, 난모세포 보존물의 소진은 전형적으로 폐경을 유발하는 50세 동안 일어난다.
또한, 생식생물학의 기본 원칙에 따르면, 난소 생식세포 풀(pool)은 일단 고갈되면 보충될 수 없다고 생각되었다. 따라서, 난모세포의 상실을 가속화하는 임의의 처리는 생식능력을 감소시킬 우려가 있고 예상된 것보다 더 어린 연령에서 폐경을 초래할 것이다. 예를 들면, 난소에 손상을 주는 광범위한 물질들, 예컨대, 화학요법제 및 방사선요법에의 여성의 노출은 일반적으로 조기 폐경 및 비가역적인 불임을 초래한다. 현재, 다양한 불리한 조건 하에서 생식능력 및 정상 난소 기능을 보존하는 제한된 치료 방법은 침습적이고(예를 들면, 난소 조직 단편 또는 단일 난모세포의 냉동보존) 종종 호르몬에 반응하는 종양을 가진 많은 여성들의 경우 의학적으로 부적합할 수 있는 선행 호르몬 요법을 필요로 한다. 또한, 폐경기에서 정상 난소 기능상실을 연기하는 치료 방법이 현재 존재하지 않는다.
수컷 및 암컷 둘다에서 기능성 생식세포를 회복시키는 2가지 주요 방법이 확인되었다. 제1 방법은 미성숙 조직(난소 또는 정소) 조직 단편을 생존 조직 상으로 이식하는 것이고, 제2 방법은 줄기세포의 단리 및 이식에 기초한 방법이다.
줄기세포 이식은 설치류 동물 모델에서 개발되었다. 마우스 또는 밀접하게 관련된 종의 생식세포를 마우스의 정세관 내로 미세주입하는 것은 공여자 정조줄기세포로부터의 정자형성을 재자극하였다. 정조세포는 이식 전에 냉동보존될 수 있거나 배양될 수 있다. 유사하게 냉동보존된 난소 피질 조직은 양 및 인간에 이식되었고, 그 결과 발정이 재개되고 정상 교배 후 생존 자손이 출생되었다.
따라서, 성숙 정자 또는 난자를 보관할 능력을 갖지 않은 환자에서 생식력을 회복시키기 위해 생식세포 보관 시스템이 인간에서 필요하다.
본 발명의 요약
본 개시내용은 수컷 또는 암컷 둘다로부터 생식줄기세포를 수집하고, 단리하고, 증폭시키고, 가공하고, 냉동보존하고, 분석하고, 방출하고 이식하는 방법을 포함하는 생식세포 보관 시스템을 제공한다.
본원에 개시된 한 실시양태에서, 생식능력의 상실 위험에 있는 포유동물로부터 생식샘 조직을 수집하는 단계; 상기 생식샘 조직을 중앙 보관 시설로 수송하는 단계; 상기 생식샘 조직을 가공하는 단계; 상기 생식샘 조직을 냉동보존하는 단계; 및 상기 냉동보존된 생식샘 조직의 생식력을 측정하는 단계를 포함하는, 생식줄기세포를 보관하는 방법이 제공된다.
상기 방법의 한 실시양태에서, 생식샘 조직은 정소 조직이다. 또 다른 실시양태에서, 정소 조직의 가공은 정소 조직의 약 0.5 내지 2.0 ㎟ 조각을 제조하는 단계를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 정소 조직의 가공은 상기 정소 조직을 콜라겐분해효소(collagenase), DNA 분해효소(DNase), 히알루론산분해효소(hyaluronidase) 및 트립신(trypsin)으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 효소로 분해하는 단계; 및 상기 하나 이상의 효소를 불활성화시켜 분리된 정소 세포의 현탁액을 수득하는 단계를 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 상기 방법은 분리된 정소 세포로부터 수컷 생식줄기세포를 단리하는 단계를 추가로 포함하고, 이때 상기 수컷 생식줄기세포는 황체형성 호르몬 수용체를 발현하지 않는다는 점을 특징으로 한다. 또 다른 실시양태에서, 상기 방법은 분리된 정소 세포로부터 수컷 생식줄기세포를 단리하는 단계를 추가로 포함하고, 이때 상기 수컷 생식줄기세포는 SSEA-4를 발현한다는 점을 특징으로 한다. 또 다른 실시양태에서, 상기 수컷 생식줄기세포는 GFR-α1 및 VASA를 추가로 발현한다.
상기 방법의 또 다른 실시양태에서, 생식력의 측정은 시험관 내에서 성숙 정자로 분화하는 정소 조직의 능력에 의해 수행된다. 또 다른 실시양태에서, 생식력의 측정은 감수분열 마커 및 감수분열후 마커의 발현, 크기 및 형태 중 하나 이상에 의한 정소 세포의 특징의 측정이다.
상기 방법의 한 실시양태에서, 생식샘 조직은 난소 조직이다. 또 다른 실시양태에서, 난소 조직의 가공은 난소 조직의 약 0.5 내지 3.0 ㎟ 조각을 제조하는 단계를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 상기 가공은 상기 난소 조직 조각을 콜라겐분해효소, DNA 분해효소, 히알루론산분해효소 및 트립신으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 효소로 분해하는 단계; 및 상기 하나 이상의 효소를 불활성화시켜 분리된 난소 세포의 현탁액을 수득하는 단계를 추가로 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 생식력의 측정은 시험관 내에서 성숙 난자로 분화하는 상기 난소 조직의 능력에 의해 수행된다. 또 다른 실시양태에서, 생식력의 측정은 감수분열 마커 및 감수분열후 마커의 발현, 크기 및 형태 중 하나 이상에 의한 난소 세포의 특징의 측정이다.
또 다른 실시양태에서, 상기 방법은 냉동보존된 생식샘 조직을 상기 생식샘 조직이 단리된 동일한 개체 내의 잔류 생식샘 조직 내로 이식하는 단계를 추가로 포함한다.
본원에 개시된 한 실시양태에서, 생식샘 조직을 수집하는 수단; 생식샘 조직을 수송하는 수단; 생식샘 조직을 가공하여 생식줄기세포를 단리하는 수단; 생식샘 조직 또는 상기 생식줄기세포를 냉동보존하는 수단; 및 냉동보존된 생식샘 조직 또는 상기 냉동보존된 생식줄기세포의 생식력을 측정하는 수단을 포함하는 생식줄기세포 보관 시스템이 제공된다.
도 1은 유세포분석(flowcytometry)을 이용하여 형질전환 OG2 마우스로부터 단리된 정소 줄기세포의 GFP(녹색 형광 단백질) 양성 하위집단의 농축을 보여준다. GFP 발현에 의해 표시된 Oct-4+ 세포는 야생형(도 1a)과 비교할 때 신생아(도 1b) 및 성체(도 1c) OG2 마우스에서 별개의 세포 집단으로서 발견되었다. Oct-4+ 세포들 중에서, c-Kit+(R5) 및 c-Kit-(R2)로 구성된 2개의 명확한 하위집단들이 발견되었다(도 1d 및 1e). GFP의 발현과 c-Kit의 발현 사이의 상관관계도 도시되어 있다(도 1f 내지 1h).
도 2는 배양에서 다중분화능(multipotent) 생식세포주(mGC)의 발달 동안 형태학적 변화를 보여준다. 마우스 Oct-4+/GFP+ 세포는 배양 전에 세포 제제에서 관찰되었다(도 2의 a; 화살표; 1 내지 3일). 배양 직전, Oct-4의 하향조절이 관찰되었다(도 2의 b; 3 내지 7일). 배양 2주에서 세포의 부착 후, 분명한 형태학적 변화가 일어났다(도 2의 c, 7 내지 15일; 도 2의 d, 15 내지 20일). 배양 후 약 3주에서, 작은 둥근 세포를 함유하는 콜로니가 형성되었다(도 2의 e; 20 내지 30일). Oct-4의 상향조절은 배양 후 약 1개월에서 관찰되었다(도 2의 f; 30 내지 40일). 신생아 OG2, 성체 OG2 또는 신생아 OG2-LacZ로부터 유래된 3개의 확립된 mGC 세포주의 영상이 각각 도 2의 g 내지 i에 제시되어 있다(도 2의 g, 신생아 OG2; 도 2의 h, 성체 OG2; 도 2의 i, OG2-LacZ). 축적 막대: 50 ㎛.
도 3은 15% 태아소 혈청(FBS)으로 보충된 PM-1(상표명) 배지에서 마우스 배아 섬유모세포(MEF) 영양세포층 상에서 배양된 다중분화능 생식전구세포를 보여준다. 배양 동안 상이한 시점에서, 형광 보조된 세포 분류(FACS)를 이용하여 GFP+ 세포의 수를 측정하였다(도 3a 내지 3d). 도 3e는 세포수 대 시간의 그래프를 보여준다. 축적 막대는 60 ㎛에 상당한다.
도 4는 mGC의 표현형적 및 분자적 특징규명을 보여준다. 다분화능(pluripotent) 및 생식세포 마커의 면역국소화(immunolocalization)는 Oct-4의 경우 도 4a 내지 4d에 도시되어 있고, Nanog의 경우 도 4e 내지 4h에 도시되어 있고, SSEA-1의 경우 도 4m 내지 4o에 도시되어 있고, 생식세포 마커 VASA의 경우 도 4i 내지 4l에 도시되어 있다. 축척 막대: 도 4a 내지 4h: 25 ㎛; 도 4i 내지 4o: 20 ㎛. RT-PCR에 의해 측정된 다분화능 마커 및 생식 특이적 마커의 발현은 도 4q에 도시되어 있다. 면역침전(IP) 전 및 후 mGC 세포에서 Oct-4, Nanog 및 Sox2의 단백질 함량의 웨스턴 블롯 분석은 도 4p에 제시되어 있다.
도 5는 성체 지방세포로부터 유래된 줄기세포(ADSC), 마우스 ES 세포, c-kit 분류 후 새로 단리된 생식줄기세포 및 계대배양 10의 다중분화능 생식줄기세포에서 텔로머라제 활성 및 핵형(karyotype) 분석을 보여준다(신생아 OG2). 생식줄기세포에서 텔로머라제 활성은 마우스 ES 세포에 필적할만하고 ADSC 세포보다 더 높다(도 5a). 도 5b는 동일한 신생아 OG2 세포주의 핵형을 보여준다. 사진은 분석된 80개의 중기 스프레드(spread)를 대표한다. 15회 계대배양 후 세포는 정상 핵형을 나타낸다.
도 6은 (NGC) 배양 전 및 (GC) 배양 후 다중분화능 생식전구세포의 각인(imprinting) 분석으로서, 차등적으로 메틸화된 구역 Meg3, Peg10, Oct-4, Igf2r 및 Rasgrf1에 대해 마우스 ES 세포와 비교된 각인 분석을 보여준다.
도 7은 mGC의 자연발생적 분화를 보여준다. 배상체(EB; 도 7a)의 낭배형성 및 극성화된 상피를 표시하는 마커(E-캐드헤린(cadherin) 및 라미닌(laminin)1; 도 7b 및 7c)의 발현 및 3개의 생식층, 즉 외배엽(ZIC1, PAX6, SOX1), 내배엽(GATA4, FOXA2) 및 중배엽(BRACHYURY, BMP4 및 COL2A1)의 초기 발달이 도 7d 내지 7f에 도시되어 있다. 배양 동안 재프로그래밍 mGC도 심근세포(도 7g 내지 7j), 지방세포(도 7k) 및 신경세포(도 7l 및 7m)로 자연발생적으로 분화하였다. 축적 막대: 도 7a 및 7i: 50 ㎛; 도 7c 및 7e: 30 ㎛; 도 7b 및 7d: 25 ㎛; 도 7g, 7h 및 7l: 45 ㎛; 도 7k: 12 ㎛.
도 8은 계통 특이적 표현형으로의 mGC의 유도된 분화를 보여준다. 신경 마커를 발현한 세포의 공초점 영상은 도 8a 내지 8g에 도시되어 있다. 신경 유전자 마커의 발현은 도 8j에 도시되어 있다. 심근세포로 분화된 mGC의 공초점 영상은 도 8i에 제시되어 있다. 심장 유전자 마커의 발현은 도 8l에 도시되어 있다. mGC의 분화 후 알시안 블루 양성 연골세포는 도 8h에 나타나 있다. 연골세포 특이적 유전자의 발현은 도 8k에 도시되어 있다. 축적 막대: 도 8a, 8c 및 8g: 20 ㎛; 도 8b 및 8h: 50 ㎛; 도 8d 내지 8f 및 8j: 10 ㎛.
도 9는 마우스 ES 세포가 피부, 근육 및 정소 내로 이식된 후 기형종을 형성하지만(도 9의 a 내지 f), 다중분화능 LacZ-GFP mGC의 이식 후에는 기형종이 형성되지 않음(도 9의 g 내지 l)을 보여준다. ESC로부터 유래된 기형종의 형태는 얇은 파라핀 절편 상의 H&E 염색에 의해 확인된 반면, 이식된 다중분화능 생식세포(mGC)의 운명은 청색으로 나타난 LacZ 염색에 의해 확인되었다. 이식 후 6주에서, GFP-LacZ+ mGC가 피부(모낭 및 인접 피지선의 융기 영역, 화살촉으로 표시됨; 도 9의 g 내지 h), 근육(화살표로 표시됨; 도 9의 i 내지 j) 및 정소(화살표로 표시됨; 도 9의 k)에서 발견되었다. 배양 전 및 후에 생식줄기세포의 이식 후 정소 재생은 도 9의 m 내지 r에 제시되어 있다. 면역결핍 마우스의 정상 정소의 횡단면은 도 9의 m에 도시되어 있다. 부설판 처리 후 1개월에서, 대다수의 정세관이 내인성 정자형성으로 인해 고갈되어 있다(도 9의 n). 새로 단리된 Oct-4+ 세포를 이식받은 마우스의 정소는 정세관 횡단면의 50% 이상에서 정자형성을 보였는데, 이것은 SSC(정조줄기세포) 성질을 가진 세포가 이 집단에 존재한다는 것을 암시한다(도 9의 o). Oct-4+/c-Kit- 세포를 이식받은 마우스의 정세관의 80% 이상이 어느 정도의 정자형성을 보였지만(도 9의 p). Oct-4+/c-Kit+ 세포를 제공받은 마우스의 대다수의 정세관 횡단면이 비어있었다(도 9의 q). 또한, 이식된 mGC는 수용자 정소에서 재증식하지 못하였는데, 이것은 상기 mGC가 SSC 성질을 갖지 않는다는 것을 암시한다(도 9의 r). 축적 막대: 도 9의 a 및 k: 275 ㎛; 도 9의 b, d 및 i: 60 ㎛; 도 9의 c: 140 ㎛; 도 9의 e: 100 ㎛; 도 9의 f: 50 ㎛; 도 9의 g 및 l: 125 ㎛; 도 9의 h 및 j: 40 ㎛; 도 9의 m 내지 r: 60 ㎛.
도 10은 mGC가 포배 및 숙주 배아 내로 도입된 후 키메라를 형성한다는 것을 보여준다. 초기 배아 발달 및 포배 형성 동안 LacZ-GFP+ mGC 세포의 도입은 도 10의 a 내지 d에 제시되어 있다. 8 세포 단계에서 주입된 GFP-lazZ 세포의 대다수는 배아 발달의 2일째 날에 도입되었고(화살촉으로 표시됨), 일부 세포는 아직 도입되지 않았다(화살표로 표시됨). GFP+ 세포는 포배의 내부 세포 덩어리(화살표로 표시됨) 내로 도입된 3.5일째 날에 추가로 발견되었다. 상이한 정도의 키메라현상(chimerism)을 보이는 4개의 키메라 배아의 일례는 전체 배아 염색으로서 도 10의 e에 도시되어 있다. 내부 기관을 가시화하기 위해, 배아들 중 2개의 배아의 시상 절편(별표로 표시됨)도 도시되어 있다(도 10의 f 및 g). 도 10의 h 내지 k는 해부된 기관에서 키메라 패턴을 보여주고, 도 10의 l 내지 o는 뇌, 심장, 간 및 생식샘 능선에서 조직학적 절편 내의 키메라 세포 집단을 보여준다(키메라 LacZ-GFP 세포는 청색으로 나타남). 키메라 새끼의 조직에서의 GFP 및 LacZ DNA의 증폭은 각각 도 10의 p 및 q에 도시되어 있다. 축적 막대: 도 10의 a 및 c: 50 ㎛; 도 10의 b 및 d: 25 ㎛; 도 10의 d 및 e: 1250 ㎛; 도 10의 h 내지 k: 625 ㎛; 도 10의 l 내지 n: 50 ㎛; 도 10의 o: 10 ㎛.
도 11은 형질전환 OG2 마우스로부터 새로 단리된 신생아 난소 세포 및 성체 난소 세포의 결과를 유세포분석도에서 그래프로 보여주는데, 이때 Oct-4 프로모터는 GFP의 발현을 유도한다. 도 11a는 GFP의 형광 강도에 의해 그래프로 도시된 성체 난소 생식줄기세포를 보여준다. 도 11b는 GFP(GFP+ 세포 상의 c-Kit의 수준)의 형광 강도에 의해 그래프로 도시된 신생아 난소 생식줄기세포를 보여준다. 도 11c는 CD117로도 공지된 c-Kit를 발현하는 신생아 GFP+ 세포의 형광 강도를 그래프로 보여준다.
도 12는 출생 후 2일째 날 형질전환 OG2 마우스의 난소에서 녹색 형광 단백질의 발현에 의해 식별될 수 있는 생식줄기세포를 보여준다. 도 12a 및 12b는 총 형광을 보여주고, 도 12c는 자가형광이 제거된 컴퓨터 증강된 횡단면 영상을 보여준다.
도 13은 OG2 형질전환 마우스로부터 단리된 마우스 배아줄기세포(레인 3), 마우스 배아섬유모세포(MEF, 레인 4), GFP+ 생식줄기세포(레인 5) 및 GFP- 세포(레인 6)로부터 단리된 mRNA의 RT-PCR 분석의 결과를 보여준다.
도 14는 MEF 세포로 구성된 영양세포 층 상에서 콜로니로서 확립되고 성장하는, 단리되고 실질적으로 정제된 난소 생식줄기세포의 현미경 영상을 보여준다. 도 14a는 배양 4일 후 콜로니를 보여주고, 도 14b는 대표적인 콜로니 형태의 제1 유형을 보여주고, 도 14c는 대표적인 콜로니 형태의 제2 유형을 보여주고, 도 14d는 콜라겐분해효소를 사용한 계대배양 후 콜로니 형태를 보여주고, 도 14e는 콜라겐분해효소 계대배양 후 명확히 한정된 경계를 가진 대표적인 콜로니 형태의 제3 유형을 보여주고, 도 14f는 콜라겐분해효소 계대배양 후 약하게 한정된 경계를 가진 대표적인 콜로니 형태의 제4 유형을 보여주고, 도 14g는 계대배양 #1 후 콜로니 형태를 보여주고, 도 14h는 계대배양 #2 후 콜로니 형태를 보여주고, 도 14i는 계대배양 #3 후 콜로니 형태를 보여주고, 도 14j 및 14k는 계대배양 #4 후 난소 생식줄기세포 콜로니의 2개의 상이한 확대를 보여준다.
도 15는 다분화능 줄기세포 마커 Oct-4(도 15a); 다분화능 줄기세포 마커 Nanog(도 15b); 생식세포 마커 VASA(도 15c); 및 다분화능 줄기세포 마커 알칼리성 인산분해효소(phosphatase)(도 15d)의 발현을 나타내도록 염색된, 단리되고 실질적으로 정제된 난소 생식줄기세포의 면역세포화학적 염색을 보여준다.
도 16은 분화하는 난소 생식줄기세포의 영상을 보여준다. 도 16a는 암컷 생식세포 콜로니의 중심에서 성장하는, 일차 난모세포와 유사한 GFP+ 세포를 보여주고; 도 16b는 여포 유사 구조체의 영상을 보여주고; 도 16c는 여성 생식세포 콜로니의 주변에서 성장하는, 일차 난모세포와 유사한 GFP+ 세포를 보여주고; 도 16d는 착색된 콜로니를 보여준다.
도 17은 큰(> 15 ㎛) 난모세포 유사 세포를 확인시켜주고 특징규명하는, 도 16의 배양된 난소 세포의 유세포분석에 의한 크기 분석의 결과를 산점도 형태의 그래프로 보여준다: MEF 대조군 세포(< 15 ㎛)를 보여주는 도 17a, 및 도 16의 난모세포 유사 세포를 보여주는 도 17b.
도 18은 성체 영장류 정소에서 정조줄기세포 및 생식세포 마커의 면역조직화학적 국소화(localization)를 보여준다.
도 19는 영장류 정소의 정세관의 기저막에서 줄기세포 마커에 의해 양성적으로 염색된 세포의 분포를 보여준다.
도 20은 유세포분석을 이용한 영장류 생식줄기세포의 표현형적 특징규명을 보여준다.
도 21은 영장류 생식줄기세포의 유세포분석을 보여준다.
도 22는 상이한 농축된 영장류 생식세포 집단들에서 GFRα+/VASA+ 세포를 보여준다.
도 23은 영장류 생식줄기세포 하위집단의 카르복시플루오레세인 디아세테이트 석신이미딜 에스테르(CSFE) 활성을 보여준다.
도 24는 영장류 생식줄기세포를 가진, 부설판으로 처리된 영장류 정소의 재증식을 보여준다: 비분류된 세포를 이식받은 수용자 마우스의 정세관(도 24의 A); 삼중 마커에 의해 분류된 세포를 이식받은 수용자 마우스의 정세관(도 24의 B); SSEA-4+ 분류된 세포를 이식받은 수용자 마우스의 정세관(도 24의 C); 및 모의세포(sham) 이식된 대조군 정소(도 24의 D).
도 25는 요오드화프로피듐에 의해 염색된 영장류 생식줄기세포 집단의 유세포분석에 의해 측정된 DNA 함량을 보여준다.
도 26은 영장류 생식줄기세포의 PLZF 발현(도 26a) 및 텔로머라제 활성(도 26b)의 정량 PCR 분석을 보여준다.
도 27은 증식 세포 핵 항원(PCNA)에 의해 측정된 증식 영장류 생식줄기세포의 백분율을 보여준다.
도 28은 영장류 생식줄기세포 하위집단의 유전자 발현 프로파일을 보여준다.
도 29는 MEF 영양세포 층 상에서의 배양 후 10일째 날 증폭된 영장류 생식줄기세포 콜로니의 형태(도 29의 A); 증폭된 영장류 생식줄기세포 콜로니의 SSEA-4 염색(도 29의 B 및 C); 및 계대배양 4 후 증폭된 영장류 생식줄기세포 콜로니의 GFR-α+ 염색(도 29의 D)을 보여준다.
도 30은 SSEA-4(도 30의 a) 및 VASA(도 30의 b)에 의해 염색된 인간 정소 조직 THT를 보여준다.
도 31은 GFR-α+(도 31의 a) 및 VASA(도 31의 b)에 의해 염색된 THT를 보여준다.
도 32는 VASA(도 32의 a) 및 Nanog(도 32의 b)에 대해 염색된 THT를 보여준다.
도 33은 SSEA-4(도 33의 a) 및 α6-인테그린(도 33의 b)에 대해 염색된 THT를 보여준다.
도 34는 이차 항체에 의해서만 염색된 인간 정소 절편으로 구성된, 도 30 내지 33에 대한 음성 대조군을 보여준다.
도 35는 부설판으로 처리된 수용자 마우스 정소 내로 이식되고 1개월 후 SSEA-4(도 35의 a) 및 인간 핵 단백질(도 35의 b)에 대해 염색된 THT SSEA-4+ 자기 비드 분류된 세포를 보여준다.
도 36은 부설판으로 처리된 수용자 마우스 정소 내로 이식되고 1개월 후 α6-인테그린(도 36의 a) 및 인간 핵 단백질(도 36의 b)에 대해 염색된 THT SSEA-4+ 자기 비드 분류된 세포를 보여준다.
도 37은 부설판으로 처리된 수용자 마우스 정소 내로 이식되고 1개월 후 SSEA-4(도 37의 a) 및 α6-인테그린(도 37의 b)에 대해 염색된 THT SSEA-4+ 자기 비드 분류된 세포를 보여준다.
도 38은 이차 항체에 의해서만 염색된 인간 정소 절편으로 구성된, 도 36 및 37에 대한 음성 대조군을 보여준다.
도 39는 대조군 및 이식된 동물의 정소의 중량을 보여준다.
도 40은 가임(도 40의 a) 및 불임(도 40의 b) 정소를 보여준다.
도 41은 가임 동물 및 불임 동물에서 정자형성(빈 세관 및 부분적으로 채워진 세관의 %)의 단계를 보여준다.
도 42는 불임 마우스 및 가임 마우스에서 GFP 양성 세관의 백분율을 보여준다.
도 43은 성인 정소 세포의 형태 및 세포 표면 마커 분석을 보여준다. 폐쇄성 무정자증 남성으로부터 수득된 정소의 형태(도 43의 a)는 정상 인간 정소(도 43의 b)와 유사하다는 것을 주목한다. 또한, 단리 후, 유사한 형태를 가진 세포가 정상 정소(도 43의 c) 및 무정자증 환자로부터 수집된 정소(도 43의 d) 둘다로부터 수득되었다. SSC가 두 정소 단리물들에 존재하였고 큰 핵 대 세포질 비, 1 내지 3개의 핵소체 및 세포질 봉입체를 가진 둥근 세포로서 확인될 수 있었다는 것을 주목한다. 성인 정소로부터 단리된 세포에서 표면 마커 SSEA-4, CD49f 및 CD90의 유세포분석(도 43e 내지 43h). 구별되는 SSEA-4+, CD49f+ 및 CD90+ 세포 집단들이 성인 정소 생검에서 발견되었고, CD49f 및 CD90에 대해 이중 염색된 세포 집단은 성인 정소에서 전혀 발견되지 않았다(도 43e 내지 43f). 4회의 독립된 유세포분석의 막대그래프 표시가 도 43i에 제시되어 있다.
도 44는 성인 정소에서 정조줄기세포 마커의 면역조직화학적 국소화를 보여준다. 정세관의 기저막에서의 SSEA-4 및 CD49f의 동시국소화(도 44의 A 내지 C). SSEA-4는 정세관의 기저막에서 SSC로 추정되는 정조세포 하위집단에서 특이적으로 국소화되어 있다. 또한, 모든 SSEA-4+ 세포들이 CD49f에 대해 양성을 나타내었지만, SSEA-4-를 나타내는 일부 CD49f+ 세포들이 존재한다. c-kit는 정세관의 기저막에 위치하는 세포 및 보다 진행된 생식세포 둘다에서 발견되었다(도 44의 E 및 F). SSEA-4와 c-Kit의 동시국소화(co-localization)는 SSEA-4+ 세포들 중 일부가 c-Kit를 보유하고 일부는 c-Kit-를 나타낸다는 것을 보여주었다. c-Kit와 CD49f의 동시국소화(도 44의 G 내지 I)는 세관 횡단면의 기저막에서 대다수의 CD49f+ 세포들이 c-Kit에 대해서도 양성으로 염색된다는 것을 보여주었다(화살표로 표시됨). 성인 정소에서 Nanog의 발현 패턴은 c-Kit와 유사하였고 Nanog는 미분화된 생식세포 및 분화된 생식세포 둘다에 존재하였다(도 44의 K 및 L). SSEA-4와 Nanog의 동시국소화는 성인 정소에서 SSEA-4+ 세포의 일부가 Nanog+를 나타낸다는 것을 보여주었다.
도 45는 성인 정소로부터 단리된 SSC의 농축된 집단의 정량 RT-PCR 분석 및 텔로머라제 활성을 보여준다. SSEA-4+ 세포는 GFR-α1, C-Ret, GPR-125 및 hTERT를 포함하는 SSC 특이적 유전자들의 유의하게(P<0.05) 더 높은 발현 수준을 보였다(도 45a). 추가로, c-Kit는 음성 세포와 비교할 때 SSEA-4+ 세포에서 현저히 증가하였다. SSEA-4+ 세포의 텔로머타제 활성도 새로 단리된 비분류된 세포보다 유의하게(P<0.01) 더 높았다(도 45b).
도 46은 마우스 정소에서 재증식하는 인간 정조줄기세포에서 특이적 마커의 발현을 보여준다. 마우스 정소 내의 인간 세포의 본질은 인간 핵 단백질 항체(HNP)에 의해 검출되었다(도 46의 A). 마우스 정소에서 콜로니화되는 모든 인간 세포들이 생식세포 특이적 마커 VASA에 대해 양성으로 염색된다는 것을 주목한다(도 46의 B 및 C). 마우스 정소의 기저막에서 인간 세포들의 일부는 CD49f와 동시국소화되었고 일부는 이 마커에 대해 음성을 나타내었다(도 46의 D 내지 F). SSEA-4와 c-Kit의 동시국소화는 마우스 정소 내의 모든 SSEA-4+ 세포들이 c-Kit를 발현한다는 것을 보여주었다(도 46의 G 내지 I). 마우스 정소에서 콜로니화된 인간 세포들 중에서 일부는 GPR-125와 동시국소화되었고 일부는 다분화능 마커 Nanog에 의해 양성적으로 염색되었다(도 46의 J 내지 L). HNP와 c-Kit의 동시국소화는 마우스 정소 내의 모든 인간 세포들이 c-Kit+를 나타낸다는 것을 보여주었다(도 46의 M 내지 O).
도 47은 유세포분석에 의한 인간 정조줄기세포의 특징규명을 위해 사용된 세포 표면 마커의 발현 패턴을 보여준다. GFR-α1, CD24, CD117 및 CD166을 발현하는 성인 정소에서 발견된 미량의 세포들(1 내지 2%)이 존재하였다. BCRP, CD29, MHCI 및 MHCII는 성인 정소 세포에서 중간 정도로(2 내지 5%) 발현되었다. CD90, CD49f, CD34 및 SSEA-4는 성인 정소로부터 단리된 세포의 표면에서 풍부하게 발견되었다. 값은 양성 세포의 실제 양 - 임의의 자가형광 발생의 양을 나타낸다.
도 48은 조직 동결 전 및 후에 마우스 정소로부터 단리된 세포의 생존율을 보여준다.
도 49는 상이한 세포 농도에서 동결된 해동된 돼지 정소 세포의 평균 생존율을 보여준다.
도 50은 3개의 상이한 시간(도 50a) 동안 및 상이한 세포 농도(도 50b)에서 3개의 상이한 배지 중에 운반된 해동된 인간 정소 세포의 생존율을 보여준다.
도 51은 상이한 농도 및 운반 조건에서 동결된 샘플의 총 세포 회수율(도 51a) 및 생존율(도 51b)을 보여준다.
도 52는 운반된 래트 정소의 평균 정소 세포 생존율의 변화를 시간에 따라 보여준다.
도 53은 불임 마우스의 우측 정소(도 53의 a) 및 좌측 정소(도 53의 b) 내의 GFP+ 정자 및 세관의 유세포분석을 보여준다.
용어의 정의
용어의 하기 정의는 읽는 사람을 위한 도움이 되는 기준으로서 제공된다. 본 특허에서 사용된 용어들은 이들이 본 발명과 관련될 때 특정 의미를 가진다. 통상의 일반적인 의미에 따라 용어들을 사용하기 위해 모든 노력이 기울여졌다. 그러나, 일반적인 통상의 의미와 하기 정의 사이에 불일치가 존재하는 경우, 하기 정의가 일반적인 용법보다 우선한다.
위탁된: 본원에서 사용된 "위탁된"은 특정 기능에 영구적으로 위탁된 것으로 간주되는 세포를 지칭한다. 위탁된 세포는 "최종적으로 분화된 세포"로도 지칭된다.
배양: 본원에서 사용된 "배양" 또는 "배양된"은 세포 분열 및 세포수의 증가가 일어나도록 하는 조절된 조건 하에서의 세포의 증식을 의미한다.
분화: 본원에서 사용된 "분화"는 특정 형태 또는 기능에 대한 세포의 적응을 의미한다. 세포에서, 분화는 보다 위탁된 세포를 발생시킨다.
배아줄기세포: 본원에서 사용된 "배아줄기세포"는 자궁벽에 부착되게 하는 발달 단계에 도달한 발달 배아로부터 유래된 임의의 분화전능(totipotent) 세포를 의미한다. 이 내용에서, 배아줄기세포 및 배아전줄기세포는 동등한 용어이다. 배아줄기세포 유사(ESC 유사) 세포는 배아로부터 직접 단리되지 않은 분화전능 세포이다. ESC 유사 세포는 단리되고 증폭된 원시성세포로부터 유래될 수 있다.
증폭된: 본원에서 사용된 "증폭된"은 배양의 원래 농도로부터 세포수 면에서 증가시키는, 세포의 성장 배양을 의미한다.
태아줄기세포: 본원에서 사용된 "태아줄기세포"는 초기 또는 중기 기관형성에서 더 이상 존재하지 않는, 발달 다세포 태아로부터 유래된 다중분화능 세포를 의미한다.
생식세포: 본원에서 사용된 "생식세포" , "생식계 세포" 또는 "생식 조직"은 생식성 세포, 예컨대, 정모세포 또는 난모세포, 또는 생식성 세포로 발달할 세포 또는 이러한 세포를 함유하는 조직을 의미한다.
생식전구줄기세포: 본원에서 사용된 "생식전구줄기세포"는 생식성 세포, 예컨대, 정조줄기세포 또는 난모세포 전구줄기세포의 전구체를 의미한다.
생식줄기세포: 본원에서 사용된 "생식줄기세포"는 생식성 세포, 예컨대, 정조줄기세포(SSC) 또는 난모세포 전구줄기세포를 의미한다.
생식샘: 본원에서 사용된 "생식샘"은 생식성 세포(생식자(gamete))를 생성하는, 동물 내의 짝을 이룬 기관들 중 임의의 기관을 의미한다. 이들은 난자를 생성하는 암컷 난소 및 정자를 생성하는 수컷 정소를 포함한다.
장기간 배양: 본원에서 사용된 "장기간 배양"은 2개월 이상 또는 10회 계대배양 이상보다 더 오랫동안 조절된 조건 하에서 세포를 증식시키는 것을 의미한다. 바람직하게는, 장기간 배양은 4개월 이상, 6개월 이상 또는 1년 이상 동안 배양된다. 바람직하게는, 장기간 배양은 15회 이상의 계대배양, 18회 이상의 계대배양 또는 20회 이상의 계대배양 동안 계대배양된다. 장기간 배양의 지속기간은 개별 세포에 주로 의존하고 세포주마다 다를 수 있다.
성숙: 본원에서 사용된 "성숙"은 최종적으로 분화된 세포 종류를 향하여 인도하는 조화된 생화학적 단계들로 구성된 과정을 의미한다.
다중분화능: 본원에서 사용된 "다중분화능"은 한정된 수의 여러 다른 세포 유형들을 발생시킬 수 있는 세포를 의미한다. 다중분화능 세포의 일례는 조혈세포, 즉 여러 유형의 혈액 세포로 발달할 수 있으나 뇌세포로는 발달할 수 없는 혈액줄기세포이다.
다중분화능 성체 기원세포: 본원에서 사용된 "다중분화능 성체 기원세포"는 외배엽, 중배엽 및 내배엽 계통의 세포로 분화되는 잠재력을 가진, 골수로부터 단리된 다중분화능 세포를 의미한다.
다분화능: 본원에서 사용된 "다분화능"은 태반의 세포 또는 자궁의 다른 지지 세포를 제외한 임의의 종류의 세포를 발생시킬 수 있는 세포를 의미한다.
출생 후 줄기세포: 본원에서 사용된 "출생 후 줄기세포"는 출생 후 다세포 유기체로부터 유래된 임의의 세포를 의미한다.
사춘기전: 본원에서 사용된 "사춘기전" 또는 "성숙기전"은 사춘기에 아직 들어가지 않은 개체를 의미한다. 사춘기의 시작은 성 호르몬, 황체형성 호르몬(LH) 및 여포 자극 호르몬(FSH)의 증가보다 먼저 일어나는 높은 생식샘 자극 호르몬(gonadotrophin) 방출 호르몬(GnRH) 박동과 관련되어 있다. 사춘기는 소녀의 경우 약 47 kg에서 일관되게 시작되고 소년의 경우 약 55 kg에서 일관되게 시작된다. 광범위한 정상 연령이 존재함에도 불구하고, 평균적으로 소녀가 소년보다 약 1 내지 2년 더 빨리 사춘기의 과정을 시작하고(소녀의 경우 평균 연령이 9 내지 14세이고 소년의 경우 평균 연령이 10 내지 17세임), 소녀는 통상적으로 17세까지 사춘기를 완료함으로써 보다 짧은 시간 이내에 사춘기를 완료한다.
