MX2012005297A

MX2012005297A - Sistema de banco de celulas madre de linea germinal.

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Publication number: MX2012005297A
Application number: MX2012005297A
Authority: MX
Inventors: Jason Pacchiarotti; Chad Maki; Fariborz Izadyar; Constance Yuen; Joel Marh; Thomas Ramos; Kyle Howerton; Jadelind Wong; Marnie Olmstead; Johnny Yung-Chiong Chon
Original assignee: Primegen Biotech Llc Dba Reprocyte
Priority date: 2009-11-05
Filing date: 2010-11-05
Publication date: 2013-02-26
Also published as: CA2779726A1; CA2779726C; BR112012010675A2; JP2013514760A; KR20130028041A; AU2010314989A1; CA2779701A1; EP2496939A1; MX2012005298A; AU2010314984B2; AU2010314984A1; EP2496939B1; CN102713614A; JP2013514969A; CN103154730A; AU2010314989B2; US9657267B2; IL219601A; BR112012010750A2; MX344716B

Abstract

Se proporcionan métodos y sistemas para el aislamiento, caracterización, crio-conservación y banco de células madre de línea germinal humanas y tejido gonadal. También se describen métodos para el trasplante de las células crio-conservadas para volver a poblar un órgano reproductor estéril.

Description

SISTEMA DE BANCO DE CÉLULAS MADRE DE LÍNEA GERMINAL Referencia Cruzada con Solicitudes Relacionadas La presente solicitud reclama el beneficio Bajo el Título 35 § 119(e) del Código de los Estados Unidos de América sobre la Solicitud Provisional de Patente Norteamericana No. 61/258,535 presentada el 5 de noviembre de 2009, cuyo contenido total está incorporado a la presente descripción como referencia.

Campo de la Invención La presente invención se refiere a un sistema de banco de células madre de la línea germinal de pacientes en riesgo de infertilidad debido al daño en sus células madre de la línea germinal y la restauración de la fertilidad en los pacientes en un uso posterior. Específicamente, la presente invención se refiere a la recolección y aislamiento de células madre de la línea germinal, procesamiento y crioconservación y determinación de capacidad reproductiva de las células. También se describen métodos para restaurar la fertilidad en pacientes de los cuales fueron aisladas las células madre de la línea germinal.

Antecedentes de la Invención Las células madre de la línea germinal residen en los órganos reproductivos, es decir, los ovarios y testículos, y representan potencialmente una de las clases de células madres más importantes y protegidas en el cuerpo del mamífero. La conservación genética y la actividad alta de telomerasa ha sido reportada en las células madre derivadas de estos tejidos, así como, la modificación extensa de ADN con modificaciones del cromosoma de cromatina. Los científicos han diferido acerca de que tipo de células madres son residentes en los tejidos reproductivos de los adultos, así como de su potencialidad y la diferenciación.

Los tratamientos de quimioterapia y radiación no solamente tienen como objetivo las células cancerosas, sino también dividen rápidamente las células. En los testículos, las células germinales que se dividen rápidamente son altamente sensibles a estas exposiciones. En los testículos prepubertos, las células madre de la línea germinal son sensibles de una manera similar y son agotadas de una manera dependiente de la dosis de manera exacta después de la exposición de radiación. Las dosis bajas de fármacos citotóxicos o irradiación agotan la espermatogonia de diferenciación mientras que pueden sobrevivir las células madre de la espermatogonia menos sensibles así como los espermatocitos y espermátidos. Las células germinales de diferenciación pueden continuar su maduración en las células del esperma y pueden volver a colonizar los túbulos seminíferos con células madre las cuales son generadas de la población de células madre sobrevivientes.

Sin embargo, en casos de un agotamiento severo, la espermatogénesis solamente puede ser restaurada en muy pocos túbulos seminíferos limitando de esta manera la fertilidad. Los pacientes serán permanentemente no fértiles después del agotamiento completo de las células madre testiculares. El impacto en la espermatogénesis se manifiesta el mismo de la manera más exacta en, o antes, en el momento de la pubertad debido a que la esperma no puede ser contenida generalmente y crioconservada como en los hombres prepubertos. Aún cuando unas pocas células madre puedan recolonizar los túbulos seminíferos si se les da tiempo suficiente para reiniciar la espermatogénesis.

Hasta recientemente, se consideraba que las gónadas femeninas de la mayor parte de especies de mamíferos, incluyendo los humanos, alojan un número finito de células germinales detenidas meioticamente (oocitos) adjuntas dentro de folículos primordiales que sirven como la pila de almacenamiento de los huevos liberados en la ovulación durante cada ciclo menstrual. Los números de oocitos disminuyen en toda la vida postnatal, a través de mecanismos que comprenden apoptosis, lo cual se consideró de manera amplia que eventualmente dejaban los ovarios desprovistos de células germinales. En los humanos, el agotamiento del oocito de la reserva de oocitos generalmente ocurre durante la quinta década de la vida, conduciendo a la menopausia.

De acuerdo con esta doctrina básica de la biología reproductiva, se consideró adicionalmente que una vez agotadas, el conjunto de células germinales del ovario no podían ser reabastecidas. Por lo tanto, cualquier tratamiento que acelera la pérdida de los oocitos amenaza con disminuir la fertilidad y ocasionará la menopausia en una edad más temprana que la esperada. Por ejemplo, la exposición de la mujer a un amplio de espectros que dañan los ovarios, tales como agentes quimioterapéuticos y radioterapias, generalmente conducen a la menopausia prematura y la esterilidad irreversible. En la actualidad, las opciones terapéuticas limitadas para conservar la fertilidad y la función normal de los ovarios bajo varias condiciones adversas son invasivas, tales como, por ejemplo, la crioconservación de los fragmentos de tejido del ovario o los oocitos simples, y con frecuencia requieren una terapia hormonal anterior la cual puede ser médicamente inapropiada para muchas mujeres con tumores que responden a las hormonas. Además, actualmente no existen opciones terapéuticas para posponer la falla normal de los ovarios en la menopausia.

Dos métodos principales han sido identificados para la restauración de las células germinales tanto en hombres como en mujeres. El primero es el injerto de tejido inmaduro (ya sea en ovarios o testículos) fragmentos de tejido en el tejido sobreviviente y el segundo está basado en el aislamiento y trasplante de células madre.

El trasplante de células germinales ha sido desarrollado en modelos de animales roedores. La microinyección de células germinales de los ratones o especies relacionadas cercanamente en los túbulos seminíferos de un ratón re-estimularon la espermatogénesis de las células madre de la espermatogenia de donador. Las células de la espermatogenia pueden ser crioconservadas o cultivadas antes de transferirlas. El tejido cortical de los ovarios crioconservados de un modo similar ha sido trasplantado en ovejas y humanos con la reasunción resultante del estro y el nacimiento de crías vivas después del apareamiento normal.

Por lo tanto, un sistema de banco de células de la línea germinal se necesita en los humanos para restaurar el potencial reproductivo en pacientes sin la capacidad de guardar en un banco el esperma o los óvulos maduros.

Breve Descripción de la Invención La presente descripción proporciona un sistema de banco de células de la línea germinal que comprende métodos para la recolección, aislamiento, expansión, procesamiento, crioconservación , ensayo, liberación e implante de células madre de la línea germinal tanto de hombres como mujeres.

En una modalidad aquí descrita, se proporciona un método para guardar en el banco células madre de la línea germinal que comprende recolectar el tejido de la gónada de un mamífero en riesgo de pérdida de la fertilidad; transportar dicho tejido de la gónada a una instalación bancaria central; procesar dicho tejido de la gónada; crioconservar dicho tejido de la gónada; y determinar el potencial de fertilidad de dicho tejido de la gónada crioconservado.

En una modalidad del método, el tejido de la gónada es el tejido testicular. En otra modalidad, el procesamiento del tejido testicular comprende preparar aproximadamente piezas de 0.5 a 2.0 mm2 de tejido testicular. En otra modalidad, el procesamiento del tejido testicular comprende digerir dicho tejido testicular con al menos una enzima seleccionada del grupo consistente de colagenasa, DNasa, hialuronidasa y tripsina y desactivar dicha al menos una enzima, obteniendo de este modo una suspensión de células testiculares disociadas.

En otra modalidad, el método comprende además el paso de aislar las células madre de la línea germinal del macho de las células testiculares disociadas, en donde las células madre de la línea germinal del macho son caracterizadas porque no expresan el receptor de hormona leutinizante. En otra modalidad, el método comprende además el paso de aislar las células madre de la línea germinal del macho de las células testiculares disociadas, en donde las células madre de la línea germinal del macho se caracteriza porque expresa las células SSEA-4. En otra modalidad, las células madre de la línea germinal expresan además GFR-a1 y los marcadores VASA.

En otra modalidad del método, la determinación del potencial de fertilidad es la capacidad del tejido testicular para diferenciarse el esperma maduro in vitro. En otra modalidad, la determinación de potencial de fertilidad es determinar las características de las células testiculares por al menos uno de la expresión meiótica y marcadores postmeióticos en tamaño y morfolog ía .

En una modalidad del método, el tejido de las gónadas es un tejido del ovario. En otra modalidad, el procesamiento del tejido del ovario comprende preparar piezas de aproximadamente 0.5 a 3.0 mm2 de tejido del ovario. En otra modalidad, el procesamiento comprende además digerir las piezas del tejido del ovario por al menos una enzima seleccionada del grupo consistente de colagenasa, DNasa, hialuronidasa y tripsina; y desactivar dicha al menos una enzima obteniendo de esta manera una suspensión de células disociadas del ovario.

En otra modalidad, la determinación del potencial de fertilidad se lleva a cabo por medio de la capacidad de dicho tejido del ovario para diferenciarse entre óvulos maduros in vitro. En otra modalidad, la determinación del potencial de fertilidad es determinar las características de las células del ovario por al menos uno de la expresión de marcadores meióticos, postmeióticos, tamaño y morfología.

En otra modalidad, el método comprende además el paso al implantar el tejido de las gónadas crioconservado en tejido de las gónadas residual en el mismo individuo del cual fue aislado el tejido de las gónadas.

En una modalidad aquí descrita, se proporciona un sistema de banco de células madre de la línea germinal el cual comprende medios para recolectar el tejido de las gónadas, medios para transportar el tejido de las gónadas; medios para procesar el tejido de las gónadas para aislar las células madre de la línea germinal; medios para crioconservar el tejido de las gónadas o dichas células madre de la línea germinal; y medios para determinar el potencial de efectividad de los tejidos de las gónadas crioconservados o dichas células madre de la línea germinal crioconservadas.

Breve Descripción de los Dibujos La figura 1 ilustra el enriquecimiento de la (GFP) (POR SUS SIGLAS EN INGLES) (proteína fluorescente verde) por subpoblaciones positivas de las células madre testiculares aisladas del ratón OG2 transgénico utilizando citometría de flujo. Las células Oct-4+ como lo indica la expresión GFP fueron encontradas como una población diferente de células, tanto en ratones OG2 neonatales (figura 1B) como de adultos (figura 1C) comparados con el tipo natural (figura 1A). Entre la células Oct-4 + , dos subpoblaciones claras consisten del Equipo-c+ (R5) y de Equipo-c- (R2) que fueron encontradas (figuras de la 1D a la 1E). La correlación entre la expresión de GFP y el Equipo-c también se muestran (figuras de la 1F a la 1 H).

La figura 2 ilustra los cambios morfológicos durante el desarrollo de líneas de células germinales multipotentes (mGC) (POR SUS SIGLAS EN INGLÉS) en el cultivo. Las células Oct-4+/GFP+ de ratón se observaron en las preparaciones de células antes del cultivo (figura (2A: flechas; días 1 al 3). Poco tiempo después del cultivo, se observó la desactivación de las células Oct-4 (figura 2B; días 3 a 7). Después de la segunda semana del cultivo ocurrieron cambios morfológicos obvios (figura 2C; días 7 al 15; figura 2D; días 15 al 20). Aproximadamente tres semanas después del cultivo, fueron formadas colonias que contienen células redondas pequeñas (figura 2E; días 20 al 30). La activación de las células Oct-4 fue observada aproximadamente en un mes del cultivo (figura 2F; días 30 al 40). Las imágenes de las tres líneas mGC establecidas derivadas de ratones OG2 neonatales, a ratones OG2 adultos y células LacZ de ratones OG2 neonatales se presentan en las figuras de la 2G a la 21 (figura 2G, OG2 neonatal; figura 2H, OG2 adulto; figura 21, OG2 LacZ), respectivamente. Barras de la escala igual a: 50 pm.

La figura 3 ilustra las células multipotentes precursoras de la línea germinal cultivadas en una capa de alimentador de fibroblasto embrionario de ratón (MEF) (POR SUS SIGLAS EN INGLÉS) en un medio PM-1™ suplementado con suero fetal bovino al 15% (FBS). En puntos diferentes del tiempo durante el cultivo, el número de células GFP+ fue determinado utilizando la clasificación de células ayudada por fluorescencia (FACS) (POR SUS SIGLAS EN INGLÉS) (figuras 3A a 3D). La figura 3E ilustra una gráfica de números de células vs tiempo. Las barras de la escala son equivalentes a 60 pm.

La figura 4 ilustra la caracterización fenotípica y molecular de las mGCs. La inmunolocalización de marcadores de células germinales y piuripotentes se ilustra en las figuras de la 4A a la 4D para las células Oct-4, las figuras de la 4E a la 4H para Nanog, figuras 4M a la 40 para células SSEA-1 y figuras 41 a la 4L para el marcador de célula germinal VASA. Las barras de escala: figuras 4A a la 4H: 25 pm; figuras 41 a la 40: 20 pm. La expresión de marcadores multipotentes y específicos germinales determinada por RT-PCR) (POR SUS SIGLAS EN INGLÉS) se muestra en la figura 4Q. El análisis Western blot y el contenido de proteína de las células Oct-4, Nanog y Sox2 en las células mGC antes y después de la inmunoprecipitación (IP) (POR SUS SIGLAS EN INGLÉS) se presenta en la figura 4P.

La figura 5 ilustra la actividad de telomerasa y el análisis de cariotipo en las células madre derivadas del tejido adiposo (ADSC) (POR SUS SIGLAS EN INGLÉS), de células de ratón (ES) (POR SUS SIGLAS EN INGLÉS), células madre de la línea germinal recientemente aisladas después de la clasificación del Equipo-c y células madre de la línea germinal multipotentes en el pasaje 10 (OG2 neonatal). La actividad de telomerasa en las células madre de la línea germinal es comparable con las células ES de ratón y más alta que las células (ADSC) (figura 5A). La figura 5B ilustra el cariotipo de la misma línea celular de ratones OG2 neonatales. La foto representativa de 80 difusiones de metafase fue analizada. Después de 15 pasajes las células exhibieron un cariotipo normal.

La figura 6 ilustra análisis de impresión de células precursoras de la línea germinal multipotente antes de (NGC) (POR SUS SIGLAS EN INGLÉS) y después del cultivo de (GC) (POR SUS SIGLAS EN INGLÉS) y comparado con las células de ratón ES para las regiones Meg3, Peg10, Oct-4, Igf2r y Rasgrfl metíladas diferencialmente.

La figura 7 ilustra la diferenciación espontánea de mGCs. La gastulación del cuerpo embrioide (EB; figura 7A) y la expresión de marcadores que indica el epitelio polarizado (E-cadherina y laminina 1; figuras 7B a 7C) y el desarrollo temprano de las tres capas germinales es decir, la ectodermia (ZIC1, PAX6, SOX1), endodermia (GATA4 , FOXA2) y mesodermia (BRACHYURY), BMP4 y COL2A1) se muestran en las figuras de la 7D a 7F. Durante el cultivo de reprogramación de mGCs también se diferenció espontáneamente en cardiomiocitos (figura 7G a 7J), adipositos (figura 7 ) y células neurales (figura 7L a 7M). Barras de la escala: figura 7A y 71: 50 pm; figura 7C y 7E: 30 pm; figura 7B y 7D: 25 µ??; figura 7G, 7H y 7L: 45 pm; figura 7K: 12 pm.

La figura 8 ilustra la diferenciación inducida de células mGCs en fenotipos específicos de linaje. Las imágenes confocales de los marcadores de células neurales expresados se muestran en las figuras 8A a la 8G. La expresión de los marcadores neurales del gen se muestra en la figura 8J. La imagen confocal de las células mGCs diferenciadas en cardiomiocitos se presentan en la figura 81. La expresión del marcador del gen cardíaco se muestra en la figura 8L. El condrocito positivo azul Alciano después de la diferenciación de las células MGCs se muestra en la figura 8H. La expresión de los genes específicos del condrocito se muestra en la figura 8K. Barras de la escala: figura 8A, 8C y 8G: 20 pm; figura 8B y 8H: 50 pm; figura 8D a 8F y 8J: 10 pm.

La figura 9 ilustra la formación de teratomas después del trasplante de células ES de ratón (figuras 9A a 9F) pero no las LacZ de células mGCs multipotentes (figura 9G a 9L) en la piel, músculos y testículos. La morfología de los teratomas derivados de ESC fue identificada por tinción H&E sobre secciones de parafina delgada mientras que el destino de las células germinales multipotentes trasplantadas (mGCs) fue identificado por la tinción LacZ mostrada en azul. Seis semanas después del trasplante, se encontraron GFP-LacZ+ de células mGCs en la piel (en el área abultada de los folículos del cabello y las glándulas sebáceas adyancentes, cabeza de la flecha; figuras 9G a 9H), en el músculo (flechas; figura 91 y 9J), y en los testículos (flechas; figura 9K). La regeneración de testículos después del trasplante de las células madre de la línea germinal antes y después del cultivo se presentan en las figura de la 9M a la 9R. La sección transversal del testículo normal de un ratón inmunodeficiente se muestra en la figura 9M. Un mes después del tratamiento con busulfan la mayor parte de los túbulos seminíferos están agotados de la espermatogénesis endógena (figura 9N). Los testículos trasplantados de un ratón con células Oct-4+ recientemente aisladas mostraron espermatogénesis de más del 50% de las secciones transversales de túbulos seminíferos indicando la presencia de células con propiedad SSC en esta población (figura 90). Aunque más del 80% de los túbulos seminíferos de los ratones trasplantados con células Oct-4 + /Equipo-c- mostraron algún grado de espermatogénesis (figura 9P), la mayor parte de las secciones transversales del túbulo de los ratones que recibieron células Oct-4 + /Equipo-c+ estaban vacíos (figura 9Q). Las células mGC trasplantadas también fallaron en volver a poblar los testículos receptores indicando que no tienen las propiedades de SSC (figura 9R). Barras de la escala: figura 9A y 9K: 275 µ??; figura 9B, 9D y 91: 60 pm; figura 9C: 140 m; figura 9E: 100 pm; figura 9F: 50 µ?t?; figura 9G y 9L; 125 µ??; figura 9H y 9J: 40 µ?t?; figura 9M a 9R: 60 pm.

La figura 10 ilustra la formación de quimeras después de la incorporación de células mGCs en blastocistos y embriones huésped. La incorporación de las células del LacZ-GFP+ de las células mGC durante el desarrollo embrionario temprano en la formación de blastocistos se presenta en las figuras de la 10A a la 10D. La mayor parte de las células GFP-lacZ inyectadas en la etapa de las células 8 han sido incorporadas en el día dos del desarrollo embrionario (cabeza de las flechas) y algunas células no han sido incorporadas todavía (flechas). Las células GFP + fueron encontradas además en el día 3.5 incorporadas en la masa de célula interior (flecha) de los blastocistos. Un ejemplo de cuatro embriones quiméricos que muestran un grado diferente de quimerismo se ilustra en la figura 10E como una tinción completa del embrión. Para visualizar los órganos internos, las secciones sagitales de dos de los embriones (indicadas por asteriscos) también se mostraron (figura 10F y 10G). La figura de la 10H a la 10K muestran el patrón quimérico en órganos cortados de la figura 10L a la 10O que muestran la población de células quiméricas en secciones histológicas en el cerebro, corazón, hígado y el borde de las gónadas (las células LacZ-GFP aparecen en azul). La amplificación del ADN de células GFP y LacZ en los tejidos de las crías quiméricas se muestra en la figura 10P y 10Q, respectivamente. Barras de la escala: figura 10A y 10C: 50 pm; figura 10B y 10D: 25 pm; figura 10E y 10D: 1250 pm; figura 10H a 10K: 625 pm; figura 10L a 10N: 50 pm; figura 100 10 pm.

La figura 11 ilustra gráficamente en una gráfica citométrica de flujo los resultados de las células de ovarios adultos y neonatales recientemente aislados de los ratones OG2 transgénicos en donde el promotor Oct-4 conduce la expresión de las células GFP. La figura 11A muestra las células madre de la línea germinal de ovario adulto como se ilustra gráficamente con la intensidad de fluorescencia de las células GFP. La figura 11B muestra células madre de la línea germinal del ovario neonatal como es ilustrado gráficamente con la intensidad de fluorescencia de las células GFP (niveles del Equipo-c en las células GFP + ). La figura 11C ilustra gráficamente la intensidad de fluorescencia de las células GFP+ neonatales que expresan el Equipo-c también conocido como CD-117.

La figura 12 ilustra las células madre de la línea germinal que se pueden identificar por la expresión de la proteína fluorescente verde en el ovario de los ratones OG2 transgénicos y el día 2 después del nacimiento; las figuras 12A y 12B muestran la fluorescencia total y la figura 12C muestra una imagen mejorada por computadora de la sección transversal con la remoción de la autofluorescencia.

La figura 13 ilustra los resultados del análisis RT-PCR de mARN aislado de las células madre embrionarias de ratón (columna 3), fibroblastos embrionarios de ratón (MEF, columna 4), células madre de la línea germinal GFP+ (columna 5) y células GFP- (columna 6) aisladas de ratones transgénicos OG2.

La figura 14 ilustra imágenes microscópicas de células madre de la línea germinal del ovario sustancialmente purificadas y aisladas establecidas y cultivadas como colonias en una capa de alimentador de células EF. La figura 14A muestra las colonias después de 4 días en cultivo; la figura 14B muestra el primer tipo de morfología de la colonia representativa; la figura 14C muestra el segundo tipo de morfología de colonia representativa; la figura 14D muestra la morfología de colonia después del pasaje con colagenasa; la figura 14E muestra el tercer tipo de morfología representativa de la colonia después del pasaje de colagenasa que tiene un límite claramente definido; la figura 14F muestra un cuarto tipo de morfología representativa de la colonia después del pasaje de colagenasa que tiene un borde definido de manera pobre; la figura 14G muestra la colonia después del pasaje #1; la figura 14H muestra la morfología de la colonia después del pasaje #2; la figura 141 muestra la morfología de la colonia después del pasaje #3, las figuras 14J y 14K muestran dos diferentes magnificaciones de las colonias de células madre de línea germinal del ovario después del pasaje #4.

La figura 15 ilustra la tinción inmunocitoquímica de células madre de la línea germinal del ovario substancialmente purificadas, teñidas para revelar la expresión del marcador pluripotente de célula madre Oct-4 (figura 15A); el marcador Nanog de célula madre pluripotente (figura 15B); el marcador VASA de línea germinal (figura 15C); y fosfatasa alcalina del marcador de célula madre pluripotente (figura 15D).

La figura 16 ilustra imágenes de la diferenciación de células madre de línea germinal de ovario. Figura 16A muestra las células GFP+ que asemejan el crecimiento de oocitos primarios en el centro de la colonia de células germinales femeninas. La figura 16B muestra imágenes de estructuras similares al folículo; la figura 16C muestra células GFP+ que se asemejan a los oocitos primarios que crecen en la cercanía de la colonia de células germinales femeninas; y la figura 16 ilustra la colonia pigmentada.

La figura 17 ilustra gráficamente un trazo de dispersión de los resultados de un análisis de tamaño citométrico de flujo de las células del ovario cultivadas de la figura 16 confirmando y caracterizando las células similares a oocitos grandes (>15 pm); la figura 17A ilustra las células de control MEF (< 15p); y la figura 17B ilustra células similares a oocitos de la figura 16.

La figura 18 ilustra la localización inmunohistoquímica de la célula madre de la espermatogonia y los marcadores de células de línea germinal en testículos de primate adulto.

La figura 19 ilustra la distribución de células teñidas positivamente con marcadores de célula madre en la membrana de la base de los túbulos seminíferos de testículos de primate.

La figura 20 ilustra la caracterización fenotípica de las células madre de la línea germinal de primate utilizando citometría de flujo.

La figura 21 muestra el análisis citométrico de flujo de las células madre de la línea germinal de primate.

La figura 22 ilustra células GFRa-+/VASA+ en diferentes poblaciones de células de la línea germinal de primate enriquecidas en diferentes células GFRa + /VASA + .

La figura 23 ilustra la actividad del éster diacetato succinimidilo de carboxifluoresceína (CSFE) (POR SUS SIGLAS EN INGLÉS) de subpoblaciones de células madre de la línea germinal de primates.

La figura 24 ilustra la repoblación de testículos de primate tratados con busulfan con las células madre de la línea germinal de primate; túbulos seminíferos de los ratones receptores trasplantados por células no clasificadas (figura 24A); células clasificadas por marcadores triples (figura 24B); células clasificadas SSEA-4+ (figura 24C); y testículos de control trasplantados ficticios (figura 24D).

La figura 25 ilustra el contenido de ADN determinado por citometría de flujo de poblaciones teñidas con yoduro de propidio de células madre de la línea germinal de primate.

La figura 26 muestra el análisis PCR cuantitativo de la expresión PLZF (figura 26A) y la actividad de telomerasa (figura 26B) en las células madre de la línea germinal de primates.

La figura 27 ilustra los porcentajes de células madre de la línea germinal de primates en proliferación determinado por la proliferación del antígeno nuclear celular (PCNA) (POR SUS SIGLAS EN INGLÉS).

La figura 28 ilustra el perfil de expresión del gen de subpoblaciones de células madre de la línea germinal de primate.

La figura 29 ilustra la morfología de una colonia de células madre de la línea germinal de primate expandida después de 10 días de cultivo en capa de alimentador MEF (figura 29A); la tinción de SSEA-4 de las colonias de células madre de la línea germinal de primate expandidas (figura 29B y 29C); y la tinción de las células GFR-a de una colonia de células madre de la línea germinal de primate expandida después del pasaje 4 (figura 29D).

La figura 30 ilustra el tejido testicular humano teñido con THT con células SSEA-4 (figura 30A) y VASA (figura 30B).

La figura 31 ilustra la tinción de THT con células GFR-a (figura 31A) y VASA (figura 31B).

La figura 32 ilustra la tinción de THT para VASA (figura 32A) y Nanog (figura 32B).

La figura 33 ilustra la tinción de THT para células SEEA-4 (figura 33A) y a6-integrina (figura 33B).

La figura 34 ilustra controles negativos para las figuras de la 30 a la 33 consistentes de secciones de testículos humanos teñidas solamente con anticuerpo secundario.

La figura 35 ilustra las células clasificadas con cuentas magnéticas más tinción de THT de las células SSEA-4 + trasplantadas en los testículos de ratones receptores tratados con busulfan y después de un mes de haber sido teñidas con SSEA-4 (figura 35A) y la proteína nuclear humana (figura 35B).

La figura 36 ilustra las células clasificadas con el tinte THT y cuentas magnéticas de las células SSEA-4+ trasplantado en testículos de ratón tratados con busulfan y después de un mes de teñidas para a6-integrina (figura 36A) y proteína nuclear humana (figura 36B).

La figura 37 ilustra las células clasificadas con tinte THT de cuentas magnéticas de células SSEA-4+ trasplantadas en testículos de ratones receptores tratados con busulfan y después de un mes de teñido para SSEA-4 (figura 37A) y a6-integrina (figura 37B).

La figura 38 ilustra el control negativo para las figuras 36 y 37 consistentes de secciones de testículos humanos teñidos solamente con el anticuerpo secundario.

La figura 39 ilustra el peso de los testículos de animales de control y trasplantados.

La figura 40 ilustra testículos fértiles (figura 40A) y no fértiles (figura 40B).

La figura 41 ilustra la etapa de espermatogénesis (porcentaje vacío y túbulos parcialmente llenos) en animales fértiles y no fértiles.

La figura 42 ilustra el porcentaje de túbulos positivos de GFP en ratones fértiles y no fértiles.

La figura 43 ilustra la morfología del análisis del marcador de superficie celular de las células testiculares de adulto humano. Observar que la morfología de los testículos obtenida de los hombres azooespérmicos obstructivos (figura 43A) son similares a los testículos humanos normales (figura 43B). Después del aislamiento de las células con morfologías similares fueron obtenidas de ambos testículos normales (43C) y los testículos recolectados de pacientes azooespérmicos (figura 43D). Observar que las células SSCs estuvieron presentes en ambos aislados de testículos y podrían ser identificadas como células redondas con núcleo grande: proporción de citoplasma, 1 a 3 nucléolos e inclusiones citoplásmicas. El análisis de citometría de flujo de los marcadores de superficie SSEA-4, CD49f y CD90 en las células aisladas de testículos humanos adultos (figuras 43E a 43H). Las poblaciones diferentes de células SSEA-4 + , CD49f+ y CD90+ se encontraron en las biopsias testiculares de adultos humanos y ninguna población de células dobles teñidas para CD49f y CD90 fue encontrada en los testículos humanos adultos (figuras 43E a 43F). La representación del histograma de cuatro análisis de flujo dependientes se presenta en la figura 43I.

La figura 44 ilustra la localización inmunohistoquímica de los marcadores de células madre de la espermatogenia en testículos de humanos adultos. La colocalización de células SSEA-4 y CD49f en la base de las membranas de los túbulos seminíferos (figura 44A a 44C). Las células SSEA-4 son localizadas específicamente en la subpoblación de la espermatogenia en las membranas de la base de los túbulos seminíferos presumiblemente las células SSCs. Todas las células SSEA-4+ también fueron positivas para CD49f, mientras que algunas células CD49f+ que son SSEA-4-. El Equipo-c fue encontrado en ambas células localizadas en la membrana de la base de los túbulos seminíferos y en las células germinales más avanzadas (figuras 44E a 44F). La colocalización de SSEA-4 y el Equipo-c reveló que algunas de las células SSEA-4+ poseen el Equipo-c y algunas con el Equipo-c-. La colocalización de las células CD49f con el Equipo-c (figura 44G a 44I) mostró que la mayor parte de las células CD49f+ en la membrana de la base de las secciones transversales tubulares también fueron teñidas positivamente para el Equipo-c (flechas). El patrón de expresión de Nanog en testículos humanos adultos fue similar al Equipo-c y estuvo presente tanto en células germinales diferenciadas como no diferenciadas (figura 44K y 44L). La colocalización de las células SSEA-4 con Nanog mostró que algunas de las células SSEA-4+ en los testículos humanos adultos son Nanog+.