원시줄기세포: 본원에서 사용된 "원시줄기세포"(PGC)는 생식세포가 될 운명을 가진, 초기 배아형성에서 존재하는 세포를 의미한다.
원시생식성줄기세포: 단축된 형태로 "생식성세포"로도 지칭되고 PGLSC로 약칭되는, 본원에서 사용된 "원시생식성줄기세포"는 성체 수컷 또는 암컷 생식 조직으로부터 유래되고 예를 들면, 방사선 또는 화학요법 후 생식적으로 불임 상태인 정소 또는 난소 조직에서 재증식하는 그의 능력에 의해 입증된 바와 같이 생식줄기세포 및 이의 자손을 발생시킬 수 있는 세포를 의미한다. 생식성세포는 성체 생식 조직에서 정지기 상태에 있을 수 있거나 활발히 분열할 수 있다.
재프로그래밍: 본원에서 사용된 "재프로그래밍"은 세포가 다분화능을 나타내고 완전히 발달된 유기체를 생성하는 잠재력을 갖도록 세포의 유전적 프로그램을 재설정하는 것을 의미한다. 또한, 이 재프로그래밍은 프로그래밍 전 상태의 세포에서 정상적으로 발현되지 않거나 발견되지 않을 재프로그래밍 특징을 경험하는 세포를 제공한다.
선택: 본원에서 사용된 "선택"은 형광 활성화된 세포 분류, 자기 비드 분류, 또는 특정 마커 프로파일을 보유하는 세포를 수집하는 다른 수단을 의미한다.
성세포: 본원에서 사용된 "성세포"는 포유동물 수컷 또는 암컷 생식 조직으로부터 유래된 이배수체 또는 홀배수체 세포를 의미한다. 이들 세포의 대표적인 예로는 수컷 생식세포, 암컷 생식모세포(genocyte), 난조세포, A형 정조세포 및 B형 정조세포가 있다.
체세포: 본원에서 사용된 "체세포"는 성세포 또는 이의 전구체를 제외한 체내의 임의의 조직 세포를 의미한다.
체세포성 줄기세포: 본원에서 사용된 "체세포성 줄기세포"는 이배수체 다중분화능 또는 다분화능 줄기세포를 의미한다. 체세포성 줄기세포는 분화전능 줄기세포가 아니다.
줄기세포: 본원에서 사용된 "줄기세포"는 자가재생할 수 있고(미분화된 상태를 유지하면서 다수의 세포 분열 주기를 통과하는 능력을 갖고) 1종 이상의 다중분화능(1종 이상의 전문화된 세포로 분화하는 성능)을 나타낼 수 있는 세포를 의미한다.
실질적으로 순수한: 본원에서 사용된 "실질적으로 순수한"은 세포의 75% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상이 원하는 특징(들)을 가진 세포 집단을 의미한다.
분화전능: 본원에서 사용된 "분화전능"은 체내 및 태반의 모든 세포들을 생성하는 데에 필요한 모든 유전 정보를 함유하는 세포를 의미한다. 인간 세포는 수정된 난자의 처음 수회 분열 동안에만 분화전능성을 가진다.
본 발명의 상세한 설명
본 개시내용은 생식능력이 상실될 위험에 있는 환자에서 생식능력 보존을 목적으로 수컷 및 암컷 둘다의 생식줄기세포를 수집하고 단리하고 증폭하고 가공하고 냉동보존하고 분석하고 방출하고 이식하는 방법을 제공한다.
골수줄기세포 이식 전에 암 및 다른 비악성 질환(예로는 겸상혈구빈혈 및 지중해빈혈이 있으나 이들로 한정되지 않음)의 치료를 위해 이용되는 화학요법 및 방사선요법은 이들 요법을 받는 환자의 생식능력에 대한 잘 입증된 유해 효과를 나타낸다. 이들 치료는 환자가 불임이 될 30% 가능성을 제시하면서, 환자의 생식능력을 영구적으로 손상시킬 수 있다.
수컷에서 불임의 위험
본 개시내용은 사춘기전 환자의 정소 생식샘 조직 및/또는 생식줄기세포를 보관하는 방법을 제공한다.
수컷에서 조직 및 생식줄기세포 보관이 요구될 질환 또는 상황은 양측성 잠복정소증, 정소꼬임, 미하강된 정소, 정계정맥류, 생식성 암 및 비생식성 암을 포함하는 암, 세포독성 요법 및 골수 이식을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 한 실시양태에서, 공여자는 사춘기전 수컷이다. 또 다른 실시양태에서, 공여자는 사춘기후 수컷이다.
성체 환자의 경우, 환자가 치료 후 불임이 되는 경우 치료 전 예방 단계는 시험관내 수정을 위해 정자를 동결하는 방법 또는 다른 보조 생식 기술이다. 화학/방사선요법을 실시할 때에 성숙 정자를 발생시키지 못한 사춘기전 환자의 경우, 조직 또는 세포 보관 이외에 다른 방법이 없다. 본 발명자들에 의한 본 방법의 발명 전, 수컷 사춘기전 환자의 생식능력을 보존하는 실현가능한 방법이 없었다. 생식능력 보존을 위한 정조줄기세포의 추출 및 냉동보존은 상당한 연구의 대상이다. 추가로, 냉동보존된 정소 조직(단일 세포 현탁물이 아님)의 이식은 동물 모델에서는 성공하였으나 인간에서는 아직 성공하지 못하였다. 정소 조직의 이식 후 생식능력 회복이라는 개념의 증명은 뮤린, 소, 돼지 및 영장류 모델을 포함하는 다양한 동물 모델뿐만 아니라 인간에서 완료되었다.
암컷에서 불임의 위험
본 개시내용은 사춘기전 환자를 위한 난소 조직 및 세포의 보관 방법, 및 성체 환자의 난소 조직, 여포 및 세포의 보관 방법을 제공한다.
암컷에서 조직 및 생식줄기세포 보관이 요구될 질환 또는 상황은 생식능력에 직접적으로 또는 간접적으로 영향을 미치는 질환 및 상황, 예컨대, 난소 낭종, 자궁외 임신, 자궁절제, 생식성 암 및 비생식성 암을 포함하는 암, 세포독성 요법, 골수 이식, 난소절제, 자궁내막증, 또는 여성이 생식력을 보존하기를 원하지만 그녀의 생식 전성기에 가까워지거나 생식 전성기를 지난 경우 가족 계획 목적을 위한 보관을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 한 실시양태에서, 공여자는 사춘기전 암컷이다. 또 다른 실시양태에서, 공여자는 사춘기후 암컷이다.
암컷에서, 세포독성 치료는 여포 파괴를 야기하고 조기 폐경 및 불임을 초래한다. 감소된 생식력 이외에, 에스트로겐 및 다른 호르몬의 상실은 장기간 건강 문제, 예컨대, 골다공증 및 심혈관 질환을 유발할 수 있다. 여성 소아암 생존자의 6% 이상은 급성 난소 기능상실을 경험하였다. 암 치료를 받은 성인 여성은 조기 폐경의 발생율이 30%이다. 다른 의학적 절차, 예컨대, 난소절제술 및 자궁절제술은 여성의 생식능력을 직접적으로 위태롭게 하거나 여성의 생식능력에 영향을 미칠 수 있다. 이들 절차는 종종 환자가 악성 또는 양성 난소 종양, 자궁외 임신, 자궁내막증 및 난소 낭종을 가진 것으로 진단받은 경우 필요하다. 유방암 환자, 또는 유방암 또는 난소암이 발달할 위험에 있는 환자는 호르몬 합병증 및 유전적 소인으로 인해 상기 암들이 발달할 가능성을 감소시키기 위해 종종 난소절제술을 받는다.
세포독성 치료를 받는 여성이 장래에 생식능력을 보장하기 위한 제한된 방법이 존재한다. 환자가 치료 후 불임이 될 경우, 세포독성 또는 세포증식억제 요법 또는 생식 기관(들)의 수술적 제거 전에 예방 단계로서, 보조 생식 기술을 이용하여 난모세포 또는 난자를 분리하고 사용을 위해 냉동보존할 수 있다. 그러나, 동결되고 해동된 인간 난모세포의 생존율은 냉동보호제가 세포막을 용이하게 침투하는 것을 허용하지 않는 낮은 표면 대 부피 비를 갖는 매우 큰 세포를 동결하는 데 있어서의 본질적인 어려움으로 인해 매우 낮다. 따라서, 조직, 원시 여포 또는 난소 세포(생식줄기세포를 함유할 수 있음) 보관이 난모세포 동결 대신에 또는 난모세포 동결 이외에 실행가능한 방법이다.
보관된 냉동보존된 난소 조직 또는 여포는 환자가 불임이 된 경우 상기 환자가 치료 후 그의 생식능력을 회복시킬 준비가 되어 있을 때 상기 환자 내로 다시 이식될 수 있다. 대안적으로, 암 치료를 받은 환자 또는 온전한 생식 기관(들)을 갖지 않은 환자의 경우, 동결된 조직 또는 여포는 시험관 또는 동물 숙주(난모세포/여포를 성숙시키기 위한 지지 시스템으로서만 사용됨) 내에서 숙주외(ex host) 성숙 과정[본원, 및 본원과 동일 날짜로 출원되고 온전히 그대로 본원에 참고로 도입되어 있는 동시계류 출원 제XX/XXX,XXX호(발명의 명칭: "Ex host maturation of germline stem cells"(변리사 참조 번호 1951314-00063))에 기재되어 있음]에서 사용될 수 있고, 성숙된 난자는 보조 생식 기법에 의해 수정될 수 있다.
본원에 개시된 생식세포는 설치류, 가축 동물, 개, 고양이 및 영장류를 포함하나 이들로 한정되지 않는 포유동물의 생식샘 조직으로부터 단리된다. 용어 "영장류"는 인간을 포함하나 이로 한정되지 않는다.
생식세포는 다양한 생식세포 마커, 배아세포 마커 및 다분화능 세포 마커의 발현 또는 발현 결여에 기초하여 단리된다. 생식세포 마커는 VASA, 전골수세포백혈병 아연 인자(PLZF), 아교로부터 유래된 신경영양 인자 수용체 α1(GFR-α1), α6-인테그린, Thy-1, CD9, CD90, CD49f, 돌리코스 비플로우루스(Dolichos biflourus) 응집소(DBA), 신경세포 부착 분자(NCAM), 생식세포 핵 항원 1(GCNA1) 및 DAZL을 포함하나 이들로 한정되지 않는다.
다분화능 세포 마커는 Oct-4(POU5F1), Nanog, 알칼리성 인산분해효소, SSEA-4, TRA1-60 및 TRA1-81을 포함하나 이들로 한정되지 않는다.
나아가, 생식세포는 생식줄기세포 유전자 및/또는 다분화능 줄기세포 유전자의 발현에 기초하여 단리될 수도 있다. 생식줄기세포 유전자는 텔로머라제, VASA, c-RET, c-Kit, PLZF, DAZL 및 GFR-α1을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 다분화능 세포 유전자는 Oct-4, Nanog, Dppa-5, Sox2, 알칼리성 인산분해효소 및 Crypto를 포함하나 이들로 한정되지 않는다.
본원에 제시된 추가 실시양태는 장기간 다중분화능 또는 다분화능 세포주가 발생되도록 하는 일부 생식세포 집단의 장기간 배양을 포함한다. 이들 세포주는 조직 특이적 계열로의 분화를 위한 세포의 공급원으로서 사용될 수 있다. 본 생식세포의 장기간 배양은 생식세포 마커 및/또는 다분화능 세포 마커, 및 생식 유전자 및/또는 다분화능 유전자의 발현 또는 발현 결여에 기초하여 실질적으로 순수한 원하는 생식세포 집단을 단리하는 단계; 및 미분화된 다중분화능 또는 다분화능 상태를 유지하면서 계속된 세포 분열을 허용하는, 실시예 단락에 개시된 성장 배지에서 상기 세포를 배양하는 단계를 포함한다. 본원에 기재된 장기간 배양은 장래 사용을 위해 냉동보존될 수 있다.
일부 실시양태에서, 단리된 실질적으로 순수한 생식세포 또는 생식세포주 집단은 재생 의약에서 치료적 적용을 위해 사용될 수 있다. 본원에 개시된 생식세포는 보다 분화된 생식세포, 예컨대, 수컷에서 정모세포, 정자세포 및 정자, 및 암컷에서 여포 및 난모세포를 형성할 수 있고 생체 내의 불임 생식 기관에서 재증식할 수 있다.
본 개시내용의 생식 조직 보관 시스템은 하기 성분 및/또는 단계를 포함한다: 1) 조직 수집; 2) 중앙 보관 위치로의 조직의 수송; 3) 중앙 은행에서의 조직의 가공; 4) 중앙 은행에서의 조직 및 단리된 세포의 냉동보존; 및 5) 조직 및/또는 단리된 세포의 품질 보증 및 방출. 임의적 제6 단계는 조직 및/또는 단리된 세포를 공여자 내로 재이식하는 것을 포함한다.
1. 수컷으로부터의 조직 수집
생식세포는 세포독성 절차의 개시 전에 또는 생식세포 조직의 파괴를 유발할 수 있는 손상 직후에 정소로부터 입수된다. 1 g 이상의 정세관 조직을 수술적 무균 상태 및 마취 하에서 절제한다. 상기 조직을 중앙 보관 시설로 운반하기 전 또는 후에 단일 세포 현탁액을 형성하기 위해 상기 조직의 물리적 및 효소적 분해를 수행할 수 있다.
한 실시양태에서, 정소 정세관 조직을 약 10x10 mm 조각으로 절단하고 5개 이하의 조각을 멸균 운반 배지를 함유하는 멸균 튜브 내에 넣는다. 또 다른 실시양태에서, 상기 조직을 단일 조각으로 유지하거나 멸균 운반 배지를 함유하는 멸균 용기 내에 넣는다.
운반 배지는 정소 정세관 조직 및/또는 분리된 세포의 생존율을 24시간 이하 동안 지지할 수 있는 임의의 배지를 포함한다. 조직 유지 배지의 비제한적 예로는 HEPES 및 항생제(페니실린 및 스트렙토마이신)로 보충된 PBS, FRS 및 DMEM뿐만 아니라 미국 특허출원 공개 제2007-0020759호(조직 배양 배지에 관한 모든 내용에 다하여 본원에 참고로 도입되어 있음)에 개시된 특허 배지도 있다.
2. 암컷으로부터의 조직 수집
세포독성 절차의 개시 전에, 생식세포 조직의 파괴를 유발할 수 있는 손상 직후에, 또는 난소절제술 또는 자궁절제술을 수행할 때에 생식세포를 난소로부터 입수한다. 1 g 이상의 난소 조직을 수술적 무균 상태 및 일반적 마취 하에서 절제한다. 상기 조직을 중앙 보관 시설로 운반하기 전 또는 후에 단일 세포 현탁액을 형성하기 위해 상기 조직의 물리적 및 효소적 분해를 수행할 수 있다.
한 실시양태에서, 난소 조직을 약 10x10 mm 조각으로 절단하고 5개 이하의 조각을 멸균 운반 배지를 함유하는 멸균 튜브 내에 넣는다. 또 다른 실시양태에서, 상기 조직을 단일 조각으로 유지하거나 멸균 운반 배지를 함유하는 멸균 용기 내에 넣는다.
운반 배지는 난소 조직 및/또는 분리된 세포의 생존율을 24시간 이하 동안 지지할 수 있는 임의의 배지를 포함한다. 조직 유지 배지의 비제한적 예로는 HEPES 및 항생제(페니실린 및 스트렙토마이신)로 보충된 PBS, FRS 및 DMEM뿐만 아니라 미국 특허출원 공개 제2007-0020759호에 개시된 특허 배지도 있다.
3. 조직의 수송
수집된 정소 또는 난소 조직을 약 4℃에서 보존하고 상기 조직이 조직 수집으로부터 24시간 이내에 중앙 보관 시설에 도달하도록 상기 조직을 중앙 보관 시설로 수송한다. 본 발명자들의 데이터는 세포의 생존율이 운반으로부터 48시간 후에 변하지 않고 운반으로부터 72시간 후에 감소하지 않음을 보여준다. 본 발명자들은 수집으로부터 24시간 이내에 조직을 갖는 것을 선호한다.
4. 조직의 가공
수집된 난소 조직 및 정소 조직을 효소로 분리하고 냉동보존 전에 생존율 및 세포 마커에 대해 분석한다. 한 실시양태에서, 냉동보존 전에 상기 조직으로부터 생식줄기세포를 농축한다. 또 다른 실시양태에서, 생식줄기세포의 농축 없이 전체 정소 세포 또는 난소 세포를 냉동보존한다.
또 다른 실시양태에서, 수컷 생식줄기세포 및/또는 암컷 생식줄기세포에 대해 특이적인 항체를 사용하는 유세포분석 분류를 이용하여 생식줄기세포에 대한 농축을 수행한다.
5. 냉동보존
생식샘 조직 및/또는 생식줄기세포를 냉동보존하기 위해 다양한 배지 및 절차를 이용할 수 있다.
한 실시양태에서, 디메틸 설폭사이드(DMSO), 에틸렌 글리콜, 글리세롤 및 프로판디올을 포함하나 이들로 한정되지 않는 하나 이상의 냉동보호제; DMEM, MEM 및 상기 개시된 특허 배지를 포함하나 이들로 한정되지 않는 하나 이상의 배양 배지; 수크로스, 덱스트란, 혈청 대체물 및 HEPES 완충제를 포함하나 이들로 한정되지 않는 하나 이상의 추가 물질을 포함하는 용액에 생식줄기세포를 냉동보존한다. 한 실시양태에서, 상기 용액은 크리오스토어(CryoStor)(상표명) CS-10 배지(바이오라이프 솔루션스 인코포레이티드(BioLife Solutions Inc.), 미국 워싱톤주 보텔 소재)를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 혈청 대체물은 넉아웃(Knockout) 혈청 대체물(인비트로겐(Invitrogen) 10828-028)이다.
그 다음, 상기 세포를 조절된 속도에서 동결하거나 "수동" 과정으로 동결한다. 조절된 속도 동결 절차는 조절된 속도 동결기를 켜고 조직 또는 세포 동결을 위한 동결 프로그램을 설정함으로써 시작된다. 조절된 속도 동결기는 액체 질소를 사용하여 내부 챔버 내의 온도를 감소시킬 것이다(이로써 상기 챔버의 임의의 내용물의 온도를 감소시킬 것임). 세포에 대한 동결 프로그램은 내부 챔버를 4℃로 냉각시키고 상기 절차를 계속하도록 자극될 때까지 상기 온도를 유지함으로써 시작된다. 조절된 속도 동결기가 냉각시키는 동안, 세포는 4℃로 냉각된 냉동보존 배지에 현탁된다. 상기 세포 현탁액을 냉동바이알(cryovial) 당 1 ㎖의 양으로 냉동바이알 내로 분취한다. 그 다음, 상기 냉동바이알을 표지하고 조절된 속도 동결기 챔버 내에 넣고 프로그램이 계속되도록 자극한다. 먼저, 상기 챔버의 온도를 4℃에서 추가 10분 동안 유지한다. 다음으로, 온도가 -80℃에 도달할 때까지 상기 챔버를 -1℃/분의 속도로 냉각시킨다. 그 다음, 상기 챔버가 -120℃의 온도에 도달할 때까지 상기 챔버를 -50℃/분의 속도로 냉각시킨다. -120℃에서 5분이 경과된 후, 동결된 세포의 온도는 -120℃로 평형화될 것이다. 그 다음, 상기 동결된 세포의 냉동바이알을 장기간 저장을 위해 액체 질소 드와(Dewar)로 옮긴다.
수동 동결 절차는 세포를 서서히 동결하는 데에 사용되는 "미스터 프로스티(Mr. Frosty)" 동결 용기(날진(Nalgene))를 준비함으로써 시작된다. 상기 "미스터 프로스티" 용기는 성공적인 세포 냉동보존 및 회수를 위해 요구되는 중요한 반복가능한 -1℃/분 냉각 속도를 제공하는 폴리카르보네이트 유닛(unit)이다. 상기 "미스터 프로스티"의 바닥을 250 ㎖의 100% 이소프로판올로 채운다. 시험관대를 상부 상에 놓고, 덮개를 상기 시험관대 상에서 조이고, 상기 "미스터 프로스티"를 사용하기 전에 1시간 이상 동안 4℃에서 놓아둔다. 상기 세포를 4℃로 냉각된 냉동보존 배지에 현탁시킨다. 이 세포 현탁액을 냉동바이알 당 1 ㎖의 양으로 냉동바이알 내로 분취한다. 그 다음, 냉동바이알을 표지하고 미리 냉각된 "미스터 프로스티"에 넣는다. 상기 "미스터 프로스티"를 4℃에서 10분 동안 다시 놓아둔다. 그 다음, 상기 "미스터 프로스티"를 -80℃ 동결기 내에 밤새 넣어둔다. -80℃ 동결기 내에 밤새 넣어둔 후, 상기 냉동바이알을 장기간 저장을 위해 액체 질소 드와로 옮긴다.
6. 난소로부터 유래된 생식 조직 및/또는 생식세포, 및 정소로부터 유래된 생식 조직 및/또는 생식세포의 품질 보증 및 방출
냉동보존 전에 또는 (안정성을 위해) 특정 시점에, 및 상기 조직 또는 세포가 이식에 적합한 조건 하에서 존재한다는 것을 보장하기 위해 방출시에 샘플에 대한 효능, 순도, 본질, 생존율 및 안정성 분석을 수행한다. 이들 분석은 (이식되는 경우 정소에서 재증식할 "효능" 잠재력을 추정하기 위해) 존재하는 생식줄기세포의 양, 세포의 생존율, 및 임의적으로 상기 세포의 본질을 확인하기 위한 DNA 분석에 대한 정보를 제공할, 상기 조직/세포 샘플 중의 특정 관련 마커를 정량한다. 안정성 분석은 냉동보존의 품질을 조사하기 위해 정기적으로 해동되는 조직 또는 세포의 작은 샘플로 구성된다.
7. 정소로부터 유래된 생식 조직 및/또는 생식세포의 재이식
단리된 실질적으로 순수한 생식줄기세포 집단을 수용자 내로 이식하는 것은 당업계에서 통상의 기술을 가진 자에게 공지된 표준 주입 수단을 사용한 직접적인 주입을 통해 달성된다. 또 다른 실시양태에서, 지지 세포, 예컨대, 정조세포 분화에 호르몬 자극을 제공하는 레이디히(Leydig) 또는 세르톨리(Sertoli) 세포를 생식줄기세포와 함께 수용자 정소로 옮긴다. 이들 옮겨진 지지 세포는 변형되지 않거나 대안적으로 유전적으로 변형된다. 이들 옮겨진 지지 세포는 공여자 또는 수용자 정소에 대한 동종성 또는 이종성을 나타낼 수 있다. 운반 유체 중의 세포의 한 예시적 농도는 단순한 실험에 의해 용이하게 확립될 수 있으나 ㎖ 당 약 103 내지 1010개 세포의 범위 내에 있을 것이다. 상기 세포를 정관, 정소망 또는 정세관 내로 도입하는데, 이것은 수동으로 수행된다. 이식된 생식줄기세포가 정소로 만족스럽게 전달되는지를 용이하게 확인하기 위해 적합한 염료 또는 거품(직경이 2 ㎛ 미만임)을 임의적으로 운반 유체 내로 도입할 수 있다. 적절한 변환기가 장착된 초음파 장치는 바늘을 주입 부위 내에 넣는 데에 도움이 될 수 있다.
적합한 세포 이식 비히클은 당업계에서 통상의 기술을 가진 자에게 공지되어 있고 분자, 예컨대, 혈청 알부민, 콜레스테롤 및/또는 레시틴, 셀레늄 및 무기 염뿐만 아니라 혈청 성분 및/또는 성장 인자 및/또는 사이토카인을 포함한다. 전형적으로, 세포 이식 비히클의 pH는 대략 생리학적인 pH, 즉 pH 7.0 내지 7.6이다.
본 세포 조성물은 단독으로 투여될 수 있거나, 또는 단회 또는 다회 투여량으로 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 담체와의 조합물로 투여될 수 있다. 적합한 약학적 담체는 불활성 생체전달 겔 또는 생체분해성 반고체 매트릭스뿐만 아니라 희석제 또는 충전제, 멸균 수용액 및 다양한 무독성 용매를 포함할 수 있다. 약학적으로 허용가능한 담체는 일반적으로 3가지 기능을 수행한다: (1) 세포를 본 세포 조성물에서 유지하거나 보존하는 기능; (2) 재생, 회복 또는 부활이 필요한 조직 부위에서 세포를 보유하는 기능; 및 (3) 실시자에 의한 본 조성물의 취급 용이성을 개선하는 기능, 예컨대, 주입가능한 조성물의 성질 또는 수술 이식재의 취급을 개선하는 기능. 본 세포 조성물을 약학적으로 허용가능한 담체와 조합하여 형성한 약학 조성물은 다양한 투여 형태, 예컨대, 주입가능한 용액 등으로 투여될 수 있다. 약학 담체는 원하는 경우 추가 성분, 예컨대, 결합제, 부형제 등을 함유할 수 있다. 수용액은 바람직하게는 필요한 경우 적절하게 완충되고, 액체 희석제는 먼저 충분한 식염수 또는 글루코스에 의해 등장성 상태가 된다. 이러한 수용액은 정맥내, 근육내, 피하 및 복강내 주입에 적합하다. 사용되는 대상 멸균 수성 매질은 당업자에게 잘 공지된 표준 기법에 의해 수득될 수 있다.
8. 난소로부터 유래된 생식 조직 및/또는 생식세포의 재이식
난소 생식줄기세포를 화학요법 또는 방사선요법 전에 환자로부터 단리하고 시험관 내에서 수를 증폭시키고 환자가 그의 생식능력을 재회득하기 위해 상기 생식줄기세포를 필요로 할 때까지 동결된 상태로 보존할 수 있다. 인간 난소로부터 단리된 세포를 미세 바늘을 이용하여 난소 표면 상피 내로 직접 이식하거나, 대안적으로 상기 세포를 피브린 응괴 형태로 응집시킬 수 있다. 피브린 응괴는 환자 자신의 혈액으로부터 제조되고 이식 과정 동안 세포의 생존율 및 생존을 지지한다. 피브린 응괴를 환자에게 다시 이식할 수 있고 난소 윤활낭 아래에 이식할 수 있다.
한 실시양태에서, 악성물을 가진 환자에서 난소 세포의 이식을 위해, 양성-음성 선택 절차를 이용하여 악성세포로부터 생식세포를 분리한다. 그러나, 비악성 환자에서, 난소 표면 상피(OSE)의 이식이 보다 실용적일 수 있다. 조직 수집시, 작은 칼을 이용하여 난소 조직의 나머지 부분으로부터 OSE를 1 mm 직경의 0.5 cm x 0.5 cm 조각으로 해부한다. 이들 조각을 유리화(vitrification) 절차를 이용하여 동결하고 환자가 생식능력 회복을 위해 상기 조각을 필요로 할 때까지 동결된 상태로 보존한다. OSE 조각이 요구되는 경우, 상기 OSE 조각을 해동하고 함께 봉합하여 보다 큰 조각을 만들고 불임 난소의 표면에 이식한다.
추가로, 상이한 발달 단계에 있는 난소 여포를 동결하고 환자 내로 재이식할 수 있거나 성숙 여포로의 시험관내 배양을 위해 사용할 수 있다. 그 다음, 이들 여포의 난모세포를 ICSI(세포질내 정자 주입) 또는 다른 보조 생식 기법으로 수정시킬 수 있다. 난소 생식줄기세포의 이식은 영구적인 생식능력 회복이다.
9. 난소로부터 유래된 생식줄기세포의 숙주외 성숙
인간 난소로부터 단리된 여성 생식줄기세포를, 초저 부착성 배양 접시에서 성장 인자 및 β-머캡토에탄올을 사용하지 않고 응집시킨 후 성장 호르몬의 존재 하에서 알긴산나트륨 또는 피브린 응괴에서 3D 배양함으로써 원시 여포로 분화시킬 수 있다. 성숙 난자로의 생식세포의 발달을 더 지지하기 위해, 이들 세포를 사춘기전 연령의 공여자의 미성숙 과립층세포로 응집시킨다. 이 방법은 일차 난모세포가 수정가능한 중기(M)-II 난모세포로 발달할 수 있게 한다. 과립층세포의 단리를 위해, 사춘기전 인간 난소로부터 난소를 해부하고, 2 단계 분화 부착 절차를 이용하여 생식세포로부터 과립층세포를 분리한다. 이 방법을 악성물을 가진 환자에게 적용한 후, 악성세포가 없는 가공된 여포를 환자 난소 내로 다시 이식하여 추가 성숙 및 여포 발달을 허용한다. 대안적으로, 이들 여포를 시험관 내에서 성숙시킨다. 환자로부터 단리된 난소 여포를 동결한 후 이 프로토콜로 처리할 수 있다. 어느 경우에서든, 이들 여포로부터 유래된 M-II 난모세포는 시험관내 수정 또는 수정을 위한 ICSI 및 후속 배아 발달을 위해 사용된다.
10. 정소로부터 유래된 생식줄기세포의 숙주외 성숙
생식줄기세포를 환자 정소 내로 재이식하는 것이 실현될 수 없는 경우(즉, 악성물, 정소꼬임, 잠복정소증의 경우), 또는 정소 지지 세포의 기능상실(즉, 성숙 정지)로 인해 생식세포 발달이 손상된 경우, 정소 생식줄기세포를 대리 동물 또는 시험관 내에서 추가 발달된 단계로 분화시키고 ICSI 또는 다른 보조 생식 기술을 위해 사용한다. 한 실시양태에서, 정조줄기세포(SSC)를 적절한 지지 세포 및 정세관 세포외 매트릭스(ECM)와 혼합하여 생식세포의 추가 발달을 지지할 수 있는 환경을 생성한다.
정자형성이 이미 사춘기전 환자에서 시작되었으나 완료되지 않은 경우, 이미 감수분열로 들어간 부분적으로 성숙된 생식세포(일차 정모세포 및 이차 정모세포)는 둥근 또는 긴 정자세포로의 추가 분화를 위해 저장되고 사용될 수 있다. 그 다음, 정자세포는 수정 및 후속 배아 발달을 허용하는 ICSI를 위해 사용될 수 있다.
개시된 방법은 인간, 마우스, 가축 동물, 예컨대, 소, 돼지, 양 및 염소, 개, 고양이 등을 포함하나 이들로 한정되지 않는 임의의 포유동물에서 이용되기에 적합하다.
생식세포 은행, 또는 수탁 또는 저장 시설은 생식세포 또는 생식줄기세포가 안전한 보존을 위해 보존되는 장소이다. 상기 저장 시설은 상기 줄기세포가 자연재해의 발생시 연장된 기간에 걸쳐 조절된 환경 하에서 안전하게 보존될 수 있도록 디자인될 수 있다. 본 발명의 한 실시양태에서, 공여자에서 생식능력을 회복시킬 필요성을 예상하고 생식세포 유닛을 저장하기 위한 수탁소, 예를 들면, 생식세포 은행이 제공된다. 개시된 방법의 범위는 이러한 수탁소의 제공뿐만 아니라 상기 수탁소를 운영하는 방법도 포함한다.
생식세포 유닛의 위치를 찾을 필요가 있을 때 이것이 용이하게 검색될 수 있도록 생식세포 유닛을 기록하는 방법이 본 발명의 범위 내에 포함된다. 임의의 색인 및 검색 시스템이 이 목적을 충족시키기 위해 이용될 수 있다. 생식세포 또는 생식 조직이 저장될 수 있도록 저장 시스템도 제공된다. 한 실시양태에서, 생식세포는 저장 시설이 수백, 수천 및 심지어 수백만 개의 상이한 생식세포 유닛을 저장할 수 있는 방식으로 저장된다.
생식세포 유닛과 관련된 식별 정보를 저장하는 방법도 제공된다. 식별 정보는 유형 식별자 정보, 환자 식별자 정보 및/또는 표현형적 정보의 유전형을 포함할 수 있다. 또한, 상기 식별 정보는 유지 정보를 포함할 수 있다. 상기 식별 정보는 생식세포 유닛의 부피 또는 유닛 당 세포의 총 수와 같은 정보를 포함할 수 있다. 이 환자 식별자 표시는 성명 또는 비밀 식별자 코드의 형태일 수 있다.
각각의 생식세포 유닛, 예를 들면, 개체의 특정 유닛은 신뢰가능하고 정확한 식별 및 검색을 위한 방식으로 색인될 것이다. 색인 시스템이 신뢰가능하고 정확한 한, 임의의 보편적인 색인 시스템이 이용될 수 있다. 예를 들면, 각각의 생식세포 유닛을 위한 각각의 용기를 문자와 숫자가 조합된 코드, 바 코드 또는 임의의 다른 인식가능한 방법, 또는 이들의 조합으로 표지할 수 있다. 수탁소 내부 및 수탁소 외부의 한 위치에서, 각각의 유닛 및 수탁소 내의 그의 위치의 식별을 가능하게 하고 유닛의 공급원 및/또는 유형의 식별을 가능하게 하는 정보의 접근가능하고 판독가능한 목록이 존재할 수 있다. 이 색인 시스템은 당업계에 공지된 임의의 방식으로, 예를 들면, 수동으로 또는 비수동으로 관리될 수 있고, 예를 들면, 컴퓨터 및 보편적인 소프트웨어가 이용될 수 있다.
한 실시양태에서, 생식세포 은행은 복수의 개체 및 복수의 생식세포 유닛과 관련된 복수의 기록을 저장하는 시스템을 포함한다. 각각의 기록은 생식세포 유닛 또는 특정 개체와 관련된 유형 정보, 유전형 정보 또는 표현형 정보를 함유할 수 있다.
생식세포 유닛의 저장은 단기간 또는 장기간일 수 있다. 저장된 생식세포는 냉동보존된다. 저장된 물질이 본원에 논의된 치료 목적을 위해 생존율을 유지하는 한, 임의의 저장 방법이 이용될 수 있다.
생식세포의 저장을 위한 많은 유형의 저장 장치가 당업계에 공지되어 있고 본 개시내용에 따라 이용될 수 있다. 한 특정 은행에 저장될 수 있는 생식세포 유닛의 수에 대한 상한은 없다. 한 실시양태에서, 상이한 개체들의 수백 개의 생식세포 유닛이 한 은행 또는 저장 시설에 저장될 것이다.
생식세포 물질을 저장하는 시설은 꽤 작을 수 있으나, 많은 수의 사람들을 위한 많은 샘플들을 여전히 저장할 수 있다. 한 실시양태에서, 생식세포 유닛은 필요한 공간의 양을 최소화하는 방식으로 저장된다.
저장 시설은 저장된 물질을 조직화하고 색인하는 임의의 방법을 위한 수단, 예를 들면, 생식세포 유닛의 자동화된 로봇 검색 및/또는 조작을 위한 수단을 포함할 수 있다. 상기 시설은 이러한 생식세포 유닛을 가공하기 위한 미세조작 장치를 포함할 수 있다. 생식세포 유닛을 저장하기 위해 1개 이상의 저장 시설을 이용할 수 있다. 이들 시설은 상당한 거리를 두고 떨어져 있는 상이한 위치에 각각 존재할 수 있다. 일부 실시양태에서, 저장 시설은 상이한 주 또는 상이한 국가에 존재할 수 있다. 저장 시설은 지하 또는 지상에 존재할 수 있다.
잠재적인 문제점을 제거하고 매우 안전한 시스템을 제공하기 위해 저장 시설 전체에서 장애 방지 컴퓨터(Fault tolerance computer) 및 중복 시스템을 이용할 수 있다. 생식세포 유닛의 효율적인 저장 및 검색을 위해 공지된 보편적인 기술, 예를 들면, 머신 비젼(Machine Vision), 로봇공학(Robotics), 자동화 운반 차량 시스템(Automated Guided Vehicle System), 자동화 저장 및 검색 시스템(Automated Storage and Retrieval Systems), 컴퓨터 통합 생산(Computer Integrated Manufacturing), 컴퓨터 보조 공정 계획(Computer Aided Process Planning) 및 통계적 공정 조절(Statistical Process Control)을 이용할 수 있다. 덜 복잡한 저장 시설, 예를 들면, 색인되고 저장된 생식세포 유닛이 존재하는 다수의 선반을 함유하는, 적절한 온도로 유지되는 큰 영역도 이용될 수 있다.