La figura 45 ilustra el análisis RT-PCR cuantitativo y la actividad de telomerasa de la población enriquecida de SSCs aisladas de los testículos de adultos. Las células SSEA-4 + mostraron niveles de expresión significativamente más altos (P<0.05) de genes específicos de células SSC incluyendo GFR-cc1, C-Ret, GRP-125 y hTERT (figura 45A). Además, el Equipo-c fue aumentado de manera notable en las células SSEA-4 + comparado con las células negativas. La actividad de telomerasa de las células SSEA-4+ fue también significativamente más alta (P<0.01) que las células no clasificadas aisladas recientemente (figura 45B).

La figura 46 ilustra la expresión de marcadores específicos en células madre de la espermatogonia humana que vuelven a poblar los testículos de ratón. La identidad de las células humanas en los testículos de ratón fue detectada por el anticuerpo de proteína nuclear humana HNP (figura 46A). Observar que todas las células humanas que colonizaron los testículos de ratón fueron teñidas positivamente para el marcador VASA específico de la célula germinal (figura 46B y 46C). Algunas de las células humanas de la membrana de la base de los testículos de ratón colocalizados con las células CD49f y algunos fueron negativos para este marcador (figura 46D a 46F). La colocalización de las células SSEA-4 con el Equipo-c mostraron que todas células SSEA-4+ en los testículos de ratón expresan el Equipo-c (figura 46G a 46I). Entre las células humanas colonizadas en los testículos de ratón algunas se colocalizan con las células GPR-125 y algunas son teñidas positivamente con el marcador Nanog pluripotente (figura 46J a 46L),. La colocalización de HNP con el Equipo-c reveló que todas las células humanas en los testículos de ratón son Equipo-c+ (figura 46M a 460).

La figura 47 ilustra el patrón de expresión de marcadores de superficie usados para la caracterización de células madre de la espermatogenia humana por citometría de flujo. Existe una cantidad diminuta de células (del 1% al 2%) encontradas en los testículos humanos adultos que expresan GFR-a1, CD24, CD117 y CD166, BCRP, CD29, MHCI y MHCII fueron moderadamente expresadas (2% al 5%) en las células testiculares humanas CD90, CD49f, CD34 y SSEA-4 fueron abundantemente encontradas en la superficie de células aisladas de testículos humanos adultos. El valor representa la cantidad real de células positivas menos cualquier evento autofluorescente.

La figura 48 ilustra la viabilidad de las células aisladas de los testículos de ratón antes y después de la congelación del tejido.

La figura 49 ilustra la viabilidad promedio de las células testiculares porcinas congeladas en diferentes concentraciones de células.

La figura 50 ilustra la viabilidad de las células testiculares humanas descongeladas enmarcadas en tres medios diferentes para tres momentos diferentes (figura 50A) y en concentraciones celulares diferentes (figura 50B).

La figura 51 ilustra el porcentaje de recuperación de células totales (figura 51A) y la viabilidad (51B) para las muestras congeladas en diferentes concentraciones y condiciones de embarque.

La figura 52 ilustra el cambio de la viabilidad de células testiculares promedio de los testículos rata embarcados con el paso del tiempo.

La figura 53 ilustra el análisis citométrico de flujo del esperma GFP+ y los túbulos en el testículo derecho (figura 53A) e izquierdo (figura 53B) en ratones no fértiles.

DEFINICIÓN DE LOS TÉRMINOS La siguiente definición de los términos se proporciona como una referencia útil para el lector. Los términos utilizados en esta patente tienen significados específicos ya que ellos están relacionados con la presente invención. Se ha hecho cualquier esfuerzo para utilizar términos de acuerdo con su significado ordinario común. Sin embargo, en donde existe discrepancia entre el significado ordinario común y las siguientes definiciones, estas definiciones substituirán el curso común.

Comprometidas: Como se usa en presente descripción, el término "comprometida" se refiere a células las cuales son consideradas que están permanentemente obligadas con una función específica. Las células obligadas es a las que también nos referimos como "células diferenciadas terminalmente".

Cultivo: Como se usa en la presente descripción los términos "cultivo o cultivado" se refiere a la propagación de células bajo condiciones controladas y el modo que ocurre la división de las células y el aumento en los números de células.

Diferenciación: Como se usa en la presente descripción "diferenciación" se refiere a la adaptación de células o función particular. En las células, la diferenciación conduce a una célula más comprometida.

Célula Madre Embrionaria: Como se usa en la presente descripción la frase "célula madre embrionaria" se refiere a cualquier célula que es totipotente derivada de un embrión en desarrollo que ha alcanzado la etapa de desarrollo para ser adherido a la pared uterina. En este concepto, la célula madre embrionaria y la célula madre pre-embrionaria son términos equivalentes. Las células similares a la célula madre embrionaria (similar a ESC), son células totipotentes no directamente aisladas de un embrión. Las células similares a ESC pueden ser derivadas de células sexuales primordiales que han sido aisladas y expandidas.

Expandido: Como se usa en la presente descripción el término "expandido" se refiere a un cultivo creciente de células que ha aumentado el número de células de su concentración original.

Célula Madre Fetal: Como se usa en la presente descripción "célula madre fetal" se refiere a una célula que es multipotente y derivada de un feto multicelular en desarrollo que ya no se encuentra en la organogénesis de la etapa temprana o media.

Célula Germinal: Como se usa en la presente descripción el término "célula germinal", "célula de la línea germinal" o "tejido de la línea germinal" se refiere a una célula reproductiva tal como un espermatocito o un oocito o una célula que se desarrollará en la célula reproductiva o un tejido que contiene dichas células.

Célula Madre Precursora de la Línea Germinal: Como se usa en la presente descripción el término, "célula madre precursora de la línea germinal" se refiere a una célula reproductiva tal como una precursora de una célula madre de la espermatogonia o una célula madre precursora del oocito.

Célula Madre de la Línea Germinal: Como se usa en la presente descripción el término "célula madre de la línea germinal" se refiere a una célula reproductiva tal como a una célula madre de la espermatogonia (SSC) o una célula madre precursora de oocito.

Gónada: Como se usa en la presente descripción el término "gónada" se refiere a cualquiera de los órganos en pares en animales que producen células reproductivas (gametos). Estas incluyen ovarios femeninos los cuales producen huevos y testículos masculinos los cuales producen esperma.

Cultivo a Largo Plazo: Como se usa en la presente descripción el término "cultivo a largo plazo" se refiere a la propagación de células bajo condiciones controladas por tiempo mayor de por lo menos dos meses o mayor de 10 pasajes. Preferentemente, los cultivos de largo plazo son cultivados por más de 4 meses, más de 6 meses o más de 1 año. Preferentemente, los cultivos de largo plazo son pasados por más de 15 pasajes, más de 18 pasajes o más de 20 pasajes. La duración de los cultivos de largo plazo es altamente dependiente de las células individuales y puede haber variabilidad de línea celular a línea celular.

Maduración: Como se usa en la presente descripción el término "maduración" se refiere a un proceso de pasos bioquímicos que conducen hacia el tipo de célula diferenciado terminalmente.

Multipotente: Como se usa en la presente descripción, el término "multipotente" se refiere a células que pueden originar varios otros tipos de células, pero esos tipos de células están limitados en número. Un ejemplo de células multipotentes son las células hematopoyéticas (células madre de la sangre) que pueden desarrollarse en varios tipos, o células madre que no se pueden desarrollar en células del cerebro.

Células Progenitoras Adultas Multipotentes: Como se usa en la presente descripción, el término "células progenitoras adultas multipotentes" se refiere a células multipotentes aisladas de la médula ósea las cuales tienen el potencial de diferenciarse en células de los linajes de ectodermia, mesordemia y endodermia.

Pluripotentes: Como se usa en la presente descripción, el término "pluripotente" se refiere a células que pueden originar cualquier tipo de célula excepto las células de la placenta y otras células de soporte del útero.

Célula Madre Postnatal: Como se usa en la presente descripción, el término "célula madre postnatal" se refiere a cualquier célula que es derivada de un organismo multicelular después del nacimiento.

Pre-Pubescente: Como se usa en la presente descripción, el término "pre-pubescente" o "prepuberto" se refiere a individuos que todavía no han entrado a la pubertad. La presentación de la pubertad está asociada con altas hormonas liberadoras de gonadotropina (GnRH) las cuales proceden a originarse en hormonas sexuales, hormonas luteinizantes (LH) y hormonas estimulantes del folículo (FSH). La pubertad comienza consistentemente alrededor de los 47 kilos para las niñas y 55 kilos para los niños. Aunque existe un amplio rango de edades normales, en promedio, las niñas comienzan a procesar el proceso de pubertad aproximadamente de 1 año a 2 años antes que los niños (con edades promedio de 9 a 14 años para las niñas y de 10 a 17 años para los niños) y alcanzan a completar en un período más corto habiendo completado generalmente las niñas la pubertad para la edad de 17.

Célula Germinal Primordial: Como se usa en la presente descripción, el término "célula germinal primordial" (PGC) se refiere a las células presentes en la embriogénesis temprana que están destinadas a convertirse en células germinales.

Células Madre Sexuales Primordiales de la Línea Germinal: Como se usa en la presente descripción, el término "células madre sexuales primordiales de la línea germinal" a las que también nos referimos en forma corta como células sexuales de la línea germinal abreviadas PGLSC, se refiere a una célula que es derivada de tejido reproductivo del hombre o mujer adultos, y las cuales pueden generar células madre de la línea germinal y su descendencia como se evidencia por su capacidad para volver a poblar de manera reproductiva los tejidos testiculares o del ovario estériles después de por ejemplo, terapia de radiación o quimioterapia. Las células sexuales de la línea germinal pueden ser quietas o se pueden dividir activamente en tejidos reproductivos de adultos.

Reprogramación: Como se usa en la presente descripción, el término "reprogramación" se refiere al restablecimiento del programa genético de una célula de modo que la célula exhibe pluripotencia y tiene el potencial de producir un organismo completamente desarrollado. Además, esta reprogramación les da a las células que pasan por las características de reprogramación que generalmente no serían expresadas o encontradas en las células en su estado de pre-programación .

Selección: Como se usa en la presente descripción, el término "selección" se refiere a células activadas de fluorescencia, clasificación, clasificación de cuentas magnéticas y otros medios para recolectar células portadoras de un perfil marcador particular.

Células Sexuales Como se usa en la presente descripción, el término "la célula sexual" se refiere a células diploides o células haploides derivadas de los tejidos reproductivos de machos o hembras mamíferos. Los ejemplos representativos de estas células incluyen gonocitos de hombre, gonocitos de mujer, oogonia, espermatogonia del tipo A y espermatogenia del tipo B.

Células Somáticas: Como se usa en la presente descripción, el término (células somáticas) se refiere a cualquier célula de tejido en el cuerpo excepto las células sexuales y sus precursores.

Células Madre Somáticas: Como se usa en la presente descripción, el término "células madre somáticas" se refiere a células diploides multipotentes o células madre pluripotentes. Las células madre somáticas no son células madre totipotentes.

Células Madre: Como se usa en la presente descripción, el término "células madre" se refiere a células que tienen la capacidad de autorrenovación (la capacidad de ir a través de numerosos ciclos de la división celular mientras mantienen la condición no diferenciada y son por lo menos multipotentes. La capacidad de diferenciarse en más de un tipo especializado de célula.

Substancialmente Puro: Como se usa en la presente descripción, el término "substancialmente puro" se refiere a una población de células en donde más del 75%, más del 85%, más 90%, más del 95%, más del 98% o más del 99% de las células tienen las características deseadas.

Totipotente: Como se usa en la presente descripción, el término" totipotente" se refiere a células que contienen toda la información genética necesaria para crear todas las células del cuerpo más la placenta. Las células humanas tienen la capacidad de ser totipotentes solamente durante las primeras cuantas divisiones de un huevo fertilizado.

Descripción Detallada de la Invención La presente invención proporciona métodos para la recolección, aislamiento, expansión, procesamiento, crioconservación, ensayo, liberación y trasplante de células madre de la línea germinal tanto de hombres como mujeres para propósitos de conservación de la fertilidad en pacientes en riesgo de perder la fertilidad.

La terapia de radiación y quimioterapia utilizadas en el tratamiento de los cánceres, así como otras enfermedades no malignas (tales como, pero sin limitarse a, la anemia de células de depranocitos y la talasemia) antes del trasplante de las células madre de médula ósea tienen un efecto perjudicial bien documentado en la fertilidad de los pacientes que pasan por estas terapias. Estos tratamientos pueden dañar permanentemente la capacidad reproductiva de los pacientes, presentándose una oportunidad del 30% de los pacientes se convierten en no fértiles.

Riesgo de Infertilidad en los Hombre La presente descripción proporciona métodos para guardar en el banco tejidos de las gónadas testiculares y/o células madre de la línea germinal de pacientes prepubertos.

Las enfermedades o situaciones en las cuales sería deseable guardar en el banco las células madre de la línea germinal y los tejidos de los hombres incluyen pero no están limitados a, criptorquidismo bilateral, torsión testicular, testículos que no han descendido, varicocele, cáncer, incluyendo cánceres reproductivos y no reproductivos, terapia citotóxica, trasplante de médula ósea. En una modalidad, el donante es un hombre prepuberto. En otra modalidad, el donante es un hombre postpuberto.

Para pacientes adultos, un paso de precaución antes del tratamiento es la opción de congelar el esperma para la fertilización in vitro u otras tecnologías reproductivas asistidas, si el paciente llega a quedar ¡nfértil después del tratamiento. Los pacientes prepubertos que no han desarrollado esperma maduro al momento de la quimio o radioterapia, no tienen otra opción sino en los bancos de tejidos o células. Antes de la invención de los métodos actuales por los presentes inventores no existían opciones posibles para restaurar la fertilidad en pacientes prepurtos machos. La extracción y crioconservación de las células madre de la espermatogonia para la conservación de la fertilidad es el asunto de investigación considerable. Adicionalmente, el trasplante de tejido testicular crioconservado (no simples suspensiones de células) ha sido exitoso en modelos de animales pero todavía no en los humanos. La prueba del concepto de la restauración de fertilidad después del trasplante del tejido testicular ha sido completada en una variedad de modelos de animal incluyendo múridos, bovinos, porcinos y modelos de primates así como en humanos.

Riesgo de Infertilidad en Mujeres La presente invención proporciona métodos para guardar en banco tejidos del ovario y células de pacientes prepubertos y tejidos del ovario, folículos y células de pacientes adultos.

Las enfermedades o situaciones en las cuales guardar en la banca los tejidos y las células madre de la línea germinal sería deseable en las mujeres incluyen enfermedades y situaciones que afectan directa o indirectamente la fertilidad, tales como, pero sin limitarse a, quistes de los ovarios, embarazos ectópicos, histerectomía, cáncer, incluyendo cánceres reproductivos y no reproductivos, terapia citotóxica, trasplante de médula ósea, ovariectomías, endometriosis, y para propósitos de planeación familiar si la mujer quiere conservar su potencial reproductivo pero se está acercando o pasando su edad reproductiva. En una modalidad, el donante es una mujer prepuberta. En otra modalidad, el donante es una mujer postpuberta.

En las mujeres, los tratamientos citotóxicos ocasionan la destrucción folicular y resultan en menopausia e infertilidad prematura. Además, para disminuir el potencial reproductivo, la pérdida de estrógeno y otras hormonas puede conducir a problemas de salud a largo plazo tales como osteoporosis y enfermedades cardiovasculares. Más del 6% de los sobrevivientes de cáncer de niñas experimentaron fallas agudas en los ovarios. Las mujeres adultas que han pasado por tratamiento de cáncer tienen un 30% de incidencia de menopausia prematura. Otros procedimientos médicos tales como las ovariectomías e histerectomías ponen en peligro directamente o pueden afectar la fertilidad de la mujer. Estos procedimientos con frecuencia son necesarios cuando se ha diagnosticado al paciente con tumores malignos o benignos en los ovarios, un embarazo ectópico, endometriosis y quistes en los ovarios. Los pacientes de cáncer de mama, o aquellos en riesgo de desarrollar cáncer de mama o del ovario, con frecuencia pasan por ovariectomías para reducir su oportunidad de desarrollar dichos cánceres debido a las complicaciones hormonales y predisposiciones genéticas.

Existen opciones limitadas para las mujeres que pasan por tratamiento citotóxico para asegurar la capacidad reproductiva en el futuro. Como un paso de precaución, antes de una terapia citotóxica o citoestática o la remoción quirúrgica de órganos reproductivos, se pueden remover los oocitos o huevos y crioconservarlos para su uso con tecnologías reproductivas asistidas, si el paciente llega a ser infértil después del tratamiento. Sin embargo, la viabilidad de oocitos congelados y deshelados humanos es bastante baja debido a las dificultades inherentes en la congelación de una célula muy grande con poca proporción de superficie a volumen lo que no permite que el crioprotector penetre en la membrana de la célula fácilmente. Por lo tanto, que estén en el banco tejidos, folículos primordiales, o células del ovario (las cuales pueden contener las células madre de la línea germinal) es una opción viable en vez de, o además de, la congelación de los oocitos.

Guardados en el banco, los tejidos crioconservados de los ovarios o testículos pueden ser trasplantados de vuelta en los pacientes si ellos llegan a quedar no fértiles. En el momento posterior al tratamiento cuando ya están listos para restaurar su fertilidad. Alternativamente, para pacientes que han pasado por tratamiento para el cáncer y quienes no tienen los órganos reproductivos intactos, los tejidos o folículos congelados pueden ser utilizados en un proceso de maduración exhuésped aquí descrito y en la Solicitud de Patente también pendiente ??/???,??? titulada "Maduración Exhuésped de Células Madre de la Línea Germinal" (Expediente Legal No. 1951314-00063) y presentada en cualquier fecha con esta misma, incorporada como referencia en su totalidad ya sea in vitro o en un animal huésped (utilizado solamente como un sistema de soporte para madurar los oocitos/folículos) y huevos madurados pueden ser fertilizados por técnicas reproductivas asistidas.

Las células de la línea germinal aquí descritas son aisladas de los tejidos de las gónadas de los mamíferos incluyendo, pero sin limitarse a, roedores, animales domesticados, perros, gatos y primates. El término "primate" incluye, pero no está limitado a, humanos.

Las células de la línea germinal son aisladas basadas en su expresión, o carecen de expresión, de una variedad de marcadores de células de la línea germinal, embrionarias y pluripotentes. Los marcadores de células de la línea germinal incluyen, pero no están limitados a, VASA, factor de zinc de leucemia promielocítica (PLZF), receptor a1 del factor neurotrófico derivado de glial (GFR-a1), a6-integrina, Thy-1, CD9, CD90, CD49f, aglutinina Dolichos biflourus (DBA), molécula de adhesión de células neurales (NCAM), antígeno 1 nuclear de la célula germinal (GCNA1) y DAZL.

Los marcadores de células pluripotentes incluyen, pero no están limitados a, Oct-4 (POU5F1), Nanog, fosfatase alcalina, SSEA-4, TRA1-60 y TRA1-81.

Además, las células de la línea germinal también pueden ser aisladas basadas en la expresión de los genes de la célula madre de la línea germinal y/o pluripotente. Los genes de la célula madre de la línea germinal incluyen, pero no están limitados a, telomerasa, VASA, c-RET, Equipo-c, PLZF, DAZL y GFR-a1. Los genes de células pluripotentes incluyen, pero no están limitados a, Oct-4, Nanog, Dppa-5, Sox2, fosfatasa alcalina y Cripto.

Las modalidades adicionales aquí presentadas incluyen el cultivo a largo plazo de ciertas poblaciones de células de la línea germinal de modo que se generan líneas celulares multipotentes o pluripotentes de largo plazo. Estas líneas celulares pueden ser usadas como una fuente de células para la diferenciación en los linajes específicos del tejido. El cultivo de largo plazo de las células de la línea germinal presentes comprende los pasos de aislar una población substancialmente pura de las células de línea germinal deseadas basados en la expresión, o carencia de expresión, de marcadores de células de la línea germinal y/o pluripotentes y genes de la línea germinal y/o pluripotentes; cultivar las células en un medio de cultivo como se describirá en la sección de Ejemplos que permitirán la división continua de las células mientras que se mantiene una condición multipotente o pluripotente no diferenciada. Los cultivos de largo plazo aquí descritos pueden ser crioconservados para usos futuros.

En ciertas modalidades, las poblaciones substancialmente puras aisladas de células de la línea germinal o líneas de células de la línea germinal pueden ser usadas para aplicaciones terapéuticas en medicina regenerativa. Las células de la línea germinal aquí descritas tienen la capacidad de formar células de la línea germinal más diferenciadas tales como espermatocitos, espermátidos y esperma en los hombres, y folículos y oocitos en las mujeres y tienen la capacidad de volver a poblar un órgano reproductivo estéril in vivo.

Los sistema de bancos de tejido de línea germinal de la presente descripción comprenden los siguientes componentes y/o pasos: 1) Recolección del tejido; 2) Transporte del tejido a la ubicación del banco central; 3) Procesamiento del tejido en el banco central; 4) Crioconservación del tejido y células aisladas en el banco central y 5) Aseguramiento de calidad y liberación del tejido y/o células aisladas. Un sexto paso opcional comprende el nuevo implante de tejido y/o las células aisladas en el donante. 1. Recolección de Tejidos de Hombres Las células de la línea germinal son recuperadas de los testículos antes del inicio de un procedimiento citotóxico poco después de una lesión la cual pueda conducir a la destrucción de los tejidos de la célula germinal. Por lo menos un gramo de tejido de túbulo seminífero es removido bajo condiciones asépticas quirúrgicas y anestesia. La digestión física y enzimática del tejido para formar una sola suspensión de células se puede llevar a cabo ya sea antes de o después del embarque del tejido a la instalación del banco central.

En una modalidad, el tejido de los túbulos seminíferos testicular es cortado en piezas apropiadas de 10 mm ?10 mm y hasta cinco piezas son colocadas en un tubo estéril que contiene el medio de embarque estéril. En otra modalidad, el tejido es mantenido en una sola pieza y colocado en un contenedor estéril que contiene los medios de embarque estériles.

Los medios de embarque pueden incluir cualquier medio el cual pueda soportar la viabilidad del tejido del túbulo seminífero testicular y/o las células disociadas por hasta 24 horas. Los ejemplos no limitativos de los medios del mantenimiento del tejido incluyen PBS, FRS, DMEM suplementado con HEPES y antibióticos (penicilina y estreptomicina), así como los medios que son propiedad descritos en la Publicación de Solicitud de Patente Norteamericana No. 2007-0020759, la cual está incorporada como referencia en la presente descripción por todos sus contenidos correspondientes a los medios de cultivo de tejidos. 2. Recolección de Tejido de las Mujeres Las células de la línea germinal son recuperadas de los ovarios antes del inicio de un procedimiento citotóxico, pronto después de una lesión la cual puede conducir a la destrucción del tejido de la célula germinal o en el momento de la ovariectomía o histerectomía. Al menos un gramo del tejido del ovario es removido bajo condiciones asépticas quirúrgicas y anestesia general. La digestión física y enzimática del tejido para formar una sola suspensión de células se puede realizar ya sea antes o después del embarque del tejido a la instalación de la banca central.

En una modalidad, el tejido de los ovarios es cortado en piezas de aproximadamente 10 mm * 10 mm y hasta cinco piezas son colocadas en un tubo estéril que contiene los medios de embarque estériles. En otra modalidad, el tejido es mantenido en una sola pieza y colocado en un tubo estéril que contiene los medios de embarque estériles.

Los medios de embarque incluyen cualquier medio el cual pueda soportar la viabilidad del tejido del ovario y/o las células disociadas por hasta 24 horas. Los ejemplos no limitativos de los medios de mantenimiento del tejido incluyen PBS, FRS, DMEM suplementado con HEPES y antibióticos (penicilina y estreptomicina), así como los medios que son propiedad que se describen en la Publicación de Solicitud de Patente Norteamericana No. 2007/0020759. 3. Transporte del Tejido El tejido testicular o del ovario recolectado es mantenido a una temperatura de aproximadamente 4°C, y transportado a la instalación de la banca central de modo que llega en la instalación de la banca central dentro de un período de 24 a 72 horas de la recolección del tejido. 4. Procesamiento del Tejido El tejido testicular o del ovario recolectado es disociado enzimáticamente, evaluado por su viabilidad y los marcadores de la célula antes de la crioconservación. En una modalidad, las células madre de la línea germinal son enriquecidas del tejido antes de la crioconservación. En otra modalidad, las células totales testiculares o del ovario, sin enriquecimiento para las células madre de la línea germinal, son crioconservadas.

En otra modalidad, el enriquecimiento de las células madre de la línea germinal es realizado por la clasificación de flujo citométrico que utiliza anticuerpos específicos para las células madre de la línea germinal de hombres y/o mujeres. 5. Crioconservación Se puede utilizar una variedad de medios y procedimientos para la crioconservación del tejido de las gónadas y/o las células madre de la línea germinal.

En una modalidad, las células madre de la línea germinal son crioconservadas en una solución que comprende al menos un crioprotector que incluye, pero no está limitado a, dimetil sulfóxido (DMSO), etilénglicol, glicerol y propanediol; al menos un medio de cultivo que incluye pero no está limitado a DMEM, MEM y los medios de propiedad descritos anteriormente; al menos un agente adicional incluyendo, pero sin limitarse a, sacarosa, dextrano, un sustituto de suero y un regulador HEPES. En una modalidad, la solución comprende medio CS-10 CryoStor™ (BioLife Solutions Inc., Bothell, WA). En otra modalidad, el sustituto de suero es un reemplazo de suero eliminado (Invitrogen 10828-028).

Las células entonces son congeladas en una cantidad controlada y mediante un proceso "manual". El procedimiento de congelación por cantidad controlada comienza encendiendo el congelador con una cantidad controlada y preparando el programa de congelación para el tejido o la congelación de la célula. El congelador de cantidad controlada usará nitrógeno líquido para disminuir la temperatura en una cámara interna. (De esta manera al disminuir la temperatura de cualquier contenido de dicha cámara). El programa de congelación para células comienza enfriando la cámara interna a una temperatura de 4°C y manteniéndola ahí hasta que se le avise de continuación del procedimiento. Aunque el congelador de cantidad controlada está enfriando, las células son suspendidas en un medio de crioconservación enfriado a una temperatura de 4°C. De esa suspensión de células se toman alícuotas en criofrascos de un mL por criofrasco. Los criofrascos entonces son etiquetados y colocados en la cámara del congelador de cantidad controlada y se le avisa al programa de continuar. Primero la temperatura de la cámara es mantenida a una temperatura de 4°C por 10 minutos adicionales. Luego, la cámara es enfriada en una cantidad de -1°C/minuto hasta que la temperatura alcanza -80°C. La cámara es enfriada entonces en una cantidad de -50°C/minuto hasta que alcanza la temperatura de -120°C, después de 5 minutos, en una temperatura de -120°C, la temperatura de las células congeladas se equilibrará en -120°C. Los criofrascos y las células congeladas entonces son transferidos a un Dewar de nitrógeno líquido para el almacenamiento a largo plazo.

El procedimiento de congelación manual comienza preparando el contenedor de congelación "Mr. Frosty" (Nalgene) el cual es usado para congelar lentamente las células. El contenedor "Mr. Frosty" es una unidad de policarbonato que proporciona el índice de enfriamiento crítico, repetible de -1°C/minuto requerido para la crioconservación exitosa de la célula y la recuperación. La base del "Mr. Frosty" es llenada con 250 mL de isopropanol al 100%. La rejilla del tubo es colocada en la parte superior, la tapa es atornillada sobre la rejilla del tubo y el "Mr. Frosty" es colocado en una temperatura de 4°C por al menos una hora antes de ser usado. Las células son suspendidas en medios de crioconservación enfriadas a 4°C. Esa suspensión de células separa alícuotas en criofrascos, de 1 mL por criofrasco. Los criofrascos entonces son etiquetados y colocados en el "Mr. Frosty" previamente enfriado. El "Mr. Frosty" se vuelve a colocar en una temperatura de 4°C durante 10 minutos. Entonces, el "Mr. Frosty" es colocado en un congelador a una temperatura de -80°C durante la noche. Después de la permanencia durante la noche en el congelador a una temperatura de -80°C, los criofrascos son transferidos a un Dewar de nitrógeno líquido para el almacenamiento a largo plazo. 6. Aseguramiento de calidad y liberación de tejidos y/o células de la línea germinal derivadas de los ovarios y los testículos Se realizan los ensayos de potencia, pureza, identidad, viabilidad y estabilidad en las muestras antes de la crioconservación , o en puntos del tiempo específicos (para estabilidad), y al momento de la liberación para asegurarse de que el tejido o células se encuentran en condiciones correctas para el trasplante. Estos ensayos cuantifican los marcadores relevantes específicos en la muestra del tejido/células que proporcionan información sobre la cantidad de células madre de la línea germinal presentes (para extrapolar el potencial de "potencia" para volver a poblar los testículos si son trasplantadas), la viabilidad de las células, y opcionalmente el análisis de ADN para confirmar la identidad de las células. El análisis de estabilidad consiste de pequeñas muestras de tejido o células que están siendo descongeladas en intervalos regulares para revisar la calidad de la crioconservación. 7. Nuevo implante de tejidos y/o células de la línea germinal derivadas de los testículos El trasplante de la población aislada substancialmente pura de células madre de la línea germinal en el recipiente se logra mediante la inyección directa utilizando los medios de inyección conocidos para los expertos en la técnica. En otra modalidad, las células de soporte, tales como las células Leydig o de Sertoli que proporcionan los estímulos hormonales para la diferenciación de la espermatogonia son transferidas a los testículos receptores junto con las células madre de la línea germinal. Estas células de soporte transferidas no son modificadas, o alternativamente, son modificadas genéticamente. Estas células de soporte transferidas pueden ser autólogas o heterólogas para cualquiera o los testículos del donante del receptor. Una concentración de ejemplo de células en el fluido de transferencia puede ser establecida fácilmente por una experimentación simple, pero probablemente se encontrará dentro de un rango de aproximadamente 103 a 1010 células por mi. Las células van a ser introducidas en los conductos deferentes, la red de los testículos o el seminífero es realizado para ser hecho manualmente. El tinte adecuado o burbujas (de menos de 2 pm de diámetro) puede ser opcionalmente incorporado en el fluido portador para la identificación fácil de la entrega satisfactoria de las células madre de la línea germinal trasplantadas a los testículos. Un ultrasonido equipado con un transductor apropiado puede ser útil para colocar la aguja en el sitio de la inyección.

Los vehículos adecuados de trasplante de células son conocidos para los expertos en la técnica e incluyen moléculas tales como albúmina de suero, colesterol y/o lecitina, setenio y sales inorgánicas así como componentes de suero y/o factores de crecimiento y/o citocinas. Normalmente, los vehículos de trasplante de células tienen un pH el cual es simplemente fisiológico, por ejemplo, de 7.0 a 7.6.

Las composiciones actuales celulares pueden ser administradas solas o en combinación con uno o más vehículos farmacéuticamente aceptables, ya sea como dosis simples o múltiples. Los vehículos farmacéuticos adecuados pueden incluir geles de bioadministración inertes o matrices semisólidas biodegradables, así como diluyentes o rellenadores, soluciones acuosas estériles y varios solventes no tóxicos. Los vehículos farmacéuticamente aceptables generalmente realizan tres funciones: (1) para mantener y conservar las células en la composición celular intacta; (2) para retener las células en el sitio del tejido cuando necesitan regeneración, restauración o rejuvenecimiento; y (3) para mejorar la facilidad de manejo de la composición actual por medio del practicante, tal como, pero sin limitase a, la mejora de las propiedades de una composición inyectable o el manejo de un implante quirúrgico. Las composiciones farmacéuticas formadas combinando una composición celular de la presente invención con un vehículo farmacéuticamente aceptable pueden ser administradas en una variedad de formas de dosificación tales como soluciones inyectables, y similares. Los vehículos farmacéuticos pueden, si se desea, contener ingredientes adicionales tales como enlazadores, excipientes, y similares. La solución acuosa preferentemente es regulada de manera adecuada si es necesario y el diluyente líquido primero se hace isotónico con suficiente solución salina o glucosa. Dichas soluciones acuosas son adecuadas para la inyección intravenosa, intramuscular, subcutánea, o intraperitoneal. Los medios acuosos estériles de la presente invención empleados se pueden obtener por medio de técnicas estándar bien conocidas para los expertos en el arte. 8. Nuevo implante de células y/o tejidos de la línea germinal derivada del ovario Las células madre de la línea germinal del ovario podrían ser aisladas de los pacientes antes de una terapia de radiación o quimioterapia, expandidas en número in vitro y mantenidas congeladas hasta que el paciente las requiere para volver a ganar su fertilidad. Las células aisladas de los ovarios humanos son trasplantadas directamente en el epitelio de la superficie de los ovarios utilizando una aguja fina o alternativamente, las células podrían ser agregadas en un coágulo de fibrina. Los coágulos de fibrina son preparados de la propia sangre de los pacientes y soportan la viabilidad y sobrevivencia de las células durante el proceso del implante. Los coágulos de fibrina podrían ser trasplantados de vuelta al paciente e injertados bajo la bolsa de los ovarios.

En una modalidad, para el trasplante de células del ovario en los pacientes con malignidades, las células germinales son separadas de las células malignas utilizando procedimientos de selección de positivo-negativo. Sin embargo, en pacientes no malignos, los trasplantes de la superficie del epitelio del ovario (OSE) puede ser más práctico. Al momento de la recolección del tejido, el OSE es cortado del resto del tejido del ovario utilizando escalpelos en piezas de 0.5 cm * 0.5 cm con un diámetro de 1 mm. Estas piezas son congeladas utilizando procedimientos de vitrificación y mantenidas congeladas hasta que los pacientes los necesitan para la restauración de la fertilidad. Cuando son necesarias, las piezas de OSE son descongeladas y suturadas juntas para hacer una pieza más grande e injertarla a la superficie del ovario que no es fértil.

Adicionalmente, los folículos del ovario en diferentes etapas de desarrollo pueden ser congelados y ya sea reimplantados en el paciente o usados para un cultivo in vitro en folículos maduros. Los oocitos de estos folículos podrían entonces ser fertilizados por medio de ICSI ("POR SUS SIGLAS EN INGLÉS") (inyección intracitoplásmica de esperma) u otras técnicas reproductivas asistidas. El trasplante de las células madre de la línea germinal en el ovario es una restauración permanente de la fertilidad. 9. Maduración exhuésped de células madre de la línea germinal derivadas del ovario Las células madre de la línea germinal femenina aisladas de los ovarios humanos pueden ser diferenciadas en folículos primordiales utilizando una agregación sin factores de crecimiento y ß-mercaptoetanol en datos de cultivo adhesivos ultra bajos seguidos por un cultivo 3D en alginato de sodio o coágulos de fibrina en la presencia de una hormona de crecimiento. Para soportar adicionalmente el desarrollo de las células germinales para madurar los huevos, estas células son agregadas con células granulosas inmaduras de donadores en edad prepuberta. Este método permite el desarrollo de oocitos primarios para oocitos fertilizables de la metafase-ll. Para el aislamiento de las células granulosas, los óvulos de ovarios humanos prepubertos son cortados y las células granulosas son separadas de las células germinales por un procedimiento de adhesión diferencial de dos pasos. Este método es aplicado para pacientes con malignidades, y folículos diseñados desprovistos de células malignas y luego trasplantados de vuelta en el ovario del paciente que permiten la maduración adicional y el desarrollo folicular. Alternativamente, estos folículos son madurados ¡n vitro. Los folículos de los ovarios aislados de los pacientes pueden ser congelados y posteriormente sometidos a este protocolo. En cualquier caso, los oocitos Mil derivados de estos folículos son usados para la fertilización in vitro o ICSI para la fertilización y el desarrollo subsecuente del embrión. 10. Maduración ex-huésped de células madre de la línea germinal derivadas de testículos En el caso de que el reimplante de las células madre de la línea germinal en los testículos de los pacientes no sea factible (por ejemplo, en malignidades, torsión de los testículos, cripto-orquidismo) o en el caso de que el desarrollo de la célula germinal haya sido perjudicado debido a la falla de las células de soporte testicular (por ejemplo, detención de la maduración), las células madre de la línea germinal testicular son diferenciadas en un animal subrogado o in vitro para las etapas desarrolladas adicionales y pueden ser usadas para el ICSI u otras tecnologías reproductivas asistidas. En una modalidad, las células madre de la espermatogonia (SSCs) ("POR SUS SIGLAS EN INGLÉS") son mezcladas con células de soporte apropiadas y matriz extracelular del túbulo seminífero (ECM) ("POR SUS SIGLAS EN INGLÉS") para crear un ambiente que puede soportar el desarrollo adicional de las células germinales.

En el caso en donde la espermatogénesis ya ha sido iniciada en pacientes prepubertos pero no completada, las células germinales parcialmente maduras que ya han entrado en la meiosis (espermatocitos primarios y secundarios) pueden ser almacenados y usados para diferenciación adicional para espermátidos redondos o alargados. Los espermátidos entonces podrían ser usados para el ICSI permitiendo la fertilización y el desarrollo posterior del embrión.

Los métodos descritos son adecuados para utilizarse en cualquier mamífero, incluyendo pero sin limitarse a, humanos, ratones, animales domesticados tales como ganado, cerdos, ovejas y cabras, perros y gatos etc.

El banco o depósito de células madre de la línea germinal o instalación de almacenamiento es un lugar en donde las células de la línea germinal o las células madre de la línea germinal son mantenidas para su guardado seguro. La instalación del almacenamiento puede ser diseñada de un modo tal que las células madre sean mantenidas seguras en el caso de desastres naturales, por períodos de tiempo prolongados y en un ambiente controlado. En una modalidad de la presente invención, un depósito, por ejemplo, un banco de células de línea germinal, se proporciona para el almacenamiento de unidades de células de la línea germinal por anticipado de una necesidad para restaurar la fertilidad del donante. El alcance de los métodos descritos incluye no solamente la aprobación de dicho depositario sino también los métodos para administrar dicho depositario.

Quedan incluidos dentro del alcance de la presente invención, los métodos de registro de unidades de células de la línea germinal, de modo que cuando una unidad de célula de línea germinal necesita ser localizada, puede ser recuperada fácilmente. Cualquier indicación o sistema de recuperación puede ser utilizada para cumplir este propósito. También se proporcionó un sistema de almacenamiento de modo que las células o tejidos de la línea germinal puedan ser almacenados. En una modalidad, las células de la línea germinal son almacenadas de un modo tal que una instalación de almacenamiento podrá almacenar cientos, miles y hasta millones de diferentes unidades de células de la línea germinal.

También se proporcionan métodos de almacenamiento que identifican la información relacionada con las unidades de células de la línea germinal. Identificando la información se puede incluir la información del tipo del identif icador, la información del identificador del paciente y/o el genotipo de información fenotípica. También se puede incluir información de mantenimiento. Se puede incluir información tal como el volumen de la unidad de células de la línea germinal o el número total de células por unidad. Esta indicación de la identificación del paciente puede ser en la forma de un nombre o un código de identificador secreto.

Cada unidad de las células de la línea germinal, por ejemplo, una unidad particular de un individuo, será indicada de una manera para una identificación confiable y exacta y la recuperación. Cualquier sistema de indexación convencional puede funcionar siempre que sea confiable y exacto. Por ejemplo, cada contenedor para cada unidad de células de línea germinal puede ser marcado con códigos alfanuméricos, códigos de barras, o cualquier otro método que se pueda reconocer o combinaciones de los mismos. En una ubicación en el depósito y fuera del depósito, puede existir una lista de información accesible y legible que hace posible la identificación de cada unidad y su localización en el depósito y habilita la identificación de la fuente y/o tipo de unidad. El sistema de indicación puede ser administrado de cualquier manera conocida en la técnica, por ejemplo, manualmente, o no manualmente, por ejemplo, se puede utilizar una computadota y software convencional.

En una modalidad, el banco de células de línea germinal comprende un sistema para almacenar una pluralidad de registros asociados con una pluralidad de individuos y una pluralidad de unidades de la célula de la línea germinal. Cada registro puede contener el tipo de información, la información genotípica o la información fenotípica asociada con las unidades de células de línea germinal o individuos específicos.

Almacenamiento de las unidades de células de línea germinal puede ser de corto plazo o largo plazo. Las células de línea germinal almacenadas son conservadas criogénicamente. Cualquier método de almacenamiento puede ser usado siempre que el producto almacenado retenga la viabilidad para los propósitos terapéuticos aquí descritos.

Muchos tipos de aparatos de almacenamiento para almacenar células de línea germinal conocidos en la técnica y pueden ser también usadas de acuerdo con la presente descripción. No existe límite superior sobre el número de unidades de células de línea germinal que pueden ser almacenadas en otro banco particular. En una modalidad, cientos de unidades de células de línea germinal de diferentes individuos serán almacenadas en un banco o una instalación de almacenamiento.

Una instalación para el almacenamiento de los productos de células de línea germinal puede ser bastante pequeña, y todavía almacenar muchas muestras para un número grande de personas. En una modalidad, las unidades de células de línea germinal son almacenadas de un modo tal, que se minimiza la cantidad de espacio necesario.

La instalación de almacenamiento puede incluir medios para cualquier método de organización e indicación de los productos almacenados, por ejemplo, recuperación robótica automatizada y/o la manipulación de unidades de las células de línea germinal. La instalación puede incluir aparatos de micromanipulación para el procesamiento de dichas unidades de células de línea germinal. Más de una instalación de almacenamiento puede ser utilizada para almacenar las unidades de células de línea germinal. Estas instalaciones puede cada una encontrarse en una ubicación diferente separada por millas. En algunas modalidades, las instalaciones de almacenamiento pueden ser en estados diferentes, en países diferentes. Las instalaciones de almacenamiento pueden ser subterráneas o superficiales.

Las computadoras de tolerancia de fallas sin sistemas redundantes pueden ser utilizadas en todas las instalaciones de almacenamiento para eliminar problemas potenciales y para proporcionar un sistema libre de fallas. Se pueden utilizar tecnologías convencionales conocidas para el almacenamiento y recuperación eficiente de las unidas de células de línea germinal, por ejemplo, Machine Vision, Robótica, un Sistema de Vehículo Guiado Automático, Sistema de Almacenamiento y Recuperación Automática, Manufactura Integrada de Computadoras, Planeación del Proceso Auxiliado por Computadora, Control del Proceso Estadístico. Las instalaciones de almacenamiento menos sofisticadas pueden ser usadas también, por ejemplo, áreas grandes mantenidas en temperaturas apropiadas que contienen numerosas rejillas en la cuales están indicadas y almacenadas las unidades de células de línea germinal.

Un depósito, instalación de almacenamiento o banco de células de la línea germinal puede incluir una o más unidades de almacenamiento para almacenar las muestras de células de línea germinal en una o más estaciones de procesamiento para procesar las unidades de células de línea germinal para almacenamiento o para el trasplante. El procesamiento se puede hacer por medio de una unidad interior y una unidad externa, por ejemplo, un laboratorio el cual se especializa en el procesamiento y almacenamiento de células de línea germinal. En algunas modalidades, el proceso completo, la adquisición, el procesamiento, tipificación, registro y almacenamiento de células madre es administrada por una unidad de control y procesamiento de datos.

En algunas modalidades, la operación de este sistema puede ser administrada por la asistencia de software dedicado. El software puede administrar la inscripción de los receptores potenciales, adquisición de unidades de células de línea germinal de los donantes, administración de la base de datos, monitoreo del almacenamiento, revisión de calidad. En algunas modalidades, este sistema puede operar en un sistema de cómputo típico. El sistema de cómputo puede incluir dispositivos de entrada, por ejemplo, un teclado o ratón, un procesador, por ejemplo, un procesador de uso general o un procesador más desarrollado con capacidades aumentadas de procesamiento de base de datos, una memoria interna, por ejemplo, RAM, ROM y un almacenamiento externo, por ejemplo, discos, CD, ROMs, ASICs y una memoria RAM externa, una memoria ROM externa. El sistema de cómputo tiene la capacidad de ejecutarse en cualquier sistema operativo. En una modalidad particular, el sistema de la base de datos almacena información para cada unidad de células de la línea germinal en el banco. Cierta información es almacenada en asociación con cada unidad. La información puede ser asociada con un donante particular, por ejemplo, una identificación del donante y la historia médica del donante. Alternativa o adicionalmente, la información puede ser información de tipo de muestra. Por ejemplo, la información podría incluir el volumen de la unidad de la célula de la línea germinal y las otras cuentas de células totales en el producto. La información almacenada con cada muestra se puede buscar e identifica la muestra de un modo tal que puede ser localizada y suministrada al cliente inmediatamente.

EJEMPLOS Los siguientes ejemplos significan ilustrarse una o más modalidades que no están limitadas a lo que aquí se describe más adelante.

Ejemplo 1 Aislamiento de Poblaciones Distintas de Células Madre de la Línea Germinal de Múridos Machos Las poblaciones puras de células madre de la línea germinal fueron aisladas clasificando las células germinales Oct-4-GFP. Las células germinales Oct-4+ fueron entonces subdivididas basadas en la expresión de la molécula receptora Equipo-c. El Equipo-c, un receptor de cinasa de tirosina, y su factor de célula madre ligando (SCF; también conocido como el Equipo ligando o factor de Acero), son los reguladores clave del crecimiento de PGC y supervivencia. El Equipo-c es expresado en los PGCs por su segregación inicial y su llegada al borde genital. En testículos de ratones postnatales, ha sido reportado que el Equipo-C puede ser usado como un marcador para la diferenciación de espermatogonia de tipo A diferenciada y no diferenciada. Las combinaciones de Oct-4 y el Equipo-c permiten el aislamiento de dos poblaciones diferentes de células madre de la línea germinal: una que contiene más células germinales primitivas o progenitores de la línea germinal (Oct-4+/Equipo + ) y otra que contiene las células madre de la línea germinal destinadas a ser SSCs (Oct-4 + /Equipo-c-) y con la capacidad de generar los testículos estériles. Las características moleculares y fenotípicas de estas células fueron analizadas antes y después del cultivo y comparar su capacidad para generar líneas de células multipotentes bajo condiciones de cultivo definidas con una mezcla de factores de crecimiento. Además, la funcionalidad de estas subpoblaciones y sus líneas mGC descendientes para volver a poblar los testículos del receptor fue evaluada utilizando las técnicas de trasplante de células madre de la espermatogonia.

Las células madre de la línea germinal de machos (GSC) mantienen la espermatogénesis por la auto-renovación del SSC y la generación de la espermatogonia comprometida con la diferenciación. Bajo ciertas condiciones in vitro, las GSC de ambos los testículos de ratones adultos y neonatales puede generar de manera reportada líneas de células germinales multipotentes (mGC) que tienen características y potencial de diferenciación similares al ESC. Sin embargo, los mGCs generados en diferentes laboratorios mostraron diferentes características de células germinales; por ejemplo, algunas retienen sus propiedades de SSC y algunas las han perdido completamente. Por lo tanto, permanece la posibilidad de que las líneas de célula germinal multipotentes derivadas pueden haber sido derivadas de diferentes subpoblaciones de las células madre de línea germinal residentes dentro de los testículos del ratón. Para investigar esta pregunta, fue usado un modelo de ratón transgénico que expresa las células GFP bajo control de un promotor Oct-4 específico de la célula germinal. Dos poblaciones diferentes fueron encontradas entre las células madre de la línea germinal con respecto a su expresión del factor de transcripción Oct-4 y el receptor del Equipo-c. Solamente el subconjunto de Oct-4+/Equipo-c+ de las células madre de la línea germinal de ratón, cuando son aisladas de cualquiera de los testículos neonatales o adultos y cultivadas en una mezcla de complejo de factores de crecimiento, generan líneas de células que expresan marcadores ES pluripotentes, por ejemplo, Oct-4, Nanog, Sox2, Rex-1, Dppa5, SSEA-1, fosfatasa alcalina, exhibieron alta actividad de telomerasa y se diferenciaron en linajes múltiples incluyendo cardiomiocitos latiendo, células neurales y condrocitos después de los protocolos de diferenciación inducida. Estos datos muestran claramente la existencia de diferentes poblaciones dentro de las células madre de línea germinal de las cuales solamente los progenitores de línea germinal pueden generar líneas de células multipotentes con algunas características pluripotentes.

Para el enriquecimiento de las células madre de la línea germinal, tanto los tejidos testiculares neonatales como adultos fueron cultivados en platos de cultivo recubiertos de gelatina por dos horas para la adhesión diferencial para remover las células somáticas pero no las células germinales. Después de la adhesión del diferencial, las suspensiones de células que contienen células positivas GFP (del 4% al 10% en los neonatos; del 0.01% al 0.05% en los adultos) podrían ser recuperadas (figuras de la 1A a la 1C). Existe la correlación entre la expresión de GFP y el Equipo-c (figuras de la 1F a la 1 H).

Las células germinales neonatales recolectadas fueron cultivadas en un medio de cultivo de células madre dentro de una mezcla de factores de crecimiento como se describieron en los platos de cultivo. Las señales GFP iniciales (figura 2A) desaparecieron después de unos cuantos días en cultivo (figura 2B). Posteriormente, las células pasaron por diferentes cambios morfológicos, formando colonias similares a cadenas que continuaron creciendo sin la señal GFP (figuras de la 2C a la 2D). La activación del Oct-4, indicada por la ocurrencia de las células GFP positivas dentro de las colonias aparecieron después de tres a cuatro semanas de cultivo (figura 2F). Después de dos a cuatro semanas en cultivo, las colonias GFP positivas fueron transferidas mecánicamente en los platos de cultivo con las capas de alimentadores de fibroblastos embrionarios múridos tratados con mitomicina C (MEF) en el mismo medio de cultivo suplementado con FBS al 15%. Después de pasarlo de tres a cuatro veces, por medio de la transferencia mecánica a los nuevos cultivos de MEF, las colonias fueron establecidas y podrían ser removidas del plato de cultivo enzimáticamente (1 mg/ml de colagenasa, de cinco a 10 minutos) para la expansión adicional y/o el almacenamiento en nitrógeno líquido. Para la desviación de la línea celular de los ratones adultos, las células GFP+ recolectadas después de la adhesión diferencial fueron clasificadas utilizando citometría de flujo y fueron cultivadas directamente en las células MEF. Utilizando los ratones OG2 u OG2-lacZ, en total han sido generadas 19 líneas de células (10 neonatales y 9 de adulto). Todas las líneas celulares expresaron ya sea el GFP (14 líneas) o el GFP-LacZ (5 líneas) (figuras de la 2G a la 21).

Además, la línea mGC fue generada de ratones CD-1 neonatales de tipo natural indicando que el método no está limitado a ratones transgénicos OG2. Las líneas celulares seleccionadas fueron congeladas/descongeladas y propagadas por más de 40 pasajes con un tiempo de duplicación de células estimado de 72 horas (utilizando tanto la cuenta manual como la clasificación GFP (figura 3)). En puntos de tiempo diferentes durante el cultivo (día 2, figura 3A; día 5, figura 3B; día 9, figura 3C; día 15, figura 3D), el número de células GFP+ fueron analizadas por FACS (figura 3E).

Las células de Equipo-c + /GFP+ fueron separadas de las células de Equipo-c-/GFP+ por medio de citometría de flujo (figuras de la 1D a la 1E) y cultivadas en alimentadores de MEF. Solamente las poblaciones del Equipo-c+ generaron colonias de mGC y ninguna línea celular podría ser generada del conjunto del Equipo-c. Entre los factores de crecimiento utilizados en este estudio, la remoción del GDNF resultó en colonias más pequeñas indicando el rol del GDNF en la auto-renovación de los mGCs. En contraste, la remoción de los FGF2 resultó en la diferenciación de las colonias, indicando el rol posible del FGF2 en el mantenimiento de los mGCs en su etapa no diferenciada. La remoción de LIF o EGF no afectó ni la expansión o la diferenciación de los mGCs.

La mayor parte de las células de las colonias mGC expresaron Oct-4 (figuras de la 4A a la 4D), Nanog (figuras de la 4E a la 4H), VASA (figuras de la 41 a la 4L), y SSEA-1 (figuras de la 4M a la 40). Éstas también expresaron genes pluripotentes Sox2, DPPa5, Rex-1, eRas, y Cripto junto con marcadores específicos de la línea germinal, incluyendo Stella, Dazl, Vasa y cRet (figura 4Q). Además, la expresión de las células Oct-4, Nanog y Sox2 fue confirmada por el análisis Western blot (figura 4P).

La línea celular de ratón en el pasaje 20 mostró alta actividad de telomerasa (figura 5A, similar al ESC) y un cariotipo normal (40, XY) (figura 5B).

La expresión global del gen y los patrones de impresión de los mGCs también fueron analizados antes y después del cultivo y comparados con el del ESC. De manera interesante, las condiciones de cultivo no cambiaron el patrón de impresión de los sitios probados de mGCs en todas las DMR ("POR SUS SIGLAS EN INGLÉS") (regiones metiladas diferenciadas). En contraste, los ratones ESC que mostraron solamente una impresión androgénetica parcial, los mGCs exhibieron claramente un patrón de impresión androgenético del 100% (figura 6). Algo sorprendentemente, el análisis de microadaptación mostró que el patrón global de expresión del gen en los mGCs tuvo una similitud del 87% antes y después del cultivo.

Cuando los mGCs fueron agregados para formar cuerpos embrioides (EBs), la gastrulación fue observada dentro de 9 a 15 días (figura 7A). Las células en los EBs expresaron marcadores tempranos de desarrollo incluyendo la E-cadherina y laminina-1 (marcadores del epitelio polarizado (figuras de la 7B a la 7C), Zic1, PASÉ y Sox1 (marcadores tempranos de ectodermia, figuras 7D y 7F), GATA4 y FoxA2 (marcadores tempranos de ectodermia, figuras de la 7E a la 7F), y Brachyury, BMP4 y COL2A1 (marcadores tempranos de mesodermia, figura 7F). En el cultivo, las colonias de mGC se diferenciaron espontáneamente en fenotipos que expresan marcadores de cardiomiocitos (figuras de la 7G a la 7J), adipocitos (figura 7K) y las células neurales (figuras 7L y 7M). Algunas de las células que se diferenciaron espontáneamente en cardiomiocitos exhibieron contracciones rítmicas por hasta tres días. Utilizando los protocolos dirigidos de diferenciación, las líneas mGC podrían ser inducidas para diferenciarse en células neurales que representan progenitores neurales (nestina, neuroDI), neuronas (MAP2, NF-68, GAD67) y células gliales (GFAP, MBP, A2B5, 04, NG2) como se muestra en las figuras de la 8A a la 8G y la 8J. También podrían ser inducidas para formar cardiomiocitos (troponina-1 , miosina cardíaca, desmina, Nkx2.5, GATA4, figuras 81 y 8L) o condrocitos (colágeno Xa1, y tinción de azul alciano, figuras 8H y 8K).

En un estudio separado de diferenciación con mGCs, el número de células (núcleos) fueron contados con y sin tinción de marcadores neurales en siete colonias dentro de un cultivo y el porcentaje promedio fue estimado como del 17.6% para las células GFAP\ 2.5% para las células Tuj-1+ y 2.3% para las células MAP-2 + . En general, la eficiencia de la diferenciación inducida por estos protocolos fue mucho más alta en las células ES comparadas con las mGCs.

Cuatro semanas después del trasplante, los testículos de los animales de control así como aquellos que recibieron células Oct-4+/Equipo-c+ no mostraron espermatogénesis en la mayoría de los túbulos seminíferos. Sin embargo, el 80% de los ratones que recibieron las células testiculares Oct-4+/Equipo-c-recientemente aisladas mostraron algunos grados de espermatogénesis en todos los testículos, indicando la presencia de las SSCs funcionales en la suspensión de células. Solamente la subpoblación del Equipo-c- de células madre de la línea germinal colonizaron los testículos de los receptores. La regeneración de los testículos después del trasplante de las células madre de la línea germinal antes y después del cultivo se presentó en las figuras de la 9M a la 9R y la Tabla 1. La sección transversal de los testículos normales de un ratón inmunodeficiente se ilustran en la figura 9M. Un mes después del tratamiento de busulfan, la mayor parte de los túbulos seminíferos fueron agotados de la espermatogénesis endógena (figura 9N). Aunque el 73% de los túbulos seminíferos de los ratones trasplantados con células Oct-4 + /Equipo-c- mostraron algún grado de espermatogénesis (figura 90), la mayor parte de las secciones transversales del túbulo de los ratones que recibieron células Oct-4 + /Equipo-c- fueron vaciados (figura 9P). la colonia positiva marcada con CSFE pronto después del trasplante de las células Oct-4 + /Equipo-c- se ilustró en la figura 9R. No se encontró espermatogénesis en la mayor parte de los túbulos seminíferos de los testículos de los ratones receptores trasplantados con mGCs, indicando que estas células no tienen propiedades de SSC (figura 9Q).

Tabla 1. Restauración de la espermatogénesis después del trasplante de subpoblaciones de células madre de la línea germinal y líneas de células germinales multipotentes en testículos de ratones de los recipientes Para la formación del teratoma, se inyectaron números iguales de ratones ESC (como control positivo) o Oct-4-GFP/LacZ mGCs en la piel, músculo y testículos de diferentes grupos de ratones rasurados ( 1 ? 106 células/sitio). Todos los ratones recipientes (6/6) recibieron teratomas desarrollados de ESC en los tres tipos de tejido. En contraste, ninguno de los ratones (0/20) que reciben mGCs dieron origen a los teratomas (figuras de la 9A a la 9F). Seis semanas después del trasplante, las células Oct-4-GFP/LacZ, se encontraron en tejidos de la piel, músculo y testicular (figuras de la 9G a la 91). Estos datos muestran que los mGCs, a diferencia de los ESC, no son tumorigénicos.

La formación de quimera fue medida inyectando las células Oct-4-GFP/LacZ cultivadas en 8 embriones de células y blastocistos del ratón CD-1. Como se muestra en las figuras de la 10A a la 10D, las células Oct-4-GFP/LacZ incorporadas en la masa celular interior de los blastocistos del ratón. Los embriones fueron transferidos al útero de ratones pseudo embarazados (un total de 45 fetos de 119 embriones transferidos). En 12.5 dpc (días posteriores al coito), la tinción de los embriones completos para LacZ (actividad de ß-galactocidasa) mostraron patrones diferentes en los ojos, cerebro y miembros (figura 10E). La intensidad de la tinción de LacZ que mucho más alta en los embriones quiméricos que recibieron las células ES de los ratones que aquellos inyectados con líneas de célula germinal multipotentes. La distribución de las células quiméricas también es demostrada en secciones histológicas del cerebro, corazón, el borde gonadal y el hígado (figuras de la 10L a la 100). La intensidad y número de células LacZ+ fue mucho más alta en los embriones quiméricos inyectados con células LacZ-ES que aquellos inyectados con células LacZ-GS. La confirmación de los tejidos quiméricos Oct-4-GFP/LacZ fue soportada por la presencia de la secuencia de ADN de GFP en la ectodermia (cerebro), mesodermia (corazón), endodermia (hígado) y los testículos de las crías quiméricas (figura 10P), así como la presencia del ADN de LacZ (figura 10Q) en todos los 4 tejidos. Estos resultados combinados claramente demuestran que el cultivo de los mGCs no son células madre no teratogénicas con algunas características pluripotentes.

Las líneas de células germinales multipotentes pueden ser generadas de los testículos de los ratones adultos sin la reprogramación de factores de crecimiento; indicando la presencia posible de una subpoblación de células con características pluripotentes en los testículos de adultos.

Independientemente, como se describió anteriormente, las líneas de las células sexuales de la línea germinal y las células precursoras de la línea germinal de las células madre de la línea germinal de ratones postnatales fueron derivadas con alguna, pero no todas, las características pluripotentes del ESC. Ambas de estas líneas de tipos de células son diferentes distintivamente de las líneas de células germinales multipotentes obtenidas por los otros laboratorios, y lo que es más notable, con respecto a la cantidad de pluripotencialidad y formación de teratomas.