수탁소, 저장 시설 또는 생식세포 은행은 생식세포 샘플을 저장하는 하나 이상의 저장 유닛, 및 저장 또는 이식을 위해 상기 생식세포 유닛을 가공하는 하나 이상의 가공 장소를 포함할 수 있다. 가공은 내부 유닛 또는 외부 유닛, 예를 들면, 생식세포 가공 및 저장에 있어서 전문화되어 있는 실험실에 의해 수행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 줄기세포를 획득하고, 가공하고, 유형분류(typing)하고, 기록하고 저장하는 전체 공정은 데이터 가공 및 조절 유닛에 의해 관리된다.
일부 실시양태에서, 이 시스템의 작동은 전용 소프트웨어의 보조에 의해 관리될 수 있다. 상기 소프트웨어는 잠재적인 수용자의 등록, 공여자로부터 생식세포 유닛의 획득, 데이터베이스 관리, 저장 모니터링 및 품질 조사를 관리할 수 있다. 일부 실시양태에서, 이 시스템은 전형적인 컴퓨터 시스템 상에서 작동할 수 있다. 상기 컴퓨터 시스템은 입력 장치, 예를 들면, 키보드 또는 마우스, 프로세서, 예를 들면, 일반적인 목적용 프로세서 또는 증가된 데이터베이스 가공 능력을 가진 보다 개발된 프로세서, 내부 메모리, 예를 들면, RAM 및 ROM, 및 외부 저장장치, 예를 들면, 디스크, ROM, ASIC, 외부 RAM 및 외부 ROM을 포함할 수 있다. 컴퓨터 시스템은 임의의 작동 시스템 상에서 실행될 수 있다. 특정 실시양태에서, 데이터베이스 시스템은 은행에서 각각의 생식세포 유닛에 대한 정보를 저장한다. 각각의 유닛과 관련된 일부 정보가 저장된다. 상기 정보는 특정 공여자, 예를 들면, 공여자 및 공여자의 병력의 식별과 관련될 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 상기 정보는 샘플 유형 정보일 수 있다. 예를 들면, 상기 정보는 생식세포 유닛의 부피 또는 물질 중의 세포의 총 수를 포함할 것이다. 각각의 샘플과 함께 저장된 정보는 검색가능하고 상기 샘플을 찾아 고객에게 즉시 제공할 수 있는 방식으로 상기 샘플을 식별한다.
실시예
하기 실시예는 이하에 기재된 것으로 한정되지 않는 하나 이상의 실시양태를 설명하기 위한 것이다.
실시예 1
구별되는 뮤린 수컷 생식줄기세포 집단들의 단리
Oct-4-GFP 생식세포를 분류함으로써 순수한 생식줄기세포 집단을 단리하였다. 그 다음, Oct-4+ 생식세포를 c-Kit 수용체 분자의 발현에 기초하여 세분하였다. 티로신 인산화효소(kinase) 수용체인 c-Kit 및 이의 리간드 줄기세포 인자(SCF; Kit 리간드 또는 Steel 인자로도 공지되어 있음)는 PGC 성장 및 생존의 핵심 조절자이다. c-Kit는 PGC가 초기 분리될 때부터 그가 생식능선에 도달할 때까지 PGC에서 발현된다. 출생 후 마우스 정소에서, c-Kit는 미분화된 A형 정조세포 및 분화하는 A형 정조세포의 분화를 위한 마커로서 사용될 수 있다는 것이 보고되었다. Oct-4와 c-Kit의 병용은 생식줄기세포에서 하기 2개의 구별되는 집단들의 단리를 허용한다: 보다 많은 원시줄기세포 또는 생식기원세포를 함유하는 한 집단(Oct-4+/c-Kit+), 및 SSC가 될 운명 및 불임 정소를 재생시킬 능력을 가진 생식줄기세포를 함유하는 다른 집단(Oct-4+/c-Kit-). 이들 세포의 분자적 특징 및 표현형적 특징을 배양 전 및 후에 분석하고 성장 인자의 혼합물을 사용하는 정의된 배양 조건 하에서 다중분화능 세포주를 발생시키는 그들의 능력을 비교하였다. 추가로, 수용자 정소에서 재증식하는 이들 하위집단 및 이들의 자손 mGC 세포주의 기능성을 정조줄기세포 이식 기법을 이용하여 평가하였다.
수컷 생식줄기세포(GSC)는 SSC의 자가재생 및 분화된 정조세포의 발생을 통해 정자형성을 유지한다. 보고에 의하면, 일부 시험관내 조건 하에서, 신생아 마우스 정소 및 성체 마우스 정소 둘다로부터 수득된 GSC는 ESC와 유사한 특징 및 분화력을 가진 다중분화능 생식세포주(mGC)를 발생시킬 수 있다. 그러나, 상이한 실험실에서 발생된 mGC들은 상이한 생식세포 특성을 보였는데, 예를 들면, 일부는 그들의 SSC 성질을 보유하고 일부는 상기 성질을 완전히 상실하였다. 따라서, 유도체 다중분화능 생식세포주가 마우스 정소 내에 존재하는 상이한 생식줄기세포 하위집단들로부터 유도되었을 수 있는 가능성이 남아 있다. 이 질문을 조사하기 위해, 생식세포 특이적 Oct-4 프로모터의 조절 하에서 GFP를 발현하는 형질전환 마우스 모델을 사용하였다. 생식줄기세포들 중에서 전사 인자 Oct-4 및 c-Kit 수용체의 발현 면에서 구별되는 2개의 집단들이 발견되었다. 신생아 정소 또는 성체 정소로부터 단리되고 성장 인자의 복합 혼합물에서 배양되었을 때 마우스 생식줄기세포의 Oct-4+/c-Kit+ 하위세트만이 다분화능 ES 마커, 즉 Oct-4, Nanog, Sox2, Rex-1, Dppa5, SSEA-1 및 알칼리성 인산분해효소를 발현하고 높은 텔로머라제 활성을 나타내고 유도된 분화 프로토콜 후 박동 심근세포, 신경세포 및 연골세포를 포함하는 다수의 계통으로 분화하는 세포주를 발생시킨다. 이 데이터는 생식줄기세포 내에 구별되는 집단이 존재하고, 상기 집단으로부터 유래된 생식기원세포만이 일부 다분화능 특징을 가진 다중분화능 세포주를 발생시킬 수 있다는 것을 명확히 보여준다.
생식줄기세포의 농축을 위해, 체세포를 제거하되 생식세포를 제거하지 않기 위한 차등적 부착을 위해 신생아 정소 조직 및 성체 정소 조직 둘다를 젤라틴으로 코팅된 배양 접시 상에서 2시간 동안 배양하였다. 차등적 부착 후, GFP 양성 세포(신생아에서 4 내지 10%; 성체에서 0.01 내지 0.05%)를 함유하는 세포 현탁액을 입수할 수 있었다(도 1a 내지 1c). GFP의 발현과 c-Kit의 발현 사이에 상관관계가 존재한다(도 1f 내지 1h).
수집된 신생아 생식세포를 배양 접시 상에서 전술된 바와 같이 성장 인자들의 혼합물을 가진 줄기세포 배양 배지에서 배양하였다. 초기 GFP 신호(도 2의 a)는 수일 배양 후 사라졌다(도 2의 b). 그 후, 세포는 GFP 신호 없이 계속 성장하는 쇄 유사 콜로니를 형성하는 구별되는 형태학적 변화를 겪었다(도 2의 c 및 d). 콜로니 내에서 GFP 양성 세포의 발생에 의해 표시되는 Oct-4의 상향조절은 3 내지 4주 배양 후 나타났다(도 2의 f). 2 내지 4주 배양 후, GFP 양성 콜로니를 15% FBS로 보충된 동일한 배양 배지 중의 미토마이신(mitomycin) C 처리된 뮤린 배아 섬유모세포 영양세포 층(MEF)을 가진 배양 접시 내로 기계적으로 옮겼다. 3회 또는 4회 계대배양 후, 새로운 MEF 배양물로 기계적으로 옮김으로써 상기 콜로니를 확립하였고 추가 증폭 및/또는 액체 질소에서의 저장을 위해 효소(콜라겐분해효소 1 mg/㎖, 5 내지 10분)를 사용하여 배양 플레이트로부터 상기 콜로니를 제거할 수 있었다. 성체 마우스로부터 세포주를 유도하기 위해, 차등적 부착 후 수집된 GFP+ 세포를 유세포분석을 이용하여 분류하였고 MEF 상에서 직접 배양하였다. OG2 또는 OG2-lacZ 마우스를 사용하여, 총 19개의 세포주(10개의 신생아 세포주 및 9개의 성체 세포주)를 발생시켰다. 모든 세포주들이 GFP(14개의 세포주) 또는 GFP-LacZ(5개의 세포주)를 발현하였다(도 2의 g 내지 i).
추가로, mGC 세포주가 신생아 야생형 CD-1 마우스로부터 발생되었는데, 이것은 상기 방법이 형질전환 OG2 마우스로 한정되지 않는다는 것을 암시한다. 선택된 세포주를 동결/해동하고, (수동 세포 카운팅 및 GFP 분류 둘다를 이용하여) 추정한 세포 배가(doubling) 시간이 72시간인 40회 이상의 계대배양 동안 상기 세포주를 증식시켰다(도 3). 배양 동안 상이한 시점들(2일째 날, 도 3a; 5일째 날, 도 3b; 9일째 날, 도 3c; 15일째 날, 도 3d)에서 GFP+ 세포의 수를 FACS로 분석하였다(도 3e).
유세포분석을 이용하여 c-Kit-/GFP+ 세포로부터 c-Kit+/GFP+ 세포를 분리하고(도 1d 및 1e) MEF 영양세포 상에서 배양하였다. c-Kit+ 집단만이 mGC 콜로니를 발생시켰고 c-Kit- 풀로부터는 어떠한 세포주도 발생될 수 없었다. 본 연구에서 사용된 성장 인자들 중에서 GDNF의 제거는 보다 작은 콜로니를 발생시켰는데, 이것은 mGC의 자가재생에 있어서 GDNF의 역할을 암시한다. 대조적으로, FGF2의 제거는 콜로니의 분화를 발생시켰는데, 이것은 mGC를 그의 미분화된 단계에서 유지함에 있어서 FGF2의 가능한 역할을 암시한다. LIF 또는 EGF의 제거는 mGC의 증폭 또는 분화에 영향을 미치지 않았다.
mGC 콜로니 내의 대다수의 세포들이 Oct-4(도 4의 a 내지 d), Nanog(도 4의 e 내지 h), VASA(도 4의 i 내지 l) 및 SSEA-1(도 4의 m 내지 o)을 발현하였다. 이들은 Stella, Dazl, Vasa 및 cRet를 포함하는 생식 특이적 마커와 함께 다분화능 유전자 Sox2, DPPa5, Rex-1, eRas 및 Cripto 또한 발현하였다(도 4q). 추가로, Oct-4, Nanog 및 Sox2의 발현은 웨스턴 블롯 분석에 의해 확인되었다(도 4p).
계대배양 20에서 마우스 세포주는 높은 텔로머라제 활성(도 5a, ESC와 유사함) 및 정상 핵형(40, XY)을 보였다(도 5b).
mGC의 전반적인 유전자 발현 및 각인 패턴 또한 배양 전 및 후에 분석하였고 ESC의 전반적인 유전자 발현 및 각인 패턴과 비교하였다. 흥미롭게도, 배양 조건은 시험된 모든 DMR(차등적으로 메틸화된 구역) 부위에서 상기 mGC의 각인 패턴을 변화시키지 않았다. 부분적인 안드로겐유전성 각인만을 보인 마우스 ESC와 대조적으로, 상기 mGC는 100% 안드로겐유전성 각인 패턴을 명확히 나타내었다(도 6). 다소 놀랍게도, 마이크로어레이 분석은 상기 mGC의 전반적인 유전자 발현 패턴이 배양 전과 배양 후에 87% 유사성을 나타낸다는 것을 보여주었다.
mGC가 응집되어 배상체(EB)를 형성한 경우, 9 내지 15일 이내에 장배형성(gastrulation)이 관찰되었다(도 7a). EB 내의 세포는 E-캐드헤린 및 라미닌1(극성화된 상피의 마커, 도 7b 및 7c); Zic1, PAX6 및 Sox1(초기 외배엽 마커, 도 7d 및 7f), GATA4 및 FoxA2(초기 내배엽 마커, 도 7e 및 7f); 및 BRACHYURY, BMP4 및 COL2A1(초기 중배엽 마커, 도 7f)을 포함하는 초기 발달 마커들을 발현하였다. 배양에서, mGC 콜로니는 심근세포(도 7g 내지 7j), 지방세포(도 7k) 및 신경세포(도 7l 및 7m)의 마커를 발현하는 표현형으로 자발적으로 분화하였다. 심근세포로 자발적으로 분화된 세포들 중 일부는 3일 이하 동안 주기적인 수축을 나타내었다. 지정된 분화 프로토콜을 이용하여, mGC 세포주가 도 8의 a 내지 g 및 도 8j에 나타낸 바와 같이 신경 기원세포(네스틴(nestin), 뉴로(neuro)D1), 신경((MAP2, NF-68, GAD67) 및 아교 세포(GFAP, MBP, A2B5, O4, NG2)를 대표하는 신경세포로 분화되도록 유도할 수 있었다. 또한, 상기 mGC가 심근세포(트로포닌(troponin)1, 심장 미오신, 데스민(desmin), Nkx2.5, GATA4, 도 8의 i 및 도 8l) 또는 연골세포(콜라겐 Xa1, 및 알시안 블루에 의한 염색, 도 8의 h 및 k)를 형성하도록 유도할 수 있었다.
mGC를 사용하는 별도의 분화 연구에서, 배양물 내의 7개의 콜로니에서 신경 마커의 염색을 이용하거나 이용하지 않고 세포(핵)의 수를 세었고, 평균 백분율은 GFAP+ 세포의 경우 17.6%로서 평가되었고 Tuj-1+ 세포의 경우 2.5%로서 평가되었고 MAP-2+ 세포의 경우 2.3%로서 평가되었다. 일반적으로, 이들 프로토로에 의한 유도된 분화의 효율은 mGC에 비해 ES 세포에서 훨씬 더 높았다.
이식으로부터 4주 후, 대조군 동물의 정소뿐만 아니라 Oct-4+/c-Kit+ 세포를 제공받은 동물의 정소도 대다수의 정세관에서 정자형성을 전혀 보이지 않았다. 그러나, 새로 단리된 Oct-4+/c-Kit- 정소 세포를 제공받은 마우스의 80%가 정소 전체에서 어느 정도의 정자형성을 보였는데, 이것은 세포 현탁액 중의 기능성 SSC의 존재를 암시한다. c-Kit- 생식줄기세포 하위집단만이 수용자 정소에서 콜로니화되었다. 배양 전 및 후, 생식줄기세포의 이식 후에 일어나는 정소 재생이 도 9의 m 내지 r 및 표 1에 제시되어 있다. 면역결핍 마우스의 정상 정소의 횡단면은 도 9의 m에 도시되어 있다. 부설판 처리 후 1개월에서, 대다수의 정세관이 내인성 정자형성으로 인해 고갈되었다(도 9의 n). Oct-4+/c-Kit- 세포를 이식받은 마우스의 정세관의 73%가 어느 정도의 정자형성을 보였지만(도 9의 o), Oct-4+/c-Kit- 세포를 제공받은 마우스의 대다수의 세관 횡단면은 비어있었다(도 9의 p). Oct-4+/c-Kit- 세포의 이식 직후 CSFE로 태그표지된 양성 콜로니가 도 9의 r에 도시되어 있다. mGC를 이식받은 수용자 마우스 정소의 대다수의 정세관에서 정자형성이 전혀 발견되지 않았는데, 이것은 이들 세포가 SSC 성질을 갖지 않는다는 것을 암시한다(도 9의 q).
생식줄기세포 하위집단 및 다중분화능 생식세포주 하위집단이 수용자 마우스 정소 내에 이식된 후 일어나는 정자형성의 회복
이식된 세포 분석된 세관 횡단면의 총 수 정자형성을 가진 세관의 총 수(%) 빈 세관의 총 수(%)
Oct-4+ 580 328(56.5)b 252(43.5)
Oct-4+/c-Kit+ 440 68(15.5)a 372(84.5)
Oct-4+/c-Kit- 580 448(77.2)c 132(22.8)
mGC 420 100(23.8)a 320(76.2)
모의세포 480 80(16.6)a 400(83.4)
기형종 형성을 위해, 동등한 수의 마우스 ESC(양성 대조군으로서) 또는 Oct-4-GFP/LacZ mGC를 상이한 누드 마우스 군의 피부, 근육 및 정소 내로 주입하였다(1 x 106개 세포/부위). ESC를 제공받은 모든 수용자 마우스(6/6)가 3종의 조직 모두에서 기형종을 발달시켰다. 대조적으로, mGC를 제공받은 마우스 중 어떠한 마우스도(0/20) 기형종을 발달시키지 않았다(도 9의 a 내지 f). 이식 후 6주에서, Oct-4-GFP/LacZ 세포는 피부, 근육 및 정소 조직에서 발견되었다(도 9의 g 내지 i). 이들 데이터는 ESC와 달리 mGC가 비종양발생성을 나타낸다는 것을 보여준다.
배양된 Oct-4-GFP/LacZ 세포를 CD-1 마우스의 8 세포 배아 및 포배 내로 주입함으로써 키메라 형성을 측정하였다. 도 10의 a 내지 d에 나타낸 바와 같이, Oct-4-GFP/LacZ 세포를 마우스 포배의 내부 세포 덩어리 내로 도입하였다. 상기 배아를 가임신 마우스의 자궁 내로 옮겼다(119개의 옮겨진 배아로부터 총 45개의 태아). 12.55 dpc(교배 후 날짜)에서, LacZ(β-갈락토시다제 활성)에 대한 전체 배아의 염색은 눈, 뇌 및 사지에서 구별되는 패턴을 보여주었다(도 10의 e). LacZ 염색의 강도는 다중분화능 생식세포주를 주입받은 키메라 배아보다 마우스 ES 세포를 제공받은 키메라 배아에서 훨씬 더 높았다. 키메라 세포의 분포도 뇌, 심장, 생식샘 능선 및 간의 조직학적 절편에서 입증되었다(도 10의 l 내지 o). LacZ+ 세포의 강도 및 수는 LacZ-GS 세포를 주입받은 키메라 배아보다 LacZ-ES 세포를 주입받은 키메라 배아에서 훨씬 더 높았다. Oct-4-GFP/LacZ 키메라 조직의 확인은 키메라 새끼의 외배엽(뇌), 중배엽(심장), 내배엽(간) 및 정소에서의 GFP DNA 서열의 존재(도 10p)에 의해서뿐만 아니라 상기 4종의 조직 모두에서의 LacZ DNA의 존재(도 10q)에 의해서도 지지되었다. 이들 조합된 결과는 배양된 mGC가 일부 다분화능 특징을 가진 비기형발생성 줄기세포라는 것을 명확히 입증한다.
다중분화능 생식세포주는 성장 인자의 재프로그래밍 없이 성체 마우스 정소로부터 발생될 수 있는데, 이것은 다분화능 특징을 가진 세포 하위집단이 성체 정소에 존재할 가능성이 있음을 암시한다.
독립적으로, 전술된 바와 같이, ESC의 다분화능 특징의 일부(그러나, 전부는 아님)를 가진 생식성세포주 및 생식전구세포가 출생 후 마우스 생식줄기세포로부터 유래되었다. 이들 2종의 세포주는 특히 다중분화능 및 기형종 형성의 정도 면에서 다른 실험실에 의해 수득된 다중분화능 생식세포주와 구별가능하게 상이하다.
마이크로어레이 분석에 기초할 때, 마우스 Oct-4+/c-Kit+ 생식세포주는 ESC보다 1000배 및 5000배 더 낮은 수준으로 다분화능 유전자 Nanog 및 Crypto를 발현하였다. 유사하게, 상기 생식세포주는 p53, Eras, Bak, Int-2 및 c-myc를 포함하나 이들로 한정되지 않는 종양유전자를 발현하였으나, 발현 수준은 ES 세포보다 수배 더 낮았다. 놀랍게도, 상기 생식세포주는 생체내 이식시 기형종을 형성하지 않았으나 마우스 배아에서 제한된 키메라 세포 집단을 형성하였다.
여러 계열의 증거는 Oct-4+/c-Kit+ 생식전구세포가 그들의 생식세포 성질을 보유하므로 ESC 및 다른 이미 보고된 정소 세포와 상이하다는 인식을 지지한다: 즉, 1) 유도된 생식전구세포주는 (GFP 분류 및 수동 카운팅에 의해 측정될 때) 약 72시간 이내에 그들의 세포수를 2배로 증가시키는 세포 주기 시간을 갖고, 이 세포 주기 시간은 생식줄기세포의 세포 주기 시간과 보다 더 유사하고 ESC의 세포 주기 시간보다 약 3배 더 길다. 2) 어레이에서의 전반적인 유전자 발현 분석에 기초할 때, 본 생식전구세포는 ESC 또는 다른 다중분화능 생식세포주의 분자 특징과 상이한 분자 특징을 가진 듯하다. 본 생식전구세포주는 시험된 유전자들 중에서 생식 특이적 유전자(VASA, Plzf, GFR-α1, Dazl)의 유의하게 보다 높은 발현 수준 및 다분화능 유전자(Oct-4, Nanog, Dppa-5, Sox2, Crypto)의 유의하게 보다 낮은 발현 수준을 보였다. 3) 이들 세포주는 그들의 자가재생을 위해 LIF 또는 FGF2보다 GDNF에 더 의존하다. GDNF는 수컷 생식줄기세포의 자가재생의 핵심 조절자인 것으로 제안되었지만, LIF 및 FGF2는 ESC의 자가재생에 있어서 중요한 역할을 수행한다. 4) 이들 세포주에서 SSEA-1의 발현 수준은 마우스 ES 세포 또는 보고된 다른 다중분화능 생식세포주에서 발견된 수준보다 더 낮았다. SSEA-1이 일부 동물 모델 시스템에서 종양 침습 및 전이에 관여할 수 있다는 것이 밝혀졌는데, 이것은 보다 높은 발현이 종양발생에 대한 보다 높은 잠재력을 반영할 수 있음을 암시한다. 5) 다중분화능 GC는 마우스 ESC 또는 다른 실험실에 의해 보고된 다른 mGC 세포주와 상이한 안드로겐성 각인 패턴을 나타내었다.
본 생식전구세포주는 그들의 생식기원세포와의 모든 유사성에도 불구하고 이식 후 정소를 재생시키지 못하였는데, 이것은 상기 생식전구세포주가 생식성세포가 아니라는 것을 입증한다.
형질전환 마우스 모델은 생식줄기세포가 그들의 Oct-4 발현에 기초하여 신생아 정소 및 성체 정소 둘다로부터 단리될 수 있게 하였다. 하기 관찰결과를 이용하여 상기 생식줄기세포를 그들의 c-Kit의 발현에 따라 2개의 하위집단으로 더 분획화하였다: c-Kit 수용체 분자를 보유하는 Oct-4-/GFP+ 세포만이 배양에 반응하였고 다중분화능 생식세포주를 발생시켰고; 2) c-Kit- 하위집단만이 정조줄기세포 이식 후 정소에서 재증식하였다. 상기 결과는 2종 이상의 구별되는 생식줄기세포 하위세트가 생식 조직 내에 존재한다는 것을 명확히 보여준다: (1) 다중분화능 생식줄기세포, 즉 생식전구세포가 될 능력을 가진 c-Kit+ 폴, 및 (2) c-Kit 발현을 상실하고 정소에서 콜로니화될 능력을 획득한 생식줄기세포, 즉 생식성세포 하위세트. 분명하게는, 성체 조직에서 생식 기관 내의 생식줄기세포는 상이한 발달 단계에 존재하거나, 대안적으로 성장 인자 신호전달 및/또는 전사 인자에 반응하는 상이한 능력을 보유한다.
재료 및 방법
정소 세포의 단리: 신생아 마우스 새끼(출생 후 2 내지 5일) 또는 성체 마우스의 정소를 신체로부터 멸균 상태로 절제하였다. 정소의 캡슐을 제거하고, 정세관을 PBS 중의 1 mg/㎖ 콜라겐분해효소 1A 및 10 유닛/㎖ DNA 분해효소로 구성된 효소 용액에 현탁시켰다. 모든 세관들이 분해될 때까지 상기 정소를 37℃의 수조 내에서 분해하였다. 태아소 혈청(FBS)을 사용하여 상기 반응을 중단하였다.
마우스 배아 섬유모세포 ( MEF ) 영양세포의 제조: 12.5 dpc CD-1 마우스 배아를 사용하여 표준 절차로 MEF를 제조하였다. 트립신처리 전에 배아를 빼내고, 분리된 세포를 플레이트 당 약 1.5개 배아의 플레이팅 밀도로 150 mm 플레이트 상에 플레이팅하였다. 초기 플레이팅 후, MEF를 1:5로 분할한 후 동결하였다(계대배양 1). 해동된 MEF(P1)를 미토마이신 C 처리 전에 증폭 목적으로 1회만 계대배양하였다. MEF 영양세포를 ㎠ 당 50 내지 60 x 103의 밀도로 플레이팅하였다. 새로운 MEF 영양세포를 7 내지 10일마다 다분화능 생식세포 배양을 위해 사용하였다. 모든 동물 실험은 실험실 동물의 관리 및 사용에 대한 지침(국립연구협회)에 따랐다
텔로머라제 활성의 평가 및 핵형분석: 텔로머라제 활성을 측정하기 위해, 150 U/㎖ RNA 분해효소(RNase)를 함유하는 CHAPS 용해 완충제를 사용하여 생식세포주(계대배양 10 이상), 새로 단리된 Oct-4+/c-Kit+ 분류된 세포 및 Oct-4+/cKit- 분류된 세포로부터 세포 추출물을 단리하였다. 세포 용해물을 4℃에서 12,000xg에서 20분 동안 원심분리하고, 상청액을 -80℃에서 저장하였다. BSA를 표준물로서 사용하여 브래드포드(Bradford) 시약으로 단백질 농도를 분석하였다. TRAPEZE 검출 키트(케미콘(Chemicon))를 사용하는 PCR 기초 분석으로 텔로머라제 활성을 검출하였다. 750 ㎍/㎕의 세포 추출물 2 ㎕를 TRAP 반응 완충제, dNTP, 기질 올리고뉴클레오티드, 텔로머라제 프라이머, 내부 표준 프라이머 및 Taq 중합효소가 함유된 총 부피 50 ㎕의 PCR 반응 혼합물에 첨가하였다. 양성 대조군으로서, 2 ㎕의 mESC 세포 추출물을 상기 반응 혼합물에 첨가하고, CHAPS 용해 완충제 단독 및 열에 의해 불활성화된 텔로머라제를 각각의 실험 샘플에 대한 음성 대조군으로서 사용하였다. 텔로머라제 연장을 위해 각각의 샘플을 30℃에서 30분 동안 항온처리한 후 PCR로 증폭시켰다. 핵형분석을 위해, 증식 세포를 0.1 ㎍/㎖ 카리오맥스 콜세미드(KaryoMAX Colcemid)(인비트로겐)와 함께 배양물 중에서 3 내지 4시간 동안 항온처리한 후, 상기 세포를 저장성 용액(0.075 M KCL)에 재현탁시키고 실온에서 10분 동안 항온처리하였다. 그 다음, 세포를 냉각된 고정화제(3:1 메탄올:아세트산)에 재현탁시키고 4℃에서 30분 이상 동안 저장하였다. 고정화제를 사용하여 세척한 후, 세포를 깨끗한 유리 슬라이드에 도포하고 공기 건조하였다. 중기 염색체를 준비하고, 어플라이드 스펙트랄 이미징 밴드 뷰(Applied Spectral Imaging Band View) 디지털 영상화 시스템을 이용하여 핵형을 생성하였다.
시험관내 분화: 배상체(EB)를 발생시키기 위해, mGSC 콜로니를 콜라겐분해효소로 분리하고 비부착성 배양 플레이트에서 15% FBS를 함유하는 PM(상표명) 배지(2006년 7월 17일자로 출원되고 조직 배양 배지에 관한 모든 내용에 대해 본원에 참고로 도입되어 있는 동시계류 미국 특허출원 제11/488,362호에 개시됨)에 플레이팅하였다. 일부 실험에서, EB는 현적으로 형성되었다. 3개의 생식 층을 대표하는 세포로의 분화를 위해 EB를 마커 측정용으로 3일마다 채취된 샘플과 함께 15일 동안 배양하였다. 유도된 분화를 위해, EB를 PM 배지에서 4일 동안 배양한 후 계통 선택을 위해 혈청 무함유 N1 배지, 즉 ITS(인슐린, 10 mg/ℓ; 트랜스페린, 5.5 mg/ℓ; 셀레늄 0.67 mg/ℓ) 및 피브로넥틴(50 ㎍/㎖)으로 보충된 DMEM/F12(인비트로겐)에서 배양하였다. 5 내지 7일 후, N1로 처리된 세포 응집물을 신경기원세포의 증폭을 위해 젤라틴으로 코팅된 배양 플레이트 내의 N2 배지(ITS를 갖되 피브로넥틴을 갖지 않고 10 ng/㎖ bFGF로 보충된 N1 배지)로 옮겼다. 심근세포로의 분화를 위해, 0.06 M DMSO, 5 mM 5'-아자-2'-데옥시-시티딘(ASA) 및 25 내지 50 μM 카르디오게놀(cardiogenol)-C를 포함하는 상이한 심장발생성 화합물의 존재 하에서 EB를 2주 동안 배양하였다. 분화 과정 동안 세포의 형태를 분석하고, RT-PCR에 의한 유전자 발현 분석 및 면역조직화학적 염색 둘다를 위해 샘플들을 채취하였다. mGSC의 연골세포 분화는 10 ng/㎖ TGF-3β 및 20% FBS로 보충된 연골발생성 유도 배지(콘드로게닉 싱글쿠오츠(Chondrogenic SingleQuots), 캠브렉스(Cambrex))를 첨가함으로써 유도하였다.
면역세포화학적(ICC) 및 면역조직화학적(IHC) 염색: 배양된 세포를 실온에서 4% 파라포름알데히드로 10 내지 30분 동안 고정시키고 4℃에서 PBS에 저장하였다. 형광 면역세포화학을 위해, 15분 동안 1x 사이토펌(Cytoperm)(비디 바이오사이언시스(BD Biosciences)) 또는 0.2% 트리톤 X-100을 사용하여 세포를 투과가능한 상태로 만든 후, 실온에서 2%(중량/부피) 소혈청 알부민(BSA), 2%(부피/부피) 정상 염소 혈청(GS)/1x 사이토펌-PBS에서 30 내지 60분 동안 항온처리하였다. 일차 항체를2% BSA/2% GS/1x 사이토펌-PBS로 최적 농도로 희석하고 4℃에서 3시간 동안 항온처리하거나, 4℃에서 차단 완충제로 밤새 희석하였다. 그 다음, 2회 세척 후, 형광 이차 항체를 2% BSA/2% 염소 혈청/1x 사이토펌-PBS로 희석하고 4℃의 암실에서 1시간 동안 항온처리하였다. 세포를 PBS로 2회 세척하고 호일로 감싸고 현미경으로 분석할 때까지 4℃에서 저장하였다. 디지털 영상 하드웨어 및 소프트웨어가 장착된 올림푸스(Olympus) IX71 현미경 또는 지에스(Ziess) LSM510 공초점 현미경을 이용하여 영상을 판독하였다.
명시야 면역세포화학을 위해, 세포를 1x PBS로 1회 세척하였다. 3%(부피/부피) H2O2를 사용하여 내인성 과산화효소(peroxidase) 활성을 15분 동안 차단한 후 투과가능한 상태로 만들고 2% BSA/2% GS/1x 사이토펌-PBS를 사용하여 30분 동안 차단하였다. 그 다음, 일차 항체를 2% BSA/2% GS/1x 사이토펌-PBS로 희석하고 4℃에서 3시간 동안 항온처리하였다. 나머지 염색은 제조자의 설명서에 따라 ABC 염색 키트를 사용하여 달성하였다. 정제수에 용해되고 5 내지 10분 동안 항온처리된 증강된 디아미노벤지딘(DAB) 기질 정제(tablet)를 사용하여 가시화하였다. 음성 대조군을 위해, 일차 항체를 누락시켰다.
유세포분석: SSEA-1 및 c-Kit를 포함하는 특이적 항체를, 인플럭스 셀 소터(Influx Cell Sorter)(사이토페이아 인코포레이티드(Cytopeia, Inc))를 이용하는 유세포분석을 위해 최적화시켰다. c-Kit 분류를 위해, Oct-4-GFP 구축물을 함유하는 새로 단리된 정소 세포를 항-CD117 APC(비디 바이오사이언시스)로 염색하였다. 일부 실험의 경우, 새로운 생식세포 콜로니를 분리하고 세포를 항-SSEA-1 항체로 염색한 후 PE-Cy7과 접합된 염소 항-마우스 IgM으로 염색하였다.
유전자 발현, 각인 분석 및 GFP 증폭: 알엔이지(RNeasy) 미니 키트(퀴아젠(Qiagen))를 사용하여 전체 RNA를 단리하였고, RNA를 RT-PCR, 정량 PCR 또는 마이크로어레이 분석을 위해 사용하였다. RT-PCR을 위해, cDNA를 센시스크립트(Sensiscript) RT 키트로 합성하고, 핫스타(HotStar) Taq DNA 중합효소를 사용하여 PCR을 수행하였다. 모든 PCR 반응은 효소를 활성화시키기 위한 95℃에서의 15분 동안의 초기 항온처리로 시작하였다. 이 항온처리 후, 15분 동안 95℃, 1분 동안 적절한 어닐링 온도 및 1분 동안 72℃로 구성된 35주기를 수행한 후, 최종 연장을 위해 10분 동안 72℃의 1주기를 수행하였다. 아이사이클러(iCycler)(상표명) 열적 순환기(바이오-라드(Bio-Rad))를 이용하여 반응을 수행하였다. Oct-4, Nanog, Rex-1, DPPa5, Dazl, β-액틴, Nkx2.5, 네스틴, Mab2 및 GFAP를 포함하는 특이적 프라이머들을 사용하여 RT-PCR에 대한 절차를 수행하였다. 내부 대조군을 위해, GADPH를 세포 샘플에 대한 하우스 킵핑 유전자로서 사용하였고, β-액틴 또는 인터루킨-2(IL-2)를 마우스 배아에서 사용하였다.
mGSC 및 mESC에서의 각인 패턴을 PCR 기초 분석으로 확인하였다. 중아황산염으로 처리된 DNA의 디메틸화된 구역(DMR) 각각의 PCR 증폭을 특이적 프라이머를 사용하여 수행하였다. 각인된 유전자의 분석을 위해, UVP 영상 소프트웨어를 이용하여 밴드 강도를 정량하였다. GFP 및 LacZ 증폭을 위해, 키메라 배아의 개별 조직을 해부를 통해 조심스럽게 수집하고 작은 조각으로 분쇄하고 제조자의 프로토콜에 따라 DNA 단리 및 정제를 위한 DNA 추출 완충제(디엔이지(DNeasy) 키트)에 넣었다.
정조줄기세포 이식: 정자형성의 재생에 대한 mGC의 기능성을 시험하기 위해, 정조줄기세포 이식을 이용하였다. 20마리의 6 내지 8주령의 면역결핍 누드 수컷 마우스(할란(Harlan))를 부설판(40 mg/kg)으로 처리하고 수용자로서 사용하였다. 부설판 처리 후 1개월에서, 2 x 105개의 세포를 정소망 주입을 통해 정세관 내로 이식하였다. 4마리의 마우스는 mGC(GFP 분류된 세포)를 제공받았다. 4마리의 다른 마우스는 새로 단리된 GFP+ 분류된 세포를 주입받았다. 4마리의 마우스는 새로 단리된 GFP+/c-Kit+ 분류된 세포를 이식받았고, 4마리의 마우스는 새로 단리된 GFP+/c-Kit- 분류된 세포를 주입받았다. 남은 4마리의 마우스는 모의 대조군으로서 사용되었고 주입받지 않았다. 이식 후 1개월에서, 동물을 희생시키고 정소를 수집하여 조직학적 평가에 사용하였다. 이식의 효능을 평가하기 위해, 정자형성을 가진 세관 횡단면의 총 수를 카운팅하였다.