Basados en el análisis de microadaptación, las líneas de células de la línea germinal de ratón Oct-4+/Equipo-c + , expresaron genes pluripotentes Nanog y cripto pero en niveles más bajos de 1000 dobleces y 5000 dobleces que el ESC. De un modo similar, las líneas celulares germinales expresaron oncógenos que incluyen, pero no están limitados a, p53, Eras, Bak, lnt-2 y c-myc, pero los niveles de expresión fueron varias veces inferiores a los de las células ES. De manera notable, las líneas de células germinales no forman teratomas al trasplante in vivo, pero forman poblaciones de células quiméricas limitadas en embriones de ratón.

Varias líneas de soporte evidencian la noción de que las células precursoras de la línea germinal Oct-4 + /Equipo-c+ retienen sus propiedades de célula germinal y por lo tanto, difieren de las ESC y otras células testiculares reportadas anteriormente: es decir, 1) las líneas celulares precursoras de línea germinal derivadas tienen un tiempo de ciclo de la célula que duplica sus números de células en aproximadamente 72 horas (determinado por la clasificación de GFP y el conteo manual), y este tiempo del ciclo celular es más similar al de las células madre de la línea germinal y es aproximadamente tres veces más largo que el de la ESC; 2) basados en el análisis global de expresión del gen en las adaptaciones, las células precursoras de línea germinal presentes parecen tener características moleculares diferentes a las de ESC u otras líneas de células germinales multipotentes. Entre los genes probados, las líneas celulares precursoras de línea germinal presentes mostraron un nivel de expresión significativamente más alto de genes específicos de línea germinal (Vasa, Plzf, GFR-a1, Dazl) y un nivel de expresión más bajo de genes pluripotentes (Oct-4, Nanog, Dppa-5, Sox2, Cripto); 3) estas líneas de células dependen más del GDNF para su auto-remoción que del LIF o FGF2. El GDNF ha sido propuesto para ser el regulador clave de la auto-renovación de las células madre de la línea germinal de los machos, mientras que los LIF y FGF2 juegan un rol crucial en la auto-renovación del ESC; 4), el nivel de expresión de SSEA-1 en estas líneas de células fue más bajo que el nivel encontrado en cualquiera de las células ES de ratón u otras líneas de células germinales multipotentes reportadas. Esto ha mostrado que el SSEA-1 puede estar involucrado en la invasión del tumor y metástasis en ciertos sistemas de modelo de animal sugiriendo que la expresión más alta puede reflejar un potencial más alto de tumorigénesis; y 5) los GCs multipotentes exhibieron un patrón de impresión androgénica que es diferente del ESC de ratón u otras líneas mGC reportadas por otros laboratorios.

A pesar de todas las similitudes en sus antepasados de la línea germinal, las líneas celulares precursoras de línea germinal de la presente invención no regeneran los testículos después del trasplante demostrando que no fueron células sexuales de la línea germinal.

El modelo de ratón transgénico permitió el aislamiento de células madre de la línea germinal de ambos testículos de ratones neonatales como adultos basados en su expresión de Oct-4. Las células madre de la línea germinal fueron fraccionadas adicionalmente en dos subpoblaciones de acuerdo con su expresión del Equipo-c con las siguientes observaciones: 1) solamente las células Oct-4-/GFP+ que poseen la molécula receptora de Equipo-c respondieron al cultivo y generaron líneas celulares germinales multipotentes; y, 2) solamente las subpoblaciones de Equipo-c de testículos que se volvieron a poblar después del trasplante de células madre de la espermatogonia. Los resultados claramente indican la presencia de por lo menos dos subconjuntos diferentes de células madre de la línea germinal dentro de los tejidos reproductivos: (1) un conjunto del Equipo-c+ con la capacidad para convertirse en células madre de la línea germinal multipotentes, por ejemplo, células precursoras de línea germinal, así como, (2) un subconjunto de células madre de la línea germinal que han perdido su expresión del Equipo-c y adquirido la capacidad de colonizar los testículos, por ejemplo, las células sexuales de la línea germinal. Aparentemente, en los tejidos de adultos, las células madre de la línea germinal en los órganos reproductivos están ya sea presentes en diferentes etapas de desarrollo, o alternativamente, poseen diferentes capacidades para responder a la señalización del factor de crecimiento y/o los factores de transcripción.

MATERIALES Y MÉTODOS Aislamiento de células testiculares. Los testículos de cualquier cría de ratones neonatales (de dos a cinco días después del nacimiento) o de ratones adultos fueron removidos de manera estéril del cuerpo. La cápsula de los testículos fue removida y los túbulos seminíferos fueron suspendidos en una solución de enzimas consistente de 1 mg/mL de colagenasa 1A y 10 unidades/mL de DNasa en PBS. Los testículos fueron digeridos a una temperatura de 37°C en un baño de agua hasta que todos los túbulos fueron digeridos. La reacción se detuvo con Suero Fetal Bovino (FBS).

Preparación de alimentadores de fibroblastos embrionarios de ratón (MEF): Se hicieron MEFs por medio de procedimientos estándar utilizando los embriones de ratón CD- 12.5 dpc. Los embriones fueron eviscerados antes de la tripsinización, y las células disociadas fueron colocadas en placas de 150 mm con una densidad de depósito en las placas de aproximadamente 1.5 embriones por placa. Después del emplacado inicial, los MEFs fueron divididos 1:5 y luego congelados (pasaje 1). Los MEFs descongelados (P1) fueron pasados solamente una vez por propósitos de expresión antes del tratamiento de mitomicina C. Los alimentadores de MEF fueron colocados en placas en una densidad de 50-60*103 por cm2. Los nuevos alimentadores de MEF fueron usados para el cultivo pluripotente de células germinales de cada siete a 10 días. Todos los experimentos de animales siguieron las instrucciones para el cuidado y uso de animales de laboratorio (National Research Council).

Evaluación de la actividad de telomerasa v la cariotipificación: Para la determinación de la actividad de telomerasa, los extractos de células fueron aislados de las líneas de células germinales (pasaje 10 y mayor), aislados recientemente las células clasificadas Oct-4+/Equipo-c+ y células clasificadas Oct-4+/Equipo-c- utilizando el regulador de lisis CHAPS que contiene 150 U/ml de RNasa. Los lisatos de células fueron centrifugados por 20 minutos a una velocidad de 12,000 x g, a una temperatura de 4°C, y los sobrenadantes fueron almacenados a una temperatura de -80°C. La concentración de proteína fue ensayada con el reactivo Bradford utilizando BSA como un estándar. La actividad de telomerasa fue detectada por un ensayo basado en PCR utilizando el Equipo de Detección TRAPEZE (Chemicon). Dos microlitros de extracto de células en 750 µ g/µ I fueron agregados a un volumen total de 50 µ? de mezcla de reacción de PCR, que contiene el Regulador de Reacción TRAP, dNTPs, oligonucleótidos del substrato, el cebador de telomerasa, el cebador estándar interno, y la polimerasa Taq. Como control positivo, 2 µ? del extracto de células mESC fue agregado a la mezcla de reacción, y el regulador de lisis CHAPS solo y el calor de la telomerasa desactivada fueron utilizados como control negativo para cada muestra experimental. Cada muestra fue incubada a una temperatura de 30°C durante 30 minutos para la extensión de telomerasa, seguida por la amplificación de PCR. Para la cariotipificación, las células de proliferación fueron incubadas en cultivos con 0.1 pg/ml de Colcemid KaryoMAX (Invitrogen) por un período de tres a cuatro horas antes de que fueran resuspendidas en solución hipotónica (0.075M KCL) e incubadas a temperatura ambiente durante 10 minutos. Luego las células se volvieron a suspender en un fijador frío (3:1 metano ácido acético) y almacenadas a una temperatura de 4°C por al menos 30 minutos. Después del lavado con el fijador, las células fueron aplicadas para limpiar las platinas de vidrio y secadas al aire. Los cromosomas de metafase fueron preparados y los cariotipos creados utilizando un sistema de elaboración de imagen digital Applied Spectral Imaging Band View.

Diferenciación in vitro: Para la generación de cuerpos embrioides (EBs), las colonias mGSC fueron disociadas con colagenasa y colocadas en placas de cultivo no adhesivo en un medio PM™ (descrito en la Solicitud de Patente Norteamericana Serie No. 11/488,362 también pendiente, presentada el 17 de julio del 2006, e incorporada como referencia de todo su contenido con respecto a los medios de cultivo celulares a la presente invención) con un contenido de FBS al 15%. En algunos experimentos, se formaron EBs en gotas colgantes. Los EBs, para la diferenciación en células que representan las tres capas germinales, fueron cultivadas por 15 días con muestras extraídas cada tres días de la determinación del marcador. Para la diferenciación inducida, los EBs fueron cultivados en el medio P por cuatro días antes de que fueran cultivados en el medio N1 libre de suero para la selección de linaje: por ejemplo, DMEM/F12 (Invitrogen) suplementado con ITS (insulina, 10 mg/l; transferrina, 5.5 mg/l; selenio, 0.67 mg/l) y fibronectina (50 g/ml). Después de cinco a siete días, los agregados de células tratadas con N1 fueron transferidos a las placas de cultivo recubiertas de gelatina en un medio N2 para la expansión de las células neurales progenitoras (medio N1 con ITS, sin fibronectina y suplementado con 10 ng/ml de bFGF). Para la diferenciación en cardiomiocitos, los EBs fueron cultivados por dos semanas en la presencia de diferentes compuestos cardiogénicos incluyendo DMSO 0.06 M, 5 mM de 5'-aza-2'-desoxi-citidina (AZA) y de 25 µ? a 50 µ? de cardiogenol-C. Durante el proceso de diferenciación, la morfología de las células fue analizada y las muestras fueron recolectadas tanto para el análisis de expresión del gen por RT-PCR como la tinción inmunohistoquímica. La diferenciación de condrocitos de los mGSCs fue inducida agregando un medio de inducción condrogénico (Chondrogenic SingleQuots, Cambrex) suplementado con 10 ng/ml de TGF-3p y FBS al 20%.

Tinción inmunocitoauímica (ICC) e inmunohistioauímica (IHC): Las células cultivadas fueron fijadas con 4% de paraformaldehído durante un período de 10 a 30 minutos a temperatura ambiente y almacenadas en PBS a una temperatura de 4°C. Para la inmunocitoquímica fluorescente las células fueron permeabilizadas con citoesperma 1x (BD Biosciences) Tritón X-100 al 0.2% durante 15 minutos y posteriormente incubadas en 2% de albúmina de suero bovino al 2% (p/v) (BSA), 2% volumen (v/v) de suero normal de cabra (GS)/1x Cytoperm-PBS durante 30 a 60 minutos ambos en temperatura ambiente. El anticuerpo primario fue ya sea diluido en la concentración óptima de BSA al 2%, GS/1x Cytoperm-PBS al 2% incubado durante 3 horas a una temperatura de 4°C o diluidos en un regulador de bloqueo durante la noche a una temperatura de 4°C. Después de dos lavados, el anticuerpo secundario fluorescente fue diluido de manera correspondiente con BSA al 2%/suero de cabra al 2%/1x Cytoperm-PBS e incubado por 1 hora a una temperatura de 4°C en la oscuridad. Las células fueron lavadas dos veces en PBS, envueltas en lámina y almacenadas a una temperatura de 4°C hasta el análisis microscópico. Las imágenes fueron registradas utilizando el microscopio Olympus 1X71 o el microscopio confocal Ziess LSM510 equipado con un equipo y software de imagen digital.

Para la inmunocitoquímica de campo de brillo, las células fueron lavadas una vez en 1x PBS. La actividad de peroxidasa endógena fue bloqueada con 3% de (v/v) H202) durante 15 minutos seguido por permeabilización, bloqueando con BSA/2% GS/1x Cytoperm-PBS al 2% durante 30 minutos. El anticuerpo primario fue diluido de manera correspondiente con BSA/2% GS/1x Cytoperm-PBS al 2% e incubado durante 3 horas a una temperatura de 4°C. El resto de la tinción fue logrado utilizando equipos de tinción ABC de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La visualización fue con una tableta de substrato de diaminobencidina mejorado (DAB) disuelto en agua purificada e incubado por un período de 5 a 10 minutos. Para los controles negativos, fue omitido el anticuerpo primario.

Citometría de Flujo: Los anticuerpos específicos, incluyendo el SSEA-1 y el Equipo-c fueron optimizados para el análisis citométrico de flujo con un Clasificador de Células Influx (Cytopeia, Inc). Para la clasificación del Equipo-c, las células testiculares aisladas recientemente con un contenido de la construcción de Oct-4-GFP fueron teñidas con anti-CD117 APC (BD Biosciences). Para algunos experimentos, las colonias de células germinales frescas fueron disociadas y las células fueron teñidas con anticuerpo anti-SSEA-1 seguido por IgM de cabra anti-ratón conjugado con PE-Cy7.

Expresión del gen, análisis de impresión v amplificación GFP: El ARN total fue aislado utilizando un mini equipo RNeasy (Qiagen) y el ARN fue usado para el RT-PCR. El análisis PCR cuantitativo o microensayo. Para el RT-PCR, cADN fue sintetizado con el equipo Sensiscript RT y el PCR fue realizado con una polimerasa de ADN HotStarTaq. Todas las reacciones del PCR comenzaron con una entubación inicial a una temperatura de 95°C durante 15 minutos para activar la enzima. Esto fue seguido por 35 ciclos de 95°C por 15 segundos, la temperatura de recocido apropiado por 1 minuto y 72°C por 1 minuto, la cual después fue seguida por un ciclo de 72°C por 10 minutos para la extensión final. Las reacciones fueron llevadas a cabo utilizando un ciclador térmico ¡CyclerTM Thermal Cycler (Bio-Rad). El procedimiento para el RT-PCR fue llevado a cabo usando los cebadores específicos incluyendo Oct-4, Nanog, Rex-1, DPPa5, Dazl, ß actina, Nkx2.5, Nestina, Mab2 y GFAP. Para los controles internos se utilizó GADPH como un gen doméstico para las muestras celulares y se utilizaron ß-actina e interleucina-2 (IL-2) en los embriones de ratón.

Los patrones de impresión en mGSCs y mESCs fueron determinados por análisis basados en PCR, la amplificación del PCR de cada región dimetilada (DMR) a partir de ADNs tratados con bisulfito se llevó a cabo por cebadores específicos. Para el análisis de los genes impresos, el software de imagen UVP fue usado para cuantificar la intensidad de la banda. Para la amplificación de GFP y LacZ, el tejido individual de embriones quiméricos fue recolectado cuidadosamente por medio de corte, picado en piezas pequeñas y colocado en el regulador de extracción de ADN (equipo DNeasy) para el aislamiento de ADN y purificación de acuerdo con el protocolo del fabricante.

Trasplante de célula madre de la espermatoqonia : Para probar la funcionalidad de los mGCs para la regeneración de espermetogénesis, se utilizó el trasplante de células madre de espermatogonia. Veinte ratones inmunodeficiente rasurados de 6 a 8 semanas de edad (Harían) fueron tratados con bisulfan (40 mg/kg) y utilizados como receptores. Un mes después del tratamiento de busulfan, las células, 2x105 fueron trasplantadas en los túbulos seminíferos por medio de una inyección en la red de los testículos. Cuatro ratones recibieron mGCs (GFP células clasificadas). Otros cuatro ratones fueron inyectados con células clasificadas GFP+ recientemente aisladas. Cuatro ratones fueron trasplantados con células clasificadas GFP + /Equipo-c+ recientemente aisladas, y cuatro ratones fueron inyectados con células clasificadas GFP + /Equipo-c-recientemente aisladas. Los otros cuatro ratones sirvieron como el control ficticio de la investigación y no fueron inyectados. Un mes después del trasplante, los anímales fueron sacrificados y los testículos recolectados se utilizaron para las evaluaciones histológicas. Para evaluar la eficiencia del trasplante, fue contado el número total de secciones transversales tubulares con espermatogénesis.

Pruebas de teratoma v formación de quimera: Para probar la capacidad de los mGCs para formar teratomas o quimeras, los ratones OG2 (Jackson Laboratories), fueron criados con ratones Rosa 26 (Jackson Laboratories) y fue generada una nueva cepa (OG2-R26). Estos ratones tuvieron tanto las construcciones GFP como LacZ en sus líneas de células germinales. El cultivo fue realizado como se describió y se produjeron nuevas líneas de célula germinal Oct-4-GFP/LacZ mGSCs para la prueba de teratoma información de quimera. Los mGSCs de ratones Oct-4-GFP/LacZ fueron examinados por su capacidad para formar teratomas in vivo por medio de una inyección subcutánea o intramuscular en los túbulos seminíferos de los ratones rasurados. Como controles positivos para la formación del teratoma, las células ES fueron inyectadas en algunos ratones. Para las inyecciones subcutáneas, intramusculares y testiculares, se inyectaron aproximadamente 1x106 células. Los ratones fueron sacrificados seis semanas después, y los tejidos recolectados para los análisis morfológicos e histológicos.

La capacidad de los GSCs de células Oct-4-GFP/LacZ de ratón para formar poblaciones de células quiméricas fue determinada después de la inyección de los blastocistos del huésped, o por su agregación con embriones en etapa de mórula, o embriones en la octava etapa de células. Las inyecciones de blastocistos de 15 a 20 células fueron llevadas a cabo utilizando los blastocistos de 3.5 días recolectados de los ratones CD-1. Después de la inyección, los blastocistos fueron transferidos (de 7 a 8 blastocistos a cada trompa del útero), en hembras pseudo embarazadas de 2.5 días de CD-1, previamente apareadas con machos vasectomizados, la incorporación de las células lacZ fue examinada en diferentes áreas de los embriones de 12.5 dpc quiméricos por el equipo de tinción de ß-galactosidasa (Sigma). Además, se realizaron análisis PCR en las células lacZ GFP en los ADNs aislados de los bordes del cerebro, corazón hígado y gónadas de los embriones quiméricos formados de células Oct-4-GFP/LacZ.

Ejemplo 2 Aislamiento, Identificación, y Caracterización de las Células Madre de la Línea Germinal de Primates Debido a que existen células madre de la línea germinal quietas y que se dividen activamente como dos poblaciones de células separadas en los testículos del ratón (Ejemplo 1), fue investigada la posibilidad de que estas dos poblaciones de células pudieran también estar presentes en los testículos de primates adultos.

La espermatogénesis es un proceso altamente regulado en el cual las células germinales no diferenciadas como células madre de la espermatogonia (SSC) se dividen y maduran para producir los espermatozoides. En los ratones, As (AS0|0) la espermatogonia son considerados que son células madre residentes responsables de la espermatogénesis ya que ellos tienen la capacidad tanto de la renovación como de la diferenciación. A diferencia de los roedores, los estudios histológicos de los primates y las células humanas demuestran dos tipos diferentes distintos de tinción nuclear residente en la membrana de la base del epitelio tubular seminífero testicular es decir, designados como espermatogonia AOSc_ra y Apá|¡da- Debajo se describen los marcadores y métodos de aislamiento para la purificación substancial de las células madre de la línea germinal testiculares de primates.

Los testículos de mono Rhesus fueron utilizados para la caracterización de las células madre de la línea germinal de primates. El examen inmunohistoquímico, los marcadores de superficie y la clasificación de las células activadas por fluorescencia fueron utilizados para identificar, caracterizar y purificar substancialmente las células madre de la línea germinal de los testículos de monos Rhesus adultos. La presencia de células madre de la línea germinal en cada población celular fue confirmada utilizando telomerasa, RT-PCR y la tinción inmunohistoquímica con el marcador VASA específico de las líneas germinales y el marcador específico de SSC GFR-a1. Se utilizó el trasplante de la espermatogonia para definir las capacidades funcionales de las poblaciones de células antes y después del enriquecimiento.

Los métodos inmunohistoquímicos fueron utilizados para identificar, caracterizar y localizar las células madre de la línea germinal de testículos de primates. Para estos estudios, los anticuerpos específicos para componentes de matriz extracelular (EC ) a6-integrina, SSEA-4 y GFR-a1 fueron utilizados para teñir de manera visible las secciones histológicas de los testículos de primates.

Los anticuerpos específicos para las células teñidas con a6-integrina localizadas adyacentes a la membrana de la base de los túbulos seminíferos, así como la membrana de la base de los túbulos seminíferos (figura 18). Un promedio de trece células de a6-integrina+ fue encontrado en cada sección transversal histológica del túbulo seminífero. Dentro de las secciones tubulares seminíferas, la mayor parte de las células de a6-integrina+ fueron también VASA + , confirmando su estado de células madre de la línea germinal. Cuantitativamente, hubieron más células de a6-integrina+ por sección transversal tubular que células GFR-a1 y los estudios de colocalización mostraron que aproximadamente el 60% de las células de a6-integrina+ también fueron GFR-a1+. Estos estudios inmunohistoquímicos combinados de los testículos de primate revelaron las células adyacentes a la membrana de la base de los túbulos seminíferos las cuales tenían colocalización de marcadores de superficie de las células de a6-integrina y SSEA-4 y con el marcador VASA específico de las células germinales y el marcador GFR-a1 específico de SSC, por ejemplo, los marcadores expresaron específicamente en las células madre de la línea germinal de los machos (figura 19).

El marcador de la superficie de las células GFR-a-1 fue expresado específicamente en las células localizadas en la membrana de la base de los túbulos seminíferos. Todas las células GFR-a-1+ también fueron positivas para el marcador VASA específico de las células germinales.

Todas las células SSEA-4+ fueron localizadas en la membrana de la base de los túbulos seminíferos de primate adulto y estas células también fueron positivas para la tinción VASA. La mayor parte de las células SSEA-4+ también fueron de a6-integrina + . También existió una colocalizacíón importante entre las células SSEA-4 y GFR-a1 mostrando que las células SSEA-4 son un marcador importante de la línea de células para las células madre de la línea germinal. Aproximadamente el 40% de las células de la espermatogonia en la membrana de la base de los túbulos seminíferos de las secciones transversales histológicas de testículos de primates expresaron las células SSEA-4.

Muy pocas células de Equipo-c+ fueron encontradas en los testículos de primate. Dentro de las secciones transversales tubulares la tinción de Equipo-c únicamente fue encontrada en las células localizadas en el lumen de los túbulos seminíferos. Todas las células de Equipo-c fueron también VASA+ mostrando que fueron células germinales diferenciadas. Ninguna tinción del Equipo-c fue encontrada en las células localizadas en la membrana de la base de las secciones transversales tubulares seminíferas. Estos descubrimientos indican que en las células madre de la línea germinal de primate existe el Equipo-c-.

Los marcadores Nanog fueron expresados abundantes en los testículos de primates. Los marcadores Nanog aparecieron como una tinción nuclear y fueron colocalizados con VASA en casi todas las células germinales en los túbulos seminíferos. La expresión de los marcadores Nanog fue más fuerte en las líneas germinales avanzadas localizadas en el lumen de los túbulos seminíferos comparadas con las células germinales no diferenciadas localizadas en la membrana de la base. El estudio de colocalización de Nanog y GFR-a1 mostró que todas las células madre de la línea germinal mostraron un nivel bajo de expresión de Nanog.

Los anticuerpos CD90 tiñeron solamente las membranas de la base y no tiñeron estructura celular alguna en los testículos.

La caracterización inmunohistoquímica de las muestras testiculares del primate mostró que las células madre de la línea germinal en testículos de primates adultos son positivas para a6-integrina, SSEA-4 y GFR-ct1 y son negativas para el Equipo-c.

Los testículos de los monos Rhesus eutanizados, en una edad de 3 a 7 fueron removidos quirúrgicamente y colocados en PBS suplementados con penicilina/estreptomicina (Cellgro e Invitrogen, respectivamente) y transportados durante la noche en hielo. Después de la remoción quirúrgica de la cápsula testicular, las muestras de biopsia fueron removidas para el análisis de histología y molecular. Los tejidos restantes tubulares seminíferos fuero finamente picados y digeridos con colagenasa A (1 mg/mL) (Roche) y Dnasa (10 U/mL) (Invitrogen) en un baño de agua de reciprocidad a 37°C durante 15 minutos. Después de la digestión de colagenasa, los tejidos no digeridos fueron sedimentados en unidad de gravidez y las células en el sobrenadante fueron removidas. Los tejidos no digeridos fueron diferidos adicionalmente en un coctel de enzima que consiste de 1.5 mg/mL de colagenasa A, 1.5 mg/mL de hialuronidasa de tipo V (Sigma) tripsina 0.5 mg/mL (Worthington Biochemical Corporation) 10 unidades/mL ADNasa ADEM en un baño de agua de reciprocidad a 37°C durante 20 minutos. El tejido digerido y sin digerir fue pasado a través de un colador de 70 pm en FBS en (suero fetal bovino; Hyclone) para desactivar las enzimas. Después de la centrifugación a una velocidad de 400Xg durante 10 minutos, los gránulos de células fueron resuspendidos en DMEM+ FBS al 10% y colocados en platos recubiertos 15 cm en C02 al 5% en incubador de aire humidificado al 95%.

La citometría de flujo fue utilizada para identificar los marcadores de superficies celulares específicos para las células madre de la línea germinal testicular de primates (figura 20). Con todo y los reportes de otros investigadores, las SSCs que no son de primate, recientemente aisladas de las células testiculares del primate adulto no expresaron la adhesión de células del epitelio/molécula de activación (EpCAM). Sin embargo, las células madre de la línea germinal fueron identificadas como una porción muy pequeña de la población de las células testiculares de primate de adultos total, menos del 1% del aislado de célula testicular total, en virtud de la expresión en la superficie de la célula del receptor GFR-a1 de GDNF. De un modo similar, y contrario a la experiencia con las células madre de la línea germinal testicular múridas (Ejemplo 1) las células madre de la línea germinal de primate adulto recientemente aisladas no expresaron el Equipo-c. Sin embargo, las células madre de la línea germinal de primate adulto (aproximadamente 2% de población de células testiculares aisladas) expresaron determinantes de carbohidratos en la superficie de la célula enlazados por medio de Dolichos biflourus agglutinin-(DBA), una lectina. Además, las células madre de la línea germinal de primate adulto expresaron los marcadores de superficie celular CD9, CD90 y CD49f (figura 21).

Para el aislamiento de las células madre de la línea germinal de primate, el Equipo-c fue regulado como la ventana de clasificación negativa/de origen contra la cual fueron tratadas ambas células CD90+ y CD49f+ para identificar las células doble positivas CD90+/CD49f+. La clasificación de las células doble positivas resultó en el aislamiento de las células madre de la línea germinal presente como de aproximadamente el 5.77% de las células totales en los aislados testiculares de primate adulto. Las últimas células doble positivas CD90 + /CD49f+ fueron recolectadas para uso adicional. La purificación todavía adicional fue lograda seleccionando las células del Equipo-c que fueron positivas para SSEA4, dando como resultado el aislamiento de una segunda población de células substancialmente purificadas que constituían aproximadamente el 2% de las células testiculares del primate adulto totales. Una purificación todavía adicional fue lograda seleccionado las células de Equipo-c que fueron positivas para todas las células CD90, CD49f y SSEA4, dando como resultado el aislamiento de la tercera población de células substancialmente purificadas que constituyó aproximadamente el 1.47% de las células testiculares totales del primate adulto totales Estos análisis citométricos de flujo combinados dieron como resultado el aislamiento y la purificación substancial de dos poblaciones de células madre de la línea germinal separadas del testículo de primates adultos con las siguientes propiedades: es decir, células (a) Thy-1+ y a6-integrina+ y (b) células SSEA-4+ que expresan ambos marcadores de superficie celular GFRal y VASA y alta actividad de telomerasa, las poblaciones de células en donde más del 50% de las células fueron positivas para las células GFR-a1 y VASA.

Para extender adicionalmente el análisis citométrico de flujo y la tinción inmunohistoquímica se clasificaron células testiculares de primate adulto recientemente aisladas de la manera siguiente: (i) a6-integrina + ; (ii) CD-90 + ; (iii) CD90 + /a6-integrina+/Equipo-c- (clasificación triple); y (iv) células SSEA-4 + . Las poblaciones de células testiculares modificadas y aisladas diferentes fueron probadas por la presencia del marcador de células de línea germinal el marcador VASA y SSC y el marcador GFR-a1 (figura 22). Las células no clasificadas contenían aproximadamente el 70% de VASA+ células, pero solamente el 10% de estas células se tiñeron positivamente para el GFR-a1. La clasificación justamente para la a6-integrina dio como resultado un aumento importante en las células tanto marcadores de la línea germinal como SSC es decir, poblaciones con 42.6% de células VASA+ y GFR-a1. La clasificación de células CD-90 solas o en combinación con el Equipo-c (clasificación triple) también aumentó de manera importante la proporción de células VASA+/GFR-a1 30% y 46.4%, respectivamente. La clasificación para células SSEA4 + solas, también dio como resultado un enriquecimiento en las células que expresan la línea germinal y los marcadores SSC es decir, poblaciones de células clasificadas en las cuales el 37.5% de las células fueron VASA+ y GFR-a1+.

Las propiedades funcionales de diferentes poblaciones de células testiculares de primates fueron determinadas antes y después de la purificación substancial probando su capacidad para volver a poblar la membrana de la base de los túbulos seminíferos en los testículos de los ratones rasurados e inmunodeficientes tratados con busulfan como fármaco quimioterapéutico. Para estos estudios, los ratones machos rasurados atímicos de 6 a 8 semanas que fueron tratados con busulfan (40 mg/kg). Un mes después, del tratamiento con busulfan 2x105 células testiculares de primate adulto fueron trasplantadas en los túbulos seminíferos por medio de inyección en la red de testículos. Para estos estudios, tres ratones recibieron un trasplante consistente de células no clasificadas aisladas recientemente, tres ratones recibieron un trasplante consistente de células clasificadas Equipo-c/SSEA-4+ aisladas recientemente y tres ratones recibieron un trasplante consistente de células clasificadas de Equipo-c/SSEA-4-aisladas recientemente.

Para identificar mejor las células de primate trasplantadas en los testículos de los ratones receptores, se utilizó el tinte vital de un éster de diacetato succinimidilo de carboxifluoreseína (CSFE) como un marcador fluorescente. El CFSE es un compuesto incoloro y no fluorescente hasta que los grupos de acetato son disociados por estearasa intracelular produciendo un producto altamente fluorescente. El último producto fluorescente fue bien retenido y fue fijado con fijador de aldehido, pero sin embargo, la intensidad fluorescente disminuyó exponencialmente con cada división de la célula. Para esta tinción vital de células, las células fueron recolectadas y lavadas una vez en 1XPBS con un contenido de BSA al 1%; y luego una vez en 1XPBS; seguido por incubación en 8 µ? de CSFE en 1XPBS a una temperatura de 37°C durante 10 minutos. Las células teñidas con tinte vital fueron lavadas con MEMa (Invitrogen) con un contenido de FBS al 2%; recolectadas por centrifugación en 400X durante 5 minutos; se volvieron a suspender en medios y contadas.

Dos semanas después del trasplante, los ratones fueron sacrificados y el número de colonias de células CSFE+ fue determinado microscópicamente en las secciones histológicas de los testículos de ratón (figura 23). Teóricamente, si las células madre de la línea germinal tienen un tiempo del ciclo celular de aproximadamente 72 horas, a las dos semanas posteriores al trasplante las células debían de haber pasado por de 2 a 3 duplicaciones celulares dando como resultado colonias de aproximadamente 4 a 8 células. Para el análisis estadístico la prueba ANOVA fue aplicada y el p<0.05 fue considerado importante.

Estos estudios del trasplante combinados mostraron que solamente la población de células SSEA-4+ con un contenido de células que expresan los marcadores GFR-a1 y VASA tuvo la capacidad de volver a poblar los testículos de ratón tratados con busulfan (figura 24). Estos descubrimientos muestran que estas células son células madre de linea germinal primordial.

Para investigar la condición de la división de células de las poblaciones respectivas de células, el contenido de ADN de las dos poblaciones fue investigado utilizando citometría de flujo (figura 25). Este análisis mostró que la población de células SSEA-4-+ tuvo un contenido de ADN celular que se asemeja al de las células en la etapa G0-G1 del ciclo celular. En contraste, las células que tienen marcadores de superficie Thy-1 y de a6-integrina tuvieron dos contenidos de ADN diferentes y separados, asemejándose ya sea a la etapa de G0-G1 del ciclo celular o la fase S. Los datos muestran que la población de células SSEA-4+ con los marcadores de superficie celular SSC representa una población quieta de células madre de la línea germinal progenitoras mientras que la población de Thy-1+ y a6-integrina+ de células representa una población que se divide activamente de SSCs (figura 27).

Los resultados muestran claramente que las células madre de la espermatogonia de la línea germinal en los testículos de primates adultos poseen características moleculares y fenotípicas similares pero diferentes de las SSC en los roedores. El examen inmunohistológico utilizando una variedad de células madre, células germinales y marcadores específicos de células madre de la espermatogonia revelaron que en las células GFR-a1 de primate es expresada específicamente la superficie de las células madre de la espermatogonia a lo largo de la membrana de la base de los túbulos seminíferos. Las células GFR-a1 es el receptor de GDNF las cuales son un regulador importante de la autorrenovación del SSC. Las células GFR-a1 fueron VASA+ indicando que son células germinales. La colocalización de a6-integrina con GFR-ct1 fue de 80% en las células localizadas dentro de los túbulos seminíferos de primates adultos. Las poblaciones de células enriquecidas seleccionando las células de a6-integrina + mostraron un nivel muy alto de colocalización con las GFR-a1, confirmando los descubrimientos utilizando los métodos inmunohistoquímicos para identificar las células madre de la línea germinal en las secciones de los testículos. La expresión de a6-integrina en el SSC de primate indica que este marcador es conservado entre las especies como ratón, mono tipie y células SSC humanas también posee este marcador en su superficie celular. La localización de algunas células de a6-integrina+ dentro de las células intersticiales fuera de los túbulos indica que este marcador solo no puede ser usado para el aislamiento de poblaciones altamente puras de SSC de los testículos de primates adultos.

Los SSCs comparten algunas pero no todas las características fenotípicas y moleculares con otras células madre, en particular, las células madre hematopoyéticas. El análisis de citometría de flujo utilizando una variedad de marcadores de superficie de células, revelaron que en los testículos de monos Rhesus adultos existen diferentes poblaciones de células que expresan la a6-íntegrina y Thy-1 y que la mayor parte de las células de los testículos de los primates fueron de Equipo-c. La tinción inmunohistoquímica de los testículos de los primates también mostró que todas las células a lo largo de la membrana de la base de los túbulos seminíferos fueron Equipo-c indicando que las células de a6-integrina+ fueron de Equipo-c-. La clasificación de la a6-integrina o Thy-1 solo dio como resultado el enriquecimiento de los marcadores SSC como lo muestra la tinción inmunohistoquímica. El ensayo de RT-PCR y telomerasa. De manera interesante, clasificando las células de a6-integrina + , Thy-1 y Equipo-c se tuvo el resultado del nivel de expresión más alto del marcador SSC PLZF como lo muestra el RT-PCR cuantitativo (figura 26A) y la actividad de telomerasa más elevada (figura 26B), indicando que la comparación de estos marcadores enriquece varias veces el SSC. Además también existe una población clara de células SSEA-4+ en los testículos de los primates las cuales también mostraron un alto nivel de actividad de telomerasa y expresaron un alto nivel tanto de marcadores germinales como de SSC (figura 28).

La tinción inmunohistoquímica mostró que las células SSEA-4+ también localizadas en la membrana de la base de los túbulos seminíferos son muy altamente colocalizadas con la a6-integrina y el GFR-a1. Los análisis citométricos de flujo mostraron que existe de aproximadamente el 5% al 7% de a6-integrina + , Thy-1 + , Equipo-c de células clasificadas en los testículos de primates adultos mientras que solamente están presentes del 2% al 3% de células SSEA-4 + . Esto también es consistente con los datos inmunohistoquímicos sobre las secciones de testículos que muestran que existe significativamente menos células SSEA-4+ encontradas por sección transversal del túbulo en las células de a6-integrina + . Esto también indica que el SSC en los testículos de primate tienen características fenotípicas de a6-integrina + , Thy-1 y Equipo-c con células SSEA4 + . La célula SSEA-4 es un antígeno embrionario específico de la etapa y es predominantemente encontrado en células pluripotentes similares a las células madre embrionarias. De manera interesante todas las células SSEA-4 coexpresaron el marcador de célula germinal VASA, sin embargo, solo una fracción de estas células se colocaliza con las células GFR-a1 indicando que este marcador se expresa solamente en subpoblaciones de células madres de la espermatogonia en los testículos del mono.

El análisis morfológico de los testículos de primate basado en la densidad de la tinción nuclear reveló que existen dos tipos de espermatogonia no diferenciada de esta especie, la espermatogonia AOSCura y Apái¡da, la espermatogonia A0SCura, se considera que va a servir de reserva de células madre y no se dividirá activamente, la espermatogonia Apáiida, se muestra como que será la célula SSC activa en los testículos de primate.

Utilizando el yoduro de propicio de tinte de ADN (Pl) en combinación con la citometría de flujo, se determinó que la población de células de SSEA-4+ de células madre de la línea germinal tiene contenidos diferentes de ADN al de las células Thy-1+, a6-integrina + . Aunque las células SSEA-4+ tuvieron un perfil de ADN similar al de las células que se dividen activamente, las células Thy-1+, a6-integrina + , mostraron un número acumulado de células detenidas en la fase S del ciclo celular. Además las células SSEA-4+ mostraron actividad de proliferación significativamente más alta que las células Thy-1+, a6-integrina+ como lomuestra la tinción de PCNA.

El marcador Nanog pluripotente el cual tiene un rol esencial en el mantenimiento de la célula ES en su etapa no diferenciada fue expresado abundantemente en los testículos de primate. La expresión de Nanog en todas las células germinales y no solamente en las células SSC indica un rol diferente para este factor de transcripción en la célula madre de la línea germinal comparado con la célula ES. Se ha mostrado que la eliminación del Nanog en las células germinales induce apoptosis en vez de la diferenciación indicando que el Nanog es un factor de supervivencia para las células germinales.

Se ha mostrado que en una de 3000 células en los testículos de ratón adulto son SSC. El porcentaje de SSC en los testículos de mono adulto basado en la tinción inmunohistoquímica con marcadores específicos de SSC GFRal y PLZF es muy similar a lo que se describió para los roedores. El estudio de trasplante de la espermatogonia también mostró que en los testículos de mono adulto existe aproximadamente el 0.3% de células SSCs.

Aquí se demostró que las células con tinción triple (CD90 + , CD49f+, Equipo-c) y las células SSEA-4+ muestran características moleculares y fenotípicas de las células SSCs, sin embargo solamente las células SSEA-4+ volvieron a poblar los testículos de los receptores después del trasplante de la espermatogonia. Esto indica que las células SSEA-4+ podrían representar las células SSC que se dividen activamente y las células teñidas triples podrían asemejar células madre tranquilas. De un modo interesante, tanto las células SSEA-4 como las células teñidas triples expresaron C-ret, en receptor de GNDF, el receptor de GDNF mientras que solamente las células clasificadas triples mostraron la expresión de PLZF. Ambas GDNF y PLZF es sabido que son reguladores principales de la autorrenovación de las células madre de la espermatogonia. Mientras que el GDNF regula la autorrenovación de SSC a través de la activación del factor de transcripción BCL6b, el PLZF mantiene la autorrenovación de las células SSC con un mecanismo todavía desconocido. El factor de zinc de leucemia promielocítica (PLZF) muestra inhibir el crecimiento celular en la transición de G1/S y transita a través de fase S por medio de la supresión de ciclina A la cual está disponible en una variedad de tipos de células. El facto PLZF también muestra inhibir el P21 otro regulador de la transición G1/S. Por lo tanto un alto nivel de factor PLZF da como resultado el bloqueo del ciclo celular y la quietud. El receptor alfa de ácido retinoico (RAR- ) ha mostrado invertir la inhibición del ciclo celular inducido por el factor PLZF aumentando la expresión de la ciclina A.

MATERIALES Y MÉTODOS Purificación substancial de células germinales de primate por citometría de flujo: La clasificación de citometría de flujo fue realizada utilizando un Clasificador de Células InFlux. Para la caracterización de la superficie y reclasificación, las células fueron teñidas con reactivos de anticuerpos específicos para los marcadores de superficie de la célula madre y los marcadores de célula madre de la espermatogonia en especies que no son de primates incluyendo anti-CD90-FITC, anti-CD49f-PE y anti-CD117-APC. Para estos análisis de marcador, las células fueron teñidas durante 30 minutos en un medio completo en hielo, lavadas una vez en regulador de tinción frío, se volvieron a suspender en medio de cultivo completo y se mantuvieron en hielo hasta el análisis citofluorométrico.

Clasificación magnética de células germinales de primate: La población de células de germinales de primate fue enriquecida por medio de la etiquetación por microcuentas magnéticas y pasar las células a través de una columna magnética. Las células testiculares de primate aisladas recientemente fueron etiquetadas con anticuerpos biotinilados para las células SSEA-4 o para las células a6-integrina y Thy-1 (Ebioscience, Abcam, BD Pharmigen, respectivamente). Una vez biotiniladas las células fueron etiquetadas con microcuentas magnéticas de estreptavidina (Miltenyi Biotec). Las células etiquetadas magnéticamente fueron seleccionadas pasando las células a través de columna a la presencia de un magneto. Las células etiquetadas magnéticamente fueron removidas de la columna removiendo la columna del magneto, liberando las células para ser lavadas fuera de la columna. Este proceso fue exitoso en el enriquecimiento de la población de células positivas para cada uno de los marcadores hasta de 22X del porcentaje original en células aisladas recientemente. Además, la clasificación magnética podría proporcionar una población tan alta como del 90% de células etiquetadas de manera pura. Este proceso de enriquecimiento fue usado en conjugación con citometría flujo fluorescente. Clasificando magnéticamente el aislamiento de células antes de realizar la citometría de flujo fluorescente, la cantidad de tiempo necesaria para descartar, las células etiquetadas de manera fluorescente fue reducida grandemente y el número de células etiquetadas de manera fluorescente y el número de células etiquetadas fluorescentemente que podrían haber sido descartadas fue aumentado de manera importante.

Tinción inmunohistoquímica de células germinales de primate: Los tejidos fueron fijados durante la noche en paraformaldehído al 4% (PF; Electron Microscopy Science); transferidos a sacarosa al 20% (Sigma) y congelados en OCT (VWR). Las criosecciones fueron preparadas en un espesor de 8 pm y almacenadas a una temperatura de -80°C. Las células clasificadas fueron fijadas en PF al 4%, se volvieron a suspender en 100mM de sacarosa en una cantidad de aproximadamente 25,000 células/10 µ I ; se transfirieron alícuotas de 10 µ I en platinas de vidrio recubiertas con ornitina/lisina; y las platinas fueron colocadas en una placa caliente a temperatura de 37°C hasta que se secaron. Las platinas fueron almacenadas a una temperatura de -80°C hasta el análisis.

Para la tinción inmunohistoquímica, las células en las secciones testiculares y las muestras clasificadas FACS fueron permeabilizadas utilizando Triton-X100 al 0.1%, y bloqueadas en cualquiera de una solución que contiene BSA al 2% y suero de oveja al 5%, o alternativamente en una solución que contiene BSA, al 2%, suero se cabra al 5% y Triton-X100 al 0.1%. El DAPI (Invitrogen) fue utilizado para la visualización nuclear. Después de lavados múltiples en 1X PBS + BSA al 2%, las células fueron conservadas utilizando Permafluor (Beckman Coulter). La distribución de los marcadores de superficie en las secciones de tejido y las células clasificadas fue evaluada utilizando el microscopio Olympus BX-61 adaptado con un software de elaboración de imagen SlideBook™. Para la localización de células testiculares de primates en los ratones o tejidos de primates, se analizaron 50 túbulos seminíferos diferentes. Por cada procedimiento de tinción de marcador diferente, se analizaron de 3 a 4 secciones diferentes y, para las muestras de células FACS, se analizaron por lo menos 200 células diferentes en por lo menos tres alícuotas diferentes.

Extracción de ARN de las células germinales de primate, análisis RT-PCR v análisis QRT-PCR: El ARN total celular fue aislado utilizando el mini equipo RNeasy (Qiagen) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. El ARN aislado entonces fue transcrito a un cADN utilizando el equipo Quantitect RT (Qiagen) y purificados con el equipo de purificación de PCR QIAquick. Para cada reacción de RT-PCR, se usaron una plantilla de cADN de 20 ng de cADN en un volumen de reacción de 25pL con HotStar Taq Plus y con diferentes cebadores respectivos. Todos los cADNs objetivo fueron amplificados por 30 ciclos. Los productos de amplificación fueron identificados por tamaño en un gel de agarosa al 2%. Para el QRT-PCR, se utilizaron 5ng de plantilla de cADN en un volumen de reacción de 25µ?_ con mezclador maestro Quantitect Sybr Green PCR (Qiagen), y las muestras fueron amplificadas utilizando un BioRad iCycler. Cada muestra fue probada por triplicado y normalizada a un control GAPDH.

Ensayo de telomerasa de células germinal de primate: Se empleó el protocolo de amplificación de repetición telomérica cuantitativa de tiempo real verde SYBR (RQ-TRAP). Los tejidos y gránulos de células fueron lavados una vez en PBS, se volvieron a suspender y se homogeneizaron en un regulador de lisis 1x Chaps con un contenido de inhibidor de RNaseOut (Invitrogen) en una concentración final de 1000 células/pL y 400 unidades/mL del inhibidor de RNaseOut. Después de 25 minutos de incubación en hielo, los lisatos de células fueron centrifugados a una temperatura de 4°C en una Microfuga de 16,000 rpm por 10 minutos. El sobrenadante fue transferido a un tubo de microcentrífuga fresco y las concentraciones de proteína determinadas midiendo la absorbancia en 280nm utilizando un espectrofotómetro ND-1000 (Nanodrop). Los volúmenes de reacción de telomerasa fueron de 25 L en una solución con un contenido de 500ng de lisato de proteína, una mezcla de PCR Verde SYBR Quantitect, l g de cebador TS, 0.5pg del cebador ACX y agua destilada libre de nucleasa. Cada muestra fue probada por triplicado junto con un control que no era de plantilla (regulador de lisis), un control positivo (células ESC) y una curva estándar preparada de alícuotas del lisato de células ESC humana que contenían 1000ng, 200ng, 40ng, 8ng ó 1.6ng de proteína. Utilizando el iCycler ¡Q5 (Bio-Rad), las reacciones fueron incubadas durante 20 minutos a una temperatura de 25°C durante 15 minutos a una temperatura de 95°C y amplificadas a 40 ciclos PCR bajo las siguientes condiciones del ciclo: 30 segundos a 95°C y 90 segundos a 60°C. Los valores del ciclo del umbral (Ct) fueron determinados de gráficas de amplificación de semi-logaritmo (aumentar el logaritmo en fluorescencia contra número de ciclos) y comparados con la gráfica estándar. El ajuste por omisión (default) del software para el umbral fue de 10 veces el promedia de la desviación estándar de la lectura de fluorescencia de cada depósito por los primeros 10 ciclos, excluyendo el ciclo 1. Las actividades de telomerasa para diferentes muestras de células testiculares de primates fueron leídas de la curva estándar y/o expresadas como un porcentaje de los valores registrados de los estándares de lisato de células ESC humanas.

Tabla 2. Composición Promedio de MEM-X de Primate Ejemplo 3 Expansión del Cultivo de Células Madre de la Línea Germinal de Primate Las células madre de la línea germinal (Ejemplo 2) después del aislamiento fueron transferidas a placas de MEF cultivadas en diferentes medios libres de suero incluyendo el Medio Libre de Suero de Ratón (MSFM), el Medio Libre de Suero de Rata (RSFM) o el medio MEM-X™. Los cambios morfológicos de las células y el número de colonias de células germinales por depósito fueron contados durante el cultivo. La mitad del medio fue cambiada cada tercer día.

Diez días después del cultivo, las colonias planas aparecieron en todos los tipos de medios (figura 29A). Las colonias en MEM-X mantuvieron su morfología mejor que otros medios de cultivo. El número de colonias encontrado en la población no clasificada fue más bajo que las células clasificadas. Entre los marcadores de superficie de células probados, el SSEA-4 y las células teñidas triple resultaron en la formación de colonias. El agotamiento de las células SSEA-4 + de las células de triple clasificación resultaron para muy pocas colonias, sin embargo el agotamiento del fenotipo de la clasificación triple de las células SEEA-4+ no cambió la habilidad de formación de colonias. Las células positivas para ambas SSEA-4 y la clasificación triple formaron el número más alto de colonias en el cultivo y las células agotadas de las células SSEA-4 y la clasificación triple no formaron colonia alguna. Entonces las colonias fueron teñidas para las células SSEA-4 (figuras 29B y 29C), GFR-a (figura 29D) y a6-integrina .

Ejemplo 4 Aislamiento de Células Madre de la Línea Germinal de Hembras Múridas Los ovarios de ratón de 40 a 60 crías postnatales OG2, transgénicas, en una edad de 2 a 5 días fueron disectadas bajo un microscopio de micro disecciones utilizadas para el aislamiento de células. Los ovarios fueron recolectados primero un plato de cultivo con un contenido de D-PBS frío suplementado con 4mM de EDTA. Utilizando una pipeta de 5ml, entonces los ovarios fueron transferidos a un tubo cónico de 50 mi. Después de la centrifugación y lavado, la solución de lavado D-PBS fue removida y los ovarios fueron suspendidos de vuelta en colagenasa (1 mg/ml) y Dnasa-I (20 unidades/ml); y colocados en un baño de agua a una temperatura de 37°C. Cada 10 minutos, los tejidos de digestión de ovario fueron interrumpidos físicamente por la pipeta y al final de la incubación (30 minutos), se agregaron 5 mi de FBS para neutralizar las enzimas. La suspensión de células resultantes fue pasada a través de un colador de 40pm para remover los desechos de tejidos y las células aisladas fueron recolectadas por centrifugación en una cantidad de 400XG durante 10 minutos. La solución de sobrenadantes de enzima-FBS fue removida y las células fueron suspendidas de nuevo en el medio de cultivo y se mantuvieron en hielo hasta que se usaron.

Las células madre de la línea germinal del ovario fueron purificadas substancialmente recolectando células GFP-positivas por citometría de flujo identificando la intensidad del fluorescente verde (figura 11 A), regulando tres canales para el Equipo-c (R2, R3 y R4) (figura 11B); y luego clasificando el R3 para la intensidad del Equipo-c (figura 11 C ) .

Utilizando la citometría de flujo, se detectaron las células GFP/Oct-4+ en ratones neonatales (figura 11A) y adultos (figura 11B) indicando la presencia de células madre de la línea germinal en los ovarios postnatales. El porcentaje de células madre de la línea germinal en el ovario del ratón disminuyeron significativamente con la edad. Aunque se encontraron del 1% al 2% de células GFP+ en los ovarios de los ratones neonatales, solamente el 0.05% estuvieron presentes en los ovarios adultos. Entre las células Oct-4 + , el 60% fueron negativas o expresaron niveles bajos del Equipo-c y 40% mostraron un nivel alto de la expresión del Equipo-c (figura 11C) indicando la presencia de dos poblaciones entre las células madre de la línea germinal. El análisis inmunohistoquímico reveló que las células GFP-Oct-4+ están presentes en todo el epitelio del ovario (figuras de la 12A a la 12C). El análisis RT-PCR mostró que las células GFP+ aisladas del ovario de ratón neonatal expresaron ambos tanto un marcador Oct-4 pluripotente como los marcadores de células germinales VASA y confirmando el Equipo-c la presencia de las células madre de línea germinal en esta población, aunque las células GFP- mostraron solamente la expresión de marcadores de células germinales (figura 13).

En contraste con las expectativas, las células de ovario adultos y neonatales aisladas recientemente mostraron muy poca actividad de telomerasa. Sin embargo, el análisis RT-PCR confirmó que las células GFP+ en la presentación del cultivo, como las células ESC expresaron células Oct-4 (figura 13). Las células expresaron Oct-4 (figura 13, columna 5) mientras que las células GFR no lo hicieron (figura 13, columna 6). Las células GFP+ expresaron los niveles más altos de VASA (figura 13, columna 5), que las células GFP. Las células GFP expresaron niveles más altos del Equipo-c que las células GFP + .

El marcador Equipo-c ha sido asociado con las células madre de la línea germinal de los machos en ciertos reportes científicos anteriores. Entre las células Oct-4 + , el 60% fueron negativos o expresaron niveles bajos del Equipo-c y el 40% mostraron un nivel alto de expresión del Equipo-c. Las células GFP+ aisladas del ovario de ratón neonatal expresaron tanto marcadores pluripotentes Oct-4 como marcadores de células germinales VASA y el Equipo-c. Los resultados combinados confirman la presencia de células madre de línea germinal en la población de células GFP+ aisladas de los ovarios de los ratones OG2.

Las células GFP+ cultivadas en capas de alimentador de MEF formaron colonias redondas y planas y algunas de las cuales tuvieron sus límites claramente definidos (figuras de la 14A a la 14C y 14E), pero otros no (figura 14F). Los representativos de los bordes claros y las colonias de bordes no claros fueron recolectados (figura 14B) y pasados en los MEFs utilizando colagenasa (figura 14D). Después de pasarlas, las células se asemejaron a colonias distintivas reconocibles por un agrupamiento central u ovalado estrecho de células redondas rodeado por células planas empacadas estrechamente planas que tienen una forma más epiteloide (figuras 14G a 141). Esta apariencia de la colonia fue continuada más allá del pasaje 4 (figuras 14J a 14K).

Como se esperaba, las colonias de células del ovario GFP+ tiñeron positivo para las células Oct-4 (figura 15A). En soporte de su identidad como células de la línea germinal, las células de estas colonias también se tiñeron positivo para el Nanog de factor de transcripción pluripotente (figura 15B). Además, estas células también expresaron el marcador específico de la línea germinal VASA (figura 15C) y la fosfatasa alcalina del marcador de célula madre (figura 15D). Los resultados combinados confirman el aislamiento, identificación, caracterización y pasaje en el cultivo de tejido de las células madre de la línea germinal en las hembras.

Las colonias GFP+ toleraron la digestión enzimática utilizando colagenasa y generaron nuevas colonias. Sin embargo no toleraron la tripsinización y la mayor parte de las colonias se diferenciaron después del tratamiento de tripsina. Las células GFP mostraron solamente la expresión de los marcadores de células germinales y no los marcadores de células madre. Después de varios pasajes, (por ejemplo, el pasaje 15) estas colonias diferenciadas retuvieron su morfología, pero la mayor parte de las células ya no expresaron el GFP, sugiriendo la desactivación del promotor Oct-4 y la diferenciación posible. Solamente unas cuantas células de cada colonia, principalmente las células grandes en el centro de la colonia, mostraron la expresión de GFP. Con el tiempo, estas células GFP+ parecieron formar células ovaladas muy grandes hasta de 40µ?? que estuvieron de residentes en la estructura que tiene similitud morfológica con los folículos del ovario (figura 16A y 16B). Eventualmente, las células GFP+ ovaladas separadas de la colonia, es decir, tomadas de la aparición de los oocitos primarios (figura 16C). Generalmente, los resultados soportan la noción de que las células madre de la línea germinal del ovario substancialmente aisladas y polificadas se diferencian y maduran ex-huésped, originando los oocitos primarios.

La presencia y la caracterización de estas células similares a oocitos grandes fue confirmada mediante el aislamiento y purificación substancial de ellas de los cultivos de la figura 16 de la manera siguiente: utilizando cuentas de dimensionamiento de citometría de flujo estándar se generó una regulación ( 1) que muestra todos los eventos de 15 micrómetros (µ), y más pequeñas; las células MEF fueron una población homogénea todas acumuladas en R1 (figura 17A); los números importantes de células grandes ( > 15 µ ) en los cultivos de células germinales de la figura 206 cultivadas en MEF (figura 208B). Algunas de estas células fueron de un diámetro de aproximadamente 60 a 70 micrómetros.

MATERIALES Y MÉTODOS Cultivo de células madre de la línea germinal del ovario: Las células GFP+ fueron cultivadas en alimentadores de MEF en un medio PM-1™ en una concentración de 5000 a 10000 por depósito de una placa de 4 depósitos. El cultivo fue mantenido a una temperatura de 37°C y la mitad del medio fue cambiada cada tercer día. Cada dos semanas las células fueron transferidas ya sea mecánicamente o enzimáticamente (colagenasa) a una nueva placa MEF.

Caracterización de células madre de línea germinal del ovario: Las células GFP-positivas recientemente aisladas fueron usadas para el ensayo de telomerasa y la elaboración del perfil de expresión del gen. Para la histología del ovario, los ovarios fueron fijados en formaldehído al 4% (PFA) en sacarosa 1M durante la noche a una temperatura de 4°C y montadas en un medio de congelación de criostato. Se prepararon secciones de cinco mieras y la localización de las células GFP+ fue determinada utilizando un microscopio fluorescente. La localización de las células madre de la línea germinal en el ovario fue confirmada por la etiquetación doble Oct-4 y VASA. Para la inmunohistoquímica (ICC), las células madre de la línea germinal del ovario cultivadas fueron fijadas en PFA al 2% por 30 minutos a temperatura ambiente, lavadas en PBS y mantenidas a una temperatura de 4°C. Para caracterizar las células madre de la línea germinal del ovario cultivadas, VASA, Oct-4, Nanog y la tinción de fosfatasa alcalina fueron realizadas utilizando un ICC de campo de brillo, como se describirá con mayor detalle más adelante.

Análisis RT-PCR v QRT-PCR: El ARN celular total fue aislado utilizando un mini equipo RNeasy (Qiagen) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. El ARN aislado fue entonces transcrito utilizando el cADN de un equipo RT Quantitect. El cADN transcrito fue purificado utilizando el equipo de purificación de PCR QIAquick. Para cada reacción de RT-PCR, se utilizaron 20 ng de la plantilla de cADN en un volumen de reacción de 25 µ?_ con HotStar Taq Plus (Qiagen) y los cebadores apropiados. Todos los objetivos fueron amplificados por 30 ciclos. Los productos de amplificación fueron identificados por tamaño en un gel de agarosa al 2%.

Para el análisis QRT-PCR, 5 ng de la plantilla de cADN fueron utilizados en un volumen de reacción de 25 pL con el mezclador maestro de PCR de Verde Sybr de Quantitect y las mezclas de reacción fueron amplificadas utilizando el BioRad iCycler. Cada muestra fue ensayada por triplicado y normalizada con el control GAPDH.

Ejemplo 5 Aislamiento de las Células Madre de la Línea Germinal de Humanos Se utilizaron para este estudio testículos humanos recolectados como biopsias testiculares de pacientes con azospermia no obstructiva o los tejidos remanentes de testículos recolectados después de la orquiectomía. Todos los tejidos fueron donados con el consentimiento informado de los pacientes. Los tejidos fueron transferidos en antibióticos de PBS a una temperatura de 4°C dentro de 24 horas de la recolección. El procedimiento de procesamiento del tejido testicular humano es similar al de los primates descritos en el Ejemplo 2.

Antes del aislamiento de las células, la muestra de tejido fue tomada por ICC y dos piezas pequeñas de los testículos fueron tomadas para las extracciones de ARN y ADN. Después del aislamiento de las células y la determinación de la viabilidad y número de células, se tomaron muestras para el análisis de ARN y ADN. Los métodos para las extracciones de ICC, ARN y ADN son similares a las de los primates que se describieron en el Ejemplo 2. Además, las células fueron etiquetadas por la expresión de los marcadores de superficie celular anteriormente mencionados para la separación de células madre de la línea germinal de primates que fueron utilizadas por la clasificación magnética de células y la citometría de flujo. Los anticuerpos y métodos utilizados para la cítometría de flujo son similares a los usados para la separación de células madre de la línea germinal de primate como se describieron en el Ejemplo 4.

La población de células germinales también fue enriquecida etiquetándola con microcuentas magnéticas y pasando las células a través de una columna magnética. Las células testiculares recientemente aisladas fueron etiquetadas con anticuerpos biotinilados para las células SSEA-4 o las células a6-integrina y Thy-1. Una vez biotiniladas, las células fueron etiquetadas con microcuentas magnéticas de estreptavidina, las células etiquetadas magnéticamente fueron seleccionadas pasando las células a través de una columna en la presencia de un magneto.