기형종 및 키메라 형성에 대한 시험: 기형종 또는 키메라를 형성하는 mGC의 능력을 시험하기 위해, OG2 마우스(잭슨 레이보레이토리스(Jackson laboratories))를 로사(Rosa) 26 마우스(잭슨 레이보레이토리스)와 교배시키고, 신규 품종(OG2-R26)을 발생시켰다. 이들 마우스는 그들의 생식세포 내에 GFP 구축물 및 LacZ 구축물 둘다를 가진다. 배양을 전술한 바와 같이 수행하였고, 기형종 및 키메라 형성 시험을 위해 새로운 Oct-4-GFP/LacZ 생식세포주를 생성하였다. 누드 마우스의 피하, 근육내 또는 정세관 내로의 주입을 통해 생체 내에서 기형종을 형성하는 마우스 Oct-4-GFP/LacZ mGSC의 능력을 조사하였다. 기형종 형성에 대한 양성 대조군으로서 ES 세포를 일부 마우스에 주입하였다. 피하, 근육내 또는 정소 주입의 경우, 약 1 x 106개 세포를 주입하였다. 6주 후, 마우스를 희생시키고, 형태학적 분석 및 조직학적 분석을 위해 조직을 수집하였다.
마우스 Oct-4+/GFP+/LacZ GSC가 키메라 세포 집단을 형성하는 능력을 상기 GSC를 숙주 포배 내로 주입한 후에 측정하였거나 상실배 단계 배아 또는 8 세포 단계 배아와 상기 GSC의 응집을 이용하여 측정하였다. CD-1 마우스로부터 수집된 3.5일 포배를 사용하여 15 내지 20개의 세포의 포배 주입을 수행하였다. 주입 후, 포배를 정관절제된 수컷과 미리 교배된 2.5일 가임신 CD-1 암컷 내로 옮겼다(자궁의 각각의 돌기 내의 7 내지 8개 포배). β-갈락토시다제 염색 키트(시그마)를 사용하여 키메라 12.5 dpc 배아의 상이한 영역에서 lazZ 세포의 도입을 조사하였다. 추가로, Oct-4-GFP/LacZ 세포로부터 형성된 키메라 배아의 뇌, 심장, 간 및 생식샘 능선으로부터 단리된 DNA에서 lacZ 및 GFP PCR을 수행하였다.
실시예 2
영장류 생식줄기세포의 단리, 확인 및 특징규명
정지기 생식줄기세포 및 활발하게 분열하는 생식줄기세포는 마우스 정소에서 2개의 구별되는 세포 집단으로서 존재하기 때문에(실시예 1), 이들 2개의 세포 집단이 성체 영장류 정소에도 존재할 가능성을 조사하였다.
정자형성은 정조줄기세포(SSC)로서 분류된 미분화된 생식세포가 분열하고 성숙하여 정자를 생성하는 고도로 조절된 과정이다. 설치류에서, As(A단일) 정조세포는 정자형성을 책임지는 설치류 줄기세포인 것으로 간주되기 때문에, 상기 정조세포는 자가재생 및 분화 둘다를 수행할 수 있다. 설치류와 달리, 영장류 및 인간 세포의 조직학적 연구는 정소 정세관 상피의 기저막 상에서 2종의 상이한 구별되는 핵 염색(즉, A어두운 및 A연한 정조세포로서 명명됨)을 입증한다.
영장류 정소 생식줄기세포의 실질적인 정제를 위한 마커 및 단리 방법이 이하에 기재되어 있다.
붉은털(Rhesus) 원숭이 시험을 영장류 생식줄기세포의 특징규명에 이용하였다. 면역조직화학적 조사, 표면 마커 및 형광 활성화된 세포 분류를 이용하여 성체 붉은털 원숭이 정소로부터 생식줄기세포를 확인하고 특징규명하고 실질적으로 정제하였다. 텔로머라제, RT-PCR, 및 생식 특이적 마커 VASA 및 SSC 특이적 마커 GFR-α1을 사용하는 면역조직화학적 염색을 이용하여 각각의 세포 집단에서 생식줄기세포의 존재를 확인하였다. 정조세포 이식을 이용하여 농축 전 및 후에 세포 집단의 기능성을 밝혔다.
면역조직화학적 방법을 이용하여 영장류 정소에서 생식줄기세포를 확인하고 특징규명하고 국소화하였다. 이들 연구를 위해, 세포외 매트릭스 성분(ECM) α6-인테그린, SSEA-4 및 GFR-α1에 대해 특이적인 항체를 사용하여 영장류 정소의 조직학적 절편을 가시적으로 염색하였다.
α6-인테그린에 대해 특이적인 항체는 정세관 내의 기저막에 인접하여 위치한 세포뿐만 아니라 정세관 기저막도 염색하였다(도 18). 평균 13개의 α6-인테그린+ 세포가 각각의 정세관 조직학적 횡단면에서 발견되었다. 정세관 절편 내에서 대다수의 α6-인테그린+ 세포는 VASA+ 또한 나타내었는데, 이것은 상기 세포의 생식줄기세포 상태를 확인시켜준다. 정량적으로, 세관 횡단면 당 α6-인테그린+ 세포가 GFR-α1보다 더 많이 존재하였고, 동시국소화 연구는 약 60%의 α6-인테그린+ 세포가 GFR-α1+ 또한 나타낸다는 것을 보여주었다. 영장류 정소의 이들 조합된 면역조직화학적 연구는 α6-인테그린 및 SSEA-4 세포 표면 마커와 생식세포 특이적 마커 VASA 및 SSC 특이적 마커 GFR-α1, 즉 수컷 생식줄기세포에서 특이적으로 발현되는 마커의 동시국소화를 가진 정세관의 기저막에 인접한 세포를 보여주었다(도 19).
GFR-α1 세포 표면 마커는 정세관의 기저막에 위치하는 세포에서 특이적으로 발현되었다. 모든 GFR-α1+ 세포들이 생식세포 특이적 마커 VASA에 대해서도 양성을 나타내었다.
모든 SSEA-4+ 세포들이 성체 영장류 정세관의 기저막에 위치하였고, 이들 세포는 VASA 염색에 대해서도 양성을 나타내었다. 대다수의 SSEA-4+ 세포들은 α6-인테그린+ 또한 나타내었다. SSEA-4와 GFR-α1 사이에 상당한 동시국소화도 존재하였는데, 이것은 SSEA-4가 생식줄기세포에 중요한 세포 표면 마커라는 것을 보여준다. 영장류 정소 조직학적 횡단면에서 정세관의 기저막에 위치하는 정조세포의 약 40%가 SSEA-4를 발현하였다.
매우 적은 c-Kit+ 세포들이 영장류 정소에서 발견되었다. 세관 횡단면 내에서 c-Kit 염색은 정세관의 내강(lumen)에 위치하는 세포에서만 발견되었다. 모든 c-Kit+ 세포들은 VASA+ 또한 나타내었는데, 이것은 상기 세포들이 분화된 생식세포라는 것을 보여준다. 정세관 횡단면의 기저막에 위치하는 세포들에서는 c-Kit 염색이 전혀 발견되지 않았다. 이들 발견은 영장류 생식줄기세포가 c-Kit-를 나타낸다는 것을 암시한다.
Nanog는 영장류 정소에서 풍부하게 발현되었다. Nanog는 핵 염색으로서 나타났고 정세관 내의 거의 모든 생식세포들에서 VASA와 동시국소화되었다. Nanog 발현은 기저막에 위치하는 미분화된 생식세포와 비교할 때 정세관의 내강에 위치하는 진행된 생식세포에서 더 강하였다. Nanog 및 GFR-α1의 동시국소화 연구는 모든 생식줄기세포들이 낮은 수준의 Nanog 발현을 보인다는 것을 보여주었다.
CD90 항체들은 기저막만을 염색하였고 정소 내의 어떠한 세포 구조체도 염색하지 않았다.
영장류 정소 샘플의 면역조직화학적 특징규명은 성체 영장류 정소 내의 생식줄기세포가 α6-인테그린, SSEA-4 및 GFR-α1에 대해 양성을 나타내고 c-Kit에 대해 음성을 나타낸다는 것을 보여주었다.
안락사된 3 내지 7세의 붉은털 원숭이로부터 정소를 수술로 절제하고, 상기 정소를 페니실린/스트렙토마이신(각각 셀그로 및 인비트로겐)으로 보충된 PBS에 넣고 얼음 상에서 밤새 수송하였다. 정소 캡슐의 수술적 제거 후, 생검 샘플을 조직학적 분석 및 분자적 분석을 위해 절제하였다. 남은 정세관 조직을 미세하게 분쇄하고 왕복 37℃ 수조 내에서 콜라겐분해효소 A(1 mg/㎖)(로슈) 및 DNA 분해효소(10 U/㎖)(인비트로겐)로 15분 동안 분해하였다. 콜라겐분해효소 분해 후, 미분해된 조직을 유닛 중력에서 침강시키고 상청액 중의 세포를 절제하였다. 미분해된 조직을, 왕복 37℃ 수조 내에서 DMEM 중의 1.5 mg/㎖ 콜라겐분해효소 A, 1.5 mg/㎖ 히알루론산분해효소 V형(시그마), 0.5 mg/㎖ 트립신(워싱톤 바이오케미칼 코포레이션(Worthington Biochemical Corporation)) 및 10 유닛/㎖ DNA 분해효소로 구성된 효소 칵테일로 20분 동안 더 분해하였다. 분해된 조직 및 미분해된 조직을 70 ㎛ 여과기(strainer)를 통해 FBS(태아소 혈청; 하이클론(Hyclone)) 내로 통과시켜 효소를 불활성화시켰다. 400xg에서 10분 동안 원심분리한 후, 세포 펠렛을 DMEM + 10% FBS에 재현탁시키고 5% CO2/95% 대기 습윤 항온처리기 내의 조직 배양물 코팅된 15 cm 접시에 넣었다.
유세포분석을 이용하여 성체 영장류 정소 생식줄기세포에 대해 특이적인 세포 표면 마커를 확인하였다(도 20). 비영장류 SSC를 사용하는 다른 연구자들의 보고와 대조적으로, 새로 단리된 성체 영장류 정소 세포는 상피세포 부착/활성화 분자(EpCAM)를 발현하지 않았다. 그러나, 생식줄기세포는 그들의 세포 표면 상에서의 GDNF 수용체 GFR-α1의 발현에 의해 전체 성체 영장류 정소 세포 집단의 매우 작은 일부(전체 정소 세포 단리물의 1% 미만)으로서 확인되었다. 유사하게, 뮤린 정소 생식줄기세포를 사용한 경우(실시예 1)와 대조적으로, 새로 단리된 성체 영장류 생식줄기세포는 c-Kit를 발현하지 않았다. 그러나, 성체 영장류 생식줄기세포(단리된 정소 세포 집단의 약 2%)는 돌리코스 비플로우루스 응집소(DBA)에 의해 결합된 세포 표면 탄수화물 결정자(determinant)인 레시틴을 발현하였다. 또한, 성체 영장류 생식줄기세포는 CD9, CD90 및 CD49f 세포 표면 마커를 발현하였다(도 21).
영장류 생식줄기세포의 단리를 위해, c-Kit는 이중 양성 CD90+/CD49f+ 세포를 확인하기 위해 CD90+ 및 CD49f+ 둘다에 대해 작도된 음성/모 분류 창(negative/parent sorting window)으로서 작동되었다. 이중 양성 세포에 대한 분류는 성체 영장류 정소 단리물 중의 전체 세포의 약 5.77%로서 존재하는 생식줄기세포의 단리를 달성하였다. 후자 CD90+/CD49f+ 이중 양성 세포는 추가 사용을 위해 수집되었다. SSEA4에 대해 양성을 나타내는 c-Kit- 세포를 선택하여 전체 성체 영장류 정소 세포의 약 2%를 구성하는 실질적으로 정제된 제2 세포 집단을 단리함으로써 추가 정제를 달성하였다. CD90, CD49f 및 SSEA4 모두에 대해 양성을 나타내는 c-Kit- 세포를 선택하여 전체 성체 영장류 정소 세포의 약 1.47%를 구성하는 실질적으로 정제된 제3 세포 집단을 단리함으로써 추가 정제를 달성하였다.
이들 조합된 유세포분석은 성체 영장류 정소로부터 하기 성질을 가진 2개의 구별되는 생식줄기세포 집단의 단리 및 실질적인 정제를 달성하였다: (a) Thy-1+ 및 α 6-인테그린+ 세포 집단 및 (b) GFR-α1 및 VASA 세포 표면 마커 둘다를 발현하고 높은 텔로머라제 활성을 가진 SSEA-4+ 세포 집단으로서, 세포의 50% 이상이 GFR-α1 세포 및 VASA 세포 둘다에 대해 양성을 나타내는 세포 집단.
유세포분석 및 면역조직화학적 염색을 더 확장하기 위해, 새로 단리된 성체 영장류 정소 세포를 하기와 같이 분류하였다: (i) α6-인테그린+; (ii) CD-90+; (iii) CD-90+/α6-인테그린+/c-Kit-(삼중 분류); 및 (iv) SSEA-4+ 세포. 단리되고 정제된 상이한 정소 세포 집단들을 생식세포 마커 VASA 및 SSC 마커 GFR-α1의 존재에 대해 시험하였다(도 22). 비분류된 세포는 약 70% VASA+ 세포를 함유하였지만, 이들 세포 중 10%만이 GFR-α1에 대해 양성으로 염색되었다. α6-인테그린 단독에 대한 분류는 생식세포 마커 및 SSC 마커 둘다를 가진 세포, 즉 42.6% VASA+ 및 GFR-α1+ 세포를 가진 집단에서 유의한 증가를 야기하였다. CD-90 단독에 대한 분류 또는 CD-90과 c-Kit-의 병용에 대한 분류(삼중 분류)도 VASA+/GFR-α1+ 세포의 비율을 각각 30% 및 46.4%로 유의하게 증가시켰다. 또한, SSEA4+ 단독에 대한 분류는 생식세포 마커 및 SSC 마커를 발현하는 세포, 즉 세포의 37.5%가 VASA+ 및 GFR-α1+를 나타내는 분류된 세포 집단에 대한 농축을 야기하였다.
상이한 영장류 정소 세포 집단들의 기능성은, 화학요법 약물인 부설판으로 처리된 면역결핍 누드 마우스의 정소에서 정세관의 기저막에서 재증식하는 그들의 능력을 시험함으로써 실질적인 정제 전 및 후에 측정하였다. 이들 연구를 위해, 9마리의 6 내지 8주령의 무흉선 누드 수컷 마우스를 부설판(40 mg/kg)으로 처리하였다. 부설판 처리 후 1개월에서, 2 x 105개 성체 영장류 정소 세포를 정소망 주입을 통해 정세관 내로 이식하였다. 이들 연구를 위해, 3마리의 마우스는 새로 단리된 비분류된 세포로 구성된 이식물을 제공받았고, 3마리의 마우스는 새로 단리된 c-Kit-/SSEA-4+ 분류된 세포로 구성된 이식물을 제공받았고, 3마리의 마우스는 새로 단리된 c-Kit-/SSEA-4- 분류된 세포로 구성된 이식물을 제공받았다.
수용자 마우스 정소에서 이식된 영장류 세포를 더 잘 확인하기 위해, 생체염료 카르복시플루오레세인 디아세테이트 석신이미딜 에스테르(CSFE)를 형광 마커로서 사용하였다. CSFE는 아세테이트 기가 세포내 에스테르분해효소(esterase)에 의해 절단되어 고형광 생성물이 생성될 때까지 무색 비형광 화합물이다. 후자 형광 생성물은 잘 보유되었고 알데하이드 고정화제로 고정되었으나, 형광 강도는 각각의 세포 분열과 함께 기하급수적으로 감소되었다. 이 생체염색을 위해, 세포를 수집하고 1% BSA를 함유하는 1x PBS로 1회 세척한 후 1x PBS로 1회 세척한 다음, 37℃에서 1x PBS 중의 8 μM CSFE와 함께 10분 동안 항온처리하였다. 생성된 생체염색된 세포를 2% FBS를 함유하는 MEMα(인비트로겐)로 세척하고 400xg에서 5분 동안 원심분리하여 수집하고 배지에 재현탁시키고 카운팅하였다.
이식 후 2주에서, 마우스를 희생시키고, 마우스의 정소의 조직학적 절편에서 CSFE+ 세포 콜로니의 수를 현미경으로 측정하였다(도 23). 이론적으로, 생식줄기세포가 약 72시간의 세포 주기 시간을 가진 경우, 이식 후 2주에서 세포는 2 내지 3회의 세포 배가 증가를 경험하여 약 4 내지 8개의 세포로 구성된 콜로니를 발생시켜야 한다. 통계적 분석을 위해, ANOVA 검정을 적용하였고, p<0.05는 유의한 것으로 간주되었다.
이들 조합된 이식 연구는 GFR-α1 및 VASA 마커를 발현하는 세포를 함유하는 SSEA-4+ 세포 집단만이 부설판으로 처리된 마우스 정소를 재증시키는 능력을 가진다는 것을 보여주었다(도 24). 이들 발견은 상기 세포가 원시생식줄기세포라는 것을 보여준다.
각각의 세포 집단의 세포 분열 상태를 조사하기 위해, 유세포분석을 이용하여 2개의 집단의 DNA 함량을 조사하였다(도 25). 이 분석은 SSEA-4+ 세포 집단이 세포 주기의 G0-G1 단계에 존재하는 세포의 세포 DNA 함량과 유사한 세포 DNA 함량을 가진다는 것을 보여주었다. 대조적으로, Thy-1 및 α6-인테그린 세포 표면 마커를 가진 세포는 세포 주기의 G0-G1 단계 또는 S 기와 유사한 2개의 구별되는 상이한 DNA 함량을 가진다. 상기 데이터는 SSC 세포 표면 마커를 가진 SSEA-4+ 세포 집단이 원시생식줄기세포의 정지기 집단을 대표하는 반면, Thy-1+ 및 α6-인테그린+ 세포 집단은 활발하게 분열하는 SSC 집단을 대표한다는 것을 보여준다(도 27).
상기 결과는 성체 영장류 정소 내의 생식정조줄기세포가 설치류에서 SSC와 유사하지만 구별되는 분자적 특징 및 표현형적 특징을 보유한다는 것을 명확히 보여준다. 다양한 줄기세포, 생식세포 및 정조줄기세포 특이적 마커를 사용하는 면역조직화학적 조사는 영장류에서 정세관의 기저막을 따라 정조줄기세포의 표면에서 GFR-α1이 특이적으로 발현된다는 것을 보여주었다. GFR-α1은 SSC의 자가재생의 중요한 조절자인 GDNF에 대한 수용체이다. GFR-α1+ 세포는 VASA+를 나타내었는데, 이것은 상기 세포가 생식세포라는 것을 암시한다. α6-인테그린과 GFR-α1의 동시국소화는 성체 영장류 정세관 내에 위치하는 세포에서 80%이었다. α6-인테그린+ 세포를 선택함으로써 농축된 세포 집단은 GFR-α1과의 매우 높은 수준의 동시국소화를 보였는데, 이것은 정소 절편에서 생식줄기세포를 확인하기 위해 면역조직화학적 방법을 이용하여 수득한 발견을 확인시켜준다. 영장류 SSC 상에서의 α6-인테그린의 발현은 마우스, 마모셋 및 인간 SSC도 그들의 세포 표면 상에서 이 마커를 보유하므로 상기 마커가 종들 사이에서 보존되어 있다는 것을 암시한다. 세관 외부의 간질세포 내에서의 일부 α6-인테그린+ 세포의 국소화는 성체 영장류 정소로부터 고도로 순수한 SSC 집단을 단리하기 위해 이 마커만을 사용할 수 없다는 것을 암시한다.
SSC는 다른 줄기세포, 특히 조혈줄기세포와 일부(그러나, 전부는 아님) 표현형적 특징 및 분자적 특징을 공유한다. 다양한 세포 표면 마커를 사용하는 유세포분석은 성체 붉은털 원숭이 정소에서 α6-인테그린 및 Thy-1을 발현하는 구별되는 세포 집단들이 존재하고, 영장류 정소 내의 대다수의 세포들이 c-Kit-를 나타낸다는 것을 보여주었다. 영장류 정소의 면역조직화학적 염색도 정세관의 기저막을 따라 모든 세포들이 c-Kit-를 나타낸다는 것을 보여주었는데, 이것은 α6-인테그린+ 세포가 c-Kit-를 나타낸다는 것을 암시한다. α6-인테그린 또는 Thy-1 단독에 대한 분류는 면역조직화학적 염색, RT-PCR 및 텔로머라제 분석에 의해 나타낸 바와 같이 SSC 마커의 농축을 야기하였다. 흥미롭게도, α6-인테그린+, Thy-1+ 및 c-Kit- 세포의 분류는 정량 RT-PCR(도 26a) 및 가장 상승된 텔로머라제 활성(도 26b)에 의해 나타낸 바와 같이 SSC 마커 PLZF의 가장 높은 발현 수준을 야기하였는데, 이것은 이들 마커의 병용이 SSC를 여러 배 농축시킨다는 것을 암시한다. 또한, 높은 수준의 텔로머라제 활성을 보이고 높은 수준의 생식세포 마커 및 SSC 마커 둘다를 발현하는 명확한 SSEA-4+ 세포 집단이 영장류 정소에도 존재하였다(도 28).
면역조직화학적 염색은 SSEA-4+ 세포도 정세관의 기저막에 위치하고 α6-인테그린 및 GFR-α1과 함께 고도로 동시국소화된다는 것을 보여주었다. 유세포분석은 약 5 내지 7%의 α6-인테그린+, Thy-1+ 및 c-Kit- 분류된 세포가 성체 영장류 정소에 존재하는 반면, 단지 2 내지 3%의 SSEA-4+ 세포가 존재한다는 것을 보여주었다. 이것은 세관 횡단면 당 발견된 SSEA-4+ 세포가 α6-인테그린+ 세포보다 상당히 더 적다는 것을 보여주는 정소 절편에 대한 면역조직화학적 데이터와도 일치한다. 또한, 이것은 영장류 정소 내의 SSC가 SSEA-4+와 함께 α6-인테그린+, Thy-1+ 및 c-Kit-의 표현형적 특징을 가진다는 것을 암시한다. SSEA-4는 단계 특이적 배아 항원이고 다분화능 세포와 유사한 배아줄기세포에서 주로 발견된다. 흥미롭게도, 모든 SSEA-4- 세포가 생식세포 마커 VASA를 동시발현하였으나, 이들 세포의 한 분획만이 GFR-α1과 동시국소화되는데, 이것은 이 마커가 원숭이 정소 내의 정조줄기세포 하위집단에서만 발현된다는 것을 암시한다.
핵 염색의 밀도에 기초한 영장류 정소의 형태학적 분석은 2종의 미분화된 정조세포, 즉 A어두운 정조세포 및 A연한 정조세포가 존재한다는 것을 보여주었다. A어두운 정조세포는 줄기세포를 보존하되 활발히 분열하지 않는 것으로 생각되고, A연한 정조세포는 영장류 정소 내의 활성 SSC인 것으로 밝혀져 있다.
유세포분석과 함께 DNA 염료 요오드화프로피듐(PI)을 사용하여, SSEA-4+ 생식줄기세포 집단이 Thy-1+ 및 α6-인테그린+ 세포와 상이한 DNA 함량을 가진다는 것을 확인하였다. SSEA-4+ 세포는 활발히 분열하는 세포와 유사한 DNA 프로파일을 가진 반면, Thy-1+ 및 α6-인테그린+ 세포는 세포 주기의 S 기에서 정지된 축적된 다수의 세포를 보였다. 뿐만 아니라, SSEA-4+ 세포는 PCNA 염색에 의해 나타낸 바와 같이 Thy-1+ 및 α6-인테그린+ 세포보다 상당히 더 높은 증식 활성을 보였다.
ES 세포들을 그들의 미분화된 단계에서 유지하는 데 있어서 필수적인 역할을 수행하는 다분화능 마커 Nanog는 영장류 정소에서 풍부하게 발현되었다. 모든 생식 세포에서 Nanog가 발현되고 SSC에서만 Nanog가 발현되지 않는다는 것은 ES 세포와 비교할 때 생식줄기세포에서 이 전사 인자의 상이한 역할을 암시한다. 생식세포에서의 Nanog의 결실은 분화보다는 오히려 아폽토시스를 유도하는 것으로 밝혀졌는데, 이것은 Nanog가 생식세포를 위한 생존 인자라는 것을 암시한다.
성체 마우스 정소에서 3000개의 세포 중 1개의 세포가 SSC라는 것이 밝혀져 있다. SSC 특이적 마커 GFR-α1 및 PLZF를 사용하는 면역조직화학적 염색에 기초할 때 성체 원숭이 정소에서 SSC의 백분율은 설치류에 대해 기재된 SSC의 백분율과 매우 유사하다. 정조세포 이식 연구도 약 0.3% SSC가 성체 원숭이 정소에 존재한다는 것을 보여주었다.
삼중 염색된(CD90+, CD49f+, c-Kit-) 세포 및 SSEA-4+ 세포가 SSC의 분자적 특징 및 표현형적 특징을 보이나, SSEA-4+ 세포만이 정조세포 이식 후 수용자 정소에서 재증식한다는 것이 본원에서 입증된다. 이것은 SSEA-4+ 세포가 활발히 분열하는 SSC를 대표할 것이고 삼중 염색된 세포가 정지기 줄기세포와 유사할 것이라는 것을 암시한다. 흥미롭게도, SSEA-4에 의해 염색된 세포 및 삼중 염색된 세포 둘다 GDNF의 수용체인 C-ret를 발현하지만, 삼중 분류된 세포만이 PLZF 발현을 보였다. GDNF 및 PLZF 둘다 정조줄기세포 자가재생의 주요 조절자인 것으로 공지되어 있다. GDNF는 BCL6b 전사 인자의 상향조절을 통해 SSC 자가재생을 조절하지만, PLZF는 아직 공지되지 않은 기작으로 SSC 자가재생을 유지한다. 전골수세포백혈병 아연 인자(PLZF)는 다양한 종류의 세포에서 사용될 수 있는 사이클린 A의 억제를 통해 G1/S 전이에서의 세포 성장 및 S 기의 통과를 억제하는 것으로 밝혀져 있다. 또한, PLZF는 G1/S 전이의 또 다른 조절자인 P21을 억제하는 것으로 밝혀져 있다. 따라서, 높은 수준의 PLZF는 세포 주기의 차단 및 정지를 초래한다. 레티노산 수용체 알파(RAR-α)는 사이클린 A의 발현을 증강시킴으로써 PLZF에 의해 유도된 세포 주기 억제를 역행시키는 것으로 밝혀져 있다.
재료 및 방법
유세포분석에 의한 영장류 생식세포 실질적 정제: 유세포분석 분류를 인플럭스 셀 소터를 이용하여 달성하였다. 표면 특징규명 및 분류를 위해, 항-CD90-FITC, 항-CD49f-PE 및 항-CD117-APC를 포함하는, 비영장류 종의 줄기세포 표면 마커 및 정조줄기세포 마커에 대해 특이적인 항체 시약을 사용하여 세포를 염색하였다. 이들 마커 분석을 위해, 세포를 얼음 상의 완전한 배지에서 30분 동안 염색하고 냉각된 염색 완충제로 1회 세척하고 완전한 배양 배지에 재현탁시키고 세포형광측정 분석을 수행할 때까지 얼음 상에서 보존하였다.
영장류 생식세포 자기 분류: 영장류 생식세포를 자기 마이크로비드로 태그표지하고 상기 세포를 자기 컬럼에 통과시킴으로써 영장류 생식세포 집단을 농축하였다. 새로 단리된 영장류 정소 세포를 SSEA-4에 대한 바이오티닐화된 항체 또는 α6-인테그린에 대한 바이오티닐화된 항체 및 Thy-1에 대한 바이오티닐화된 항체들(각각 에바이오사이언스(Ebioscience), 아브캠(Abcam) 및 비디 파밍겐(Pharrmingen))로 표지하였다. 일단 바이오티닐화되면, 상기 세포를 스트렙타비딘 자기 마이크로비드(밀테니이 바이오텍(Miltenyi Biotec))로 표지하였다. 상기 세포를 자석의 존재 하에서 컬럼에 통과시킴으로써 자기적으로 표지된 세포를 선택하였다. 상기 컬럼을 자석으로부터 제거하고 상기 세포가 상기 컬럼으로부터 세척되어 유동하게 함으로써 상기 컬럼으로부터 자기적으로 표지된 세포를 제거하였다. 이 과정은 마커 각각에 대해 양성을 나타내는 세포의 집단을 새로 단리된 세포에서의 원래의 백분율의 22배까지 농축시키는 데 있어서 성공적이었다. 또한, 자기 분류는 90%만큼 높은 순수하게 표지된 세포 집단을 제공할 수 있었다. 이 농축 과정은 형광 유세포분석과 함께 이용되었다. 형광 유세포분석을 수행하기 전에 세포 단리물을 자기적으로 분류함으로써 형광 표지된 세포를 분류하는 데 필요한 시간의 양을 크게 감소시켰고, 분류될 수 있는 형광 표지된 세포의 수를 크게 증가시켰다.
영장류 줄기세포 면역조직화학적 염색: 조직을 4% 파라포름알데하이드(PF; 일렉트론 마이크로스코피 사이언스(Electron Microscopy Science))에서 밤새 고정시켰고; 20% 수크로스(시그마) 내로 옮기고 OCT(VWR)에서 동결하였다. 8 ㎛ 두께의 냉동절편을 제조하고 -80℃에서 저장하였다. 분류된 세포를 4% PF에서 고정시키고, 약 25,000개 세포/10 ㎕로 100 mM 수크로스에 재현탁시키고, 10 ㎕의 분취액을 오르니틴/라이신으로 코팅된 유리 슬라이드 상으로 옮기고, 상기 슬라이드를 건조될 때까지 37℃ 고온 플레이트 상에 놓아두었다. 슬라이드를 분석할 때까지 -80℃에서 저장하였다.
면역조직화학적 염색을 위해, 0.1% 트리톤-X100을 사용하여 정소 절편 및 FACS 분류된 샘플 중의 세포를 투과가능한 상태로 만들고, 2% BSA 및 5% 양 혈청을 함유하는 용액, 또는 대안적으로 2% BSA, 5% 염소 혈청 및 0.1% 트리톤-X100을 함유하는 용액에서 차단하였다. 핵 가시화를 위해 DAPI(인비트로겐)를 사용하였다. 1x PBS + 2% BSA로 다회 세척한 후, 퍼마플루오르(Permafluor)(벡크만 코울터(Beckman Coulter))를 이용하여 세포를 보존하였다. 슬라이드북(SlideBook)(상표명) 영상화 소프트웨어가 장착된 올림푸스 BX-61 현미경을 이용하여 조직 절편 및 분류된 세포에서의 표면 마커의 분포를 평가하였다. 마우스 또는 영장류 조직에서의 영장류 정소 세포의 국소화를 위해, 50개의 상이한 정세관을 분석하였다. 각각의 상이한 마커 염색 절차를 위해, 3 또는 4개의 상이한 절편을 분석하고, FACS 세포 샘플을 위해 200개 이상의 상이한 세포를 3개 이상의 상이한 분취액에서 분석하였다.
영장류 생식세포 RNA 추출, RT-PCR 분석 및 QRT-PCR 분석: 제조자의 권고에 따라 알엔이지 미니 키트(퀴아젠)를 사용하여 전체 세포 RNA를 단리하였다. 그 다음, 콴티텍(Quantitect) RT 키트(퀴아젠)를 사용하여 상기 단리된 RNA를 cDNA로 전사시키고 퀴아퀵(QIAquick) PCR 정제 키트를 사용하여 정제하였다. 각각의 RT-PCR 반응을 위해, 20 ng의 cDNA 주형을 핫스타 Taq 플러스 및 상이한 각각의 프라이머와 함께 25 ㎕ 반응 부피로 사용하였다. 모든 표적 cDNA를 30주기 동안 증폭시켰다. 증폭 생성물을 2% 아가로스 겔 상에서의 크기로 확인하였다. QRT-PCR의 경우, 5 ng의 cDNA 주형을 콴티텍 SYBR 그린 PCR 마스터 혼합물(퀴아젠)과 함께 25 ㎕ 반응 부피로 사용하고, 바이오라드 아이사이클러를 이용하여 샘플을 증폭시켰다. 각각의 샘플을 3회 반복하여 분석하고 GAPDH 대조군으로 표준화하였다.
영장류 생식세포 텔로머라제 분석: SYBR 그린 실시간 정량 텔로머성 반복부 증폭 프로토콜(RQ-TRAP)을 이용하였다. 조직 또는 세포 펠렛을 PBS로 1회 세척하고, 알엔에이즈아웃(RNaseOut) 억제제(인비트로겐)를 함유하는 1x CHAPS 용해 완충제에 1000개 세포/㎕ 및 400 유닛/㎖의 알엔에이즈아웃 억제제의 최종 농도로 재현탁시키고 균질화하였다. 얼음 상에서 25분 동안 항온처리한 후, 세포 용해물을 4℃의 마이크로원심분리기에서 16,000 rpm으로 10분 동안 원심분리하였다. 상청액을 새로운 마이크로원심분리기 튜브로 옮기고, ND-1000 분광계(나노드롭(Nanodrop))를 이용하여 280 nm에서 흡광도를 측정함으로써 단백질 농도를 측정하였다. 텔로머라제 반응 부피는 500 ng 단백질 용해물, 콴티텍 SYBR 그린 PCR 혼합물, 1 ㎍ TS 프라이머, 0.5 ㎍ ACX 프라이머 및 핵산분해효소(nuclease) 무함유 증류수를 함유하는 용액에서 25 ㎕이었다. 주형 부재 대조군(용해 완충제), 양성 대조군(ESC 세포), 및 1000 ng, 200 ng, 40 ng, 8 ng 또는 1.6 ng의 단백질을 함유하는 인간 ESC 용해물의 분취액으로부터 작도된 표준 곡선과 함께 각각의 샘플을 3회 반복하여 시험하였다. 아이사이클러 아이큐5(iCycler iQ5)(바이오-라드)를 이용하여, 반응물을 25℃에서 20분 및 95℃에서 15분 동안 항온처리하고 하기 주기 조건 하에서 40회 PCR 주기로 증폭시켰다: 95℃에서 30초 및 60℃에서 90초. 역치 주기 값(Ct)을 반-로그 증폭 도면으로부터 측정하고(형광에서의 로그 증가 대 주기 수) 표준 곡선과 비교하였다. 역치에 대한 소프트웨어 디폴트 설정은 주기 1을 제외하고 처음 10주기에 걸쳐 각각의 웰의 형광 판독치의 표준 편차의 평균의 10배이었다. 상이한 영장류 정소 세포 샘플들에 대한 텔로머라제 활성을 상기 표준 곡선으로부터 판독하고/하거나 인간 ESC 용해물 표준물을 사용하여 판독한 값의 백분율로서 표시하였다.
MEM-X 영장류 배지 조성
성분 최종 농도
DMEM/F12 N/A
테스토스테론 50 ng/㎖
에스트라디올 50 ng/㎖
소혈청 알부민 5 ㎍/㎖
피루브산나트륨 30 ㎍/㎖
하이드로코르티손 0.05 mM
D/L 락트산 1 ㎕/㎖
글루타민 1X
MEM 비타민 2X
MEM NEAA 1X
인슐린-트랜스페린-셀레닌 1X
페니실린/스트렙토마이신 1X
표피 성장 인자 20 ng/㎖
염기성 섬유모세포 성장 인자 10 ng/㎖
인간 백혈병 억제 인자 10 ng/㎖
아교 유래된 신경영양 인자 40 ng/㎖
실시예 3
영장류 생식줄기세포의 배양 증폭
단리 후 생식줄기세포(실시예 2)를 MEF 플레이트로 옮기고 마우스 혈청 무함유 배지(MSFM), 래트 혈청 무함유 배지(RSFM) 또는 MEM-X(등록상표) 배지를 포함하는 상이한 혈청 무함유 배지에서 배양하였다. 세포의 형태학적 변화 및 웰 당 생식세포 콜로니의 수를 배양 과정 동안 카운팅하였다. 배지의 절반을 2일마다 교체하였다.