Las células etiquetadas magnéticamente fueron removidas de la columna, removiendo la columna del magneto y liberando las células para que sean deslavadas de la columna. Este proceso fue exitoso para enriquecer la población de células positivas para cada uno de los marcadores hasta de 22X, del porcentaje original en células aisladas recientemente. Además, la clasificación magnética podría proporcionar una población tan alta como células etiquetadas de manera pura al 90%. Este proceso de enriquecimiento fue utilizado en la conjugación con citometría de flujo fluorescente. Clasificando magnéticamente las células antes de realizar la citometría de flujo fluorescente, la cantidad de tiempo necesario para clasificar las células etiquetadas fluorescentemente fue reducido de manera importante y el número de células etiquetadas fluorescentemente que podrían ser clasificadas fue aumentado de manera importante.

Las células clasificadas entonces fueron utilizadas para el análisis de RT-PCR y de ADN. También, algunas muestras de las células fueron sometidas a un ensayo de trasplante de la espermatogonia utilizando ratones inmunodeficientes como receptores. Las técnicas para el trasplante de las células madre de la espermatogonia son similares a las de ratón y primate descritas en los Ejemplos 1 y 2.

La tinción inmunohistoquímica en secciones congeladas preparadas tanto para las biopsias testiculares como para el remanente del tejido de los testículos revelaron que existen muchas células de a6-integrina+ en la membrana de la base de las secciones transversales tubulares. También las células SSEA-4+ y las células GFRa1+ fueron encontradas en la membrana de la base de los túbulos seminíferos.

Después de que se realizó el ICC: los tejidos de testículos humanos totales (THT) teñidos para SSEA-4 y VASA (figura 30); teñidos con THT para GFR-a y VASA (figura 31); teñidos con THT para VASA y Nanog (figura 32); teñidos con bHT-1 (biopsia de tejido de testículos humanos) para células SSEA-4 y a6-integrina (figura 33). Los controles negativos consistieron de secciones de testículos humanos teñidos solamente con anticuerpo secundario (figura 34). Las células SSEA-4 + clasificadas con cuentas magnéticas THT fueron trasplantadas en testículos de ratones receptores tratados con busulfan y después de un mes fueron seccionadas y teñidas para los siguientes marcadores: de células SSEA-4 y proteína nuclear humana (HNP, figura 35); células de a6-integrina y HNP (figura 36); células SSEA-4 y a6-integrina (figura 37). Los controles negativos consistieron de células THT trasplantadas en secciones de testículos de ratón teñidas solamente con anticuerpo secundario (figura 38). Todas las tinciones contenían tinte nuclear general.

El análisis de citometría de flujo confirmó la observación inmunohistoquímica y las poblaciones positivas para las células de a6-¡ntegrina se encontraron en las muestras recolectadas de los testículos humanos. Además, se encontró una población distinta de células Thy-1+. La colocalización de células Thy-1 y de a6-integrina mostraron que existen tres subpoblaciones de células Thy-1+ dentro de los testículos humanos: 1) una media de Thy-1 y baja de a6-integrina, 2) una alta de Thy-1 y media de a6-integrina, y 3) una alta de Thy-1 y negativa de a6-integrina. La mayor parte de las células de a6-integrina+ fueron Thy-1-. También existió una población clara de células SSEA-4 + (del 10% al 12%) y de células GFR-a+ (del 1% al 5%) encontradas en los testículos humanos. La clasificación magnética mejoró de manera importante el porcentaje de células SSEA-4+ a 44% indicando un aumento de cuatro veces para este marcador.

El análisis RT-PCR cuantitativo reveló que entre las muestras probadas de células SSEA-4+ y células GFR-a+ expresan los niveles más altos de marcadores de las células madre de la espermatogonia incluyendo las células C-RET, PLZF, y TERT y los marcadores de células germinales incluyendo VASA y DAZL. La actividad de telomerasa es indicativa de células madre de la espermatogonia. El trasplante de células madre de la espermatogonia reveló que las células SSEA-4+ colonizan los testículos de los ratones receptores y las vuelven a poblar, indicando que estas células son células madre de la espermatogonia funcionales.

Se ha mostrado que los ratones machos no fértiles se pueden hacer fértiles a través del trasplante de células madre de la línea germinal de machos (GSC's) de un ratón donante y que estos ratones pueden entonces producir crías. Sin embargo, las propiedades de los ratones derivados de este método no han sido previamente examinadas. El objetivo de este estudio fue determinar las propiedades de los ratones derivados del trasplante de células GSC y comparados con los patrones de crecimiento conocidos de la cepa de origen. La figura 45 ilustra el crecimiento promedio de machos (figura 45A) y hembras (figura 45B). Los ratones F1 criados a través de la cría de ratones derivada de los trasplantes de GSC en los machos. Estos índices de crecimiento son similares a los índices de crecimiento de los ratones de origen proporcionados por el proveedor (datos no mostrados).

Ejemplo 6 Características Fenotípicas de Células Madre de la Espermatogonia Humana Las células testiculares humanas fueron enriquecidas por las células madre de la espermatogonia (SSCs) mediante la clasificación magnética de la célula SSEA-4 y la población enriquecida fue microinyectada en los testículos de un ratón recipiente. Un mes después del trasplante, los testículos fueron recolectados y se hicieron criosecciones. Para identificar las células humanas en los testículos de ratón, se determinó el uso del anticuerpo de proteína nuclear humana (HNP) conjugado con Alexa-488. La colocalización de HNP con células germinales, células somáticas, células madre y marcadores pluripotentes (Tabla 3) fue utilizada para evaluar las características fenotípicas de las células SSC humanas en los testículos de ratón.

La colonización extensa de células humanas detectada por la tinción de HNP en los testículos de ratón, indica la presencia de una población altamente enriquecida de SSC en las células clasificadas magnéticamente SSEA-4. Todas las células humanas colonizaron los testículos de ratones y fueron positivamente teñidas para el marcador de la célula germinal VASA y negativamente teñidas por LHR, un marcador para las células testiculares de Sertoli y de Leydig. Esto indica que todas las células colonizadas son células germinales. Entre los marcadores usados en este estudio solamente el 15% de las células humanas expresaron las células SSEA-4, el 31% expresó la a6-integrina y el 45% de ellos expresó las células GPR125 en su superficie. Casi todas las células humanas que colonizaron los testículos de ratón expresaron el Equipo-c indicando que este marcador es necesario para la auto-renovación de la célula SSC. Entre los testículos marcadores pluripotentes, ninguna célula Oct-4+ o TRA- 160+ fueron encontradas, pero el 29% de las células humanas mostraron la expresión de Nanog. Esto indica que existe una población de células entre las células SSCs humanas con características pluripotentes. Casi todas las células SSEA-4 también fueron positivas para la a6-integrina. También, todas las células SSEA-4+ fueron positivas para el Equipo-c indicando que solamente la población del Equipo-c+ de células SSCs tiene la capacidad de colonización de los testículos receptores.

Tabla 3 Este estudio demuestra claramente que las células SSCs humanas tienen características fenotípicas de VASA + , Equipo-c + , LHR-, TRA1-60-, Oct4- y las subpoblaciones de células SSCs humanas son células SSEA4 + , a6-integrina + , GPR125+ y Nanog + . Esto indica que están presentes poblaciones diferentes de células SSCs en los testículos humanos.

El Receptor de Hormona Luteinizante (LHR) no se colocaliza con las células germinales de monos, humanos, o ratones como lo indican los estudios de colocalización de VASA, SSEA4, GFRa, y a6-integrina. El LHR es expresado en las células de Sertoli y Leydig indicado por la localización y morfología de dichas células positivas. La conexina-43 aparece para teñir tanto las células germinales localizadas en la membrana de la base, las células de Sertoli, y posiblemente las células de Leydig.

Ejemplo 7 Crioconservación de los Tejidos de la Línea Germinal de Hombres El tejido testicular de hombres con un contenido de células madre de la espermatogonia es obtenido como en el Ejemplo 6. Cualesquiera células aisladas o tejidos testiculares son crioconservados. Adicionalmente, los pequeños segmentos de túbulos seminíferos son conservados para utilizarse en la maduración ex-huésped.

Las células o tejidos son crioconservados en una solución que comprende al menos un crioprotector incluyendo, pero sin limitarse a, dimetíl sulfóxido (DMSO), etilénglicol , glicerol, y propanediol; al menos un medio de cultivo incluyendo, pero sin limitarse a, DMEM, MEM y los medios de propiedad descritos anteriormente; al menos un agente adicional incluyendo, pero sin limitarse a, sacarosa, dextrano, un substituto de suero y regulador HEPES. En un ejemplo, la solución comprende los medios CS-10 de CryoStor™ (BioLife Solutions Inc.). Las células o tejidos son congelados ya sea por métodos convencionales o en una cantidad controlada.

Para descongelarlas, las células madre de la línea germinal crioconservadas son suspendidas en 1.5 mL de DMEM con una concentración de DMSO del 10%. La suspensión de las células es entonces diluida a 50 mL con el medio para traer la concentración del DMSO al 0.3%. Las células entonces son centrifugadas, los medios aspirados, y las células se vuelven a suspender en medios para traer la concentración residual del DMSO a no más del 0.012%.

Con el objeto de determinar si los testículos deben ser crioconservados en la suspensión de células o en la forma de tejido, los testículos de ratones prepubertos de dos a cinco días de edad fueron obtenidos y algunos testículos fueron crioconservados como tejidos y algunos fueron disociados a una suspensión de una sola célula antes de la crioconservación. El protocolo de congelación de cantidad controlada fue utilizado en ambos casos. Después de la descongelación, el número de células totales recuperadas, la viabilidad y los marcadores de la superficie de las células fueron analizados para determinar la proporción de las células germinales, células somáticas y células madre de la línea germinal en cada suspensión. Los resultados indican que la crioconservación de las células son mejores que el tejido. Aunque las células de testículos de ratón crioconservadas son aproximadamente un 95% viables, las células aisladas de tejidos congelados son viables aproximadamente en un 80% (figura 48).

También fue determinado que el número apropiado de células por volumen del medio de crioconservación para utilizarlo con las células testiculares porcinas. Las células fueron obtenidas de testículos de cerdos prepubertos (~3 meses de edad) y se volvieron a suspender en medio de congelación en una concentración de 2.5, 5, 10 y 20 x 10 /mi y fueron congelados bajo un protocolo de congelación de cantidad controlada. Después de descongelarlas, el número de células total recuperadas, la viabilidad y los marcadores de la superficie de las células fueron analizados para determinar la proporción de las células germinales, células somáticas y células madre de la línea germinal en cada suspensión. La concentración de células no tuvo efecto en su, viabilidad o composiciones celulares (figura 49). Las células pueden ser congeladas en bolsas o en criofrascos.

Debido a la falta de disponibilidad del material de testículos humanos prepubertos, los testículos de humanos adultos también fueron estudiados. Las muestras de los testículos de los hombres jóvenes adultos (dos muestras) que pasaron por la cirugía trans-sexual también fueron usadas para guardarlas en el banco. También las biopsias de los testículos (tres muestras) donadas de una clínica de fertilidad fueron utilizadas para el tejido y guardar en los bancos las células. Las células de los testículos demostraron alta viabilidad después de descongelarlas utilizando congelación de cantidad controlada y la viabilidad no fue afectada por la densidad de las células y los medios de transporte diferentes pero la viabilidad fue reducida después de 72 horas del transporte (figuras 50A y 50B).

Adicionalmente, se determinó si las células de los testículos eran mantenidas mejor después de la crioconservación utilizando la congelación manual o por medio de una congelación lenta en un ambiente controlado. Los testículos de ratones prepubertos de dos a cinco días de edad y testículos de porcinos prepubertos de tres meses de edad también fueron utilizados para este experimento, algunas células fueron congeladas manualmente y algunas con un protocolo de congelación de cantidad controlada. Después de descongeladas, el número total de células recuperadas, la viabilidad y los marcadores de la superficie de las células fueron analizados para determinar la proporción de células germinales, células somáticas y células madre de la línea germinal en cada suspensión. La crioconservación de células múridas bajo protocolos de congelación congeladas producen células con características similares a la congelación manual (Tabla 4).

Tabla 4 na = no disponible; M = congelación manual; CRF = congelación de cantidad controlada.

Tabla 5 Ejemplo 8 Crioconservación de Tejidos de la Línea Germinal Femeninos Una diferencia principal entre la gametogénesis masculina y femenina es que en la oogénesis femenina se encuentra una etapa más avanzada que la masculina en la etapa prepuberta. Aunque en los testículos solamente las células germinales que van a ser vistas son células madre de la espermatogonia y sus precursores, en el ovario, los oocitos dentro de los folículos primordiales son considerados como las unidades reproductivas funcionales. Actualmente, para conservación de la fertilidad femenina en una edad prepuberta se encuentran dos opciones disponibles: 1) La crioconservación de los segmentos del ovario. 2) La crioconservación de los folículos primordiales. La crioconservación de los ovarios humanos ya sea por protocolos de congelación lenta o con vitrificación ha sido hecha exitosamente. Basados en estos resultados, preparando una capa muy delgada del epitelio de la superficie de los ovarios se requiere conservar los componentes foliculares necesarios para la regeneración de los ovarios. Los ovarios después de la congelación/descongelación y el trasplante pueden resultar en una restauración consistente de la fertilidad y el nacimiento de crías saludables en los ratones.

Para los ovarios crioconservados, las partes delgadas del ovario (<1 mm) de mujeres en edad prepuberta serán preparadas y cortadas en piezas pequeñas. Una combinación de DMSO, etilénglicol (EG) y substituto de suero (SS) en DMEM se utilizará como medio de congelación. La vitrificación será conducida de acuerdo con el siguiente protocolo: (1) equilibrar en EG al 7.5% y DMSO al 7.5% en SS al 20% por 25 minutos, (2) equilibrar en EG al 20% y DMSO al 20% en sacarosa 0.5 M por 15 minutos hasta que se hunden los tejidos, y (3) colocar los tejidos en las tiras de metal y sumergirlos directamente en nitrógeno líquido. Para descongelar el tejido, las tiras de metal son sumergidas directamente en sacarosa 1 M a una temperatura de 37°C por al menos un minuto y luego son transferidas a sacarosa 0.5 M por cinco minutos a temperatura ambiente. El tejido descongelado entonces es lavado dos veces en el medio de base sin crioprotector.

También es determinado si los ovarios son mantenidos mejor después de la crioconservación del tejido o la suspensión de las células en un modelo de animal más cercano al humano. Los tejidos del ovario de los monos prepubertos y adultos son utilizados en este estudio. A la llegada de los ovarios estos son cortados y la corteza es separada de la médula. La corteza del ovario es entonces cortada en piezas pequeñas (2 x 2 mm). La mitad de las piezas son usadas para la congelación de tejidos y la otra mitad son sometidas al cortador de tejidos y la digestión enzimática para el aislamiento de los folículos y células. Son utilizados crioprotectores diferentes y protocolos de congelación. La viabilidad y supervivencia de la célula y folículos congelados bajo diferentes condiciones es analizada y descongelados por citometría de flujo y para la apoptosis.

Ejemplo 9 Transporte de Células Germinales v Tejidos Este estudio determinó que medios de transporte son más adecuados para embarcar los testículos. También, la densidad correcta de las células para la crioconservación de las células de los testículos fue investigada. Debido a la falta de disponibilidad de testículos humanos de muchachos prepubertos, se utilizaron testículos porcinos. Cada testículo fue cortado en diez piezas y un número igual de piezas fue dividido en dos tubos: 1) con un contenido de MEM, y 2) con un contenido de PBS. Al momento de la llegada, el tejido fue disociado a células solas y las células congeladas en diferentes densidades de 2.5 a 20 x 106/ml. Los resultados indican que ambos el MEM y el PBS pueden soportar los testículos humanos durante el embarque y también la viabilidad de las células no es afectada por la densidad de las células (figuras 51A y 51B).

Adicionalmente, el tiempo máximo que el tejido puede ser mantenido en una caja de embarque validada antes del procesamiento de la célula fue determinado. Los testículos de ratas prepubertas fueron utilizados para este experimento y los tejidos fueron mantenidos en la caja de embarque validada por hasta 96 horas después de la remoción del cuerpo. Los resultados demostraron claramente que la viabilidad es mantenida hasta por 48 horas (figura 52). La viabilidad de las células cayó significativamente después de 72 horas del embarque, sin embargo, todavía del 85% al 90% de las células sobrevivieron después de cuatro días del embarque.

Ejemplo 10 Ensayo de Potencia de Ratón - Evaluación de Fertilidad El trasplante de células madre de línea germinal de machos de un animal donante a los testículos de un receptor no fértil han sido previamente descritos. Los donantes de células germinales colonizan los testículos del receptor y producen esperma derivada del donante, de modo que el macho receptor puede distribuir el material genético del donante de células germinales. El trasplante de células germinales representa un ensayo de reconstitución funcional para las células madre de línea germinal de machos y como tal ha aumentado bastante nuestra capacidad para estudiar la biología de las células madre en los testículos y definir los fenotipos de la infertilidad. Primero desarrollado en los roedores, la técnica ahora ha sido usada en un número de especies de animales, incluyendo animales domésticos, pollos y peces. Existen aplicaciones mayores para esta tecnología en animales: primero, para estudiar los aspectos fundamentales de la biología de la célula madre de la línea germinal de los machos y la fertilidad del macho; después, para conservar el potencial reproductivo de los individuos valiosos genéticamente por el trasplante de células germinales de machos dentro o entre las especies. Por lo tanto, el trasplante de células germinales de macho es un método valioso únicamente para el estudio, conservación y manipulación de la fertilidad del macho en los animales.

Para validar el ensayo de trasplante de células germinales GFP, el número óptimo de trasplantes de células germinales GFP fueron determinados para el trasplante en ratones tratados con busulfan. El número óptimo de células de trasplante de las células germinales GFP es determinado, apareando los ratones machos rasurados de células germinales GFP transplantados con un ratón hembra rasurado. La cría de GFP+ de estos apareamientos determinará si las células germinales GFP trasplantadas restauraron la fertilidad y produjeron crías de GFP viables. Las crías de GFP son entonces usadas para validar el ensayo de trasplante de células germinales GFP comparando los parámetros descritos debajo con las células totales trasplantadas y/u otros parámetros (expresión del marcador, peso de los testículos, etc.). Después de que las crías de GFP nacieron, esas crías de GFP del engendro de células germinales GFP trasplantadas son usadas para verificar la fertilidad y la transmisión de la línea germinal de las células germinales GFP en la siguiente progenie mediante el apareamiento nuevo con los ratones rasurados.

Cada ratón macho transplantado con GFP+ individual es apareado con cuatro ratones hembra rasurados. Las dos hembras son apareadas con cada macho todas las noches. Las cuatro hembras son cicladas cada noche dependiendo de su ciclo de calor. Los machos aparearán por tres semanas después de una semana de descanso, y comenzarán otro ciclo de tres semanas de apareamiento sí las hembras no han formado un tapón vaginal. Estos procedimientos darán a las hembras la oportunidad óptima de embarazarse, mientras que los períodos de descanso permitirán que los machos se recuperen de los apareamientos continuos. Cada mañana, los ratones son revisados por tapones vaginales como un indicador positivo de un apareamiento exitoso. Este procedimiento de apareamiento es continuado de cinco a siete meses después del trasplante. Si ninguna hembra se embaraza, continuarán los apareamientos por dos meses adicionales.

Después del período de apareamiento, se detienen los apareamientos y los testículos de los ratones transplantados con GFP son analizados por análisis de flujo, análisis de esperma para GFP, e histología para determinar el número del marcador de GFP+ y SSC+ expresado en los testículos. La progenie F1 también es ensayada por GFP utilizando fluorescencia y PCR. Como los ratones rasurados no tienen pelo, cualquier cría con pelo habría sido generada del esperma de GFP positivo.

Con el objeto de evaluar la fertilidad y la transmisión de la línea germinal de GFP o el color de recubrimiento de la progenie F1, se les permite madurar a la edad dos meses y luego son apareados con dos ratones rasurados (macho o hembra) por dos meses para asegurar los embarazos. Después de que un ratón F1 produjo una progenie F2, los ratones F2 de GFP+ y/o el color de recubrimiento + el ratón serán seleccionados por GFP con fluorescencia y PCR. Esto verificará la transmisión de la línea germinal transgeneración de las células GFP + . La progenie F2, la cual probó ser de GFP+ es entonces sacrificada y los órganos reproductivos recolectados para histología para verificar la espermatogénesis completa con el esperma de GFP + .

Las células de testículos frescas aisladas de los ratones prepubertos pueden restaurar la fertilidad en los ratones tratados con busulfan y el 87% de los ratones volvieron a ganar su fertilidad ya sea por el apareamiento natural o utilizando técnicas reproductivas asistidas. Para determinar si las células testiculares crioconservadas pueden restaurar la fertilidad, se trataron ratones rasurados macho de cinco a ocho semanas de edad con busulfan y los animales se hicieron infértiles después de un mes. Las células de crías de GFP+ prepubertas de dos a cinco días de edad fueron congeladas y usadas como células del donante para el trasplante. Los ratones recibieron uno de cuatro regímenes de tratamiento: nueve ratones recibieron células (5*105) que han sido manualmente congeladas; nueve recibieron células (5x105) que han sido congeladas con un método de congelación de cantidad controlada; nueve recibieron células (1.25*105) que han sido congeladas con protocolo de congelación controlado; y otras nueve recibieron un número pequeño de células (5*104) que han sido congeladas con un protocolo de congelación de cantidad controlada. Tres meses después del trasplante, los animales fueron apareados con dos hembras cada uno y la eficiencia del apareamiento fue determinada mediante la revisión del tapón y el número de embarazos y las crías de GFP fueron registrados. Uno de estos animales que volvió a ganar la fertilidad, pero produjo crías rasuradas, fue sacrificado y la presencia del esperma de GFP fue determinado utilizando citometría de flujo y microscopio fluorescente (figura 46). El análisis de citometría de flujo de éstos mostró que existe una pequeña población de esperma de GFP+ en los testículos izquierdos mientras ningún esperma de GFP+ fueron encontrados en los testículos derechos. Los túbulos GFP+ se encontraron en ambos testículos derecho e izquierdo de los ratones indicando que las células trasplantadas han sobrevivido y colonizado los testículos receptores. Basados en los datos de flujo solamente el 0.5% de los espermatozoides son GFP positivos.

Ejemplo 11 Correlación Entre la Morfología de los Testículos y la Fertilidad: Un grupo de ratones usados en el ensayo de potencia se mantuvieron en apareamiento durante 5 meses y algunos de ellos habían probado ser fértiles y algunos no indujeron embarazo alguno y fueron por lo tanto calificados como no fértiles (por medio del apareamiento natural estos ratones pueden haber tenido una cuenta baja de esperma). Estos animales fueron sacrificados y los testículos fueron removidos quirúrgicamente y el esperma fue recolectado y congelado. El esperma congelado fue utilizado después para la separación del esperma GFP+ por medio de citometría de flujo para ser utilizado para la inyección de esperma intra citoplásmica (ICSI). Estos testículos fueron pesados primero y luego analizados bajo una microscopía de disección equipado con luz fluorescente adecuada para la detección de GFP y CFP. Después de un examen simple los testículos fueron fijados en PFA al 4% y las secciones congeladas se hicieron para el examen histológico.

Los testículos de los animales transportados fueron más pesados de una manera significativa que los del grupo de control no trasplantados (figura 39). El examen simple de los testículos bajo el microscopio de micro disección, reveló que todos los animales trasplantados con las células donantes GFP desarrollaron células espermatogénicas GFP+ como lo indican los túmulos GFP. Basados en la intensidad, la longitud y distribución de las áreas teñidas con GFP los testículos fueron calificados del 1 al 5, siendo entonces el 1 la calificación menor y el 5 la calificación de integración más alta. De modo interesante, los ratones fértiles (n = 2) demostraron la calificación de integración más alta (5), mientras que existió una variación grande entre los animales no fértiles (n=4) con una calificación promedio de 2.75 (Tabla 6). Las imágenes representati as de los testículos fértiles y los no fértiles después del examen simple se muestran en las figuras 40 y 55. El examen histológico de estos artículos demostró que los animales fértiles tuvieron un porcentaje de túbulos de más alto de manera significativa teniendo el esperma como fue comparado con los ratones no fértiles. Como se esperaba, los animales no fértiles mostraron porcentajes significativamente más altos de túbulos vacíos o llenos parcialmente (figura 41). Inesperadamente, el porcentaje de los túbulos con células GFP + fue más alto en los ratones no fértiles comparados con los ratones fértiles (figura 42).

Tabla 6. Calificación GFP después de un examen simple Los resultados demuestran claramente que el peso de los testículos aumentó de manera importante después del trasplante. El examen histológico y simple ambos mostraron la repoblación extensa de las células GFP+ en todos los animales trasplantados. Aunque la calificación GFP basada en el examen simple mostró una correlación positiva con la fertilidad, el porcentaje de túbulos GFP+ mostró una correlación inversa. Existe una correlación positiva entre el número de túbulos con espermatogénesis completa y la fertilidad y una correlación negativa entre el número de túmulos vacíos y la fertilidad.

Los resultados indican que el peso de los testículos, la calificación GFP, y la histología de los testículos son indicadores confiables de la fertilidad y pueden ser utilizados en el futuro para la determinación del éxito pronosticado del el trasplante.

Ejemplo 12 Restauración de la fertilidad con tejido testicular crioconservado Los ratones macho que han sido esterilizados por medio del tratamiento con busulfan, el 77.78% de los ratones puede tener su fertilidad restaurada por medio de la cirugía de trasplante testicular de las células. Un rango de aproximadamente 101,563 a 1,000,000 de células trasplantadas en cada uno de los testículos da como resultado la restauración de la fertilidad. También, el rango de células inyectadas GFR-a+ que pueden resultar en la restauración de la fertilidad es de 41 a 6,675, y el rango de las células inyectadas son Equipo-c-/a6-integrina+ que puede restaurar la fertilidad es de 22,648 a 166,500. Las células SSEA-1+ no parecen estar presentes en ratones prepubertos y por lo tanto no se correlacionaron con la fertilidad después del trasplante, pero el mismo marcador para las células (SSEA-4) humano puede ser crucial para la restauración de la fertilidad. También, las células Teñidas Triples y con Thy-1 (Thy-1+, Equipo-c-, a6-integrina + ) no se correlacionaron con la restauración de la fertilidad en el ratón, pero pueden ser importantes en los humanos.

Ejemplo 13 Restauración de la fertilidad con el tejido de ovarios de ratones crioconservados El objetivo de este proyecto es encontrar si el tejido de los ovarios es trasplantado más exitosamente en los tejidos o en una forma de suspensión celular. Los ratones fueron ovariectomizados y algunos injertos recibidos, de ovarios frescos, algunos injertos recibieron los ovarios congelados/descongelados, algunas recibieron un injerto de un coágulo que contiene células frescas de los ovarios y folículos, algunos recibieron un injerto de un coágulo que contiene células del ovario congeladas/descongeladas y folículos, y algunos permanecen intactos como control para la cría normal. El Factor de Crecimiento Vascular del Endotelio (VEGF) fue agregado a los coágulos para promover la vascularización y la angiogénesis de los coágulos injertados.

Ejemplo 14 Trasplante de las Células Madre de la Espermatogonia en Testículos Humanos Utilizando Técnica Ultrafina de Microinyección Endoscópica La técnica de trasplante de células madre de la espermatogonia en roedores fue desarrollada hace más de una década utilizando un microscopio capilar de vidrio o de microdisección. En el ratón, la anatomía y tamaño de los testículos proporcionan acceso factible a la red de los testículos por medio de los conductos eferentes permitiendo el trasplante rápido y confiable de un número suficiente de SSCs en el lumen de los túbulos seminíferos por una sola inyección en los conductos eferentes. La red de testículos en los roedores es visible desde fuera de los testículos y está localizada en una distancia lo suficientemente lejos de la arteria testicular y las venas.

Sin embargo, en los mamíferos más grandes la anatomía y el tamaño de los testículos es diferente. Primero, la red de testículos está localizada en los testículos en la cercanía del suministro de sangre testicular. En segundo lugar, existen eferentes múltiples dúctiles que conectan la red de testículos al epidídimo. Finalmente, el tamaño de los testículos requiere un volumen más alto de suspensión de células para llenar los testículos (volúmenes de mililitros en vez de microlitros). En los bovinos y monos, los métodos guiados por ultrasonido han sido desarrollados para el trasplante de SSCs en los testículos por medio de una inyección de una aguja grande en el lumen de los testículos. Sin embargo, estos protocolos son ineficientes e invasivos ya que en ambos métodos la inyección en algunos casos resulta en un daño a la red de los testículos y hemorragia.

También se describen aquí, el aparato de microinyección para los testículos humanos que permite el acceso del exterior de los segmentos de testículos humanos, incluyendo el epidídimo, y teniendo la capacidad de maniobrar en los conductos eferentes individuales permitiendo el acceso a la red de los testículos sin el daño a las arterias y venas. Este aparato consiste de dos partes: Un catéter endoscópico capilar, el cual tiene una fuente de luz y una cámara que permite que el operador guíe el catéter, y un catéter más angosto interno que pasa a través de los conductos eferentes y transfiere la suspensión de células dentro de la red de los testículos. El catéter es insertado en el epidídimo por medio de una incisión pequeña y es guiado a los conductos eferentes. Antes de la inyección de células, una solución de contraste de ultrasonido (Levovist) es inyectada y el flujo de la solución es monitoreada por un aparato de ultrasonido para asegurar que la solución está pasando a través de la red de los testículos dentro de los túbulos seminíferos.

La ventaja de este aparato es un acceso no invasivo y confiable para el lumen testicular humano. Este aparato puede también ser usado para propósitos de diagnóstico de infertilidad en los hombres, por ejemplo, encontrando la ubicación exacta de la azospermia obstructiva. El aparato puede también ser utilizado para recolectar células y tejidos del epidídimo y la red de testículos de una manera menos invasiva.

Ejemplo 15 Células Madre de la Línea Germinal de Machos Prepubertos v su Uso en el Tratamiento de la Infertilidad Los tratamientos de cánceres portados por la sangre, los cuales son los cánceres más comunes en la niñez, tienden a requerir agentes de alquilación, combinados con una irradiación total del cuerpo y el trasplante de médula ósea. Estos tratamientos no solamente destruyen las células malignas, sino también tienen un efecto citotoxico en la espermatogonia que se divide rápidamente. Como resultado, la falla espermatogénica y la infertilidad pueden ocurrir durante la edad adulta. Los adolescentes y hombres adultos tienen la opción de guardar en criobancos su semen antes del tratamiento del cáncer y, por inseminación artificial, IVF o ICSI, pueden ser padres de niños los cuales son genéticamente de su propiedad.