배양으로부터 10일 후, 평평한 콜로니가 모든 종류의 배지에서 나타났다(도 29의 A). MEM-X 중의 콜로니는 그들의 형태를 다른 2종의 배양 배지에서보다 더 잘 유지하였다. 비분류된 집단에서 발견된 콜로니의 수는 분류된 세포보다 더 적았다. 시험된 세포 표면 마커들 중에서 SSEA-4 및 삼중 염색된 세포가 콜로니를 형성하였다. 삼중 분류된 세포로부터의 SSEA-4+ 세포의 제거는 극소수의 콜로니를 야기하였으나, SSEA-4+ 세포로부터의 삼중 분류 표현형의 제거는 콜로니 형성 능력에 영향을 미치지 않았다. SSEA-4 및 삼중 분류 둘다에 대해 양성을 나타내는 세포는 배양물에서 가장 많은 수의 콜로니를 형성하였고, SSEA-4 및 삼중 분류로부터 제거된 세포는 어떠한 콜로니도 형성하지 않았다. 그 다음, 상기 콜로니를 SSEA-4(도 29의 B 및 C), GFR-α(도 29의 D) 및 α6-인테그린에 대해 염색하였다.
실시예 4
뮤린 암컷 생식줄기세포의 단리
미세해부 현미경 하에서 40 내지 60마리의 2 내지 5일령의 형질전환 OG2 출생 후 새끼로부터 마우스 난소를 해부하고 세포 단리를 위해 사용하였다. 먼저 난소를 4 mM EDTA로 보충된 냉각된 D-PBS를 함유하는 배양 접시에 수집하였다. 그 다음, 5 ㎖ 피펫을 이용하여 난소를 50 ㎖ 원추형 튜브로 옮겼다. 원심분리 및 세척 후, D-PBS 세척 용액을 제거하고 난소를 콜라겐분해효소(1 mg/㎖) 및 DNA 분해효소-I(20 유닛/㎖)에 재현탁시키고, 37℃ 수조 내에 넣었다. 분해되는 난소 조직을 10분 마다 피펫을 이용하여 물리적으로 파괴하고 항온처리(30분)의 말기에 5 ㎖의 FBS를 첨가하여 효소를 중화시켰다. 생성된 세포 현탁액을 40 ㎛ 여과기에 통과시켜 조직 데브리스(debris)를 제거하고, 단리된 세포를 400xg에서 10분 동안 원심분리하여 수집하였다. 상청액 효소-FBS 용액을 제거하고, 세포를 배양 배지에 재현탁시키고 사용할 때까지 얼음 상에서 보존하였다.
녹색 형광 강도를 확인하고(도 11a) c-Kit에 대해 3개의 채널(R2, R3 및 R4을 열은 후(도 11b) c-Kit 강도에 대해 R3을 분류하는(도 11c) 유세포분석을 이용하여GFP 양성 세포를 수집함으로써 난소 생식줄기세포를 실질적으로 정제하였다.
유세포분석을 이용하였을 때 GFP/Oct-4+ 세포는 신생아(도 11a) 및 성체(도 11b)에서 검출되었는데, 이것은 생식줄기세포가 출생 후 난소에 존재한다는 것을 암시한다. 마우스 난소에서의 생식줄기세포의 백분율은 연령에 따라 상당히 감소하였다. 신생아 마우스의 난소에서는 1 내지 2% GFP+ 세포가 발견되었지만, 성체 난소에서는 0.05%만이 존재하였다. Oct-4+ 세포들 중에서 60%는 c-Kit에 대해 음성을 나타내었거나 낮은 수준의 c-Kit를 발현하였고 40%는 높은 수준의 c-Kit 발현을 보였는데(도 11c), 이것은 생식줄기세포들 중에서 2개의 집단이 존재한다는 것을 암시한다. 면역조직화학적 분석은 GFP-Oct-4+ 세포가 난소 상피 전체에 존재한다는 것을 보여주었다(도 12a 내지 12c). RT-PCR 분석은 신생아 마우스 난소로부터 단리된 GFP+ 세포가 다분화능 마커 Oct-4 및 생식세포 마커 VASA 및 c-Kit 둘다를 발현하지만(이것은 생식줄기세포가 이 집단에 존재한다는 것을 확인시켜줌), GFP- 세포는 생식세포 마커의 발현만을 보인다는 것을 보여주었다(도 13).
예상과 대조적으로, 새로이 단리된 성체 또는 신생아 난소 세포는 매우 낮은 텔로머라제 활성을 보였다. 그러나, RT-PCR 분석은 ESC와 유사하게 배양 초기에서 GFP+ 세포가 Oct-4를 발현한다는 것을 확인시켜주었다(도 13). GFP+ 세포는 Oct-4를 발현하였지만(도 13, 레인 5), GFP- 세포는 Oct-4를 발현하지 않았다(도 13, 레인 6). GFP+ 세포는 GFP- 세포보다 더 높은 수준의 VASA를 발현하였다(도 13, 레인 5). GFP- 세포는 GFP+ 세포보다 더 높은 수준의 c-Kit를 발현하였다.
마커 c-Kit는 일부 이전 과학 보고에서 수컷 생식줄기세포와 관련되어 있었다. Oct-4+ 세포들 중에서 60%는 c-Kit에 대해 음성을 나타내었거나 낮은 수준의 c-Kit를 발현하였고 40%는 높은 수준의 c-Kit 발현을 보였다. 신생아 마우스 난소로부터 단리된 GFP+ 세포는 다분화능 마커 Oct-4 및 생식세포 마커 VASA 및 c-Kit 둘다를 발현하였다. 조합된 결과는 생식줄기세포가 OG2 마우스의 난소로부터 단리된 GFP+ 세포 집단에 존재한다는 것을 확인시켜준다.
MEF의 영양세포 층 상에서 배양된 GFP+ 세포는 둥글고 평평한 콜로니를 형성하였고, 이들 중 일부는 명확히 한정된 경계를 가졌지만(도 14a 내지 14c 및 14e), 나머지 콜로니들은 그러한 경계를 갖지 않았다(도 14f). 명확한 경계를 가진 콜로니를 대표하는 콜로니 및 명확한 경계를 갖지 않는 콜로니를 대표하는 콜로니를 선택하여(도 14b) 콜라겐분해효소를 삳용하여 MEF 상에서 계대배양하였다(도 14d). 계대배양 후, 세포는 보다 더 상피 유사한 모양을 가진 평평하고 단단하게 팩킹된 세포에 의해 둘러싸인 작고 둥근 세포의 단단한 타원형 중심 집단에 의해 인식될 수 있는 구별되는 콜로니로 조립되었다(도 14g 내지 14i). 이 콜로니 출현은 계대배양 4 이상까지 계속되었다(도 14j 내지 14k).
예상된 바와 같이, GFP+ 난소 세포의 콜로니는 Oct-4에 대해 양성으로 염색되었다(도 15a). 이들 콜로니의 세포는 다분화능 전사 인자 Nanog에 대해서도 양성으로 염색되었는데(도 15b), 이것은 상기 세포의 본질이 생식세포라는 것을 지지한다. 추가로, 이들 세포는 생식 특이적 마커 VASA(도 15c) 및 줄기세포 마커 알칼리성 인산분해효소(도 15d) 또한 발현하였다. 조합된 결과는 조직 배양물에서 암컷 생식줄기세포의 단리, 확인, 특징규명 및 계대배양을 확인시켜준다.
GFP+ 콜로니는 콜라겐분화효소를 사용하는 효소적 분해에 대한 내성을 나타내었고 새로운 콜로니를 발생시켰다. 그러나, 상기 콜로니는 트립신분해에 대한 내성을 나타내지 않았고 대다수의 콜로니가 트립신 처리 후 분화되었다. GFP- 세포는 생식세포 마커의 발현만을 보였고 줄기세포 마커의 발현을 보이지 않았다. 여러 계대배양(예를 들면, 계대배양 15) 후, 이들 분화된 콜로니는 그들의 형태를 유지하였지만, 대다수의 세포는 GFP를 더 이상 발현하지 않았는데, 이것은 Oct-4 프로모터의 하향조절 및 가능한 분화를 암시한다. 각각의 콜로니에서 소수의 세포만이(주로 콜로니의 중심에 있는 큰 세포) GFP 발현을 보였다. 시간의 경과에 따라, 이들 GFP+ 세포는 난소 여포와 형태학적으로 유사한 구조체에 존재하는 매우 큰(40 ㎛ 이하) 타원형 세포를 형성하는 듯하였다(도 16a 및 16b). 결과적으로, 타원형 GFP+ 세포, 즉 일차 난모세포의 외관을 띠는 세포가 상기 콜로니로부터 분리되었다(도 16c). 전체적으로, 상기 결과는 단리되고 실질적으로 정제된 난소 생식줄기세포가 시험관 내에서 분화하고 성숙하여 일차 난모세포를 발생시킨다는 인식을 지지한다.
이들 큰 난모세포 유사 세포의 존재 및 특징은 하기와 같이 도 16의 배양물로부터 상기 세포를 실질적으로 단리하고 정제함으로써 확인하였다: 표준 유세포분석 정립(sizing) 비드를 사용하여, 15 마이크로미터(㎛) 이하의 모든 이벤트를 보여주는 게이트(gate)(R1)를 발생시키고, MEF 세포는 R1에서 모두 축적된 균질한 집단이었고(도 17a), MEF 상에서 성장한 도 206의 생식세포 배양물에 상당한 수의 큰 세포(>15 ㎛)가 존재하였다(도 208b). 이들 세포들 중 일부는 직경이 약 60 내지 70 ㎛이었다.
재료 및 방법
난소 생식줄기세포의 배양: GFP+ 세포를 4-웰 플레이트의 웰 당 5000 내지 10000의 농도로 PM-1(상표명) 배지 중의 MEF 영양세포 상에서 배양하였다. 배양을 37℃에서 유지하였고, 배지의 절반을 2일마다 교체하였다. 2주마다 세포를 새로운 MEF 플레이트로 기계적으로 또는 효소적으로(콜라겐분해효소) 옮겼다.
난소 생식줄기세포의 특징규명: 새로 단리된 GFP-양성 세포를 텔로머라제 분석 및 유전자 발현 프로파일링을 위해 사용하였다. 난소 조직학적 분석을 위해, 난소를 4℃에서 1 M 수크로스 중의 4% 파라포름알데하이드(PFA)로 밤새 고정시키고 냉동미세절단 동결 배지에 넣었다. 5 ㎛ 절편을 제조하고 GFP+ 세포의 국소화를 형광 현미경을 이용하여 확인하였다. 난소에서 생식줄기세포의 국소화는 Oct-4 및 VASA 이중 표지에 의해 확인되었다. 면역세포화학(ICC)을 위해, 배양된 난소 생식줄기세포를 실온에서 2% PFA로 30분 동안 고정시키고 PBS로 세척하고 4℃에서 보존하였다. 배양된 난소 생식줄기세포를 특징규명하기 위해, VASA, Oct-4, Nanog 및 알칼리성 인산분해효소 염색을 이하에 더 기재된 바와 같이 명시야 ICC를 이용하여 수행하였다.
RT-PCR 및 QRT-PCR 분석: 제조자의 권고에 따라 알엔이지 미니 키트(퀴아젠)를 사용하여 전체 세포 RNA를 단리하였다. 그 다음, 콴티텍 RT 키트를 사용하여 상기 단리된 RNA를 cDNA로 전사시켰다. 퀴아퀵 PCR 정제 키트를 사용하여 전사된 cDNA를 정제하였다. 각각의 RT-PCR 반응을 위해, 20 ng의 cDNA 주형을 핫스타 Taq 플러스(퀴아젠) 및 적절한 프라이머와 함께 25 ㎕ 반응 부피로 사용하였다. 모든 표적들을 30주기 동안 증폭시켰다. 증폭 생성물을 2% 아가로스 겔 상에서의 크기로 확인하였다. QRT-PCR을 위해, 5 ng의 cDNA 주형을 콴티텍 SYBR 그린 PCR 마스터 혼합물과 함께 25 ㎕ 반응 부피로 사용하고, 반응 혼합물을 바이오라드 아이사이클러를 이용하여 증폭시켰다. 각각의 샘플을 3회 반복하여 분석하고 GAPDH 대조군으로 표준화하였다.
실시예 5
인간 남성 생식줄기세포주의 단리
비폐쇄성 무정자증을 앓는 환자로부터 정소 생검으로서 수집된 인간 정소 또는 정소절제술 후 수집된 정소 조직의 잔존물을 본 연구에 사용하였다. 모든 조직들은 환자의 공식적인 동의 하에서 공여되었다. 조직을 수집 후 24시간 이내에 4℃에서 PBS-항생제로 옮겼다. 인간 정소 조직의 가공 절차는 실시예 2에 개시된 영장류에 대한 가공 절차와 유사하다.
세포 단리 전, ICC를 위해 조직 샘플을 채취하고, RNA 및 DNA 추출을 위해 2개의 작은 정소 조각을 채취하였다. 세포 단리, 및 생존율 및 세포수의 측정 후, RNA 및 DNA 분석을 위해 샘플을 채취하였다. ICC, RNA 추출 및 DNA 추출에 대한 방법은 실시예 2에 개시된 영장류와 유사하다. 추가로, 영장류 생식줄기세포의 분리를 위해 이미 개발되어 있고 자기 세포 분류 및 유세포분석에 의해 사용되는 세포 표면 마커의 발현에 대해 세포를 표지하였다. 유세포분석을 위해 사용되는 항체 및 방법은 실시예 4에 개시된 영장류 생식줄기세포의 분리를 위해 사용된 항체 및 방법과 유사하다.
또한, 생식세포를 자기 마이크로비드로 태그표지하고 상기 세포를 자기 컬럼에 통과시킴으로써 상기 생식세포 집단을 농축하였다. 새로 단리된 정소 세포를 SSEA-4 또는 α6-인테그린 및 Thy-1에 대한 바이오티닐화된 항체들로 표지하였다. 일단 바이오티닐화되면, 상기 세포를 스트렙타비딘 자기 마이크로비드로 표지하였다. 상기 세포를 자석의 존재 하에서 컬럼에 통과시킴으로써 자기적으로 표지된 세포를 선택하였다.
상기 컬럼을 자석으로부터 제거하고 상기 세포가 상기 컬럼으로부터 세척되어 유동하게 함으로써 상기 컬럼으로부터 자기적으로 표지된 세포를 제거하였다. 이 과정은 마커 각각에 대해 양성을 나타내는 세포 집단을 새로 단리된 세포에서의 원래의 백분율의 22배까지 농축시키는 데 있어서 성공적이었다. 또한, 자기 분류는 90%만큼 높은 순수하게 표지된 세포 집단을 제공할 수 있었다. 이 농축 과정은 형광 유세포분석과 함께 이용되었다. 형광 유세포분석을 수행하기 전에 세포를 자기적으로 분류함으로써 형광 표지된 세포를 분류하는 데 필요한 시간의 양을 크게 감소시켰고, 분류될 수 있는 형광 표지된 세포의 수를 크게 증가시켰다.
그 다음, 분류된 세포를 RT-PCR 및 DNA 분석을 위해 사용하였다. 또한, 면역결핍 마우스를 수용자로서 사용하는 정조세포 이식 분석을 몇몇 샘플 세포에 대해 수행하였다. 정조줄기세포 이식을 위한 기법은 실시예 1 및 2에 개시된 마우스 및 영장류와 유사하다.
정소 생검 및 잔존물 정소 조직 둘다로부터 제조된 동결된 절편에 대한 면역조직화학적 염색은 세관 횡단면의 기저막에 많은 α6-인테그린+ 세포가 존재한다는 것을 보여주었다. SSEA-4+ 세포 및 GFR-α1 세포도 정세관의 기저막에서 발견되었다.
하기 ICC가 수행되었다: 전체 인간 정소 조직(THT)을 SSEA-4 및 VASA에 대해 염색하였고(도 30), THT를 GFR-α1 및 VASA에 대해 염색하였고(도 31), THT를 VASA 및 Nanog에 대해 염색하였고(도 32), 인간 bHT(정소 생검 조직)을 SSEA-4 및 α6-인테그린에 대해 염색하였다(도 33). 인간 정소 절편으로 구성된 음성 대조군은 이차 항체로만 염색되었다(도 34). THT SSEA-4+ 자기 비드 분류된 세포를 부설판으로 처리된 수용자 마우스 정소 내로 이식하고, 1개월 후 절편화하고 하기 마커들에 대해 염색하였다: SSEA-4 및 인간 핵 단백질(HNP, 도 35); 6-인테그린 및 HNP(도 36); SSEA-4 및 α6-인테그린(도 37). 마우스 정소 절편 내의 THT 이식된 세포로만 구성된 음성 대조군은 이차 항체로만 염색되었다(도 38). 모든 염색이 일반적인 핵 염료를 함유한다.
유세포분석은 면역조직화학적 관찰결과를 확인시켜주었고,α α6-인테그린에 대한 양성 집단은 인간 정소로부터 수집된 샘플에서 발견되었다. 추가로, 구별되는 Thy-1+ 세포 집단이 발견되었다. Thy-1과 α6-인테그린의 동시국소화는 인간 정소 내에 Thy-1+ 세포의 3개의 하위집단이 존재한다는 것을 보여주었다: 1) Thy-1 중간 및 α6-인테그린 낮음, 2) Thy-1 높음 및 α6-인테그린 중간, 및 3) Thy-1 높음 및 α6-인테그린 음성. 대다수의 α6-인테그린+ 세포가 Thy-1-를 나타내었다. 인간 정소에서 발견된 명확한 SSEA-4+(10 내지 12%) 및 GFR-α+(1 내지 5%) 세포 집단도 존재하였다. 자기 분류는 SSEA-4+ 세포의 백분율을 44%까지 상당히 증가시켰는데, 이것은 이 마커에 대한 4배 증가를 암시한다.
정량 RT-PCR 분석은 시험된 샘플들 중에서 SSEA-4+ 세포 및 GFR-α+ 세포가 C-RET, PLZF 및 TERT를 포함하는 정조줄기세포 마커, 및 VASA 및 DAZL을 포함하는 생식세포 마커를 가장 높은 수준으로 발현한다는 것을 보여주었다. 텔로머라제 활성은 정조줄기세포를 표시한다. 정조줄기세포 이식은 SSEA-4+ 세포가 수용자 마우스의 정소에서 콜로니화되고 재증식한다는 것을 보여주었는데, 이것은 이들 세포가 기능성 정조줄기세포라는 것을 암시한다.
공여자 마우스로부터의 수컷 생식줄기세포(GSC)의 이식을 통해 불임 마우스를 가임 마우스로 만들 수 있다는 것, 및 이들 마우스가 나중에 자손을 생산할 수 있다는 것이 밝혀졌다. 그러나, 이 방법으로부터 유도된 마우스의 성질은 이전에 조사된 적이 없다. 본 연구의 목적은 GSC 이식으로부터 유도되고 모 품종의 공지된 성장 패턴과 비교된 마우스의 성질을 확인하는 것이다. 도 54는 수컷 GSC 이식으로부터 유도된 마우스의 교배를 통해 생산된 수컷(도 54a) 및 암컷(도 54b) F1 마우스의 평균 성장을 보여준다. 이들 성장 속도는 상업적 공급원에 의해 제공된 모 마우스의 성장 속도(데이터는 나타내지 않음)와 유사하다.
실시예 6
인간 정조줄기세포의 표현형적 특징
SSEA-4에 대한 자기 분류를 이용하여 인간 정소 세포에서 정조줄기세포(SSC)를 농축하고, 농축된 집단을 수용자 마우스의 정소 내로 미세주입하였다. 이식 후 1개월에서, 정소를 수집하고 냉동절편을 제조하였다. 마우스 정소 내의 인간 세포의 본질을 알렉사-488에 접합된 인간 핵 단백질(HNP) 항체를 사용하여 확인하였다. HNP와 생식세포, 체세포, 줄기세포 및 다분화능 마커들(표 3)의 동시국소화를 이용하여 마우스 정소 내의 인간 SSC의 표현형적 특징을 평가하였다.
마우스 정소에서의 HNP 염색에 의해 검출된 인간 세포의 광범위한 콜로니화는 SSC의 고도로 농축된 집단이 SSEA-4 자기 분류된 세포에 존재한다는 것을 암시한다. 마우스 정소에서 콜로니화된 모든 인간 세포들이 생식세포 마커 VASA에 대해 양성으로 염색되었고 정소 세르톨리 및 레이디히 세포에 대한 마커인 LHR에 대해 음성으로 염색되었다. 이것은 모든 콜로니화된 세포가 생식세포라는 것을 암시한다. 본 연구에서 사용된 마커들 중에서, 인간 세포의 15%만이 SSEA-4를 발현하였고, 인간 세포의 31%가 α6-인테그린을 발현하였고, 인간 세포의 45%가 그들의 표면 상에서 GPR125를 발현하였다. 마우스 정소에서 콜로니화된 거의 모든 인간 세포들이 c-Kit를 발현하였는데, 이것은 이 마커가 SSC 자가재생을 위해 필요하다는 것을 암시한다. 다분화능 마커 정소들 중에서 Oct-4+ 또는 TRA-160+ 세포는 전혀 발견되지 않았지만, 인간 세포의 29%가 Nanog 발현을 보였다. 이것은 다분화능 특징을 가진 인간 SSC들 중에서 한 세포 집단이 존재한다는 것을 암시한다. 거의 모든 SSEA-4 세포들이 α6-인테그린에 대해서도 양성을 나타내었다. 또한, 모든 SSEA-4+ 세포가 c-Kit에 대해 양성을 나타내었는데, 이것은 SSC의 c-Kit+ 집단만이 수용자 정소에서 콜로니화 능력을 가진다는 것을 암시한다.
마커 양성 세포의 백분율
VASA 100
LH-R 0
SSEA-4 15
α6-인테그린 31
GPR-125 45
c-Kit 96
Nanog 29
Oct-4 0
TRA1-60 0
본 연구는 인간 SSC가 VASA+, c-Kit+, LHR-, TRA1-60- 및 Oct4-의 표현형적 특징을 갖고, 인간 SSC 하위집단이 SSEA4+, α6-인테그린, GPR125+ 및 Nanog+를 나타낸다는 것을 명확히 입증한다. 이것은 상이한 SSC 집단들이 인간 정소에 존재한다는 것을 암시한다.
황체형성 호르몬 수용체(LHR)는 VASA, SSEA4, GFR-α 및 α6-인테그린 동시국소화 연구에 의해 표시되는 바와 같이 원숭이, 인간 또는 마우스 생식세포와 동시국소화되지 않는다. 이들 양성 세포의 위치 및 형태에 의해 표시되는 바와 같이 LHR은 세르톨리 및 레이디히 세포 상에서 발현된다. 콘넥신(Connexin)-43은 기저막에 위치하는 생식세포, 세르톨리 세포 및 가능하게는 레이디히 세포를 염색하는 듯하다.
실시예 7
수컷 생식 조직의 냉동보존
정조줄기세포를 함유하는 인간 남성 정소 조직을 실시예 6에서와 같이 수득한다. 단리된 세포 또는 정소 조직을 냉동보존한다. 추가로, 숙주외 성숙에서의 사용을 위해 정세관의 작은 절편을 보존한다.
상기 세포 또는 조직을, 디메틸 설폭사이드(DMSO), 에틸렌 글리콜, 글리세롤 및 프로판디올을 포함하나 이들로 한정되지 않는 하나 이상의 냉동보호제; DMEM, MEM 및 상기 개시된 특허 배지를 포함하나 이들로 한정되지 않는 하나 이상의 배양 배지; 수크로스, 덱스트란, 혈청 대체물 및 HEPES 완충제를 포함하나 이들로 한정되지 않는 하나 이상의 추가 물질을 포함하는 용액에서 냉동보존한다. 한 예에서, 상기 용액은 크리오스토어(상표명) CS-10 배지(바이오라이프 솔루션스 인코포레이티드(BioLife Solutions Inc.))를 포함한다. 상기 세포 또는 조직을 보편적인 방법 또는 조절된 속도로 동결한다.
해동을 위해, 냉동보존된 생식줄기세포를 DMSO 농도가 10%인 1.5 ㎖의 DMEM에 현탁시킨다. 그 다음, 세포 현탁액을 배지로 50 ㎖로 희석하여 DMSO 농도가 0.3%가 되게 한다. 그 다음, 상기 세포를 원심분리하고, 배지를 흡입하고, 상기 세포를 배지에 재현탁시켜 잔류 DMSO 농도가 0.012%를 초과하지 않게 한다.
정소가 세포 현탁액 또는 조직 형태로 냉동보존되어야 하는지를 확인하기 위해, 2 내지 5일령의 성숙기전 마우스 정소를 수득하고, 일부 정소를 조직으로서 냉동보존하고, 일부 정소를 냉동보존 전에 단일 세포 현탁액으로 분리하였다. 두 경우에서 조절된 속도 동결 프로토콜을 이용하였다. 해동 후, 회수된 총 세포수, 생존율 및 세포 표면 마커를 분석하여 각각의 현탁액 중의 생식세포, 체세포 및 생식줄기세포의 비율을 측정하였다. 결과는 세포의 냉동보존이 조직의 냉동보존보다 더 우수하다는 것을 보여준다. 냉동보존된 마우스 정소 세포는 약 95% 생존율을 보인 반면, 동결된 조직으로부터 단리된 세포는 약 80% 생존율을 보인다(도 48).
또한, 돼지 정소 세포를 사용하여 냉동보존 배지의 부피 당 사용될 세포의 적절한 수를 측정하였다. 세포를 성숙기전 돼지 정소(약 3개월령)로부터 수득하고 2.5, 5, 10 및 20 x 106개 세포/㎖의 농도로 동결 배지에 재현탁시키고 조절된 속도 동결 프로토콜 하에서 동결하였다. 해동 후, 회수된 총 세포수, 생존율 및 세포 표면 마커를 분석하여 각각의 현탁액 중의 생식세포, 체세포 및 생식줄기세포의 비율을 측정하였다. 세포 농도는 세포의 생존율 또는 세포 조성에 영향을 미치지 않는다(도 49). 세포는 백(bag) 또는 냉동바이알 내에서 동결될 수 있다.
사춘기전 인간 정소 물질을 입수할 수 없기 때문에, 성인의 정소도 연구하였다. 성전환 수술을 받은 젊은 성인 남성의 정소 샘플(2개의 샘플)을 보관을 위해 사용하였다. 불임 클리닉으로부터 공여받은 정소 생검(3개의 샘플)도 조직 및 세포 보관을 위해 사용하였다. 정소 세포는 조절된 속도 동결을 이용한 경우 해동 후 높은 생존율을 나타내었고, 생존율은 세포 밀도 또는 상이한 수송 배지에 의해 영향을 받지 않았으나, 생존율은 수송으로부터 72시간 후 감소되었다(도 50a 및 50b).
추가로, 정소 세포가 수동 동결을 이용하거나 조절된 환경 하에서의 느린 동결을 이용하는 냉동보존 후 더 우수하게 유지되는지를 확인하였다. 2 내지 5일령의 성숙기전 마우스 및 3개월령의 성숙기전 돼지 정소를 본 실험을 위해 사용하였고, 몇몇 세포들을 수동으로 동결하고, 몇몇 세포들을 조절된 속도 동결 프로토콜을 이용하여 동결하였다. 해동 후, 회수된 총 세포수, 생존율 및 세포 표면 마커를 분석하여 각각의 현탁액 중의 생식세포, 체세포 및 생식줄기세포의 비율을 측정하였다. 조절된 동결 프로토콜 하에서의 뮤린 세포의 냉동보존은 수동 동결과 유사한 특징을 가진 세포를 생성한다(표 4).
샘플 # 동결 방식 GFP +/7 AAD - 생존 GFP / CD49f + 생존 GFP / CD117 - 생존 GFP +/ CD117 -/ CD49f + GFP +/ CD117 -/CD49f+(집단)
1 M na 6.10 33.36 19.80 0.068
2 M na 6.16 49.90 14.29 0.072
3 M 62.92 7.21 63.12 22.86 0.140
4 M na 14.16 68.30 21.56 0.150
5 CRF 14.00 6.93 16.72 34.69 0.054
6 CRF 13.85 6.11 15.83 29.31 0.045
7 CRF 14.20 6.88 16.80 32.22 0.049
8 CRF 44.50 8.24 50.45 18.80 0.083
9 CRF 14.40 5.22 17.17 29.73 0.044
10 CRF 15.31 5.51 17.56 30.58 0.049
11 CRF 12.61 5.68 18.22 28.72 0.029
12 CRF 16.00 7.30 14.90 26.80 0.041
13 CRF 12.2 7.10 15.20 26.00 0.041
na = 입수불가능함; M = 수동 동결; CRF = 조절된 속도 동결
동결 프로토콜 새로운 세포 생존율 동결되고 해동된 세포 생존율(%) 회수된 생존 세포의 수
수동 94.4 85.7 1892000
CRF 95.6 91.2 1938000
실시예 8
암컷 생식 조직의 냉동보존
수컷 생식자형성(gametogenesis)과 암컷 생식자형성 사이의 한 가지 주요한 차이점은 암컷 난자형성이 성숙기전 단계에서 수컷보다 더 진행된 단계에 있다는 점이다. 정소에서 관찰되는 유일한 생식세포는 정조줄기세포 및 이의 전구체이지만, 난소에서 원시 여포 내의 난모세포는 기능성 생식 유닛으로서 간주된다. 현재, 성숙기전 연령에서 암컷 생식능력의 보존을 위한 2가지 방법이 이용가능하다: 1) 난소 절편의 냉동보존; 및 2) 원시 여포의 냉동보존. 느린 동결 프로토콜 또는 유리화로 인간 난소를 냉동보존하는 것이 성공적으로 수행되었다. 이들 결과에 기초할 때, 난소 재생에 필요한 여포 성분들을 보존하기 위해서는 난소 표면 상피의 매우 얇은 층을 제조하는 것이 요구된다. 동결/해동 및 이식 후 난소는 마우스에서 일관된 생식능력 회복 및 건강한 자손의 출생을 야기할 수 있다.
난소를 냉동보존하기 위해, 성숙기전 연령 암컷의 난소의 얇은 슬라이드를 제조하여 작은 조각으로 절단할 것이다. DMEM 중의 DMSO, 에틸렌 글리콜(EG) 및 혈청 대체물(SS)의 조합물을 동결 배지로서 사용할 것이다. 하기 프로토콜에 따라 유리체화를 수행할 것이다: (1) 20% SS 중의 7.5% EG 및 7.5% DMSO에서 25분 동안 평형화시키고, (2) 조직이 잠길 때까지 0.5 M 수크로스 중의 20% EG 및 20% DMSO에서 15분 동안 평형화시키고, (3) 조직을 금속 스트립 상에 놓고 액체 질소 내에 직접 담근다. 상기 조직을 해동하기 위해, 상기 금속 스트립을 37℃에서 1 M 수크로스에 1분 이상 동안 직접 담근 후 실온에서 0.5 M 수크로스로 5분 동안 옮긴다. 그 다음, 해동된 조직을 냉동보호제가 없는 기초 배지로 2회 세척한다.
난소가 인간에 보다 가까운 동물 모델에서 조직 또는 세포 현탁액의 냉동보존 후 더 잘 유지되는지도 확인한다. 성숙기전 원숭이 및 성체 원숭이의 난소 조직을 본 연구에서 사용한다. 난소가 도착되면 상기 난소를 해부하고 피질을 수질로부터 분리한다. 그 다음, 난소 피질을 작은 조각으로 절단한다(2 x 2 mm). 조각의 절반을 조직 동결을 위해 사용하고, 여포 및 세포의 단리를 위해 나머지 절반에 대한 조직 절단 및 효소적 분해를 수행한다. 상이한 냉동보호제 및 동결 프로토콜을 이용한다. 상이한 조건 하에서 동결된 세포 및 여포의 생존율 및 생존을 해동 후 유세포분석 및 아폽토시스로 분석한다.
실시예 9
생식세포 및 조직의 수송
본 연구는 어떤 수송 배지가 정소를 운반하는 데에 보다 적합한지를 확인하였다. 정소 세포의 냉동보존을 위해 적절한 세포 밀도도 조사하였다. 사춘기전 소년의 인간 정소는 입수될 수 없기 때문에, 돼지 정소를 사용하였다. 각각의 정소를 10개의 조각으로 절단하고, 동일한 수의 조각을 2개의 튜브 내로 나누었다: 1) MEM을 함유하는 튜브, 및 2) PBS를 함유하는 튜브. 조직이 도착하면, 상기 조직을 단일 세포로 분리하고 세포를 2.5 내지 20 x 106개 세포/㎖의 상이한 밀도로 동결한다. 결과는 MEM 및 PBS 둘다 운반 과정 동안 인간 정소를 지지할 수 있고 세포의 생존율 또한 세포 밀도에 의해 영향을 받지 않는다는 것을 보여준다(도 51a 및 51b).
추가로, 상기 조직이 세포 가공 전에 검증된 운반 박스 내에서 유지될 수 있는 최대 시간을 측정하였다. 성숙기전 래트 정소를 본 실험을 위해 사용하였고, 조직을 몸체로부터의 제거 후 97시간 이하 동안 검증된 운반 박스 내에서 유지하였다. 결과는 생존율이 48시간 이하 동안 유지된다는 것을 명확히 입증하였다(도 52). 세포의 생존율은 72시간 후의 운반 후 상당히 감소되었으나, 세포의 85 내지 90%가 4일의 운반 후 여전히 생존하였다.
실시예 10
마우스 효능 분석 - 생식능력 평가
수컷 생식줄기세포를 공여자 동물로부터 불임 수용자의 정소로 이식하는 것은 전술되었다. 공여자 생식세포는 수용자 수컷이 생식세포 공여자의 유전물질을 분배할 수 있도록 수용자의 정소에서 콜로니화되어 공여자로부터 유래된 정자를 생성한다. 생식세포 이식은 수컷 생식줄기세포에 대한 기능성 재구성 분석을 대표하고 그 자체로서 정소 내의 줄기세포의 생물학을 연구하고 불임의 표현형을 밝히는 본 발명자들의 능력을 크게 증가시켰다. 설치류에서 처음 개발된 상기 기법이 현재 가축 포유동물, 닭 및 어류를 포함하는 다수의 동물 종에서 사용되고 있다. 동물에서 이 기술에 대한 주요 용도가 존재한다: 첫재, 수컷 생식줄기세포 생물학 및 수컷 생식능력의 기본적인 양태의 연구; 및 둘째, 종 내에서 또는 종 사이에서 수컷 생식세포 이식에 의한 유전적으로 귀중한 개체의 생식력 보존. 따라서, 수컷 생식세포의 이식은 동물에서 수컷 생식능력의 연구, 보존 및 조작을 위한 특별히 귀중한 방법이다.
GFP 생식세포 이식 분석을 검증하기 위해, 부설판으로 처리된 마우스 내로의 이식을 위한 GFP 생식세포의 최적 이식 수를 측정하였다. 이식된 GFP 생식세포 누드 수컷 마우스를 누드 암컷 마우스와 교배시켜 GFP 생식세포의 최적 이식 세포수를 측정한다. 이 교배로부터 발생된 GFP+ 자손은 이식된 GFP 생식세포가 생식능력을 회복시키고 생존 GFP 자손을 생산하는 경우 확인될 것이다. 그 다음, 하기 기재된 파라미터를 이식된 전체 세포 및/또는 다른 파라미터(마커 발현, 정소 중량 등)와 비교함으로써 GFP 자손을 이용하여 GFP 생식세포 이식 분석을 검증한다. GFP 새끼가 출생된 후, 이식된 GFP 생식세포 모체로부터 발생된 GFP 자손을 이용하여 생식능력, 및 누드 마우스와의 교배에 의한 다음 자손으로의 GFP 생식세포의 생식 전달을 검증한다.
각각의 개별 GFP+ 이식된 수컷 마우스를 4마리의 누드 암컷 마우스와 교배시킨다. 2마리의 암컷을 매일 밤 각각의 수컷과 교배시킨다. 4마리의 암컷이 그들의 발정 주기에 따라 매일 밤 순환된다. 수컷을 3주 동안 교배시키고 1주간 휴식시키고 암컷이 질전(vaginal plug)을 형성하지 못한 경우 또 다른 3주의 교배를 시작할 것이다. 이들 절차는 휴식 기간이 수컷으로 하여금 계속된 교배로부터 회복될 수 있게 하면서 암컷에게 임신할 최적의 기회를 갖게 할 것이다. 매일 아침, 성공적인 교배의 양성 표시자인 질전에 대해 마우스를 조사한다. 이 교배 절차는 이식 후 5 내지 7개월 동안 계속된다. 임신한 암컷이 없는 경우, 추가 2개월 동안 교배를 계속할 것이다.