Los pacientes prepubertos se encuentran en un gran riesgo de perder su fertilidad ya que no tienen una espermatogénesis completa. Su epitelio seminífero contiene solamente las células de Sertoli y diferentes tipos de espermatogonia, entre los cuales se encuentran las células madre. Debido a la ausencia de gametos maduros, la crioconservación de tejidos inmaduros es actualmente el único medio por el cual puede ser conservada la fertilidad de los muchachos jóvenes.

El trasplante de células de testículos ha sido realizado utilizando testículos de donantes de una amplia variedad de animales, en su mayor parte utilizando ratones inmunocomprometidos como receptores. Los animales que han sido utilizados como donantes en los experimentos en donde los recipientes fueron ratones incluyen; ratones, ratas, hámsters, conejos y perros, ganado, monos y humanos. La progenie derivada de las células de los testículos del donante solamente se ha mostrado en ratones y ratas.

Las estrategias para conservar la fertilidad de pacientes prepubertos incluyen el aislamiento y la crioconservación de las células madre de la línea germinal. Estas células madre de la línea germinal pueden ser auto-trasplantadas en los pacientes después de una terapia de radiación y/o quimioterapia. Sin embargo, el auto-trasplante de células de la línea germinal de pacientes de cáncer posee el riesgo de la transmisión de células malignas. Por lo tanto, las células de la línea germinal deben de ser completamente aisladas de las células malignas. Aquí se describe un método, basado en una clasificación de citometría de flujo, que selecciona diferencialmente las células madre de la línea germinal para purificarlas de las células de cáncer.

También se describe un ensayo de importancia fisiológica del trasplante de células madre de la línea germinal. Los resultados del ensayo permitirán decisiones acerca de la cantidad de células madre necesarias para restaurar la fertilidad. Además, es utilizado para evaluar la estabilidad, viabilidad y potencia de las células madre de la línea germinal en el momento de la recolección del tejido y antes de la liberación. Un modelo de ratón es usado ya que los marcadores de superficie para las células madre de la espermatogonia en esta especie son bien caracterizados y está disponible una técnica de trasplante. Esta técnica de trasplante probará la funcionalidad de las células madre de la línea germinal en los testículos de los ratones inmunodeficientes tratados con busulfan permitiendo el progreso completo de la espermatogénesis de las células del donante en el animal receptor. 1. Determinación de anticuerpos adecuados para las células de soporte testicular.

El receptor de hormona leutinizante (LHR) es un marcador específico para diferenciar las células germinales de las células somáticas. El LHR solamente se enlaza a las células de Sertoli y células de Leydig en los testículos.

Tabla 7 2. Separación de células madre de la línea germinal de células de cáncer.

El objetivo de este estudio es enriquecer las células madre de la línea germinal mientras se remueven cualesquiera células de tumor de una muestra de un paciente, se ha desarrollado un método que selecciona diferencialmente y aisla las células madre de la línea germinal de una población de células heterogénea; para cuantificar el proceso de selección hasta un punto en donde ha sido agotada la contaminación de células cancerosas lo suficiente para la aplicación clínica. Esto incluye la evaluación de cuantas células de cáncer se requieren para iniciar el crecimiento del tumor. Con el objeto de tratar a cada paciente de acuerdo con el fenotipo de su enfermedad, se ha desarrollado un método para la inmunofenotipificación específica de la enfermedad. Para hacer esto, la expresión del marcador de superficie de las células específicas para el tipo específico de cáncer será evaluado y utilizado en el agotamiento de células de cáncer de la muestra del paciente.

La preocupación principal de este procedimiento es el aislamiento de las células madre de línea germinal. Un procedimiento para la selección negativa de células germinales de ratones leucémicos mediante la clasificación de citometría de flujo ha sido establecido con anticuerpos contra dos marcadores de superficie expresados en las células de cáncer en la sangre incluyendo el MHC de clase I y el antígeno de leucocitos comunes (CD45). Este procedimiento conduce al trasplante exitoso de las células de línea germinal de ratón en testículos de los receptores sin la transmisión de la leucemia en los ratones. En una exclusión adicional para las células malignas, las células germinales humanas son seleccionadas positivamente con marcadores específicos para células germinales tales como células CD90, CD49f, SSEA-4 y GFR-a. Además, otros indicadores del cáncer pueden ser empleados tales como la detección de la ploida del ADN. La meta de este modelo es restaurar la fertilidad sin reintroducir el cáncer en un paciente.

Los experimentos determinarán la factibilidad de una selección positiva o negativa para células madre de la línea germinal, un umbral cuando un tumor puede ser re-transplantado en un modelo de ratón y la topología de expresión del marcador de superficie específico de la enfermedad. 3. Ensayo de Potencia de la Célula Madre de la Espermatogenia Para alcanzar conclusiones acerca de la capacidad de las poblaciones de células madre de línea germinal diferentes para restaurar la fertilidad en los testículos tratados con busulfan, es necesario un ensayo de la potencia. Cada una de las poblaciones fue comparada con un control negativo para determinar el aumento en la eficiencia. Esto también permite conclusiones acerca de la necesidad y el tipo de células cotrasplantadas tales como células de Leydig, células de Sertoli o células mioides. Las cantidades crecientes de células madre de la línea germinal producirían una eficiencia más alta de las células trasplantadas y la restauración de fertilidad. Para poder reconocer de manera no ambigua las células del donador del recipiente, las células madre de la línea germinal son aisladas de los testículos de los ratones transgénicos GFP (NAGY, Jackson Labs). Para imitar los pacientes humanos prepubertos, ratones machos juveniles entre siete y 10 días fueron utilizados para la recolección de células madre de la línea germinal.

Tabla 8 Análisis de eficiencia de trasplante. Una ronda activa de espermatogénesis dura aproximadamente 35 días en el ratón, y por lo tanto, todos menos dos de los ratones transplantados fueron sacrificados cuatro semanas después del trasplante. Los testículos fueron cortados y pesados como un indicador de la espermatogénesis activa. Los testículos entonces fueron digeridos en una suspensión simple de células y la expresión del GFP detectó la citometría de flujo. Esto permitió la determinación del número de células GFP+ que se originaron de las células madre del donante. Los testículos también fueron evaluados por citometría de flujo por los mismos marcadores para alcanzar conclusiones acerca de la cantidad de células madre de la línea germinal presentes que se originan del donante y el recipiente endógeno.

Detección de restauración de fertilidad. Los dos ratones restantes fueron usados para el apareamiento ocho semanas después del trasplante. Cada uno de los machos apareados con dos hembras rasuradas. Las crías generadas fueron probadas por su expresión de GFP y el color del pelo para demostrar de que cepa se habían originado. Las crías de cada ratón transplantado fueron observadas por anormalidades eventuales. Los resultados se ilustran en la Tabla 9.

Ejemplo 16 Diferenciación y Prueba de Funcionalidad de Células Germinales Cultivadas en los Ovarios de Ratón Los trasplantes de tejido del ovario (OTT) se están convirtiendo en una estrategia cada vez más popular para la conservación de la fertilidad y la propagación de folículos del ovario. El espectro incorpora el OTT en gemelos discordantes por fallas prematuras del ovario (POF) y para restaurar la función del ovario (OF) en las mujeres con disgénesis del ovario utilizando el tejido del ovario de donantes apareados, por ejemplo, el trasplante heterólogo. Otra indicación propuesta es prolongar la vida reproductiva en las mujeres de otra manera saludable. Los usos potenciales propuestos para los tejidos del ovario recolectados son: maduración in vivolin vitro de folículos primordiales, el xenoinjerto de tejidos del ovario, o el uso de un método novedoso para diferenciar de manera posterior las células germinales, mientras se usan coágulos de plasma sanguíneo y los injertan con tejidos del ovario para la maduración y desarrollo de los oocitos.

Para desarrollar un método de diferenciación de las células germinales OG2 de ratones hembra en folículos y/u oocitos mediante el injerto de células germinales OG2 de ratón con células de tejido del ovario junto con coágulos de plasma sanguíneo en ovarios funcionales o desarrollándolo injertándolos en un espacio subcutáneo en el lomo del ratón rasurado. La meta del experimento es determinar si la función de los coágulos de plasma como un medio de injerto para diferenciar las células germinales en oocitos maduros o inmaduros mientras se co-cultivan con ovarios funcionales. Para probar las etapas tempranas del desarrollo del folículo, 4 coágulos de sangre, son injertados en el espacio subcutáneo en el lomo de los ratones rasurados y un coágulo es removido cada 7 días durante 28 días y los coágulos son revisados por el desarrollo de folículos y oocitos por el examen histológico. Para probar la funcionalidad de las células trasplantadas diferenciadas co-injertadas en el ovario del huésped, los ratones son apareados naturalmente para ver si existen cualesquiera oocitos funcionales que se hayan diferenciado, se pueden fertilizar, para poder producir crías vivas de las células trasplantadas. Para probar cual de los métodos de coágulo podría ser más exitoso para la diferenciación y propagación, cuatro condiciones de coágulos co-injertados a los ovarios huésped en la bolsa de los ovarios son usados en el espacio r o OI 01 Tabla 9 TD = testículo derecho; TI - testículo izquierdo; ND = no determinado; a6 =aWntegrina subcutáneo: 1) células GS de hembras OG2 cultivadas en MEF (Día 0); 2) EBs temprano (dos días de edad) de las células GS de las hembras OG2 cultivadas; 3) células como oocitos tardíos de los EBs (seis días de edad) de las células GS de hembras OG2 cultivadas; 4) células de ovario aisladas recientemente y folículos de cuatro a seis días de edad de ratones GFP de FVB (utilizados como un control positivo). Métodos: Formación de Embroides de Células Germinales: Una placa de 6 depósitos que contiene un cultivo de colonias hembra OG2 es obtenido en una confluencia de -80% (las colonias tenían un contacto mínimo entre ellas). Los medios son aspirados y los depósitos son lavados una vez con PBS y se agregaron a cada depósito 700 pL de tripsina caliente. Luego las placas son colocadas en un incubador a una temperatura de 37°C durante cuatro minutos. Cada depósito de la placa de 6 depósitos es triturado para lavar las células OG2 de las hembras fuera de la capa de MEF y luego romper la capa de MEF tanto como sea posible. Después de que cada depósito es triturado, todos los depósitos son micropipeteados en un tubo cónico de 50 mL con un contenido de un volumen igual (4.2 mL) de PM1™ + 15% FBS + GFs. Un mL de PM-1+15% FBS + GFs es usado para lavar los primeros tres depósitos de la placa de 6 depósitos y combinados con células del paso 6 anterior y este paso es repetido para los últimos tres depósitos de la placa de 6 depósitos. Entonces las células fueron hiladas hacia abajo en una cantidad de 400*g por cinco minutos y los sobrenadantes aspirados con aspiración de vacío y luego se utiliza una pipeta de 200 µ?_ para aspirar el sobrenadante restante. Las células se vuelven a suspender en 8 ml_ de PM-1+15% FBS, sin ß-mercaptoetanol, ni GFs. Dos ml_ de esta suspensión celular son pipeteados en cada uno de los 4 depósitos de una placa no adhesiva de 6 depósitos y la placa es colocada en un incubador a una temperatura de 37°C durante un período de dos a nueve días con un cambio de medios del 50% cada dos días. Los medios son cambiados pipeteando 1000pL de medio en los depósitos.

Digestión del Tejido de Soporte del Ovario. Los ovarios de los ratones GPF OG2 LacZ/Oct4 de cuatro a ocho días de edad son aislados y cortados con tijeras finas de disección. Los ovarios cortados son transferidos a 2 mi de DMEM regulado por HEPES con un contenido de FCS al 5% y colagenasa (1.5 mg/ml). Los ovarios en la solución de digestión son incubados en un baño de agua a una temperatura de 37°C durante 30 minutos, con un pipeteado suave cada 10 minutos. 12 mi de DMEM regulado por HEPES con un contenido de FCS al 5% son agregados para detener la digestión de los ovarios y la mezcla de digestión después de 30 minutos. Las células son hiladas en una cantidad de 80*G durante 10 minutos a una temperatura de 4°C. El sobrenadante es removido y las células lavadas dos veces por centrifugación.

Preparación de Mezcla de Células de Soporte de Ovario con Células Germinales para la Diferenciación. Las células digeridas de un ovario son usadas como células de soporte para las células germinales para cada condición. 100 K de células GS de cada condición se agregaron a un granulo de célula OG2/LacZ de ovario digerido completamente. Por únicamente las últimas células GS del EB (Día 6), en vez de utilizar 100 K de células GS, 100 células similares a oocitos (de 40 pm a 70 pm) son recolectadas y agregadas manualmente a un granulo de célula OG2/LacZ de ovario digerido completamente. La mezcla de las células es mezclada completamente con golpes suaves. Las células son hiladas en una cantidad de 80*G durante 10 minutos a una temperatura de 4°C, y luego todos los sobrenadantes son removidos.

Elaboración del Coágulo de Plasma de Sangre. Las mezclas de células preparadas son hiladas bajo una cantidad de 80*G durante cinco minutos. El sobrenadante es removido cuidadosamente y se le agregaron 20 µ? de plasma venoso. Las células se volvieron a suspender en plasma venoso por golpecitos suaves para agitar hacia un solo lado las células y el plasma. Se remueven 20 µ? de plasma y células para hacer una gota en un plato de 6 cm y se le agregan 0.5 µ? de CaCI2 1M a la gota de plasma. Se cubre el plato y se coloca la gota de plasma con las células en el incubador a una temperatura de 37°C. Se incuban por 30 minutos para permitir que se forme el coágulo. Después de 30 minutos de incubación, los coágulos endurecidos a una consistencia similar a la gelatina y están listos para el trasplante en la bolsa de los ovarios junto al ovario.

Trasplante de Coágulos Venosos con Células Germinales en la Bolsa de los Ovarios. Los ratones rasurados de seis a ocho semanas son anestesiados con 0.5 mi de Avertina. Se frota el lomo de los ratones recipientes con etanol al 70% y luego se hacen dos pequeñas incisiones longitudinales pequeñas (no menos de 1 cm) en la piel con tijeras de disección fina cerca de la línea media en el nivel de la última costilla (una incisión a la derecha de la línea media y la otra a la izquierda de la línea media). Se desliza la piel a la izquierda o a la derecha hasta que la incisión se encuentra sobre el ovario (naranja-rosa) o una almohadilla de grasa (blanca), ambas de las cuales son visibles a través de la pared del cuerpo. Luego se recolecta la pared del cuerpo con pinzas y se hace una incisión pequeña (evitando los vasos sanguíneos más grandes) justamente sobre el ovario con pinzas. Utilizando unas pinzas de punta roma, se recolecta la almohadilla de grasa y es jalada fuera del ovario izquierdo, el oviducto y el útero, lo cual será adjuntado a la almohadilla de grasa. Se desliza el sujetador de sierra fina en la almohadilla de grasa y se pone a reposar sobre el lomo de modo que el ovario, el oviducto, y el útero permanecen fuera de la pared del cuerpo. Se recolecta suavemente en el ratón y se coloca en la etapa del microscopio estéreo con su cabeza a la izquierda. Se corta cuidadosamente el ovario y se hace una incisión pequeña (2 mm) con tijeras de disección finas dentro de la bolsa del ovario. La recolección del coágulo de plasma hecho anteriormente con las células y el coágulo es insertado cuidadosamente dentro de una incisión pequeña en la bolsa de los ovarios. Utilizando las pinzas, se coloca suavemente el coágulo dentro de la incisión pequeña de la bolsa de los ovarios. Utilizando las pinzas se coloca suavemente el coágulo dentro del sitio de incisión de la bolsa de los ovarios. Se suelta el sujetador y se remueve el ratón de la etapa del estéreomicroscopio. Se utilizan las pinzas para recolectar la almohadilla de grasa y colocar el ovario, el oviducto, y la parte trasera del útero dentro de la pared del cuerpo. Se cose la pared del cuerpo con una o más costuras (opcionales) y se cierra la piel con los sujetadores de las heridas. Se repite en el lado opuesto (lado derecho) del ratón. Al día siguiente se revisó la salud general del ratón transplantado. Siete días después del trasplante se removieron los sujetadores de la herida.

Trasplante de Coágulos Venosos con Células Germinales en el Espacio Subcutáneo en el Lomo del Ratón. Aunque el ratón se encuentre todavía bajo anestesia del implante en la bolsa de los ovarios, utilizar las tijeras para separar el músculo de la piel de los dos sitios de incisión originales. Se insertan dos coágulos por cada sitio de incisión (total de 4 coágulos por ratón) dentro del espacio subcutáneo. Se inserta un coágulo a la derecha del sitio de incisión y el otro coágulo a la izquierda del sitio de incisión. Se repite el procedimiento para el segundo sitio de incisión por 2 coágulos adicionales. Un coágulo insertado subcutáneamente es removido una vez cada siete días por 28 días por medio de remoción quirúrgica. Los coágulos removidos son fijados en 5 mi de paraformaldehído al 4%, incrustados en el OTC, crioseccionados en 8 µ?? y teñidos como hematoxilina y eosina para mostrar si se están formando la diferenciación y propagación de los folículos por medio de la morfología. De ser necesario, las platinas son teñidas con los anticuerpos específicos de los oocitos.

Apareamiento de Ratones Rasurados Transplantados. Los ratones rasurados transplantados son revisados 21 días después de la cirugía y luego diariamente para determinar si el ratón estaba en calor. El cierre de la herida es tomada como una incisión de deficiencia de estrógeno y la reapertura como un signo de que los folículos estrogénicos han emergido en el injerto. Después de la apertura vaginal o tres semanas posteriores a la operación (lo que suceda primero), las hembras huésped son apareadas con los machos fértiles. Las hembras son inspeccionadas diariamente por signos de apareamiento (tapones vaginales). Aquellos que son apareados se les vuelve a permitir parir. En las seis a 12 semanas posteriores al trasplante, todos los huéspedes son autopsiados, la condición del aparato reproductivo son examinados, y el injerto de la cápsula del ovario es removida y fijada en 5 mi de paraformaldehído al 4%, incrustada en el OTC, crioseccionada en 8 µ?t? y teñida con hematoxilina y eosina.

Ejemplo 17 Identificación y Caracterización de la Repoblación de Células Madre de la Espermatoqonia de Testículos Humanos Adultos Las células madre de la espermatogonia (SSCs) mantienen la espermatogénesis por medio de la auto-renovación y la producción continua de espermatozoides durante la vida completa. Los estudios histológicos y ultraestructurales revelaron que en los mamíferos no primates, la espermatogonia As (solo A) es considerada como que es la célula madre de la espermatogénesis. Al momento de la división de la espermatogonia A, las células hijas ya sea que migran lejos de ellas o se convierten en dos nuevas células madre, o permanecen juntas a través del puente intercelular y se convierten en espermatogonia A apareada (Apr). La espermatogonia Apr se desarrolla adicionalmente en cadenas de cuatro, ocho o 16 espermatogenias alineadas A (Aal). La espermatogonia Aal se diferencia en la espermatogonia A1 y después de seis divisiones mitóticas da como resultado en A2, A3, A4 y finalmente, la espermatogonia B, la cual origina los espermatocitos en la última división mitótica.

A diferencia de los roedores, en los humanos y otros estudios de morfología nuclear histológicos clásicos de los primates indica que los dos tipos de espermatogonia no diferenciada están presentes en la membrana de la base del epitelio seminífero testicular, designadas como espermatogonia Aoscura y Apá|ida. La ca r a ct e r i z a c i ó n morfológica de las células madre de la espermatogonia en las biopsias testiculares de pacientes que han pasado por semicastración para los tumores malignos y radioterapia y quimioterapia mostraron que las células madre de los testículos humanos más probablemente son la espermatogonia Apá|¡da, los estudios recientes en los testículos de mono Rhesus adulto, también se reveló que la espermatogonia AOScura representa la población de reserva de células madre la cual rara vez se divide y son activadas después de un insulto citotóxico, mientras que la espermatogonia Apá|¡da son células madre activas que pasan por divisiones de auto-renovación regulares para mantener la espermatogénesis bajo circunstancias normales. Esto indica que ambas espermatogénesis de humanos y primates tienen una ontogenia similar, y por lo tanto las características de las subpoblaciones de células SSCs entre estas dos especies podrían ser similares.

En general, debido a la poca disponibilidad de marcadores específicos, fenotípicos y las características moleculares de las células SSCs en los testículos de humanos adultos son entendidos de manera pobre. Utilizando los monos Rhesus, las poblaciones enriquecidas de células SSCs de los testículos de primates adultos fueron caracterizadas y aisladas. Utilizando los marcadores seleccionados encontrados en la superficie de las células SSCs de primates, fue investigada la identidad de diferentes poblaciones de células SSCs en los testículos de humanos adultos. Además, las poblaciones enriquecidas de células SSCs humanas fueron trasplantadas en los testículos de ratones receptores y fue investigada la identidad de las células madre de la espermatogonia humana de la repoblación en los testículos de los ratones receptores.

MATERIALES Y MÉTODOS Preparación de Tejido y aislamiento de células. Los tejidos testiculares desprovistos de contaminación del tumor fueron obtenidos de pacientes quienes pasaron por una orquiectomía y que fueron generosamente donados por dos pacientes. Las biopsias testiculares fueron obtenidas de los pacientes que pasaron este procedimiento TESE (extracción de biopsia testicular y esperma testicular). Todos los pacientes han firmado la forma de consentimiento informado antes de la recolección de tejidos. Una pequeña porción del tejido fue extraída y utilizada en este estudio. Los tejidos testiculares y las biopsias fueron removidos quirúrgicamente, colocados en PBS suplementado con penicilina/estreptomicina y transportados tan poco como dos horas en la noche en hielo.

Las muestras de tejido testicular fueron tomadas para la histología y los análisis biológicos moleculares. Los túbulos seminíferos de los tejidos restantes fueron finamente picados y digeridos con colagenasa A (1 mg/mL) y DNasa (10 U/mL) en un baño de agua de reciprocidad a una temperatura de 37°C durante 15 minutos. Después de la digestión de colagenasa, los tejidos no digeridos se permitió que se asentaran y las células del sobrenadante fueron removidas. El tejido no digerido fue digerido adicionalmente en un cocktail de enzimas consistente de 1.5 mg/mL de colagenasa A, 1.5 mg/mL de hialuronidasa de tipo V, 0.5 mg/mL de tripsina, y 10 U/mL de DNasa en DMEM en un baño de agua de reciprocidad a una temperatura de 37°C durante 20 minutos. Después de colar el tejido no digerido restante, las células aisladas fueron centrifugadas en 400 g por 10 minutos. Los gránulos de células se volvieron a suspender en ME + HEPES + FBS al 5% y colocados en platos recubiertos de cultivo de tejido de 15 cm en un incubador humidificado de C02 al 5% hasta el análisis. Las muestras de biopsia testicular fueron solamente digeridas en el cocktail de enzimas y generalmente utilizadas para solamente un propósito debido a su pequeño tamaño.

Citometría de flujo y clasificación magnética. Para la clasificación y caracterización de la superficie de las células, las células fueron teñidas con los marcadores de células madre seleccionados utilizados para la caracterización de los SSCs de primates incluyendo CD90-FITC, CD49Í-PE, y CD117-APC y SSEA-4 (Tabla 10). Las células fueron teñidas durante 30 minutos en MEM + HEPES + 5% FBS (medio completo) en hielo, una vez lavados, y se volvieron a suspender en medio completo y mantener en hielo hasta el análisis de flujo. El análisis de flujo fue realizado en un Clasificador de Células InFlux. La fluoresceína (FITC) (POR SUS SIGLAS EN INGLÉS) y ficoeritrina (PE) (por sus siglas en inglés) fueron excitadas con un láser de 200 mW en una longitud de onda de 488 nm y la emisión fue recolectada con filtros de paso de banda de 530/40 y 580/30 respectivamente. La aloficocianina (APC) (por sus siglas en inglés) fue excitada con un láser de 25 mW en una longitud de onda de 638 nm y la emisión fue recolectada con un filtro de paso de banda 670/40. Para la clasificación magnética, las células (hasta 200x106) se volvieron a suspender en un medio de DMEM + 10%FBS y SSEA-4 la biotina fue agregada (1:200) y fue incubada en hielo por una hora. El regulador de etiquetación que contiene PBS, BSA (0.5%) y 2mM de EDTA es preparado y desgasificado durante 10 minutos. El regulador de etiquetación fue agregado a las células SSEA-4 teñidas y centrifugadas en 400g por 10 minutos. Las células SSEA-4 se volvieron a suspender en 1.8 mL de regulador y se le agregaron 200 pL de microcuentas de estreptavidina. También, 100 pL de SSEA-4-FITC del anticuerpo conjugado se agregaron para poder revisar la pureza de las células separadas magnéticamente por citometría de flujo y se incubó a una temperatura de 4°C durante 20 minutos. Se agregaron 10 ml_ de regulador al tubo, y se centrifugaron 400g durante 7 minutos.

Tinción Histológica e Inmunohistoquímica. Los tejidos fueron fijados durante la noche en 4% de paraformaldehído (PFA) (POR SUS SIGLAS EN INGLÉS) y transferidos a sacarosa 20% para el equilibrio de la noche. Los tejidos fueron congelados en el compuesto OCT y las criosecciones fueron preparadas en un espesor de 8 pm y almacenadas a una temperatura de -80°C. Para la histología, las secciones fueron lavadas en PBS y teñidas con hematoxilina de Mayer durante 5 minutos, lavadas con agua destilada durante 5 minutos y montadas utilizando un medio de montaje acuoso. Las secciones fueron entonces analizadas utilizando el microscopio de campo de brillo. Para la tinción inmunohistoquímica, las secciones de los testículos fueron bloqueadas y permeabilizadas utilizando Triton-X al 0.1%/ BSA al 2%/ suero de oveja al 5%. Entonces las platinas fueron teñidas con la célula germinal y anticuerpos específicos de SSC como se describieron en la Tabla 10. El DAPI fue utilizado para la visualización nuclear. Después de lavados múltiples en agua destilada las células fueron conservadas utilizando un conservador fluorescente acuoso. Las platinas fueron analizadas usando el microscopio Olympus BX-61 con un software de elaboración de imagen SlideBook™. Para los estudios de cuantificación, aproximadamente 25 secciones transversales de túbulos por platina fueron contados y los datos de las 4 platinas fueron conjuntados y presentados en este estudio.

Extracción de ARN y Análisis PCR de Tiempo Real. Un ARN celular total fue aislado utilizando el Mini Equipo RNeasy (Qiagen Inc.) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. El ARN aislado fue entonces transcrito a cADN utilizando el equipo RT Quantitect (Qiagen) y purificado después con un equipo de purificación de PCR QIAquick (Qiagen). Para cada reacción de RT-PCR, se utilizaron 20 ng de plantilla de cADN en un volumen de reacción de 25 µ?_ con HotStar Taq Plus (Qiagen) y los cebadores respectivos (Tabla 11). Todos los objetivos fueron amplificados por 30 ciclos. Los productos de amplificación fueron identificados por tamaño en un gel de agarosa al 2%. Para el análisis QRT-PCR, se utilizaron 5 ng de plantilla de cADN en un volumen de reacción de 25 L con el mezclador maestro PCR verde Quantitect SYBR (Qiagen) y se operaron en un BioRad iCycler. Cada muestra fue probada por triplicado y normalizada con un control GAPDH.

Tabla 10 Tabla 11 Ensayo de Telomerasa. Ha sido adaptado el protocolo de amplificación de repetición telomérica cuantitativa de tiempo real en Verde SYBR (RQ-TRAP) de Wege et al (Wege H, Chui MS, Le HT, Tran JM, Zern MA (2003) el protocolo de amplificación de repetición telomérico de tiempo real Verde SYBR para la cuantificación rápida de la actividad de telomerasa. Nucí. Acids Res. 31, e3.). El tejido o los gránulos de células fueron lavados una vez con PBS y se volvieron a suspender y se homogeneizaron en un regulador de lisis preparado con un contenido de regulador de lisis Chaps 1x y 400 U/ml de inhibidor de RNaseOut en un volumen de 1,000 células/µ?. Después de 25 minutos de incubación en hielo, los lisatos de células fueron centrifugados a una velocidad máxima por 10 minutos en una temperatura de 4°C. El sobrenadante entonces fue transferido a un nuevo microtubo de centrífuga y las concentraciones de proteína fueron determinadas en A280 nm con el espectrofotómetro ND-1000. Las reacciones se hicieron en volúmenes de 25 µ? con un contenido de 500 ng de lisato de proteína, mezcla PCR Verde de Quantitect SYBR (Qiagen), 1 g de cebador TS, 0.5 g del cebador ACX, y agua libre de nucleasa. Para cada placa de reacción probada, cada muestra fue probada por triplicado junto con un control sin plantilla (regulador de lisis), un control positivo (células ESC), y una curva estándar preparada a partir de los lisatos de proteína ESC Humana (1000 ng, 200 ng, 40 ng, 8 ng, 1.6 ng). Utilizando el iCycler iQ5 (Bio-Rad), las reacciones fueron incubadas por 20 minutos a una temperatura de 25°C, por 15 minutos a una temperatura de 95°C, y amplificados en 40 ciclos de PCR por 30 segundos a una temperatura de 95°C y 90 segundos a una temperatura de 60°C. Los valores de umbral del ciclo (Ct) fueron determinados de las gráficas de amplificación de semi-log (aumento de log en la fluorescencia contra el número de ciclos) y comparados con una gráfica estándar. Las programaciones del software por omisión (default) para umbrales de 10 veces el promedio de la desviación estándar de la lectura de fluorescencia de cada depósito sobre los primeros 10 ciclos, excluyendo el ciclo 1. La actividad de telomerasa fue expresada como un porcentaje relativo a los ESCs humanos.