교배 기간 후, 교배를 중단시키고 GFP 이식된 마우스의 정소를 유동 분석, GFP에 대한 정자 분석, 및 정소에서 발현된 GFP+ 및 SSC+ 마커의 수를 측정하기 위한 조직학적 분석으로 분석한다. 또한, 형광 및 PCR을 이용하여 F1 자손을 GFP에 대해 분석한다. 누드 마우스가 털을 갖지 않기 때문에, 털을 가진 임의의 새끼는 GFP 양성 정자로부터 발생되어야 한다.
생식능력, 및 F1 자손으로부터의 GFP 또는 외피 색채의 생식 전달을 평가하기 위해, 상기 자손들을 2개월령까지 성숙시킨 후 임신을 보장하기 위해 2마리의 누드 마우스(수컷 또는 암컷)와 2개월 동안 교배시킨다. F1 마우스가 F2 자손을 생산한 후, 형광 및 PCR을 이용하여 F2 GFP+ 및/또는 털 색채+ 마우스를 GFP에 대해 검색할 것이다. 이것은 GFP+ 세포의 세대간 생식 전달을 입증할 것이다. 그 다음, GFP+를 나타내는 것으로 입증된 F2 자손을 희생시키고, GFP+ 정자를 사용하여 완전한 정자형성을 입증하기 위한 조직학적 분석을 위해 생식 기관을 수집하였다.
성숙기전 마우스로부터 단리된 새로운 정소 세포는 부설판으로 처리된 마우스에서 생식능력을 회복시킬 수 있고, 상기 마우스의 87%가 천연 교배 또는 보조 생식 기법의 이용에 의해 그들의 생식능력을 재획득할 수 있다. 냉동보존된 정소 세포가 생식능력을 회복시킬 수 있는지를 확인하기 위해, 5 내지 8주령의 수컷 누드 마우스를 부설판으로 처리하였고, 상기 동물들은 1개월 후 불임이 되었다. 2 내지 5일령의 성숙기전 GFP+ 새끼의 세포를 동결하고 이식을 위한 공여자 세포로서 사용하였다. 마우스는 4종의 처리 방법들 중 하나를 제공받았다: 9마리의 마우스는 수동으로 동결된 세포(5 x 105)를 제공받았고; 9마리의 마우스는 조절된 속도 동결 방법에 의해 동결된 세포(5 x 105)를 제공받았고; 9마리의 마우스는 조절된 동결 프로토콜에 의해 동결된 세포(1.25 x 105)를 제공받았고; 9마리의 마우스는 조절된 속도 동결 프로토콜에 의해 동결된 보다 적은 수의 세포(5 x 104)를 제공받았다. 이식 후 3개월에서, 동물들을 각각 2마리의 암컷과 교배시키고, 질전 조사 및 임신 횟수를 이용하여 교배의 효율을 측정하고, GFP 새끼를 기록하였다. 생식능력을 재획득하였으나 누드 새끼를 생산한 동물들 중 한 마리를 희생시키고 유세포분석 및 형광 현미경을 이용하여 GFP 정자의 존재를 확인하였다(도 53). 이 유세포분석은 좌측 정소에 작은 GFP+ 정자 집단이 존재한다는 것을 보여주었으나, 우측 정소에서는 GFP+ 정자가 전혀 발견되지 않았다. GFP+ 세관은 마우스의 우측 정소 및 좌측 정소 둘다에서 발견되었는데, 이것은 이식된 세포가 수용자 정소에서 생존하여 콜로니화되었다는 것을 입증한다. 유동 데이터에 기초할 때, 0.5%의 정자만이 GFP 양성을 나타내었다.
실시예 11
정소 형태와 생식능력의 상관관계
효능 분석에서 사용된 일군의 마우스를 5개월 동간 계속 교배시켰고, 이들 중 일부는 가임 상태인 것으로 입증되었고, 일부는 어떠한 임신도 유도하지 못하였으므로 불임으로서 기록되었다(자연 교배를 이용할 때; 이들 마우스는 적은 정자 수를 가졌을 수 있음). 이들 동물을 희생시키고, 정소를 수술적으로 제거하고 정자를 수집하여 동결하였다. 그 후, 동결된 정자는 세포질내 정자 주입(ICSI)에 사용될 GFP+ 정자를 유세포분석으로 분리하는 데에 사용되었다. 먼저, 정소의 중량을 측정한 후, 정소를 GFP 및 CFP 검출에 적합한 형광 광원이 장착된 해부 현미경 하에서 분석하였다. 육안 조사 후, 정소를 4% PFA로 고정시키고 조직학적 조사를 위해 동결된 절편을 제조하였다.
이식된 동물의 정소는 비이식된 대조군보다 상당히 더 무거웠다(도 39). 미세해부 현미경 하에서의 정소의 육안 조사는 GFP 공여 세포를 이식받은 모든 동물들이 GFP 세관에 의해 표시되는 바와 같이 GFP+ 정자형성 세포를 발달시켰다는 것을 보여주었다. GFP로 염색된 영역의 강도, 길이 및 분포에 기초하여 정소를 1 내지 5로 점수 매겼는데, 이때 1은 최소 통합 점수이고 5는 최대 통합 점수이다. 흥미롭게도, 가임 마우스들(n=2)은 최대 통합 점수(5)를 나타내었지만, 평균 점수가 2.75인 불임 동물들(n=4) 사이에는 큰 편차가 있었다(표 6). 육안 조사 후 가임 정소 및 불임 정소의 대표적인 영상이 도 40 및 55에 도시되어 있다. 이들 정소의 조직학적 조사는 불임 마우스와 비교할 때 가임 동물에서 정자를 가진 세관의 백분율이 상당히 더 높다는 것을 입증하였다. 예상된 바와 같이, 불임 동물은 상당히 더 높은 백분율의 빈 세관 및 부분적으로 채워진 세관을 보였다(도 41). 예상외로, GFP+ 세포를 가진 세관의 백분율은 가임 마우스와 비교할 때 불임 마우스에서 더 높았다(도 42).
육안 조사 후 GFP 점수
샘플 GFP Y/N GFP 점수 (1-5)
5N RT Y 5
5N LT Y 5
6N RT Y 1
6N LT Y 5
6R RT Y 2
6R LT Y 2
9L RT 가임 Y 5
9L LT 가임 Y 5
14N RT 가임 Y 5
14N LT 가임 Y 5
22N LT Y 5
23N RT Y 1
23N LT Y 1
22LL RT 가임 n n/a
22LL LT 가임 n n/a
8RR RT n n/a
8RR LT n n/a
상기 결과는 이식 후 정소 중량이 상당히 증가하였다는 것을 명확히 입증한다. 조직학적 조사 및 육안 조사 둘다 모든 이식받은 동물에서 GFP+ 세포의 광범위한 재증식을 보여주었다. 육안 조사에 기초한 GFP 점수는 생식능력과 양의 상관관계를 보였으나, GFP+ 세관의 백분율은 역의 상관관계를 보였다. 완전한 정자형성을 가진 세관의 수와 생식능력 사이에 양의 상관관계가 존재하고, 빈 세관의 수와 생식능력 사이에 음의 상관관계가 존재한다.
상기 결과는 정소 중량, GFP 점수 및 정소 조직학적 조사가 생식능력의 신뢰할만한 표시자이고 이식의 예상된 성공을 확인하기 위해 장래 이용될 수 있다는 것을 입증한다.
실시예 12
냉동보존된 정소 조직을 사용한 생식능력의 회복
부설판 처리에 의해 불임 상태가 된 수컷 마우스에서, 77.78%의 마우스가 정소 세포 이식 수술에 의해 그들의 생식능력을 회복시킬 수 있었다. 각각의 정소 내로 이식된 약 101,563 내지 1,000,000개 범위의 세포가 생식능력을 회복시킨다. 또한, 생식능력을 회복시킬 수 있는 GFR-α+ 주입된 세포의 범위는 41 내지 6,675이고, 생식능력을 회복시킬 수 있는 c-Kit-/α6-인테그린+ 주입된 세포의 범위는 22,648 내지 166,500이다. SSEA-1+ 세포는 성숙기전 마우스에 존재하는 것 같지 않으므로 이식 후 생식능력과 상관관계를 갖지 않았지만, 인간의 경우 동일한 마커(SSEA-4)가 생식능력 회복을 위해 중요할 수 있다. 또한, Thy-1 및 삼중 염색된(Thy-1+, c-Kit- 및 α6-인테그린+) 세포는 마우스에서 생식능력 회복과 상관관계를 갖지 않았지만 인간에서는 중요할 수 있다.
실시예 13
냉동보존된 마우스 난소 조직을 사용한 생식능력의 회복
본 프로젝트의 목적은 난소 조직이 조직 또는 세포 현탁액 형태로 보다 성공적으로 이식되는지를 확인하는 것이다. 마우스의 난소를 절제하였고, 일부 마우스는 새로운 난소의 이식물을 제공받았고, 일부 마우스는 동결/해동된 난소의 이식물을 제공받았고, 일부 마우스는 새로운 난소 세포 및 여포를 함유하는 응괴의 이식물을 제공받았고, 일부 마우스는 동결/해동된 난소 세포 및 여포를 함유하는 응괴의 이식물을 제공받았고, 일부 마우스는 정상 번식을 위한 대조군으로서 온전한 상태로 남아있었다. 혈관 내피 성장 인자(VEGF)를 상기 응괴에 첨가하여 이식된 응괴의 혈관형성 및 혈관신생을 촉진하였다.
실시예 14
초박 내시경 미세주입 기법을 이용한 인간 정소 내로의 정조줄기세포의 이식
유리 모세관 및 미세해부 현미경을 이용하는 정조줄기세포 이식 기법은 설치류에서 십년 이상 전에 개발되었다. 마우스에서, 정소의 해부학적 구조 및 크기는 정소날세관을 통한 정소망 내로의 용이한 접근을 제공하여, 충분한 수의 SSC가 정소날세관(efferent ductus) 내로의 단일 주입에 의해 정세관의 내강 내로 빠르고 신뢰가능하게 이식될 수 있게 한다. 설치류에서 정소망은 정소의 외부로부터 가시화될 수 있고 정소 동맥 및 정맥으로부터 충분히 먼 거리에 위치한다.
그러나, 큰 포유동물에서 정소의 해부학적 구조 및 크기는 상이하다. 첫째, 정소망이 정소 혈액 공급에 가까이 인접하여 정소 내에 위치한다. 둘째, 정소망을 정소상체(epidydimis)에 연결하는 다수의 정소날세관이 존재한다. 마지막으로, 정소의 크기는 정소를 채우기 위해 보다 많은 부피의 세포 현탁액을 필요로 한다(㎕ 부피보다 ㎖ 부피). 소 및 원숭이에서, 큰 바늘을 정소 내강 내로 주입하여 SSC를 정소 내로 이식하기 위한 초음파 유도된 방법이 개발되었다. 그러나, 이들 프로토콜은 상기 두 방법에서 몇몇 경우 주입이 정소망에 대한 손상 및 출혈을 발생시키기 때문에 비효율적이고 침습적이다.
외부로부터 정소상체를 포함하는 인간 정소 절편까지의 접근을 허용하고 개별 정소날세관 내로 이동시키는 능력을 가짐으로써 동맥 및 정맥을 손상시키지 않으면서 정소망으로의 접근을 허용하는, 인간 정소를 위한 미세주입 장치도 본원에 개시되어 있다. 이 장치는 2개의 부품으로 구성된다: 광원, 및 작동자가 카테터를 작동할 수 있게 하는 카메라를 갖는 내시경 모세관 카테터; 및 정소날세관을 통과하고 세포 현탁액을 정소망 내로 전달하는 보다 좁은 내부 카테터. 상기 카테터를 작은 절개를 통해 정소상체 내로 삽입하고 정소날세관으로 이동시킨다. 세포 주입 전, 초음파 조영 용액(레보비스트(Levovist))을 주입하고, 상기 용액이 정소망을 통과하여 정세관 내로 들어가는 것을 보장하기 위해 상기 용액의 유동을 초음파 장치로 모니터링한다.
이 장치의 장점은 비침습성, 및 인간 정소 내강으로의 신뢰가능한 접근이다. 이 장치는 남성 불임의 진단 목적, 예를 들면, 폐쇄성 무정자증의 정확한 위치의 발견을 위해 이용될 수도 있다. 또한, 상기 장치는 보다 덜 침습적인 방식으로 정소상체 및 정소망으로부터 세포 및 조직을 수집하는 데에 이용될 수 있다.
실시예 15
사춘기전 수컷 생식줄기세포 및 불임 치료에서의 이의 용도
가장 흔한 소아암인 혈액 유래 암의 치료는 전신 방사선조사 및 골수 이식과 병용되는 알킬화제를 필요로 하는 경향이 있다. 이들 치료는 악성세포를 파괴할 뿐만 아니라 빠르게 분열하는 정조세포에 대해서도 세포독성 효과를 나타낼 수 있다. 그 결과, 정자형성 실패 및 불임이 성년기에 일어날 수 있다. 청년 및 성인 남성은 암 치료 전에 그들의 정액을 냉동보관하는 선택권을 갖거나, 인공수정, IVF 또는 ICSI를 통해 유전적으로 그들 자신의 자손의 아버지가 될 수 있다.
사춘기전 환자는 정자형성을 완료하지 않았기 때문에 그들의 생식능력을 상실할 위험이 더 크다. 그들의 정세관 상피는 세르톨리 세포 및 상이한 종류의 정조세포만을 함유하고, 이들 중에서 정자세포가 존재한다. 성숙 생식자의 부재 때문에, 미성숙 조직의 냉동보존은 현재 어린 소년들에서 생식능력을 보존할 수 있는 유일한 수단이다.
매우 다양한 동물의 공여자 정소를 사용하고 면역손상된 마우스를 수용자로서 주로 사용하여 정소 세포 이식을 수행하였다. 수용자가 마우스인 실험에서 공여자로서 사용된 동물은 마우스, 래트, 햄스터, 토끼, 개, 소, 원숭이 및 인간을 포함한다. 공여자 정소 세포로부터 유래된 자손은 마우스 및 래트에서만 관찰되었다.
사춘기전 환자의 생식능력을 보존하는 방법은 생식줄기세포의 단리 및 냉동보존을 포함한다. 이들 생식줄기세포는 화학요법 및/또는 방사선요법 후 환자 내로 자가이식될 수 있다. 그러나, 암 환자의 생식세포의 자가이식은 악성세포의 전달 위험을 부가한다. 따라서, 생식세포는 악성세포로부터 완전히 단리되어야 한다. 생식줄기세포를 차등적으로 선택하고 상기 세포를 암세포로부터 정제하는, 유세포분석 분류에 기초한 방법이 본원에 개시되어 있다.
생식줄기세포 이식을 위한 생리학적 관련 분석도 본원에 개시되어 있다. 상기 분석의 결과는 생식능력을 회복시키는 데 필요한 줄기세포의 대략적인 양을 결정할 수 있게 할 것이다. 또한, 상기 결과는 조직을 수집할 때 및 방출 전에 생식줄기세포의 안정성, 생존율 및 효능을 평가하는 데에 이용된다. 마우스 모델이 이용되는데, 이는 이 종에서 정조줄기세포에 대한 표면 마커가 잘 특징규명되어 있고 이식 기법이 이용될 수 있기 때문이다. 이 이식 기법은 수용자 동물에서 공여자 세포의 정자형성의 완전한 진행을 허용하는 생식줄기세포의 기능성을 부설판으로 처리된 면역결핍 마우스 정소에서 시험할 것이다.
1. 정소 지지 세포에 적합한 항체의 확인
황체형성 호르몬 수용체(LHR)는 체세포로부터 생식세포를 식별하는 특이적 마커이다. LHR은 정소에서 세르톨리 세포 및 레이디히 세포에만 결합한다.
세포 표면 마커 세포내 마커 양성 염색 세포 종류
성체 성숙기전 성체 성숙기전
CD3620 AMH 인히빈(Inhibin) 알파 세르톨리
클래스 I MHC 비멘틴
(Vimentin)		 비멘틴
 세르톨리
Leu M3 세포각질 세르톨리
CLA-1/SR-BI 세르톨리, 레이디히, 정자세포 첨체소포
HSL 세르톨리, 레이디히, 정조세포, 정모세포의 골기 구역, 정자세포의 핵
GalC GalC 세르톨리, 레이디히, 세관간 공간의 결합 조직
A2B5 CNPase CNPase 세르톨리, 레이디히, 관간 공간의 결합 조직
Thy-1 GFAP GFAP 레이디히
O4-항원 (O4) 네스틴 레이디히
p75/NTR COL-1 결합 조직
13.5pc 마우스에서 PM 세포
인히빈 βA 결합 조직
13.5pc 마우스에서 PM 세포
칼데스몬(Caldesmon)1 결합 조직
13.5pc 마우스에서 PM 세포
트로포미오신(Tropomyosin)1 결합 조직
13.5pc 마우스에서 PM 세포
2. 암세포로부터 생식줄기세포의 분리
본 연구의 목적은 환자 샘플로부터 임의의 종양 세포를 제거하면서 생식줄기세포를 농축하는 것(불균질한 세포 집단으로부터 생식줄기세포를 차등적으로 선택하고 단리하는 방법이 개발됨); 및 임상적 적용을 위해 충분한 정도로 오염 암세포가 제거된 시점까지 선택 과정을 정량하는 것이다. 이것은 종양 성장을 개시하기 위해 얼마나 많은 암세포가 필요한지를 평가하는 것을 포함한다. 각각의 환자를 그의 질환 표현형에 따라 치료하기 위해, 질환 특이적 면역표현형유형분류(immunophenotyping) 방법이 개발될 것이다. 이를 수행하기 위해, 특정 종류의 암에 대한 특이적 세포 표면 마커 발현이 평가되고 환자 샘플로부터 암세포를 제거하는 데에 이용될 것이다.
본 절차의 주요 관심은 생식줄기세포의 단리이다. 유세포분석 분류를 이용하여 백혈병 마우스로부터 생식세포를 음성적으로 선택하는 절차는 MHC 클래스 I 및 공통된 백혈구 항원(CD45)을 포함하는, 혈액 암세포에서 발현되는 2개의 표면 마커에 대한 항체에 의해 확립되었다. 이 절차는 마우스에서 백혈병을 전달하지 않으면서 마우스 생식세포를 수용자 정소 내로 성공적으로 이식하였다. 악성세포의 추가 배제를 위해, 생식세포에 대한 특이적 마커, 예컨대, CD90, CD49f, SSEA-4 및 GFR-α를 사용하여 인간 생식세포를 양성적으로 선택하였다. 추가로, 암에 대한 다른 표시자, 예컨대, DNA 배수체 검출도 이용될 수 있다. 이 모델의 목적은 암을 환자 내로 재도입하지 않으면서 생식능력을 회복시키는 것이다.
실험은 생식줄기세포에 대한 양성 또는 음성 선택의 실행가능성, 종양이 마우스 모델에 재이식될 수 있는 역치 시점, 및 질환 특이적 표면 마커 발현 위상(topology)을 확인할 것이다.
3. 정조줄기세포 효능 분석
상이한 생식줄기세포 집단이 부설판으로 처리된 정소에서 생식능력을 회복시키는 능력에 대한 결론에 도달하기 위해, 효능 분석이 필요하다. 각각의 집단을 음성 대조군과 비교하여 효능의 증가를 확인하였다. 이것은 동시이식된 세포 종류, 예컨대, 레이디히 세포, 세르톨리 세포 또는 근육유사 세포의 필요성에 대한 결론도 허용한다. 증가하는 양의 생식줄기세포는 보다 높은 효율의 이식된 세포 및 생식능력의 회복을 제공해야 한다. 수용자로부터 공여자 세포를 명확히 인식할 수 있기 위해, 형질전환 GFP 마우스(NAGY, 잭슨 랩스(Jackson Labs)) 정소로부터 생식줄기세포를 단리한다. 사춘기전 인간 환자를 모방하기 위해, 7 내지 10일령의 젊은 수컷 마우스를 생식줄기세포의 수집을 위해 사용하였다.
이식된 세포 수용자 마우스의 수 필요한 총 세포수 공여자 새끼의 수 교배용 마우스
1.5 x 106 3 4.5 x 106 3 1
7.5 x 105 6 4.5 x 106 3 2
5.0 x 105 9 4.5 x 106 3 2
2.5 x 105 18 4.5 x 106 3 2
1.0 x 105 18 1.8 x 106 3 2
0 5 0 0 2
총계 59 15 11
이식 효율 분석: 정자형성의 활성 주기는 마우스의 경우 약 35일 동안 지속되므로, 이식받은 마우스 중 2마리만을 이식 후 4주에서 희생시켰다. 정소를 해부하고 활성 정자형성의 표시자로서 중량을 측정하였다. 그 다음, 정소를 단일 세포 현탁액으로 분해하고 GFP의 발현을 유세포분석으로 검출하였다. 이것은 공여자 줄기세포로부터 유래되는 GFP+ 세포수의 측정을 허용하였다. 또한, 유세포분석으로 동일한 마커에 대해 정소를 평가하여 공여자 및 내인성 수용자로부터 유래된 존재하는 생식줄기세포의 양에 대한 결론에 도달하였다.
생식능력 회복의 검출: 2마리의 남은 마우스를 이식 후 8주에서 교배를 위해 사용하였다. 각각의 수컷을 2마리의 누드 암컷과 교배시켰다. 발생된 자손을 그들의 GFP 발현 또는 털 색채에 대해 분석하여 유래하는 품종이 무엇인지를 입증하였다. 각각의 이식받은 마우스의 자손을 우발적인 기형에 대해 관찰하였다. 결과는 표 9에 기재되어 있다.
실시예 16
마우스 난소 배양된 생식세포의 분화 및 기능성 시험
난소 조직 이식(OTT)은 생식능력 보존 및 난소 여포의 증식을 위한 점진적으로 인기있는 방법이 되고 있다. 스펙트럼은 조기 난소 기능상실(POF)에 대해 불일치하는 쌍생아에서 OTT를 도입하고 일치하는 공여자의 난소 조직을 사용하여, 즉 이종 이식을 이용하여 난소 발생장애를 가진 여성에서 난소 기능(OF)을 회복시키기 위해 OTT를 도입한다. 또 다른 제안된 조치는 건강한 여성에서 생식 수명을 연장하는 것이다. 수집된 난소 조직에 대해 제안된 잠재적 용도는 다음과 같다: 원시 여포의 생체내/시험관내 성숙, 난소 조직의 이종이식, 또는 난모세포의 성숙 및 발달을 위해 혈액 혈장 응괴를 사용하고 상기 응괴를 난소 조직과 함께 이식하면서 생식세포를 후속적으로 분화시키는 신규 방법의 이용.
마우스 OG2 생식세포를 혈액 혈장 응괴 중의 난소 조직 세포와 함께 기능성 난소로 이식하거나 이들을 누드 마우스의 등 위의 피하 공간 내로 이식함으로써 암컷 마우스 OG2 생식세포를 여포 및/또는 난모세포로 분화시키는 방법을 개발하기 위해 본 실험을 수행한다. 본 실험의 목적은 혈장 응괴를 기능성 난소와 함께 동시배양하면서 상기 혈장 응괴가 생식세포를 미성숙 또는 성숙 난모세포로 분화시키는 이식 배지로서 작용하는지를 확인하는 것이다. 여포 발달의 초기 단계에 대해 시험하기 위해, 4개의 세포-응괴를 누드 마우스의 등 위의 피하 공간 내로 이식하고, 1개의 응괴를 28일 동안 7일마다 1회에 제거하고, 조직학적 조사를 이용하여 상기 응괴를 여포 및 난소 발달에 대해 조사한다. 숙주 난소 내로 동시이식된 분화된 이식된 세포의 기능성을 시험하기 위해, 분화되어 있고 수정가능하며 이식된 세포로부터 생존 새끼를 발생시킬 수 있는 임의의 기능성 난모세포가 존재하는지를 확인하기 위해 마우스들을 자연 교배시킨다. 어떤 응괴 방법이 분화 및 증식을 위해 가장 성공적인 방법일 수 있는지를 시험하기 위해, 난소 윤활낭 및 피하 공간에서 숙주 난소로 동시이식된 4가지 응괴 상태가 사용된다: 1) MEF 상에서 배양된 OG2 암컷 GS 세포(0일); 2) 배양된 OG2 암컷 GS 세포로부터 유래된 초기 EB(2일령); 3) 배양된 OG2 암컷 GS 세포로부터 유래된 EB(6일령)로부터 유래된 후기 난모세포 유사 세포; 및 4) 4 내지 6일령 FVB GFP 마우스로부터 새로 단리된 난소 세포 및 여포(양성 대조군으로서 사용됨).
Figure pct00001
생식세포 배상체 형성: OG2 암컷 콜로니의 배양물을 함유하는 6-웰 플레이트를 약 80% 전면생장율에서 수득한다(콜로니는 서로 최소한의 접촉을 가짐). 배지를 흡입하고 상기 웰을 PBS로 1회 세척하고, 700 ㎕의 가온된 트립신을 각각의 웰에 첨가하였다. 그 다음, 플레이트를 37℃ 항온처리기 내에 4분 동안 넣어둔다. 6-웰 플레이트의 각각의 웰의 내용물을 분쇄하여 MEF 층으로부터 OG2 암컷 세포를 세척한 후 가능한 많이 MEF 층을 파괴한다. 각각의 웰의 내용물을 분쇄한 후, 모든 웰의 내용물을 동일한 부피(4.2 ㎖)의 PM-1(상표명) + 15% FBS + GF가 함유된 50 ㎖의 원추형 튜브 내로 마이크로피펫팅하였다. 1 ㎖의 PM-1 + 15% FBS + GF를 사용하여 6-웰 플레이트의 처음 3개 웰을 세척하고 전단계의 세포와 조합하고, 이 단계를 6-웰 플레이트의 마지막 3개 웰에 대해 반복한다. 그 다음, 상기 세포를 400xg에서 5분 동안 원심분리하고 상청액을 진공 흡입으로 흡입한 후 200 ㎕의 피펫을 이용하여 남은 상청액을 흡입한다. 상기 세포를 β-머캡토에탄올 및 GF가 없는 8 ㎖의 PM-1 + 15% FBS에 재현탁시킨다. 이 세포 현탁액 2 ㎖를 6-웰 비부착성 플레이트의 4개의 웰 각각 내로 피펫팅하고, 2일마다 50% 배지를 교체하면서 상기 플레이트를 37℃ 항온처리기 내에서 2 내지 9일 동안 넣어둔다. 1000 ㎕의 배지를 웰 내로 피펫팅함으로써 상기 배지를 교체한다.
지지 난소 조직의 분해: 4 내지 8일령의 LacZ/Oct-4 GPF OG2 마우스의 난소를 단리하고 미세한 해부용 가위로 양등분한다. 양등분된 난소를 5% FCS 및 콜라겐분해효소(1.5 mg/㎖)가 함유된 2 ㎖의 HEPES 완충된 DMEM으로 옮긴다. 10분마다 약하게 피펫팅하면서 분해 용액 중의 난소를 37℃ 수조 내에서 30분 동안 항온처리한다. 30분 후, 5% FCS를 함유하는 12 ㎖의 HEPES 완충된 DMEM을 첨가하여 난소 및 분해 혼합물의 분해를 중단한다. 세포를 4℃에서 80xg로 10분 동안 원심분리한다. 상청액을 제거하고 세포를 원심분리로 2회 세척한다.
분화를 위해 생식세포와 난소 지지 세포의 혼합물의 제조: 1개의 난소의 분해된 세포를 각각의 조건에 대한 생식세포용 지지 세포로서 사용한다. 각각의 조건의 100K GS 세포를 1개의 완전히 분해된 OG2/LacZ 난소 세포 펠렛에 첨가한다. GS 세포로부터 유래된 후기 EB(6일)의 경우에만, 100K GS 세포를 사용하는 대신에 100개의 난모세포 유사 세포(40 내지 70 ㎛)를 수동으로 선택하여 1개의 완전히 분해된 OG2/LacZ 난소 세포 펠렛에 첨가한다. 세포 혼합물을 약하게 두드려서 완전히 혼합한다. 세포를 4℃에서 80xg로 10분 동안 원심분리한 후 모든 상청액을 제거한다.
혈액 혈장 응괴의 제조: 제조된 세포 혼합물을 80xg에서 5분 동안 원심분리한다. 상청액을 조심스럽게 제거하고 20 ㎕의 정맥 혈장을 첨가한다. 약하게 두드려서 세포 및 혈장을 볼텍싱함으로써 세포를 정맥 혈장에 재현탁시킨다. 20 ㎕의 혈장 및 세포를 제거하고, 6 cm 접시 상에 1개의 소적을 적하시키고 0.5 ㎕의 1 M CaCl2를 혈장 소적에 첨가한다. 접시를 덮고 혈장 소적을 세포와 함께 37℃ 항온처리기 내에 넣어둔다. 30분 동안 항온처리하여 응괴가 형성되게 한다. 30분의 항온처리 후, 응괴는 젤라틴 유사한 경도까지 경화되고 난소에 인접한 난소 윤활낭 내로 이식될 준비가 된다.
난소 윤활낭 내로의 정맥 응괴와 생식세포의 이식: 6 내지 8주령 누드 마우스를 0.5 ㎖의 아버틴으로 마취시킨다. 수용자 마우스의 등을 70% 에탄올로 닦아낸 후 마지막 늑골의 수평면에 있는 중앙선 근처에서 미세한 해부용 가위를 사용하여 피부에서 2개의 작은 단일 세로 절개(1 ㎝ 미만)를 만들었다(상기 중앙선의 우측에서의 1개의 절개 및 상기 중앙선의 좌측에서의 다른 1개의 절개). 상기 절개가 난소(주황색-분홍색) 또는 지방 패드(백색) 상에 존재할 때까지 피부를 좌측 또는 우측으로 활주시키는데, 이때 상기 난소 및 지방 패드 둘다 체벽을 통해 가시화된다. 그 다음, 상기 체벽을 핀셋으로 붙잡고 핀셋을 이용하여 난소 바로 위에 작은 절개(보다 큰 혈관을 피하기 위해)를 만든다. 무딘 핀셋을 이용하여 지방 패드를 붙잡고 상기 지방 패드에 부착되어 있을 좌측 난소, 난관 및 자궁을 떼어낸다. 지혈소겸자 클램프를 상기 지방 패드 상으로 활주시키고 난소, 난관 및 자궁이 체벽 외부에 남아있도록 상기 클램프를 등 위에 놓는다. 마우스를 조심스럽게 붙잡아 그의 머리를 좌측으로 하여 입체현미경의 단(stage) 상에 놓는다. 난소를 조심스럽게 찾고 미세한 해부용 가위를 이용하여 난소 윤활낭 내로 작은 절개(2 mm)를 만든다. 세포를 함유하는 미리 만들어진 혈장 응괴를 세포와 함께 집어 난소 윤활낭의 상기 작은 절개 내로 조심스럽게 삽입한다. 핀셋을 이용하여 상기 응괴를 난소 윤활낭 절개 부위 내로 조심스럽게 넣는다. 지혈소겸자 클램프를 풀고 마우스를 입체현미경의 단으로부터 제거한다. 핀셋을 이용하여 상기 지방 패드를 붙잡고 난소, 난관 및 자궁을 체벽 내에 다시 넣는다. 체벽을 1 또는 2회의 바느질로 꿰매고(임의적) 피부를 상처용 클립으로 봉합한다. 마우스의 반대 측면(우측) 상에서 반복한다. 다음날, 이식받은 마우스의 일반적인 건강을 조사한다. 이식 후 7일에서 상처용 클립을 제거한다.
마우스 등의 피하 공간 내로의 정맥 응괴와 생식세포의 이식: 마우스가 난소 윤활낭 내로의 이식으로부터의 마취 하에 여전히 있는 동안, 가위를 이용하여 2개의 원래의 절개 부위의 피부로부터 근육을 분리한다. 각각의 절개 부위에 대해 2개의 응괴(마우스 당 총 4개의 응괴)를 피하 공간 내로 삽입한다. 1개의 응괴를 상기 절개 부위의 우측에 삽입하고 다른 응괴를 상기 절개 부위의 좌측에 삽입한다. 추가 2개의 응괴에 대하여 제2 절개 부위에서 절차를 반복한다. 수술적 제거에 의해 28일 동안 1개의 피하 삽입된 응괴가 7일마다 1회씩 제거된다. 제거된 응괴를 5 ㎖의 4% 파라포름알데하이드에서 고정시키고 OTC에 포매하고 8 ㎛로 냉동절단하고 헤마톡실린 및 에오신으로 염색하여 형태학적 조사로 여포의 분화 및 증식이 일어나는지를 확인한다. 필요하다면 슬라이드를 난모세포 특이적 항체로 염색한다.
이식받은 누드 마우스의 교배: 이식받은 누드 마우스를 수술 후 21일부터 매일 조사하여 마우스가 발정기에 있는지를 확인한다. 입구의 폐쇄를 에스트로겐 결핍의 표시로서 간주하고, 재개방을 에스트로겐성 여포가 이식물에서 출현하였다는 징후로서 간주한다. 질 개방 후 또는 수술 후 3주에서(어느 시점이든 보다 이른 시점에서), 숙주 암컷을 가임 수컷과 교배시킨다. 교배의 징후(질전)에 대해 암컷을 매일 조사한다. 교배된 암컷이 새끼를 낳게 한다. 이식 후 6 내지 12주에서, 모든 숙주를 부검하고, 생식관의 상태를 조사하고, 난소 캡슐로부터 이식물을 제거하고 5 ㎖의 4% 파라포름알데하이드에서 고정시키고 OTC에 포매하고 8 ㎛로 냉동절단하고 헤마톡실린 및 에오신으로 염색한다.
실시예 17
성인 정소로부터 재증식하는 정조줄기세포의 확인 및 특징규명
정조줄기세포(SSC)는 전체 수명 동안 정자의 자가재생 및 연속적인 생성을 통해 정자형성을 유지한다. 조직학적 연구 및 초미세구조 연구는 비영장류 포유동물에서 As(A 단일) 정조세포가 정자형성의 줄기세포인 것으로 간주된다는 것을 보여주었다. A 정조세포의 분열시, 딸세포는 서로 멀리 이동하여 2개의 새로운 줄기세포가 되거나, 세포간 가교를 통해 함께 남아 A-쌍(Apr) 정조세포가 된다. Apr 정조세포가 4개, 8개 또는 16개의 A-정렬된(Aal) 정조세포로 더 발달한다. Aal 정조세포는 A1 정조세포로 분화하고, 6회의 유사분열 후 A2, A3, A4 및 최종적으로 B 정조세포(마지막 유사분열에서 정모세포를 발생시킴)를 발생시킨다.
설치류와 달리, 인간 및 다른 영장류에서 핵 형태학의 고전적인 조직학적 연구는 A어두운 정조세포 및 A연한 정조세포로서 명명된 2종의 미분화된 정조세포가 정소 정상피(seminiferous epithelium)의 기저막 상에 존재한다는 것을 보여준다. 악성 종양에 대한 반거세 및 방사선요법과 화학요법을 받은 환자의 정소 부검시 정조줄기세포의 형태학적 특징규명은 인간 정소의 줄기세포가 A연한 정조세포일 가능성이 매우 높다는 것을 보여주었고, 성체 붉은털 원숭이 정소에서의 최근 연구도 A어두운 정조세포가 거의 분열하지 않고 세포독성 자극 후에 활성화되는 예비 줄기세포 집단을 대표하는 반면, A연한 정조세포는 정상 환경 하에서 주기적인 자가재생 분열을 경험하여 정자형성을 유지하는 활성 줄기세포라는 것을 보여주었다. 이것은 인간 및 영장류 정자형성 둘다 유사한 개체발생을 가지므로 이들 2 종 사이에 SSC 하위집단의 특징이 유사할 것임을 암시한다.
일반적으로, 특이적 마커가 입수불가능하기 때문에, 성인 정소 내의 SSC의 표현형적 특징 및 분자적 특징이 잘 이해되어 있지 않다. 붉은털 원숭이를 사용하여 성체 영장류 정소의 농축된 SSC 집단을 특징규명하고 단리하였다. 영장류 SSC의 표면에서 발견된 선택된 마커를 사용하여 성인 정소 내의 상이한 SSC 집단들의 본질을 조사하였다. 또한, 농축된 인간 SSC 집단을 수용자 마우스 정소 내로 이식하고, 수용자 마우스 정소 내의 재증식하는 인간 정조줄기세포의 본질을 조사하였다.
재료 및 방법
조직 준비 및 세포 단리: 종양 오염이 없는 정소 조직은 정소절제술을 받은 환자로부터 수득하였고 2명의 환자들에 의해 관대하게 공여되었다. 정소 생검은 TESE(정소 생검 및 정소 정자 추출) 절차를 받은 환자로부터 입수되었다. 모든 환자들이 조직 수집 전에 공식 동의서에 서명하였다. 조직의 작은 일부를 추출하고 본 연구에 사용하였다. 정소 조직 및 생검을 수술적으로 절제하고 페니실린/스트렙토마이신으로 보충된 PBS에 넣고 얼음 상에서 2시간만큼 짧은 시간 내지 하룻밤 동안 수송하였다. 조직학적 분석 및 분자생물학적 분석을 위해 정소 조직 샘플을 채취하였다. 남은 조직의 정세관을 미세하게 분쇄하고 왕복 37℃ 수조 내에서 콜라겐분해효소 A(1 mg/㎖) 및 DNA 분해효소(10 U/㎖)로 15분 동안 분해하였다. 콜라겐분해효소에 의한 분해 후, 미분해된 조직을 정치시키고, 상청액 중의 세포를 제거하였다. 미분해된 조직을 왕복 37℃ 수조 내에서 DMEM 중의 1.5 mg/㎖ 콜라겐분해효소 A, 1.5 mg/㎖ 히알루론산분해효소 V형, 0.5 mg/㎖ 트립신 및 10 U/㎖ DNA 분해효소로 구성된 효소 칵테일로 20분 동안 더 분해하였다. 남은 미분해된 조직을 걸러낸 후, 단리된 세포를 400xg에서 10분 동안 원심분리하였다. 세포 펠렛을 MEM + HEPES + 5% FBS에 재현탁시키고 분석할 때까지 5% CO2 습윤 항온처리기 내의 조직 배양물 코팅된 15 cm 접시에 넣어두었다. 정소 생검 샘플을 상기 효소 칵테일에서만 분해하였고 그들의 작은 크기로 인해 일반적으로 하나의 목적을 위해서만 사용하였다.
유세포분석 및 자기 분류: 세포 표면 특징규명 및 분류를 위해, CD90-FITC, CD49f-PE, CD117-APC 및 SSEA-4를 포함하는, 영장류 SSC의 특징규명에 사용되는 선택된 줄기세포 마커를 사용하여 세포를 염색하였다(표 10). 세포를 얼음 상에서 MEM + HEPES + 5% FBS(완전 배지)에서 30분 동안 염색하고 1회 세척하고 완전 배지에 재현탁시키고 유동 분석을 수행할 때까지 얼음 상에서 보존하였다. 유동 분석은 인플럭스 셀 소터 상에서 달성하였다. 플루오레세인(FITC) 및 피코에리쓰린(PE)을 488 nm 200 mW 레이저로 여기시키고, 방사를 각각 530/40 및 580/30 밴드 통과 필터로 수집하였다. 알로피코시아닌(APC)을 638 nm 25 mW 레이저로 여기시키고 방사를 670/40 밴드 통과 필터로 수집하였다. 자기 분류를 위해, 세포(200 x 106개 이하)를 DMEM + 10% FBS에 재현탁시키고, SSEA-4-바이오틴을 첨가하고(1:200) 얼음 상에서 1시간 동안 항온처리하였다. PBS, BSA(0.5%) 및 2 mM EDTA를 함유하는 표지 완충제를 제조하고 10분 동안 탈기시켰다. 표지 완충제를 SSEA-4에 의해 염색된 세포에 첨가하고 400xg에서 10분 동안 원심분리하였다. SSEA-4 세포를 1.8 ㎖의 완충제에 재현탁시키고, 200 ㎕의 스트렙타비딘 마이크로비드를 첨가하였다. 자기적으로 분리된 세포의 순도를 유세포분석으로 조사할 수 있도록 100㎕의 SSEA-4-FITC 접합된 항체를 첨가하고 4℃에서 20분 동안 항온처리하였다. 10 ㎖의 완충제를 튜브에 첨가하고 400xg에서 7분 동안 원심분리하였다.
조직학적 염색 및 면역조직화학적 염색: 조직을 4% 파라포름알데하이드(PFA)에서 밤새 고정시키고 밤샘 평형화를 위해 20% 수크로스로 옮겼다. 조직을 OCT 화합물로 동결하고 8 ㎛ 두께의 냉동절편을 제조하고 -80℃에서 저장하였다. 조직학적 염색을 위해, 절편을 PBS로 세척하고 메이어 헤마톡실린으로 5분 동안 염색하고 증류수로 5분 동안 세척하고 수성 표본고정 배지를 사용하여 표본고정시켰다. 그 다음, 상기 절편을 명시야 현미경을 이용하여 분석하였다. 면역조직화학적 염색을 위해, 0.1% 트리톤-X/2% BSA/5% 양 혈청을 사용하여 정소 절편을 차단하고 투과가능한 상태로 만들었다. 그 다음, 슬라이드를 표 10에 기재된 생식세포 및 SSC 특이적 항체로 염색하였다. 핵 가시화를 위해 DAPI를 사용하였다. 증류수로 다회 세척한 후, 수성 형광 보존제를 사용하여 세포를 보존하였다. 슬라이드북(상표명) 영상화 소프트웨어가 장착된 올림푸스 BX-61 현미경을 이용하여 슬라이드를 분석하였다. 정량화 연구를 위해, 슬라이드 당 약 25개의 세관 횡단면을 카운팅하고 4개의 슬라이드로부터 수득된 데이터를 함께 모아 본 연구에서 제시하였다.
RNA 추출 및 실시간 PCR 분석: 제조자의 권고에 따라 알엔이지 미니 키트(퀴아젠 인코포레이티드)를 사용하여 전체 세포 RNA를 단리하였다. 그 다음, 콴티텍 RT 키트(퀴아젠)를 사용하여 상기 단리된 RNA를 cDNA로 전사시킨 후 퀴아퀵 PCR 정제 키트(퀴아젠)를 사용하여 정제하였다. 각각의 RT-PCR 반응을 위해, 20 ng의 cDNA 주형을 핫스타 Taq 플러스 및 각각의 프라이머와 함께 25 ㎕ 반응 부피로 사용하였다. 모든 표적물을 30주기 동안 증폭시켰다. 증폭 생성물을 2% 아가로스 겔 상에서의 크기로 확인하였다. QRT-PCR의 경우, 5 ng의 cDNA 주형을 콴티텍 SYBR 그린 PCR 마스터 혼합물(퀴아젠)과 함께 25 ㎕ 반응 부피로 사용하고, 바이오라드 아이사이클러 상에서 증폭을 실시하였다. 각각의 샘플을 3회 반복하여 분석하고 GAPDH 대조군으로 표준화하였다.
항원 항체 공급원 작업 희석비 방법
CD49f 비디 파밍겐 1:100 유세포분석
CD49f 산타 크루즈 바이오텍 1:200 ICC
CD29 케미콘 1:100 유세포분석
CD90 비디 파밍겐 1:100 유세포분석
CD117 비디 파밍겐 1:100 유세포분석
CD117 산타 크루즈 바이오텍 1:100 ICC
SSEA-4 이바이오사이언시스 1:200 유세포분석
SSEA-4 케미콘 1:200 ICC
SSEA-4-바이오틴 이바이오사이언시스 1:200 MACS
스트렙타비딘 마이크로비드 밀테니이 바이오텍 1:20 MACS
GFR-α1 알&디 바이오시스템스 1:100 유세포분석, ICC
GPR-125 아브캠 1:250 ICC
Oct-4 산타 크루즈 바이오텍 1:50 ICC
Tra-1-60 케미콘 1:100 ICC
DDX4(VASA) 아브캠 1:200 ICC
VASA 알&디 바이오시스템스 1:100 ICC
Nanog 베틸 1:100 ICC
HNP 케미콘 1:250 ICC
알렉사 488 인비트로겐 1:500 ICC
알렉사 568 인비트로겐 1:500 ICC
FITC 잭슨 1:200 유세포분석
DAPI 인비트로겐 1:10.000 ICC
TO-PRO-3 인비트로겐 1:100 유세포분석
훽스트(Hoechst) 33342 인비트로겐 1:1000 유세포분석
알렉사 488 항체 표지 키트 인비트로겐 ICC
유전자 5' 서열 3' 서열 서열번호 DNA 크기 ( bp )
C-Kit AGGTGACACTATAGAATAGCACGGTTGAATGTAAGGCT AGGTGACACTATAGAATAGCACGGTTGAATGTAAGGCT 1,2 151
GFRa1 AGGTGACACTATAGAATATCAGCAAGTGGAGCACATTC GTACGACTCACTATAGGGAAGCATTCCGTAGCTGTGCTT 3,4 256
PLZF AGGTGACCACTATAGAATATTCATCCAGAGGGAGCTGTT CTACGACTCACTATAGGGACCTCGTTATCAGGAAGCTCG 5,6 155
c-Ret AGGTGACACTATAGAATAACATTGCCCAGCAACTTAGG GTACGACTCACTATAGGGAGGTGGCTCCTTTCTCAACTG 7,8 219
GPR125 AGGTGACACTATAGAATACTTGGCGCAGATGTGATAGA GTACGACTCACTATAGGGAGAAAAGTTGGCTGCTTCCAC 9,10 215
Dppa5 AGGTGACACTATAGAATAGAAAGTTCCCGAAGACCTGA GTACGACTCACTATAGGGAACTGGAGCATCCACTTGGTC 11,12 252
FGFR3 AGGTGACACTATAGAATATGGGTTTTCTCATCACTCTGC GTACGACTCACTATAGGGAGTTGGACTCCAGGGACACCT 13,14 247
hTERT AGGTGACACTATAGAATATTGTCAAGGTGGATGTGACG GTACGACTCACTATAGGGAGGCTGGAGGTCTGTCAAGGT 15,16 227
텔로머라제 분석: SYBR 그린 실시간 정량 텔로머성 반복부 증폭 프로토콜(RQ-TRAP)은 문헌(Wege H, Chui MS, Le HT, Tran JM, Zern MA (2003) SYBR Green real-time telomeric repeat amplification protocol for the rapid quantification of telomerase activity. Nucl. Acids Res. 31, e3.)으로부터 개조되었다. 조직 또는 세포 펠렛을 PBS로 1회 세척하고 1x CHAPS 용해 완충제 및 400 U/㎖ 알엔에이즈아웃 억제제를 함유하는 제조된 용해 완충제에 1,000개 세포/㎕의 농도로 재현탁시키고 균질화하였다. 얼음 상에서 25분 동안 항온처리한 후, 세포 용해물을 4℃에서 최대 속도로 10분 동안 원심분리하였다. 그 다음, 상청액을 새로운 마이크로원심분리 튜브로 옮기고, 단백질 농도를 ND-1000 분광계로 A280 nm에서 측정하였다. 500 ng의 단백질 용해물, 콴티텍 SYBR 그린 PCR 혼합물(퀴아젠), 1 ㎍의 TS 프라이머, 0.5 ㎍의 ACX 프라이머 및 핵산분해효소 무함유 물을 함유하는 25 ㎕의 부피로 반응을 수행하였다. 분석되는 모든 반응 플레이트에 대해, 주형 부재 대조군(용해 완충제), 양성 대조군(ESC 세포), 및 인간 ESC 단백질 용해물(1000 ng, 200 ng, 40 ng, 8 ng, 1.6 ng)로부터 작도된 표준 곡선과 함께 각각의 샘플을 3회 반복하여 시험하였다. 아이사이클러 아이큐5(바이오-라드)를 이용하여, 반응물을 25℃에서 20분 및 95℃에서 15분 동안 항온처리하고 95℃에서 30초 및 60℃에서 90초 동안 40회 PCR 주기로 증폭시켰다. 역치 주기 값(Ct)을 반-로그 증폭 도면으로부터 측정하고(형광에서의 로그 증가 대 주기수) 표준 곡선과 비교하였다. 역치에 대한 소프트웨어 디폴트 설정은 주기 1을 제외하고 처음 10주기에 걸쳐 각각의 웰의 형광 판독치의 표준 편차의 평균의 10배이다. 텔로머라제 활성을 인간 ESC에 대해 상대적인 백분율로서 표시하였다.
정조줄기세포 이식: 수용자 마우스 정소에서의 콜로니화에 의한 세포 집단의 기능성을 시험하기 위해 정조줄기세포 이식 기법을 이용하였다. 8주령의 면역결핍 무흉선 누드-폭슨(Foxn)1nu 수컷 마우스(할란)를 단회 복강내 부설판 주사(40 mg/kg)로 처리하고 수용자로서 사용하였다. 부설판 처리 후 1개월에서, 0.3 내지 0.8 x 106개의 SSEA-4+ 자기 분류된 성인 정소 세포를 정소망 주입을 통해 정세관 내로 이식하였다. 이식 후 4주에서, 상기 마우스를 희생시키고 정소를 4% PFA에서 고정시키고 냉동절편을 제조하였다. 인간 핵 단백질 항체를 다른 줄기세포 또는 생식세포 마커와 함께 사용하여 마우스 정소 내의 인간 정조줄기세포의 본질을 인식하였다. 모든 동물 실험을 실험실 동물의 관리 및 사용에 대한 국립연구협회 지침에 따라 수행하였다.
통계학적 분석: 달리 명시된 경우를 제외하고, 모든 실험을 3회 반복하였다. 통계적 분석을 위해 2 샘플 스튜던트 T 검정 및 ANOVA 검정을 이용하였고 P<0.05를 유의수준으로서 간주하였다.
결과
정조줄기세포의 단리 및 농축: 폐쇄성 무정자증 남성으로부터 수집된 정소 생검으로부터 단리된 세포는 정상 인간 정소와 유사한 정자형성 세포의 형태 및 분포를 보였는데, 이것은 정자형성이 이들 환자에서 진행되고 있다는 것을 암시한다. 각각의 샘플로부터 87%의 생존율로 평균 0.5 x 106개의 세포를 단리하였다. 정조줄기세포는 다른 세포들 중에서 큰 핵 대 세포질 비, 1 내지 3개의 핵소체 및 세포질 봉입체를 갖는 둥근 세포로서 형태학적으로 검출되었다(도 39). 정조줄기세포의 농축을 위해, 성인 정소 조직으로부터 분리된 세포를 유세포분석을 이용하여 다양한 세포 표면 마커에 대해 분석하였다. 다양한 줄기세포 마커에 의해 염색된 성인 정소 세포의 발현 프로파일은 도 43에 제시되어 있다. SSC의 특징규명을 위해 사용된 표면 마커들 중에서, 성체 붉은털 원숭이 정소 내의 SSC 상에서 발현되는 것으로 밝혀진 SSEA-4가 인간 정소에서 풍부하게 발현되었다. 정소 생검 및 공여된 조직 둘다로부터 단리된 인간 정소 세포를 시험하였고 13.3 ± 1.4%의 세포가 그들의 표면 상에서 SSEA-4를 발현한다는 것이 발견되었다. 설치류 및 영장류 정소에서 기재된 SSC 마커의 또 다른 하위세트는 CD49f(α6-인테그린), CD90(Thy-1), CD117(c-Kit) 및 조합 CD49f+/CD90+/CD117-(삼중 염색)이다. 성인 정소에서, 25 ± 2.5%의 세포가 CD49f를 발현하고 13 ± 5%의 세포가 CD90+를 나타낸다. 흥미롭게도, 원숭이 정소와 대조적으로, 인간 정소에서는 삼중 염색된 세포의 집단이 존재하지 않았다(도 39e 내지 39h).
정소 절편의 조직학적 염색 및 면역조직화학적 염색: 조직학적 조사는 정소 생검이 헤마톡실린-에오신 염색 후 공여된 조직과 비교될 때 유사한 형태를 가진다는 것을 보여주었다(도 39a 및 39b). 인간 SSC의 분포 및 마커 발현을 더 잘 이해하기 위한 면역조직화학적 조사를 위해 인간 정소 조직을 채취하였다. α6-인테그린으로도 공지되어 있는 SSEA-4 및 CD49f는 성인 정소에서 흥미로운 염색 패턴을 가졌는데, 이 패턴은 원숭이 정소에서 이전에 관찰된 것과 매우 유사하다(도 40). 조직학적 정량에 따르면, 정세관의 기저막에 인접한 거의 모든 생식세포들이 설치류 및 원숭이 SSC 및 다른 다중분화능 줄기세포의 표면에서 발견된 마커인 CD49f를 발현한다(세관 횡단면 당 28.7 ± 1.2). 또한, 정세관의 기저막을 따라 많은 세포들이 인간 배아줄기(ES)세포, 배아생식줄기(EG)세포 및 성체 붉은털 원숭이 SSC에서 발견된 다분화능 마커인 SSEA-4를 발현한다(세관 횡단면 당 18 ± 1). 흥미롭게도, 대다수의 SSEA-4+ 세포(88.3%)가 CD49f와 동시국소화된다. 성인 정소에서 CD90에 대한 특이적 면역반응은 발견되지 않았다. 예상외로, 대다수의 생식세포가 줄기세포 인자에 대한 수용체이자 생식세포 분화의 초기 마커인 c-Kit를 그들의 표면 상에 국소화시키는 것이 아니라 핵 내에 국소화시킨다는 것이 관찰되었다. 약 75%의 SSEA-4+ 세포가 c-Kit와 동시국소화되었는데, 이것은 2개의 상이한 SSC 집단이 성인 정소에 존재할 가능성이 있다는 것을 암시한다. 또한, CD49f 및 c-Kit의 동시국소화는 정세관의 기저막에 있는 대다수의 CD49f+ 세포(73.6%)가 SSEA-4와 매우 유사한 c-Kit를 동시발현한다는 것을 보여주었다. 모든 SSEA-4+ 세포들이 생식세포 마커 VASA에 대해서도 양성을 나타낸 반면, CD-49f+ 세포의 50%만이 VASA 염색을 보였는데, 이것은 CD-49f가 정소 체세포의 표면에서도 발현된다는 것을 암시한다. 이것과 대조적으로, 황체형성 호르몬 수용체(LHR)는 정세관 내의 VASA+ 세포 상에서 발현되지 않지만 인간 정소 내의 세르톨리 세포 및 레이디히 세포의 세포질을 염색하는 것으로 보이는데, 이것은 LHR이 성인 정소 내의 체세포에서만 발현되고 생식세포에서는 발현되지 않는다는 것을 암시한다(도 44). 인간 정소의 기저막에 Oct-4를 발현하는 명백한 세포 집단이 존재하였는데, 이것은 인간 SSC 중에서 다분화능 특징을 갖는 세포 집단이 존재한다는 것을 암시한다.
실시간 PCR 및 텔로머라제 분석: 정조줄기세포 특이적 발현에 대해 시험하기 위해 SSEA-4+ 세포 및 SSEA-4- 세포에 대한 유전자 발현 분석을 수행하였다. c-Kit, GFRα-1, PLZF, c-RET 및 GPR-125를 포함하는 모든 유전자들이 SSEA-4+ 집단에서 3배 이상 내지 7배 이하로 더 많이 발현되었다(도 41a). 놀랍게도, SSEA-4+ 세포는 FGFR-3에 대한 훨씬 더 높은(24배) 발현 수준을 보였는데(데이터는 나타내지 않음), 이것은 FGFR-3 및 이의 리간드 FGF9가 인간 SSC 증식 및 자가재생에 관여할 것임을 암시한다. 더욱이, SSEA-4 분류된 세포에서 h-TERT의 보다 높은 발현 수준은 그들의 높은 텔로머라제 활성 수준 및 그들의 재증식 능력을 암시한다. 인간 배아줄기세포(hESC)에 상대적인 텔로머라제 활성에 대하여 SSEA-4 양성 분류된 세포를 정소로부터의 비분류된 세포와 비교하였다(도 41b). 상기 비분류된 세포는 hESC(100%)와 비교할 때 평균 10.4% ± 10.32%의 텔로머라제 활성을 보인 반면, SSEA-4+ 세포는 상기 비분류된 세포와 비교할 때 약 5배 더 많은 발현(54.6%(+/- 7.8%))을 보였는데, 이 발현은 hESC 텔로머라제 발현보다 약 2배 적다. 이것은 상향조절된 h-TERT 발현의 발견을 지지하고 SSEA-4 양성 세포에서 적어도 연장된 복제 능력을 암시한다.
정조줄기세포 이식: 인간 정조줄기세포의 콜로니화 효율을 시험하고 마우스 정소에서 재증식하는 인간 SSC의 표면 상에서 발현되는 마커를 밝히기 위해 농축된 상기 인간 정조줄기세포 집단을 이식받은 마우스 정소에 대한 동시국소화 연구를 수행하였다. 이들 마커의 국소화의 요약은 표 12에 제시되어 있다. HNP를 SSEA-4, CD49f 및 c-Kit와 함께 사용하였을 때, 인간 핵 단백질에 대해 양성을 나타내는 세포의 28.1%(± 3.6%)가 CD49f에 대해 양성을 나타내고, 94.9%(± 1.3%)가 c-Kit에 대해 양성을 나타내고 14.2%(± 3.6%)가 SSEA-4에 대해 양성을 나타낸다. 나아가, 본 발명자들은 SSEA-4+ 세포의 100%가 c-Kit에 대해서도 양성을 나타낸다는 것을 관찰하였는데, 이것은 SSEA-4+/c-Kit+ 세포만이 수용자 마우스 정소 내로 도입될 수 있으므로 SSEA-4+ 집단 중에서 자가재생하는 SSC일 가능성을 추가로 암시한다. α6-인테그린 및 SSEA-4를 사용한 동시국소화 연구는 SSEA-4+ 세포의 95.63%(± 1.6%)가 α6-인테그린에 대해서도 양성을 나타낸다는 것을 입증하였다. 이들 결과, 및 α6-인테그린이 HNP와 동시국소화되고 SSEA-4 및 HNP보다 2배 더 많다는 사실을 고려할 때, 2개의 α6-인테그린+ 세포 집단, 즉 α6-인테그린+/SSEA-4+ 집단 및 α6-인테그린+/SSEA-4- 집단이 수용자 정소에서 재증식할 수 있는 SSC이다. α6-인테그린+ 세포만이 도입된 세포의 약 4분의 1을 차지한다는 사실도 주목해야 하는데, 이것은 도입된 SSC의 약 75%가 유세포분석에 의해 표면 마커로 아직 특징규명되지 않았다는 것을 의미한다. 거의 모든 도입된 세포들이 c-Kit에 대해 양성으로 염색된다 하더라도, c-Kit는 대다수의 세포에서 핵 내에 국소화되고 c-Kit+ 세포는 유세포분석에 의해 발견되지 않았다(도 43). HNP와 다른 세포 표면 마커의 동시국소화는 마우스 정소에서 콜로니화된 인간 SSC가 마우스 SSC의 표면 상에서 발현되는 마커인 CD-29(α1-인테그린)를 발현하지 않는다는 것을 보여주었다(도 42). 그러나, HNP 세포의 42.8%가 GPR-125와 동시국소화되는데, 이것은 이 마커가 재증식하는 인간 SSC 집단의 표면에서 발현된다는 것을 암시한다. 또한, HNP 양성 세포의 28.3%가 다분화능 마커 Nanog와 동시국소화되는데, 이것은 재증식하는 인간 SSC의 약 3분의 1이 다분화능 특징을 가질 것임을 암시한다.
마커 HNP와의 동시국소화 (%)
VASA 100
c-Kit 49.8 ± 2.9
GPR-125 42.8 ± 2.6
LH-R 0
CD49f 28.1 ± 3.6
CD29 0
SSEA-4 14.2 ± 3.6
Nanog 28.3 ± 1.5
Oct-4 측정되지 않음
Tra-1-60 0
논의
본 연구는 성인 정소 내의 정조줄기세포가 마우스와 상이하고 영장류 SSC와 유사하지만 동일하지 않은 표현형적 특징 및 분자적 특징을 가진다는 것을 명확히 입증한다. 먼저, 인간 정소 절편 및 단리된 세포에서 선택된 마커들의 국소화 및 발현이 연구되었다. 면역조직화학적 연구는 시험된 마커들 중에서 SSEA-4가 인간 SSC의 표면에서 특이적으로 발현된다는 것을 입증하였다. 모든 SSEA-4 세포가 정세관의 기저막에 위치하였고 생식세포 마커 VASA와 동시국소화되었다. 이것은 성체 영장류 정소에서 이전에 관찰된 것과 매우 유사하다. 그러나, 성인 정소 내의 SSEA-4+ 세포의 백분율은 원숭이 정소(2%)보다 인간 정소(13%)에서 훨씬 더 높았다. 분자생물학적 분석도 SSEA-4 분류된 세포가 모든 SSC 특이적 유전자들의 보다 높은 발현 수준 및 텔로머라제 활성의 보다 높은 수준을 가진다는 것을 보여주었는데, 이것은 정조줄기세포가 이 집단에 존재한다는 것을 암시한다. 이전 연구들은 마우스 정소 및 성체 영장류 정소로부터 단리된 SSC가 CD49f 및 CD90을 발현하고 CD117에 대해 음성을 나타낸다는 것을 보였다. 단리된 인간 정소 세포에서의 CD49f 및 CD90의 발현은 이미 보고되어 있다. 이 면역조직화학적 연구는 인간 정소에서 CD49f가 정세관의 기저막을 따라 국소화된다는 것을 보여주었는데, 이것은 이 마커가 SSC뿐만 아니라 분화하는 A형 정조세포에서도 발현된다는 것을 암시한다. 또한, 정세관 외부에서의 일부 CD49f 양성 세포의 발현은 CD49f가 인간 SSC에서 발현되지만 특이적 마커가 아니고 인간 정소로부터 SSC를 농축하는 데 있어서 단독으로 사용될 수 없다는 것을 암시한다. 유세포분석은 면역조직화학적 염색을 확인시켜주었고 CD49f 또는 CD90에 대해 양성으로 염색되는 구별되는 세포 집단이 성인 정소 내부에 존재한다는 것을 보여주었으나, 영장류와 대조적으로 인간 정소에는 이중 양성 세포 집단이 전혀 존재하지 않았다. SSEA-4와 유사하게, CD49f+ 및 CD90+ 세포의 백분율도 원숭이 정소와 비교할 때 성인 정소에서 훨씬 더 높았다.
유세포분석은 매우 적은 CD117+ 세포가 성인 정소에 존재한다는 것을 보여주었지만, 면역조직화학적 염색은 정세관의 기저막에 존재하는 많은 세포뿐만 아니라 인간 정소의 내강 구획 내에 존재하는 세포에서도 c-Kit의 국소화를 보여주었다. 인간 정소에서 c-Kit 단백질의 유사한 국소화 패턴이 다른 연구자들에 의해 보고되었다. 최근에, 미분화된 정조세포에서 c-Kit 발현이 단계 특이적이라는 것이 밝혀졌는데, 이것은 이 단백질이 인간 정자형성의 초기 단계 동안 관여한다는 것을 암시한다. c-Kit는 조혈줄기세포 및 기원세포, 및 생식샘을 포함하는 여러 비조혈 조직에서 발현되는 티로신 인산화효소 막 단백질이다. c-Kit 및 이의 리간드 줄기세포 인자(SCF)가 이동 및 콜로니화, 증식 및 분화를 포함하는 생식세포 발달 동안의 다양한 기능에 관여한다는 것을 보여주는 많은 증거가 존재한다. 성인 정소 내의 세포는 그들의 핵에서 c-Kit 단백질을 발현하지만 그들의 막에서는 발현하지 않는다. c-Kit의 핵 국소화는 이들 세포가 유세포분석에 의해 검출될 수 없는 이유를 설명할 것이다. c-Kit는 일반적으로 막 단백질이지만, 그의 세포질 및 핵 국소화가 보고되어 있다. SSEA-4와 c-Kit의 이중 국소화는 2개의 SSEA-4+ 세포 집단, 즉 c-Kit 발현을 나타내는 한 집단 및 c-Kit 발현을 나타내지 않는 다른 한 집단이 성인 정소에 존재한다는 것을 보여주었다. 마우스 SSC에서의 연구에 기초할 때 SSC는 c-Kit 음성을 나타내는 것으로 밝혀졌다.
성체 영장류에서, SSEA-4+ 세포는 수용자 마우스 정소에서 재증식할 수 있는, 활발히 분열하는 정조줄기세포 집단이다. SSEA-4 자기 분류를 이용하여 인간 SSC를 정제하고, SSEA-4+ 세포를 부설판으로 처리된 수용자 마우스 정소 내로 이식하였다. SSEA-4+ 세포는 이식 후 대다수의 마우스 정세관의 기저막에서 발견되었는데, 이것은 기능성 SSC가 이 집단에 존재한다는 것을 암시한다. 놀랍게도, 수용자 정소에서 콜로니화된 모든 인간 세포들이 c-Kit+를 나타내었는데, 이것은 SSEA-4 분류된 세포의 c-Kit+ 분획만이 수용자 정소에서 콜로니화될 수 있으므로 인간 정소에서 활성 SSC라는 것을 암시한다. RT-PCR 분석도 SSEA-4 분류된 세포가 c-Kit 및 FGFR3의 매우 높은 발현 수준을 가진다는 것을 보여주었다. 인간 SSC에서의 c-Kit의 발현은 이 수용체 및 이의 리간드 SCF가 인간 SSC의 콜로니화 및/또는 재증식에 관여한다는 것을 암시할 것이다. c-Kit 및 SCF가 생식세포 이동, 부착 및 증식의 핵심 조절자라는 것을 입증하는 많은 증거가 존재한다. 또한, 인간 SSC에서의 FGFR3의 높은 발현은 이 수용체의 리간드가 인간 SSC의 증식 및 자가재생에 관여한다는 것을 암시할 것이다. 섬유모세포 성장 인자(FGF) 및 이의 수용체(FGFR)는 초기 배아 및 생식세포 발달을 위한 핵심 신호전달 분자이다. FGF는 마우스 SSC 및 인간 SSC의 생존 및 유지를 촉진하는 것으로 밝혀졌다. 시험관내 연구는 FGF9가 FGFR3에 대한 매우 강력한 리간드라는 것을 보여주었다. 따라서, FGF9 및 SCF를 인간 SSC의 배양 배지에 첨가하는 것은 시험관 내에서의 그들의 생존 및 증식에 유리할 것이다.
또한, 마우스 정소 내에 도입된 인간 세포 하위집단은 그들의 표면 상에서 GPR-125를 발현하였는데, 이것은 이 마커도 재증식하는 인간 SSC 상에서 발현된다는 것을 암시한다. 마우스 정소 절편 및 인간 정소 절편에서의 GPR-125의 발현이 보고되어 있다. 마우스 정소 내의 재증식하는 인간 SSC 하위집단은 다분화능 마커 Nanog에 대해 양성으로 염색된다. 일부 SSC에서의 다분화능 마커 Nanog 및 SSEA-4의 발현은 성인 정소 내의 SSC 하위집단이 다른 세포 계통으로 분화하는 다중분화능을 가질 것임을 암시한다. 마우스 및 인간 정소로부터의 다중분화능 세포주의 발생은 인간 SSC의 다중분화력을 지지하고, 이것은 이들 세포가 생식능력의 회복 이외에 재생 질환에 대해서도 임상적으로 적용될 수 있다는 것을 암시한다. 다른 한편으로, 인간 정소에서의 Nanog의 면역국소화는 미분화된 SSC로 한정되었을 뿐만 아니라 Nanog는 심지어 정세관의 내강 내의 모든 생식세포들에서도 국소화되었다. 이 관찰결과는 성체 영장류 정소와 매우 유사한데, 이것은 진행된 생식세포에서 전사 인자 Nanog의 상이한 역할을 암시한다. Nanog에 대한 이러한 역할의 성질은 아직 확인되어야 하나, 다분화능 마커 Oct-4가 생식세포에 대한 생존 인자이고 그의 하향조절이 분화보다는 아폽토시스 및 세포 사멸을 초래할 것이라는 보고가 있다.
또한, 이식 연구는 정조줄기세포 콜로니화에 대한 인간 정세관과 마우스 정세관 사이의 틈새(niche) 상용성을 입증하였다. 흥미롭게도, 수용자 마우스 정소 내의 SSEA-4+(14%) 세포 및 CD49f+(28%) 세포의 백분율은 인간 정소(SSEA-4의 경우 13%이고 CD49f의 경우 27%임)와 매우 유사하였는데, 이것은 인간 SSC가 그의 천연 환경과 매우 유사한 수준으로 빈 마우스 정소에서 콜로니화되고 재증식하는 능력을 가지므로 마우스 정소가 인간 SSC의 콜로니화에 유리한 환경을 제공한다는 것을 암시한다. 그러나, 한정된 정조세포 증식보다 더 진행된 임의의 발달은 본 연구뿐만 아니라 소, 돼지 영장류 또는 인간 SSC를 사용하는 이전의 연구에서도 발견되지 않았다. 마우스 정소는 고등 동물 종으로부터의 완전한 정자형성을 지지하기에 적합한 환경을 제공할 수 없지만, 그의 정세관의 기저막은 인간 정소와 매우 유사한 방식으로 인간 정조줄기세포를 선택적으로 유인하고 수용하는 능력을 가진다.
요약하건대, 성인 정소 내의 재증식하는 정조줄기세포는 SSEA-4+, CD49f+, CD90+, GPR-125+ 및 c-Kit+의 표현형적 특징을 가진다. 약 3분의 1의 SSC가 Nanog를 발현하는데, 이것은 다분화능 특징을 갖는 정조줄기세포 집단이 성인 정소에 존재한다는 것을 암시한다. 이 결과는 임상적 적용, 배양 증폭 또는 분화 목적으로 정조줄기세포를 성인 정소로부터 단리하고 정제하는 것과 직접적으로 관련되어 있다. 추가로, 인간 SSC 하위집단에서의 다분화능 마커의 발현은 이들 세포가 세포 대체 요법 및 조직 재생을 위한 이들 세포의 잠재적 적용을 암시한다.
실시예 18
인간 남성 생식 조직 및 생식세포의 수집, 가공, 냉동보존 및 보관
연구 대상자들은 참여하는 주요 연구자들의 권고에 기초하여 본 연구에 등록된다. 일단 대상자들이 본 연구를 위한 기준에 적합하다는 것이 확인되면, 대상자는 동의(소수의 경우 찬성) 과정을 완료한다. 대상자는 생식샘 조직의 일부를 제거하는 수술을 받고, 이 조직은 특정 조건 하에서 가공 시설로 운반된다. 조직의 작은 일부를 면역조직화학적 분석을 위해 저장한다. 상기 가공 시설은 기계적 공정 및 효소적 공정을 이용하여 조직으로부터 세포를 단리한다. 세포의 작은 일부를 생존율, 세포 표면 마커 및 미생물 오염에 대해 분석한다. 남은 세포를 냉동 동결하고 액체 질소 증기상 내에 저장한다.
정소 조직을 상이한 조건 하에서 수집한다. 먼저, 미하강된 정소 또는 꼬임을 바로잡기 위한 수술 과정 동안 중량이 약 1 g인 작은 정소 조직 조각을 멸균 조건 하에서 절제한다. 정소암 환자의 경우, 암 성장을 제거하기 위한 수술 과정 동안 보다 큰 정소 조직 조각을 절제한다. 암 환자, 지중해빈혈 또는 겸상혈구빈혈 환자, 또는 줄기세포 이식을 필요로 하는 다른 비악성 조혈 증상을 가진 환자의 경우, 수술을 수행하여 정소 조직의 일부를 절제한다.
수술: 미하강된 정소, 정소꼬임 또는 정계정맥류를 바로잡기 위한 음낭 수술 동안, 15-날 외과용 메스를 이용하여 정소의 백색막(tunica albuginea)의 전방 표면 상에서 약 1 내지 2 mm 길이의 작은 절개를 만든다. 정소를 수동으로 압박(압착)하여 정세관 조직을 배출시킨다. 배출된 조직을 포획하여 튜브 내에 넣고 우편을 통해 상기 가공 시설로 제공되는 온도 조절된 상자 내에 다시 넣는다. 그 다음, 백색막의 작은 절개를 흡수가능한 봉합재로 봉합하여 상기 백색막을 복원시키고 지혈(절개로부터의 임의의 출혈의 조절)을 제공한다. 환자를 수술실로 데려가서 수행하는 일차 절차는 통상적으로 계획된 바와 같이 일어난다. 화학요법 또는 방사선요법에 의해 불임이 된, 원발성 악성물을 갖는 환자의 경우, 코어 바늘 생검 기법을 통한 정소 조직의 경피 수집 또는 다른 절차를 경험한 환자의 경우 상기 절차와 유사한 개방 추출이 보호자 선호에 기초하여 수행된다.
수술 후 추적조사: 환자는 회복실에 있을 때, 그들의 절차 후 10 내지 14일에 1회, 6개월에, 12개월에, 및 그 후 본 연구에 계속 등록되어 있는 동안 해마다 합병증의 징후에 대해 수술 후 추적조사를 받는다. 환자/가족이 등록을 중단할 것을 선택하는 경우, 추적조사는 추적조사에 대한 통상적인 임상적 조치에 기초하여 수행될 것이다. 매년 주기적으로, 환자는 그들이 등록을 계속 유지하거나 평가를 위해 그들 자신의 신체검사를 편안하게 수행할 때까지 진행되는 정소 성장/위축증의 결여에 대해 평가받을 것이다. 보호자 및 환자는 방문할 때마다 정소 자가검사를 수행하는 방법을 배울 것이다. 환자는 추적조사를 위해 되돌아가도록 지시받을 것이고 그들이 생식능력을 회복시키기를 원한다고 결정할 때에 상담을 받을 것이다. 수술 후 초기 합병증인 혈종(출혈)은 회복실 및 수술 후 첫 번째 방문에서 평가될 것이다. 음낭 초음파는 정소 순환 및 크기를 평가하기 위해 6개월째 날 방문에서 수행될 것이다.
가공 실험실로의 운반: 대표자가 조직을 추출하여 가공 시설로 수송한다. 상기 조직을, 2 내지 8℃의 온도를 48시간 동안 유지할 수 있는 미리 검증된 운반기 내부에 넣는다. 상기 조직을 개인 차량을 통해 수송하고 가공 센터에 도착하면 즉시 가공한다.
조직 가공: ISO 클래스 7 클린 룸(Class 7 Clean Room) 환경의 내부에 있는 클래스 II 타입 2A(Class II Type 2A) 생물안전 캐비넷의 내부에서 조직 가공을 수행한다. 상기 조직 가공을 수행하는 데 필요한 모든 물질들을 가공 전에 상기 생물안전 캐비넷 내부에 넣고, 필요한 경우 임의의 추가 품목들을 멸균한다. 보조자는 작업자를 보조하고 상기 생물안전 캐비넷 내부 및 외부로의 물질들의 적절한 통과를 보장한다. 멸균된 가운을 입은 작업자는 상기 생물안전 캐비넷의 외부에 있는 임의의 물질 및 미리 멸균되지 않은 임의의 물질을 만지지 않을 것이다. 먼저, 형태학적 분석을 위해 작은 조직 조각을 절제하고, 상기 생물안전 캐비넷 내부에 있는 저울 상에서 남은 조직의 중량을 측정한다. 남은 절차를 그것 나름대로 수행한다: 25 ㎖의 멸균 PBS + EDTA를 4개의 50 ㎖ 원추형 튜브 각각 내로 피펫팅한다. 멸균 족집게를 이용하여 정소 조직을 PBS + EDTA를 함유하는 튜브 내에 넣고 5초 동안 적신다. 조직 조각을 제1 튜브로부터 제거하고 제2 튜브, 제3 튜브 및 제4 튜브를 사용하여 반복한다. PBS + EDTA로 세척한 후, 상기 조직을 빈 멸균 50 ㎖ 튜브에 넣는다. 2 ㎖의 PBS + EDTA를 상기 조직을 함유하는 상기 튜브 내로 피펫팅한다. 멸균 수술용 가위를 이용하여 상기 조직을 분쇄한다. 일단 정소 조직이 분쇄되면 PBS + EDTA를 사용하여 부피를 10 ㎖까지 채운다. 10 ㎖의 2x 콜라겐분해효소/DNA 분해효소를 피펫팅하고 파라필름으로 단단히 밀봉한다. 상기 튜브를 건조 항온처리기 내에서 20분 동안 항온처리하고 이것이 수행되었을 때 400xg에서 1분 동안 원심분리한다. 파라필름을 제거하고, 튜브의 바닥에 있는 미분해된 정소 조직을 교란시키지 않도록 주의하면서 액체를 제거한다. PBS + EDTA를 사용하여 부피를 10 ㎖까지 채운다. 10 ㎖의 2x 효소 용액을 첨가한다. 덮개를 단단히 밀폐하고 파라필름으로 밀봉한다. 상기 튜브를 진탕 건조 항온처리기 내에 넣고 25분 동안 항온처리한다. 완료되었을 때, 파라필름을 제거하고 2.2 ㎖의 혈청 대체물을 첨가하고 잘 혼합한다. 혼합물을 100 ㎛ 여과기에 통과시켜 새로운 50 ㎖ 튜브 내에 모은다. 실온에서 400xg로 10분 동안 원심분리한다. 상청액을 흡입하고 10 ㎖의 MEM +10%를 첨가하여 균질한 세포 현탁액을 생성한다. 단리된 세포는 세포 카운팅 및 생존율 측정 분석, 유동 분석 및 냉동보존을 위해 준비된 상태이다.
효능, 본질, 순도 및 안정성 분석(동결 전 및 해동 후): 단리된 세포를 카운팅할 것이다. 이 데이터는 표준 조직 가공으로부터 수득될 조직의 중량 당 세포의 공지된 양(세포/g)과 상관관계를 가져야 한다. 상기 데이터가 상관관계를 갖지 않는 경우, 상기 데이터는 조직에서의 문제점 또는 프로토콜로부터의 편차를 암시할 수 있다. 그러면, 동결을 위한 준비에서 세포를 적절한 농도, 즉 동결 배지 1 ㎖ 당 3 내지 5 x 106개 세포의 농도로 조절한다.
생존가능한 세포의 백분율을 측정하기 위해 단리된 세포를 시험한다. 이것은 하기 2종의 생존율 분석에 의해 카운팅 과정 동안 수행될 것이다: 트립판 블루 염료 배제 생존율 분석 및 7AAD 유세포분석.
7AAD 유세포분석의 경우, 단일클론/다중클론 항체를 사용한 단일 색채 또는 다중 색채 염색을 위해 세포를 준비한다. 필요한 경우, 이차 항체 염색을 완료한다. 마지막 세척 단계 후, 세포를 1 ㎖(1000만개 세포의 경우)의 분석용 완충제에 재현탁시킨다. 7AAD 원액을 최종 농도(1 ㎍)로 각각의 튜브에 첨가하고 10분 동안 항온처리한다. 이 용액 중의 샘플을 유세포분석기 상에서 분석할 때까지 광으로부터 보호하면서 4℃에서 보존한다. 생존율이 20% 미만인 샘플은 제약사 의사와 상담한 후에만 냉동 동결될 것이다.
세포의 건강, 품질, 크기 및 일반적인 외관을 확인하기 위한 형태학적 분석을 위해 위상차 현미경 하에서 세포를 평가한다. 단일 세포로의 조직의 분해 효율 및 세포 덩어리의 존재도 분석한다. 위상차 하에서 건강한 세포는 밝고 둥근 구조를 유지하고 어둡거나 단편화된 상태로 보이지 않는다. 핵 및 세포질을 포함하는 세포내 구조체에 대한 보다 상세한 정보는 호프만(Hoffmann) 또는 노르마르스키(Normarski) 현미경에 의해 수득될 수 있다. 이들 현미경 하에서 생식세포는 큰 핵 대 세포질 비, 1 내지 3개의 핵소체 및 세포질 봉입체를 가지면서 둥글게 보인다. 세르톨리 세포는 크고 불규칙적인 형태를 가지는 반면, 레이디히 세포는 그들의 세포질 내에 작은 소포체와 유사한 다수의 액체 소적을 가진다.
유세포분석 마커: 정자: X 염색체가 Y 염색체보다 더 크다. 형광 DNA 염료(헥스트 33342)를 정자에 적용하고 20분 동안 항온처리한다. 유세포분석기는 정자의 상대적인 밝기(XX가 XY보다 더 밝음)에 기초하여 정자를 분리한다.
생식세포주: 인간 및 영장류 SSEA-4, CD49f, CD114, CD90, GFR-α 및 Rat, 및 마우스 CD49f, SSEA-1 및 GFR-α.
레이디히 세포: 이들 세포는 특이적 마커를 결여하지만, 본 발명자들이 사용한 마커는 황체형성 호르몬 수용체(LHR)이다.
염색 프로토콜: 세포를 염색 배지 1 ㎖ 당 5 내지 10 x 106개 세포의 농도로 현탁시킨다. FBS, 및/또는 Fc 수용체에 대한 특이적 항체를 사용하여 차단을 수행한다. 일차 항체를 100만개의 세포 당 1 ㎍의 최종 농도로 첨가한다. 암실에서 얼음 상에서 30분 동안 항온처리한다. 세척한다. 2차 항체를 100만개의 세포 당 0.5 ㎍의 농도로 첨가한다(필요한 경우). 암실에서 얼음 상에서 30분 동안 항온처리한다. 세척한다. 염색 배지 1 ㎖ 당 5 내지 10 x 106개 세포의 농도로 현탁시킨다. 분석할 때까지 암실에서 얼음 상에서 보존한다.
면역조직화학적 마커: 생식세포 면역조직화학적 마커는 VASA를 포함하나 이로 한정되지 않는다. 정조줄기세포 마커에 대한 파라핀 또는 동결된 절편 염색을 위한 다른 IHC 마커는 SSEA-4 및 CD49f이고 생식세포 마커의 경우 VASA, c-Kit, GFR-α 및 PLZF이다. 이들 마커는 상이한 종류의 생식세포들의 존재 및 생식능력을 회복시키는 상기 세포들의 잠재력을 평가하기 위한 분석에서 사용된다.
동결된 조직 절편에 대한 형광 염색 프로토콜: 수퍼 PAP 펜을 이용하여 조직 절편 주변에 명확한 경계를 그린다. 조직 절편을 PBS로 2회 세척하여 OCT를 제거한다. 실온에서 PBS 중의 5% 염소 또는 양 혈청 + 1% BSA + 0.1% 트리톤-X를 사용하여 1시간 동안 차단한다(차단 용액은 3일 이내에 제조되어 4℃에서 저장되어야 함). 트리톤-X가 없는 동일한 차단 용액이 표면 마커를 위해 사용될 수 있다. 4℃에서 1% BSA 중의 일차 항체와 함께 밤새 항온처리한다. 절편을 PBS로 5분 동안 3회 세척한다. 실온에서 PBS 중의 1% BSA 중의 이차 항체와 함께 1시간 동안 항온처리한다. 이차 항체를 제거한다. 핵 염색제[헥스트(1:5000), DAPI(1:5000), 토프로(ToPro)-3(1:200)]를 사용하여 염색한다. 절편을 PBS로 5분 동안 3회 세척한다.
분자생물학 마커: 생식세포 분자 마커는 VASA를 포함하나 이로 한정되지 않는다. RT-PCR, 실시간 PCR 또는 다중 PCR을 위한 다른 유전자 발현 마커는 정조생식세포 마커(SSEA-4 및 CD49f) 및 생식세포 마커(VASA, c-Kit, GFR-α 및 PLZF)이다. 이들 마커는 상이한 종류의 생식세포들의 존재 및 생식능력을 회복시키는 상기 세포들의 잠재력을 평가하기 위한 분석에서 사용된다.
HLA A/B/DR 유형분류 및 ABO/Rh 유형분류: ABO/Rh 유형분류를 수행하여 환자의 신원을 확인한다. DNA 기초 방법을 이용하여 HLA 유형분류를 수행하여 환자의 신원을 확인한다. 채혈된 혈액을 함유하는 1개의 튜브를 HLA 유형분류를 위해 ASHI 승인된 실험실로 보낸다. 유사하게, 채혈된 혈액을 함유하는 1개의 튜브를 ABO/Rh 유형분류를 위해 CLIA 승인된 실험실로 보낸다. 상기 튜브들은 프로토콜에 따라 가공 시설로부터 보내진다.
안전성을 보장하기 위해 하기와 같이 감염성 질환 시험을 수행할 것이다: 혈청학적 시험: HIV-1/2, HTLV-I/II, HCV, HBsAg, HBc, 매독, CMV, 샤가스(Chagas)병; NAT: HIV, HCV 및 WNV. 채혈된 혈액을 함유하는 1개의 튜브를 감염성 질환 시험; 진균, 호기성 및 혐기성 박테리아 배양 시험; 및 종분화 및 항생제 감수성 시험(배양물이 양성을 나타내는 경우)을 위해 CLIA 승인된 실험실로 보낼 것이고, 안전성을 보장하기 위해 미생물 배양이 수행될 것이다. 배양물이 양성을 나타내는 경우, 환자가 이식시에 적절한 항생제 치료를 받을 수 있도록 종분화 및 감수성 시험이 수행될 것이다.
냉동보존: 조직 가공으로부터 단리된 세포를, 생식세포의 냉동보존을 위해 고안된 임상적 등급의 냉동보호제를 함유하는 특수 배지에 현탁시킨다. 그 다음, 조절된 속도 동결기를 이용하여 세포를 +4℃부터 -60℃까지 -1℃/분의 속도로 서서히 동결하고 -60℃부터 -90℃까지 -10℃/분의 속도로 서서히 동결한다. 그 다음, 세포를 -150 내지 -196℃의 일시적 격리 저장 액체 질소 증기상에 넣는다.
격리 저장: 냉동보존된 생성물을 -150 내지 -196℃의 일시적 격리 액체 질소 탱크의 증기상 내에 저장한다. 생성물이 종양 세포, 호기성 박테리아, 혐기성 박테리아 또는 진균에 의해 오염되거나 HIV-1/2, HTLV-I/II, HCV, HBsAG, HBc 또는 WNV에 반응하는 경우, 오염된 생성물을 영구적 격리 액체 질소 탱크의 증기상으로 옮긴다. 일시적 격리 탱크 내의 모든 생성물들이 오염되지 않은 경우, 상기 일시적 격리 탱크를 영구적 저장 탱크로 상태 변화시킨다.
영구적 저장: 미생물에 의해 오염되어 있지 않고 HIV-1/2, HTLV-I/II, HCV, HBsAG, HBc 및 WNV에 반응하지 않는 생성물을 -150 내지 -196℃의 영구적 저장 액체 질소 동결기의 증기상 내에 저장한다.
종양 세포, 호기성 박테리아, 혐기성 박테리아 또는 진균에 의해 오염되거나 HIV-1/2, HTLV-I/II, HCV, HBsAG, HBc 및 WNV에 반응하는 것으로 확인된 생성물은 -150 내지 -196℃의 영구적 격리 액체 질소 탱크의 증기상 내에 영구적으로 저장한다. 간염 및 HIV 시험을 위해 등록자들을 연구하기 위해서는 동의가 요구될 것이다. 임의의 양성 결과는 동의된 단체에 공개될 것이고 적절한 상담을 위한 조회 및 치료가 제공될 것이다.
연구 결과는 가공 및 냉동보존 동안 세포의 손실 및 생존율의 측정(해동 후와 동결 전의 비교); 냉동 저장시 생성물 안정성의 측정(동결 후 상이한 시점들에서 해동 후 분석); 다양한 조치에 대한 불임율의 측정; 수술적 수집 절차에 대한 불리한 반응 또는 합병증 발생율의 측정; 해동 후 세포의 생존율에 대한 대상자 연령의 영향의 측정; 및 해동 후 생존율에 대한 효율적인 냉동보존 프로토콜의 영향의 측정을 포함할 것이다.
프로토콜 중단 규정: 수술적 수집 절차로부터 직접적으로 발생된 임의의 사망 또는 심각한 불리한 반응이 존재하는 경우 시험을 위한 환자의 증원이 중단되고 IRB에 의해 검토될 것이다. IRB가 시험을 재개시하는 것이 타당하다고 간주하는 경우에만 환자의 증원이 재개될 것이다.
실시예 19
인간 여성 생식 조직 및 생식세포의 수집, 가공, 냉동보존 및 보관
환자 등록: 연구 대상자들은 참여하는 주요 연구자들의 권고에 기초하여 본 연구에 등록될 것이다. 일단 대상자가 본 연구를 위한 기준에 적합하다는 것이 확인되면, 대상자는 동의(소수의 경우 찬성) 과정을 완료한다.
수술 및 난소 조직 수집: 난소 조직을 상이한 조건 하에서 수집한다. 수술 과정 동안 중량이 약 1 내지 2 g인 작은 난소 피질 조직 조각을 멸균 조건 하에서 절제한다. 난소절제술 또는 난소자궁적출술이 요구되는 경우, 예컨대, 난소 낭종 환자의 경우, 암 성장 또는 전체 난소를 절제하거나 양쪽 난소 둘다를 절제하기 위한 수술 과정 동안 보다 큰 난소 조직 조각을 절제한다. 암 환자, 지중해빈혈 또는 겸상혈구빈혈 환자, 또는 줄기세포 이식을 필요로 하는 다른 비악성 조혈 증상을 가진 환자의 경우, 대기 수술을 수행하여 난소 조직의 일부 또는 난소를 제거한다.
가공 실험실로의 운반: 대표자가 조직을 추출하여 가공 시설로 수송한다. 상기 조직을, 2 내지 8℃의 온도를 48시간 동안 유지할 수 있는 미리 검증된 운반기 내부에 넣을 것이다.
조직 가공: 일단 조직이 가공 시설에 도착하면, 상기 조직을 멸균 조건 하에서 ISO 클래스 7 클린 룸 환경의 내부에 있는 클래스 II 타입 2A 생물안전 캐비넷의 내부에서 기계적으로 및 효소적으로 분해한다. 먼저, 운반 배지를 페트리 접시로 옮기고 부유하는 여포 및 난자를 양안 현미경 하에서 수집한다. 난소 조직 동결을 위해, 난소의 피질을 작은 얇은 조각으로 자르고 냉동보존을 위해 준비한다. 해부하고 작은 여포 및 세포를 단리하기 위해, 난소를 작은 조각으로 절단하고 효소적으로 분해한다. 그 다음, 단리된 세포 및 여포를 냉동보존을 위해 추가로 가공한다. 상기 조직 가공을 수행하는 데 필요한 모든 물질들을 가공 전에 상기 생물안전 캐비넷 내부에 넣고, 필요한 경우 임의의 추가 품목들을 멸균한다. 멸균된 가운을 입은 작업자는 상기 생물안전 캐비넷의 외부에 있는 임의의 물질 및 미리 멸균되지 않은 임의의 물질을 만지지 않는다. 보조자는 작업자를 보조하고 상기 생물안전 캐비넷 내부 및 외부로의 물질들의 적절한 통과를 보장한다.
효능, 본질, 순도 및 안정성 분석(동결 전 및 해동 후): 단리된 세포를 카운팅한다. 이 데이터는 조직 가공으로부터 수득되는 조직의 중량 당 세포의 공지된 양과 상관관계를 가져야 한다.
안정성은 가공 후 난소 세포의 특징규명이다. 안정성은 생존율 및 형태학적 분석을 포함한다. 약 50만개 미만의 세포를 시험에 사용하고 10년 동안 1년에 1회씩 재분석한다.
생존가능한 세포의 백분율을 측정하기 위해 단리된 세포를 시험한다. 이것은 하기 2종의 생존율 분석에 의해 카운팅 과정 동안 수행된다: 트립판 블루 염료 배제 생존율 분석(생존율이 50% 미만인 샘플은 제약사 의사와의 상담 후에만 냉동 동결됨) 및 7AAD 유세포분석(생존율이 20% 미만인 샘플은 제약사 의사와의 상담 후에만 냉동 동결됨).
세포의 건강, 품질, 크기 및 일반적인 외관을 확인하기 위한 형태학적 분석을 위해 위상차 현미경 하에서 세포를 평가한다. 단일 세포로의 조직의 분해 효율 및 세포 덩어리의 존재도 분석한다. 위상차 하에서 건강한 세포는 밝고 둥근 구조를 유지하고 어둡거나 단편화된 상태로 보이지 않는다. 핵 및 세포질을 포함하는 세포내 구조체에 대한 보다 상세한 정보는 호프만 또는 노르마르스키 현미경에 의해 수득될 수 있다. 가능한 느슨하고 부유하는 난모세포의 존재는 양안 현미경 하에서 관찰될 수 있다. 난모세포는 둥글고 큰 세포이고 그들의 핵 성숙 단계에 따라 핵 소포체(GV)를 가질 수 있거나 1개의 극체(polar body)(MI) 또는 2개의 극체(MII)를 동반할 수 있다. 형태학적으로 난소로부터 해부될 수 있는 다른 구조체는 원시 여포부터 다양한 크기의 공동(antral) 여포까지 상이한 발달 단계에 있는 여포이다. 여포는 중앙에서 난모세포를 함유하고 그의 주변에서 하나 또는 여러 층의 과립층세포 및 포막세포를 함유한다. 원시 여포 및 일차 여포의 크기는 200 내지 500 ㎛로 다양하고, 공동 여포의 크기는 수 밀리미터일 수 있고, 그라피안(graffian) 여포는 2 내지 3 ㎝일 수 있다. 여포는 난소 내에 묻혀 있고 난소에 단단히 부착되어 있기 때문에, 기계적 또는 효소적 분리를 이용하지 않고 여포를 발견할 가능성은 매우 낮다.
세포의 건강, 품질, 크기 및 특이적 특징을 확인하기 위해 세포를 염색하고 벤치탑 유세포분석기로 평가할 것이다. 생식세포 유동 마커는 VASA, Oct-4, c-Kit 및 SSEA-4를 포함하나 이들로 한정되지 않는다.
난모세포 IHC 마커는 GDF9, ZP1, ZP4 및 Scp3을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 피질 과립 IHC 마커는 PNA를 포함하나 이로 한정되지 않는다. 이들 마커의 조합물을 잠재적인 생식세포를 포함하는 상이한 종류의 난소 세포들의 존재 및 생식능력을 회복시키는 상기 세포들의 잠재력을 평가하기 위한 분석에서 사용된다.
생식세포 분자 마커는 VASA, Oct-4, c-Kit 및 SSEA-4를 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 난모세포 분자 마커는 BicD1, GDF9, ZP1, ZP4, Ybx2 및 Scp3을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 피질 과립 분자 마커는 PNA를 포함하나 이로 한정되지 않는다. 이들 마커의 조합물은 잠재적인 생식세포를 포함하는 상이한 종류의 난소 세포들의 존재 및 생식능력을 회복시키는 상기 세포들의 잠재력을 평가하기 위한 분석에서 사용된다.
ABO/Rh 유형분류를 수행하여 환자의 신원을 확인할 것이다. DNA 기초 방법을 이용하여 HLA 유형분류를 수행하여 환자의 신원을 확인한다. 조직 수집시 채혈된 혈액 샘플을, 승인된 실험실의 프로토콜에 따른 HLA 유형분류를 위해 ASHI 승인된 실험실로 보내고 승인된 실험실의 프로토콜에 따른 ABO/Rh 유형분류를 위해 CLIA 승인된 실험실로 보낸다.
안전성을 보장하기 위해 감염성 질환 시험을 수행할 것이다. HIV-1/2, HTLV-I/II, HCV, HBsAg, HBc, 매독, CMV, NAT, HIV, HCV 및 WNV에 대한 혈청학적 시험을 위해, 조직 수집시 채혈된 혈액 샘플을 승인된 실험실의 프로토콜에 따른 시험을 위해 CLIA 승인된 실험실로 보낸다. 진균, 호기성 및 혐기성 박테리아 배양 시험; 및 종분화 및 항생제 감수성 시험(배양물이 양성을 나타내는 경우)을 수행하여 안전성을 보장한다. 배양물이 양성을 나타내는 경우, 난소 조직 또는 세포의 임의의 장래 자가이식 전에 종분화 및 감수성 시험을 수행하여 임의의 미생물을 박멸한다.
냉동보존: 조직 가공으로부터 단리된 세포를, 난소 세포 및 난소 조직의 냉동보존을 위해 고안된 냉동보호제를 함유하는 특수 배지에 현탁시킨다. 그 다음, 조절된 속도 동결기를 이용하여 세포를 +4℃부터 -60℃까지 -1℃/분의 속도로 서서히 동결하고, -60℃부터 -90℃까지의 동결 속도는 -10℃/분일 것이다. 보다 큰 세포, 여포 및 난소 조직 스트립의 경우, 다른 냉동보존 방법, 예컨대, 유리체화를 이용한다. 그 다음, 세포를 -150 내지 -196℃의 격리 저장 액체 질소 증기상 내에 넣는다.
격리 저장: 냉동보존된 생성물을 -150 내지 -196℃의 일시적 격리 액체 질소 탱크 내에 저장한다. 생성물이 종양 세포, 호기성 박테리아, 혐기성 박테리아 또는 진균에 의해 오염되거나 HIV-1/2, HTLV-I/II, HCV, HBsAG, HBc 또는 WNV에 반응하는 경우, 오염된 생성물을 영구적 격리 액체 질소 탱크의 증기상으로 옮긴다. 일시적 격리 탱크 내의 모든 생성물들이 오염되지 않은 경우, 상기 일시적 격리 탱크를 -150 내지 -196℃의 영구적 저장 탱크로 상태 변화시킨다.
영구적 저장: 호기성 박테리아, 혐기성 박테리아 및 진균에 의해 오염되어 있지 않고 HIV-1/2, HTLV-I/II, HCV, HBsAG, HBc 및 WNV에 반응하지 않는 생성물을 -150 내지 -196℃의 영구적 저장 액체 질소 동결기 탱그의 증기상 내에 저장한다.
종양 세포, 호기성 박테리아, 혐기성 박테리아 또는 진균에 의해 오염되거나 HIV-1/2, HTLV-I/II, HCV, HBsAG, HBc 및 WNV에 반응하는 것으로 확인된 생성물은 -150 내지 -196℃의 영구적 격리 액체 질소 탱크의 증기상 내에 영구적으로 저장한다. 간염 및 HIV 시험을 위해 등록자들을 연구하기 위해서는 동의가 요구된다. 임의의 양성 결과는 동의된 단체에 공개되고 적절한 상담을 위한 조회 및 치료가 제공된다.
연구 결과는 가공 및 냉동보존 동안 세포의 손실 및 생존율의 측정(해동 후와 동결 전의 비교); 냉동 저장시 생성물 안정성의 측정(동결 후 상이한 시점들에서 해동 후 분석); 다양한 조치에 대한 불임율의 측정; 수술적 수집 절차에 대한 불리한 반응 또는 합병증 발생율의 측정; 해동 후 세포의 생존율에 대한 대상자 연령의 영향의 측정; 및 해동 후 생존율에 대한 효율적인 냉동보존 프로토콜의 영향의 측정을 포함할 것이다.
프로토콜 중단 규정: 수술적 수집 절차로부터 직접적으로 발생된 임의의 사망 또는 심각한 불리한 반응이 존재하는 경우 시험을 위한 환자의 증원이 중단되고 IRB에 의해 검토될 것이다. IRB가 시험을 재개시하는 것이 타당하다고 간주하는 경우에만 환자의 증원이 재개될 것이다.
달리 명시되지 않은 한, 본 명세서 및 특허청구범위에서 사용된 성분의 양, 성질, 예컨대, 분자량, 반응 조건 등을 표현하는 모든 수치는 모든 경우에서 용어 "약"에 의해 수식되는 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 반대로 명시되어 있지 않은 한, 본 명세서 및 첨부된 특허청구범위에 기재된 수치적 파라미터는 본 발명에 의해 수득되고자 하는 원하는 성질에 따라 달라질 수 있는 근사치이다. 가능한 한, 각각의 수치적 파라미터는 특허청구범위에 대한 균등론의 적용을 한정하기 위한 시도로서 해석되어서는 안 되고 적어도 통상의 반올림 기법을 적용함으로써 기재된 유의한 숫자의 수치에 비추어 해석되어야 한다. 본 발명의 넓은 범위를 기재하는 수치적 범위 및 파라미터가 근사치임에도 불구하고, 특정 실시예에 기재된 수치적 값은 가능한 정확하게 기재되어 있다. 그러나, 임의의 수치적 값은 각각의 시험 측정에서 발견된 표준 편차로부터 필요적으로 발생되는 일부 오차를 본질적으로 함유한다.
본원에 달리 명시되어 있거나 내용에 의해 명확히 모순되지 않는 한, 본 발명을 기술하는 내용(특히, 하기 특허청구범위의 내용)에서 사용된 단수형 관사 및 유사한 관사는 단수형 및 복수형 둘다를 커버하는 것으로 해석되어야 한다. 본원에서 값의 범위에 대한 언급은 단지 상기 범위 내에 포함되는 각각의 별도의 값을 개별적으로 언급하는 속기 방법으로서 사용되기 위한 것이다. 본원에 달리 명시되어 있지 않은 한, 각각의 개별 값은 그것이 본원에 개별적으로 언급되는 것처럼 본 명세서 내로 도입된다. 본원에 달리 명시되어 있거나 내용에 의해 명확히 모순되지 않는 한, 본원에 기재된 모든 방법들은 임의의 적합한 순서로 수행될 수 있다. 본원에 제공된 임의의 모든 예 또는 예시적 표현(예를 들면, "예컨대")의 사용은 단지 본 발명을 더 잘 설명하기 위한 것이고 청구된 본 발명의 범위에 대한 한정을 부가하지 않는다. 본 명세서에서 어떠한 표현도 본 발명의 실시에 필수적인 임의의 청구되지 않은 구성요소를 표시하는 것으로서 간주되어서는 안 된다.
본원에 개시된 본 발명의 대안적 구성요소 또는 실시양태의 분류는 한정으로서 해석되어서는 안 된다. 각각의 군 구성원은 개별적으로, 또는 그 군의 다른 구성원 또는 본원에서 발견된 다른 구성요소와의 임의의 조합으로 언급되고 청구될 수 있다. 한 군의 하나 이상의 구성원은 편리함 및/또는 특허성의 이유로 한 군에 포함될 수 있거나 한 군으로부터 삭제될 수 있다는 것이 예상된다. 임의의 이러한 포함 또는 삭제가 일어나는 경우, 본 명세서는 변형된 군을 함유함으로써 첨부된 특허청구범위에서 사용된 모든 마쿠시 군의 기재된 설명을 충족시키는 것으로 간주된다.
본 발명을 실시하기 위해 본 발명자들에게 공지된 최적 방식을 포함하는 본 발명의 일부 실시양태가 본원에 기재되어 있다. 물론, 이들 실시양태에 대한 변경이 상기 설명을 읽었을 때 당업계에서 통상의 기술을 가진 자에게 자명할 것이다. 본 발명자들은 당업자가 적절한 경우 그러한 변경을 이용할 것임을 예상하고, 본 발명자들은 본 발명이 본원에 구체적으로 기재된 것과 다른 방식으로 실시될 수 있다고 생각한다. 따라서, 본 발명은 적용가능한 법에 의해 허용되는 바와 같이 본원에 첨부된 특허청구범위에서 인용된 보호대상의 모든 변형 및 등가물을 포함한다. 나아가, 본원에 달리 명시되어 있거나 내용에 의해 명확히 모순되지 않는 한, 전술된 구성요소들과 이들의 모든 가능한 변경의 임의의 조합이 본 발명에 포함된다.
더욱이, 본 명세서 전체에서 특허 및 인쇄된 공개문헌이 다수 언급된다. 상기 언급된 참조문헌 및 인쇄된 공개문헌 각각은 온전히 그대로 본원에 참고로 개별적으로 도입되어 있다.
본원에 개시된 특정 실시양태는 "구성된" 또는 "본질적으로 구성된"이라는 표현의 사용에 의해 특허청구범위에서 더 한정될 수 있다. 전이 용어 "구성된"은 출원시 존재하든 아니면 보정에 의해 부가되든 관계없이 특허청구범위에서 사용될 때 특허청구범위에서 특정되어 있지 않은 임의의 구성요소, 단계 또는 성분을 배제한다. 전이 용어 "본질적으로 구성된"은 특허청구범위를 특정된 물질 또는 단계, 및 기본 및 신규 특징(들)에 물질적으로 영향을 미치지 않는 물질 또는 단계로 한정한다. 특허청구된 본 발명의 실시양태는 본원에 본질적으로 또는 명시적으로 기재되어 있고 실시될 수 있다.
마지막으로, 본원에 개시된 본 발명의 실시양태는 본 발명의 원리를 설명하는 것으로 이해되어야 한다. 이용될 수 있는 다른 변형은 본 발명의 범위 내에 있다. 따라서, 한정이 아니라 예로서 본 발명의 대안적 구성이 본원의 교시에 따라 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 도시되고 기재된 것으로 정확히 한정되지 않는다.
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Claims (16)

  1. 생식능력의 상실 위험에 있는 포유동물로부터 생식샘 조직을 수집하는 단계;
    상기 생식샘 조직을 중앙 보관 시설로 수송하는 단계;
    상기 생식샘 조직을 가공하는 단계;
    상기 생식샘 조직을 냉동보존하는 단계; 및
    상기 냉동보존된 생식샘 조직의 생식력을 측정하는 단계
    를 포함하는, 생식줄기세포를 보관하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 생식샘 조직이 정소 조직인 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 정소 조직의 가공이 정소 조직의 약 0.5 내지 2.0 ㎟ 조각을 제조하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  4. 제2항에 있어서, 상기 정소 조직의 가공이
    상기 정소 조직을 콜라겐분해효소(collagenase), DNA 분해효소(DNase), 히알루론산분해효소(hyaluronidase) 및 트립신(trypsin)으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 효소로 분해하는 단계; 및
    상기 하나 이상의 효소를 불활성화시켜 분리된 정소 세포의 현탁액을 수득하는 단계
    를 포함하는 것인 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 분리된 정소 세포로부터 수컷 생식줄기세포를 단리하는 단계를 추가로 포함하고, 이때 상기 수컷 생식줄기세포가 황체형성 호르몬 수용체를 발현하지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제4항에 있어서, 상기 분리된 정소 세포로부터 수컷 생식줄기세포를 단리하는 단계를 추가로 포함하고, 이때 상기 수컷 생식줄기세포가 SSEA-4를 발현하는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 수컷 생식줄기세포가 GFR-α1 및 VASA를 추가로 발현하는 것인 방법.
  8. 제2항에 있어서, 상기 생식력을 측정하는 단계가 시험관 내에서 성숙 정자로 분화하는 상기 정소 조직의 능력에 의해 수행되는 것인 방법.
  9. 제2항에 있어서, 상기 생식력을 측정하는 단계가 정소 세포의 특징을 감수분열 마커 및 감수분열후 마커의 발현, 크기 및 형태 중 하나 이상으로 측정하는 단계인 방법.
  10. 제1항에 있어서, 상기 생식샘 조직이 난소 조직인 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 난소 조직의 가공이 난소 조직의 약 0.5 내지 3.0 ㎟ 조각을 제조하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 가공이
    상기 난소 조직 조각을 콜라겐분해효소, DNA 분해효소, 히알루론산분해효소 및 트립신으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 효소로 분해하는 단계; 및
    상기 하나 이상의 효소를 불활성화시켜 분리된 난소 세포의 현탁액을 수득하는 단계
    를 추가로 포함하는 것인 방법.
  13. 제10항에 있어서, 상기 생식력을 측정하는 단계가 시험관 내에서 성숙 난자로 분화하는 상기 난소 조직의 능력에 의해 수행되는 것인 방법.
  14. 제10항에 있어서, 상기 생식력을 측정하는 단계가 난소 세포의 특징을 감수분열 마커 및 감수분열후 마커의 발현, 크기 및 형태 중 하나 이상으로 측정하는 단계인 방법.
  15. 제1항에 있어서, 상기 냉동보존된 생식샘 조직을 이 생식샘 조직이 단리된 동일한 개체 내의 잔류 생식샘 조직 내로 이식하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  16. 생식샘 조직을 수집하는 수단;
    생식샘 조직을 수송하는 수단;
    생식샘 조직을 가공하여 생식줄기세포를 단리하는 수단;
    생식샘 조직 또는 상기 생식줄기세포를 냉동보존하는 수단;
    냉동보존된 생식샘 조직 또는 상기 냉동보존된 생식줄기세포의 생식력을 측정하는 수단
    을 포함하는 생식줄기세포 보관 시스템.
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