Trasplante de la Célula Madre de la Espermatogonia. La técnica de trasplante de célula madre de la espermatogonia fue utilizada para probar la funcionalidad de las poblaciones de célula mediante la colonización en testículos de ratones receptores. Los ratones machos Athymic Nude-Foxn 1 nu (Harían) deficientes del sistema inmune fueron tratados con una sola inyección de busulfan intraperitoneal (40 mg/kg) y se utilizaron como receptores. Un mes después del tratamiento de busulfan, células testiculares humanas de adultos clasificadas magnéticamente de 0.3 a 0.8 x 106 SSEA-4+ fueron transplantadas en los túbulos seminíferas por medio de una inyección en la red de los testículos. Cuatro semanas después del trasplante, los ratones fueron sacrificados y los testículos fueron fijados en PFA al 4% y se hicieron criosecciones. La identidad de las células madre de la espermatogenia humana en los testículos de ratón fue reconocida utilizando un anticuerpo de proteína nuclear humana en combinación con otras células madre o marcadores de célula germinal. Todos los experimentos en animales fueron realizados de acuerdo con las Instrucciones del National Research Council para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio.

Análisis Estadístico. Excepto que se indicara de otra manera todos los experimentos son repetidos tres veces. Dos muestras de la prueba T del estudiante y la prueba ANOVA fueron utilizadas para el análisis estadístico y una calificación de P<0.05 se consideró como importante.

RESULTADOS Aislamiento y enriquecimiento de células madre de la espermatogonia. Las células aisladas de las biopsias testiculares recolectadas de hombres azoospérmicos obstructivos mostraron una morfología y distribución similares de las células espermatogénicas a los testículos humanos normales indicando que la espermatogénesis está en progreso en estos pacientes. En promedio, 0.5 x 106 células se aislaron de cada muestra con la viabilidad del 87%. Las células madre de la espermatogenia fueron detectables morfológicamente entre otras células como células redondas con un núcleo grande a la proporción de citoplasma, de 1 a 3 nucléolos e Inclusiones citoplásmicas (FIG. 39). Para el enriquecimiento de las células madre de la espermatogonia disociadas, de los tejidos testiculares humanos adultos se analizaron por diferentes marcadores de superficie celular utilizando citometría de flujo. El perfil de expresión de las células testiculares humanas adultas teñidas con varios marcadores de células madre se presentan en la FIG. 43. Entre los marcadores de superficie utilizados por la caracterización de las células SSCs, SSEA-4 se ha mostrados que son expresados en los SSCs en los testículos de mono Rhesus adulto, que fue expresada abundantemente en los testículos humanos. Las células testiculares humanas aisladas de ambas biopsias testiculares y tejidos donados fueron probados si se descubrió que de 13.3 ± 1.4% de células expresan la célula SSEA-4 en su superficie. Otro subconjunto de marcadores de SSC que han sido descritos en testículos de roedores y primates son las células CD49f (a6- integrina), CD90 (Thy-1), CD117 (Equipo-c), y en combinación CD49f+/CD90 + /CD117- (Tinción Triple). En los testículos humanos de adultos, 25 ± 2.5% de células expresan CD49f y 13± 5% son células CD90 + . De manera interesante, en contraste con los testículos de un mono, no hubo población de células Teñidas Triples en los testículos humanos (FIG. 39E a 39H).

Tinción Histológica e Inmunohistoquímica de las Secciones Testiculares. El examen histológico reveló que las biopsias testiculares tienen una morfología superior cuando son comparadas con las células donadas después de la tinción de hematoxilina-eosina (figuras 39A y 39B). Los tejidos testiculares humanos fueron tomados del examen inmunohistoquímico para entender mejor la distribución de la expresión del marcador de las SSCs humanas. Las células SSEA-4 y CD49f, también conocidas como a6-integrina, tienen patrones de tinción interesantes en los testículos de los humanos adultos, los cuales son muy similares a las observaciones anteriores en los testículos de los monos (figura 40). De acuerdo con las cuantificaciones histológicas, casi todas las células germinales adyacentes a la membrana de la base de los túbulos seminíferos expresan células CD49f (28.7 ± 1.2 por sección transversal del túbulo), un marcador que se ha descubierto en la superficie de las células SSCs de ratón y los monos y otras células madre multipotentes. También, muchas de las células a lo largo de la membrana de la base de los túbulos seminíferos expresan las células SSEA-4 (18 ± 1 por sección transversal del túbulo), un marcador pluripotente encontrado en la célula madre embrionaria humana (ES) y las células germinales embrionarias (EG) y las células SSCs de mono Rhesus adulto. De manera interesante, la mayor parte (88.3%) de las células SSEA-4+ se colocalizan con las células CD49f. Ningunas inmuno-reacciones específicas fueron encontradas para las células CD90 en los testículos humanos adultos. Inesperadamente, se observó que la mayor parte de las células germinales localizadas en el Equipo-c, un receptor para el factor de células madre y un marcador temprano para la diferenciación de las células germinales, en el núcleo en vez de en su superficie. Aproximadamente, el 75% de las células SSEA-4+ colocalizadas con el Equipo-c, sugiriendo la posibilidad de la existencia de dos poblaciones diferentes de SSCs en los testículos humanos adultos. También, la colocalización de las células CD49f y el Equipo-c mostraron que la mayor parte (73.6%) de las células CD49f+ en la membrana de la base de los túbulos seminíferos coexpresan el Equipo-c el cual es muy similar al de las células SSEA-4. Todas las células SSEA-4+ fueron también positivas para el marcador VASA de la célula germinal mientras que solamente el 50% de las células CD-49Í+ mostraron la tinción VASA indicando que las células CD-49f también son expresadas en la superficie de las células somáticas testiculares. Contrario a esto, el receptor de hormona luteinizante (LHR) no es expresado en las células VASA+ en los túbulos seminíferos, pero parece teñir el citoplasma de las células de Sertoli y de Leydig en los testículos humanos, indicando que el LHR es expresado solamente en las células somáticas y no en las células germinales en los testículos humanos adultos (figura 44). Existió una población clara de células en la membrana de la base de los testículos humanos expresando las células Oct-4 indicando la existencia de una población de células entre las SSCs humanas con características plurípotentes.

PCR de Tiempo Real v Ensayo de Telomerasa. El análisis de expresión del gen fue realizado en las células SSEA-4+ y SSEA-4- para probar la expresión específica de las células madre de la espermatogonia. Todos los genes incluyendo el Equipo-c, GFRa-1, PLZF, c-RET, y GPR-125 fueron expresados por lo menos hasta tres veces y hasta siete veces mayores en la población de células SSEA-4+ (figura 41A). De manera notable, las células SSEA-4+ mostraron un nivel de expresión mucho más alto (de 24 veces) para las células FGFR-3 (datos no mostrados), indicando que las células FGFR-3 y su ligando FGF9 podrían estar involucradas en la proliferación de SSC humana y la auto-renovación. Además, el nivel más alto de expresión de las células h-TERT en las células clasificadas SSEA-4 indican su nivel alto de actividad de telomerasa y su capacidad de repoblación. Las células SSEA-4 clasificadas positivamente fueron comparadas con ningunas células clasificadas para los testículos contra las células madre embrionarias humanas (hESCs) para la actividad de telomerasa (figura 41B). Ningunas células clasificadas mostraron un promedio de actividad de telomerasa de 10.4% ± 10.32% comparada con las células hESCs (100%), mientras que las células SSEA-4+ tuvieron aproximadamente cinco veces más expresión comparadas con ningunas células clasificadas 54.6% ( + /- 7.8%), las cuales también son de aproximadamente dos veces menores que la expresión de telomerasa de las células hESC. Esto soporta el descubrimiento de la expresión activada de las células h-TERT y sugiere por lo menos capacidades de duplicación prolongadas en las células SSEA-4 positivas.

Trasplante de las Células Madre de la Espermatoqonia.

Los estudios de colocalización se hicieron en los testículos de ratón que han sido trasplantados con una población enriquecida de células madre de la espermatogonia humana para probar su eficiencia de colonización y sus marcadores desenredados expresados en la superficie de las células SSCs humanas que vuelven a poblar los testículos del ratón. La síntesis de la localización de estos marcadores se presenta en la Tabla 12. Utilizando el HNP junto con las células SSEA-4, CD49f, y el Equipo-c, de las células que son positivas para la proteína nuclear humana, el 28.1% (± 3.6%) son positivas para las células CD49f, el 94.9% (± 1.3%) son positivas para el Equipo-c, y el 14.2% (± 3.6%) son positivas para las células SSEA-4. Además, observamos que el 100% de las células SSEA4 + también son positivas para el Equipo-c, indicando además la posibilidad de que solamente las células SSEA-4 + /Equipo-c+ pueden integrarse en los testículos de ratones receptores y por lo tanto, son las SSCs que se están auto-renovando entre la población de células SSEA-4+. Los estudios de colocalización con a6-integrina y las células SSEA-4 han demostrado que el 95.63% (± 1.6%) de las células SSEA-4+ también son positivas para la a6-integrina. Considerando estos resultados, y el hecho de que la a6-integrina se colocaliza con las células HNP, dos veces más que las células SSEA-4 y HNP, dos poblaciones de células de a6-integrina + , a6-integrina + /SSEA4+ y a6-integrina + /SSEA-4-, son SSCs que pueden volver a poblar los testículos receptores. También se deberá notar que las células de a6-integrina+ solamente toman en cuenta aproximadamente una cuarta parte de las células integradas, significando que aproximadamente el 75% de las SSCs que se han integrado tienen todavía que ser caracterizadas con el marcador de superficie por citometría de flujo. Aunque casi todas las células integradas se tiñen de manera positiva para el Equipo-c, está localizado en el núcleo de la mayor parte de las células y las células del Equipo-c+ no encontradas por citometría de flujo (figura 43). La colocalización de células HNP con otros marcadores de superficie celular revelaron que las SSCs humanas colonizadas en los testículos de ratón no expresan el CD-29 (ß1 -integrina), un marcador que es expresado en la superficie de las SSCs de ratón (figura 42). Sin embargo, el 42.8% de las células HNP colocalizadas con las células GPR-125 indicando que este marcador es expresado en la superficie de una población de células SSCs humanas de repoblación. También, el 28.3% de células HNP positivas colocalizaron un marcador Nanog pluripotente indicando que aproximadamente una tercera parte de la repoblación de las células SSCs humanas podrían tener características pluripotentes.

Tabla 12 EXPLICACIÓN Este estudio demuestra claramente que las células madre de la espermatogonia en los testículos de humanos adultos tiene características fenotípicas y moleculares distintas a los de ratones y similares, pero no idénticas a las células SSCs de primate. Primero, la localización y expresión de los marcadores seleccionados en las secciones de los testículos humanos y las células aisladas fueron estudiadas. Los estudios inmunohistoquímicos demostraron que entre los marcadores probados, la célula SSEA-4 es específicamente expresada en la superficie de las SSCs humanas. Todas las células SSEA-4 estuvieron localizadas en la membrana de la base de los túbulos seminíferos y colocalizadas en el marcador VASA de células germinales. Esto es muy similar a las observaciones anteriores en los testículos de primates adultos. Sin embargo, el porcentaje de células SSEA-4+ en los testículos humanos adultos fue mucho más alta en los testículos humanos (13%) que en los testículos de mono (2%). El análisis de biología molecular también reveló que las células clasificadas SSEA-4 tienen nivel de expresión más alto de todos los genes específicos de SSC y un alto nivel de actividad de telomerasa indicando la presencia de células madre de la espermatogenia en esta población. Los estudios anteriores mostraron que las SSCs aisladas del ratón y los testículos de primates adultos expresan las células CD49f y CD90 y son negativas para CD117. La expresión de las células CD49f y CD90 en las células de los testículos humanos aisladas ya han sido reportados. El estudio inmunohistoquímico reveló que las células CD49f en los testículos humanos estaba localizado a lo largo de la membrana de la base de los túbulos seminíferos sugiriendo que este marcador está expresando tanto las células SSCs así como diferenciando la espermatogonia de tipo A. También, la expresión de algunas células CD49f positivas fuera de los túbulos seminíferos indica que las células CD49f, aunque expresadas en las SSCs humanas, no son un marcador específico y no pueden ser utilizadas solas para el enriquecimiento de las SSCs de los testículos humanos. El análisis de citometría de flujo confirmó la tinción inmunohistoquímica y mostró que existe una población distinta de células dentro de los testículos humanos adultos teñidas positivamente para los marcadores CD49f o CD90, sin embargo, en contraste, para los primates no existió población de células positivas dobles presentes en los testículos humanos. Similar a las células SSEA-4, el porcentaje de células CD49f+ y CD90 + también fue mucho más alto en los testículos humanos adultos comparados con los testículos de mono.

Aunque el análisis de citometría de flujo reveló que existen muy pocas células CD117+ en los testículos humanos adultos, la tinción inmunohistoquímica mostró la localización del Equipo-c en muchas células en la membrana de la base de los túbulos seminíferos así como células en el compartimento luminar de los testículos humanos. Un patrón similar de localización de la proteína del Equipo-c en los testículos humanos ha sido reportada por otros investigadores. Recientemente, se mostró que la expresión del Equipo-c en la espermatogonia no diferenciada es específica de la fase indicando el involucramiento de esta proteína durante las etapas tempranas de la espermatogénesis humana. El Equipo-c es una proteína de membrana de cinasa de tirosina la cual es expresada en las células madre hematopoyéticas y las células progenitoras y en varios tejidos no hematopoyéticos incluyendo las gónadas. Existe un cuerpo de evidencia grande que muestra el involucramiento del Equipo-c y su factor de células madre de ligando (SCF) en una variedad de funciones durante el desarrollo de la célula germinal incluyendo la migración y la colonización, proliferación y diferenciación. Las células en los testículos adultos humanos expresan la proteína del Equipo-c en su núcleo y no en la membrana. La localización nuclear del Equipo-c podría explicar por qué estas células no podrían ser detectadas por citometría de flujo. Aunque el Equipo-c es generalmente una proteína de membrana, su localización citoplásmica y nuclear ha sido reportada. La localización doble de las células SSEA-4 con el Equipo-c mostraron que existen dos poblaciones de células SSEA-4+ en los testículos humanos de adultos, uno con y el otro sin la expresión del Equipo-c. Basados en los estudios de las SSCs de ratones se muestran como que son del Equipo-c negativo.

En el primate adulto, las células SSEA-4+ son la población que se divide activamente de células madre de la espermatogonia con capacidad de volver a poblar los testículos de ratón receptores. Las células SSCs humanas fueron purificadas por la clasificación magnética de SSEA-4 y las células SSEA-4+ fueron trasplantadas en testículos de ratón de receptores tratados con busulfan. Las células SSEA-4+ se encontraron en la membrana de la base de la mayor parte de los túbulos seminíferos de ratón después del trasplante indicando la presencia de SSCs funcionales en esta población. Sorprendentemente, todas las células humanas que colonizaron los testículos receptores fueron Equipo-c + , indicando que solamente la fracción del Equipo-c+ de las células clasificadas SSEA-4 pudieron colonizar los testículos receptores, y por lo tanto, son las SSCs activas en los testículos humanos. El análisis RT-PCR también reveló que las células clasificadas SSEA-4 tienen un nivel de expresión muy alto del Equipo-c y el FGFR3. La expresión del Equipo-c en las SSCs humanas podría indicar el involucramiento de este receptor y su ligando SCF en la colonización y/o repoblación de las SSCs humanas. Existe un cuerpo grande de evidencia que demuestra que el Equipo-c y el SCF son reguladores clave de la adhesión y proliferación de la migración de células germinales. También, la alta expresión de FGFR3 en las SSCs humanas podría indicar el involucramiento de sus ligandos en la proliferación y la auto-renovación de las células SSCs humanas. Los factores de crecimiento de fibroblastos (FGFs) y sus receptores (FGFRs) son moléculas de señalización clave para el desarrollo embrionario temprano y las células germinales. Los FGFs se ha mostrado que promueven la supervivencia y el mantenimiento de las SSCs de ratón y humanas. Los estudios in vitro mostraron que el FGF9 es un ligando muy potente para las células FGFR3. Por lo tanto, la adición del FGF9 y el SCF para el medio de cultivo de las SSCs humanas podría ser benéfica para la supervivencia y proliferación in vitro.

También, una subpoblacion de células humanas integradas en los testículos de ratón expresaron las células GPR-125 en su superficie, indicando que este marcador solo es expresado en la repoblación de las células SSCs humanas. La expresión del GPR-125 en los ratones y secciones de testículos humanos ha sido reportada. Las subpoblaciones de SSCs de repoblación humanas en los testículos de ratón son teñidas de manera positiva para el marcador pluripotente Nanog. La expresión de los marcadores pluripotentes Nanog y las células SSEA-4 en algunas de las SSCs indican que la subpoblacion de las SSCs en los testículos humanos adultos podría tener una capacidad multipotente para diferenciarse en otros linajes de células. La generación de líneas de células multipotentes de los testículos de ratón y humanos soportan multipotencialmente las células SSCs humanas sugiere la aplicación clínica de estas células para enfermedades degenerativas diferentes a la restauración de la fertilidad. Por otra parte, la inmunolocalización de Nanog en los testículos humanos fue no solamente limitada a las SSCs no diferenciadas sino también fue localizada en todas las células germinales hasta en el lumen de los túbulos seminíferos. Esta observación es muy similar a los testículos de primate adultos sugiriendo un rol diferente del factor de Nanog de transcripción en las líneas germinales avanzadas. La naturaleza de dicho rol para el Nanog todavía va a ser determinada, sin embargo, se ha reportado que el marcador Oct-4 pluripotente es un factor de supervivencia de las células germinales, y su desactivación resultará en la apoptosis y la muerte de las células en vez de la diferenciación.

El estudio de trasplante también demostró la compatibilidad del nicho entre los túbulos seminíferos humanos y de ratón para la colonización de células madre de la espermatogonia. De manera interesante, los porcentajes de células SSEA-4+ (14%) y células CD49f+ (28%) en los testículos de ratón receptores fue muy similar al de los testículos humanos (13% para células SSEA-4 y 27% para células CD49f) indicando que las SSCs humanas tienen la capacidad de colonizar y volver a poblar los testículos vacíos de ratón en un nivel muy similar a su ambiente natural sugiriendo que los testículos de ratón han proporcionado un ambiente favorable para la colonización de las células SSCs humanas. Sin embargo, cualquier desarrollo adicional que hubiera limitado la proliferación de la espermatogenia no fue encontrado ni en este estudio ni en estudios anteriores utilizando las SSCs de bovinos, porcinos, primates o humanos. Aunque los testículos de ratón no pueden proporcionar el ambiente apropiado para soportar la espermatogénesis completa de especies más altas, su membrana de la base de los túbulos seminíferos tiene la capacidad de atraer selectivamente y alojar las células madre de la espermatogonia humana de una manera muy similar a los testículos humanos.

En síntesis, las células madre de la espermatogonia en la repoblación en los testículos adultos humanos tienen características fenotípicas de SSEA-4 + , CD49f+, CD90 + , GPR-125+ y Equipo-c + . Aproximadamente, una tercera parte de las SSCs expresan el Nanog indicando la existencia de poblaciones de células madre de la espermatogonia en los testículos humanos adultos con características pluripotentes. Los resultados han dirigido las implicaciones de aislamiento y purificación de las células madre de la espermatogonia de testículos humanos adultos para aplicaciones clínicas, expansión de cultivo o propósitos de diferenciación. Además, la expresión de marcadores pluripotentes en subpoblaciones de SSCs humanas indican una aplicación potencial de estas células para la terapia de reemplazo celular y la regeneración del tejido.

Ejemplo 18 Recolección. Procesamiento, Crioconservación v Banca de Tejidos y Células Humanas de la Línea Germinal del Hombre Los sujetos de la investigación se han inscrito en este estudio basado en las recomendaciones de un investigador principal que participa. Una vez que es determinado que los sujetos encajan en los criterios para el estudio, el sujeto completa el consentimiento (y consiente el caso de un proceso menor). El sujeto se somete a cirugía para remover una porción del tejido de las gónadas y este tejido es embarcado bajo condiciones específicas a la instalación de procesamiento. Una porción pequeña del tejido es guardada para el análisis inmunohistoquímico. La instalación de procesamiento aisla las células del tejido utilizando un proceso mecánico y enzimático. Una pequeña porción de las células son ensayadas por su viabilidad, marcadores de la superficie de la célula y contaminación de microbios. Las células restantes son congeladas criogénicamente y almacenadas en la fase de vapor de nitrógeno líquido.

El tejido testicular es recolectado bajo condiciones diferentes. Primero, durante la cirugía para corregir los testículos que no han descendido o la torsión de testículos, una pequeña parte del tejido testicular que pesa aproximadamente 1 gramo es removido bajo condiciones estériles. Para pacientes de cáncer testicular, la pieza más grande del tejido testicular es removido durante la cirugía para remover el crecimiento canceroso. Para pacientes de cáncer, talasemia o pacientes de anemia de células de depranocitos o pacientes con otras indicaciones hematológicas no malignas las indicaciones que requieren el trasplante de células madre, la cirugía es realizada para remover la porción del tejido testicular.

Cirugía. Durante un procedimiento del escroto para corregir los testículos que no han descendido, la torsión testicular o la varicocele, una incisión pequeña es hecha en la superficie anterior de la túnica albugínea de los testículos con un escalpelo de una hoja 15, de aproximadamente de 1 mm a 3 mm de largo. Los testículos son comprimidos manualmente (exprimidos) para producir la salida del tejido tubular seminífero. El tejido expresado es capturado y colocado en el tubo y regresado por medio de un transportador a las cajas controladas por temperatura proporcionadas a la instalación de procesamiento. La incisión pequeña en la túnica albugínea es cerrada entonces con un material de sutura que se absorbe para volverse a aproximar a la túnica albugínea y para proporcionar la hemostasis (control de cualquier sangrado de la incisión). El procedimiento principal del cual el paciente fue traído a la sala de operaciones es originado como se planteó normalmente. Para pacientes con malignidades principales que se han vuelto no fértiles por medio de los tratamientos de radiación y quimioterapia se realizan, ya sea una recolección percutánea de los tejidos testiculares por medio de técnicas de biopsia de aguja de núcleo o una extracción abierta similar al procedimiento anterior para pacientes que pasan por otros procedimientos basados en la preferencia paterna.

Seguimiento Post-quirúrgico: Se hace seguimiento en los pacientes después de la cirugía para ver los signos de complicaciones en la sala de recuperación, una vez de 10 a 14 días después de su procedimiento, y a los seis meses, 12 meses, y luego anualmente durante la inscripción en progreso del estudio. Si los pacientes/familia eligen continuar la inscripción, el seguimiento estará basado en las indicaciones clínicas normales para el seguimiento. En cada aniversario, los pacientes serán evaluados para el crecimiento testicular en progreso/falta de atrofia ya sea mientras continúan inscritos o hasta que ellos están funcionando de una manera cómoda para sus propios exámenes físicos para este punto final. A los padres y pacientes se les instruirá acerca de la forma de realizar el auto-examen testicular cada vez para la visita. A los pacientes se les instruirá para registrarse para el seguimiento y se les aconsejará en dicho momento conforme decidan si desean perseguir la fertilidad. Con las complicaciones tempranas post-operatorias de los hematomas (sangrado) serán evaluadas en la sala de recuperación y en la primera visita después de la operación. El ultrasonido del escroto se realizará en la visita de los seis meses para evaluar la circulación y tamaño testicular.

Embarque al Laboratorio de Procesamiento. El tejido es recolectado por un representante y transportado a la instalación de procesamiento. El tejido es colocado dentro de un embarcador precalificado con capacidad para mantener una temperatura de 2°C hasta 8°C durante 48 horas. El tejido es transportado por medio de un vehículo personal y procesado inmediatamente una vez que se encuentra en el centro de procesamiento.

Procesamiento del Tejido. El procesamiento del tejido se lleva a cabo dentro de un gabinete de bioseguridad Clase II Tipo 2A dentro de un Entorno de Habitación Limpia ISO Clase 7. Todos los materiales necesarios para realizar el procesamiento del tejido son colocados dentro del gabinete de bioseguridad antes del procesamiento y cualesquiera partidas adicionales son esterilizadas si son necesarias. Un asistente auxilia al operador y asegura el pasaje de materiales apropiado dentro y fuera del gabinete de bioseguridad. El operador, estando vestido de manera estéril, no tocará nada fuera del gabinete de bioseguridad o nada que no haya sido esterilizado anteriormente. Primero, una pequeña pieza del tejido es removida para el análisis morfológico y el tejido restante es pesado en una báscula dentro del gabinete de bioseguridad. El resto del procedimiento sigue como tal: pipetear 25 mL de PBS + EDTA estéril en cada uno de los cuatro tubos cónicos de 50 mL. Usando tenacillas estériles, colocar el tejido testicular en el tubo con PBS + EDTA y sumergirlo por cinco segundos. Remover la pieza del tejido del primer tubo y repetir el procedimiento con el segundo, tercero, y cuarto tubos. Después de lavarlos en PBS + EDTA, se coloca el tejido en un tubo estéril de 50 mL vacío. Pipetear 2 mL de PBS + EDTA dentro del tubo con el tejido. Las tijeras quirúrgicas estériles cortan el tejido. Una vez que el tejido testicular ha sido picado, traer el volumen hasta 10 mL con PBS+EDTA. Pipetear 10 mL de Colagenasa 2X/DNAsa y sellar estrechamente con parafina. Incubar el tubo por 20 minutos en una incubadora seca y centrifugar un minuto en 400 x g cuando ya estuvo hecho. Remover la parafina y remover el líquido, teniendo cuidado de no perturbar el tejido testicular no digerido al fondo del tubo. Traer el volumen hasta 10 mL con PBS + EDTA. Agregar 10 mL de una solución de enzimas 2x. Cerrar herméticamente la tapa y sellarla con parafina. Colocar el tubo en una incubadora de agitación seca e incubarlo por 25 minutos. Cuando está completo, remover la parafina y agregar 2.2 mL de reemplazo de suero y mezclar bien. Pasar la mezcla a un colador de 100 µ? dentro de un nuevo tubo de 50 mL. Centrifugar en 400 x g por 10 minutos a temperatura ambiente. Aspirar el sobrenadante y agregar 10 mL de MEM + 10% para crear una suspensión de células homogénea. Las células aisladas ahora están listas para la cuenta de células y el ensayo de determinación de viabilidad, ensayo de flujo, y crioconservación.

Ensayos de Potencia, Identidad, Pureza v Estabilidad (Previo a la Congelación y Después del Deshielo). Las células aisladas serán contadas. Estos datos deben de correlacionarse con una cantidad conocida de células por peso de tejido (células/g) que debe de ser obtenida del procesamiento estándar del tejido. Si no se correlacionan podría indicar un problema con el tejido o una desviación del protocolo. En la preparación de la congelación, las células son entonces ajustadas a una concentración apropiada, de 3 a 5 x 106 células por mi de medio de congelación.

Las células aisladas son probadas para determinar el porcentaje de células que son viables. Esto se hace durante el proceso de cuenta con dos tipos de ensayos de viabilidad: Ensayo de viabilidad de exclusión de tinte azul tripano y el ensayo citométrico de flujo 7AAD: Para el ensayo citométrico de flujo 7AAD, las células son preparadas para un solo color o para tinción de colores múltiples con anticuerpos monoclonales/policlonales. De ser necesario, completar la tinción secundaria del anticuerpo. Después del último paso de lavado, volver a suspender las células 1 mi (por 10 millones de células) de regulador para el análisis. Agregar la solución del material 7-AAD a una concentración final (1 pg) a cada tubo e incubarlo durante 10 minutos. Mantener las muestras en esta solución a una temperatura de 4°C protegidas de la luz hasta el análisis en el citómetro de flujo. Las muestras con una viabilidad de <20% serán congeladas criogénicamente solamente después de consultar con el director médico.

Las células son evaluadas bajo un microscopio de contraste de fase para el análisis morfológico para determinar la salud, calidad, tamaño y apariencia general de las células. La eficiencia de la digestión del tejido para las células simples y la presencia de agrupaciones de células también son analizadas. Bajo la fase de contraste, las células saludables mantienen una estructura redonda, brillosa y no aparecen oscuras o fragmentadas. Una información más detallada acerca de las estructuras intracelulares, incluyendo el núcleo y el citoplasma, puede ser obtenida de un microscopio Hoffmann o Normarski. Bajo estos microscopios, las células de la línea germinal parecen redondas con una proporción de núcleo a citoplasma de 1 a 3 nucléolos y la inclusión citoplásmica. Las células de Sertoli son grandes y de forma irregular, mientras que las células de Leydig tienen muchas gotitas de lípidos en su citoplasma lo cual se mira como vesículas pequeñas.

Marcadores Citométricos de Flujo: Esperma: El cromosoma-X es más grande que el cromosoma-Y. Un tinte de ADN fluorescente (Hoechst 33342) es aplicado al esperma e incubado durante 20 minutos. El citómetro de flujo lo separa basado en su brillo respectivo; XX es más brilloso que XY.

Células de la Línea Germinal: Las células SSEA4, CD49f, CD114, CD90, GFR-a, Rat y de Ratón CD49f, SSEA1, GFR-a Humanas y de Primate.

Células de Leydig: Estas células carecen de marcadores específicos, pero uno que ha sido usado es el receptor de hormona luteinizante (LHR).

Protocolo de Tinción: Las células suspendidas en una concentración de 5 a 10 x 106 células por mi del medio de teñido. Se hace el bloqueo con FBS y/o anticuerpo específico para los receptores Fe. Se agrega el anticuerpo primario a una concentración final de 1 pg por millón de células. Se incuba 30 minutos en hielo en la oscuridad. Lavar. Se agrega el anticuerpo secundario a 0.5 g por millón de células (si es necesario). Se incuba 30 minutos en hielo en la oscuridad. Se lavan. Se suspenden a una concentración de 5 a 10 x 106 células por mi de los medios de tinción. Se mantiene en hielo en la oscuridad hasta el análisis.

Marcadores Inmunohistoquímicos: Los marcadores inmunohistoquímicos de las células de la línea germinal incluyen, pero no están limitados a, VASA. Otros marcadores IHC para la tinción de las secciones de parafina o congeladas para los marcadores de la célula de la línea germinal de la espermatogonia son SSEA-4, CD49f y para marcadores de células germinales son VASA, Equipo-c, GFR-a, y PLZF. Estos marcadores son usados en un ensayo para evaluar la presencia de diferentes tipos de células de la línea germinal y su potencial para restaurar la fertilidad.

Protocolo de Tinción Fluorescente para Secciones de Tejido Congeladas. Utilizando una Pluma Super PAP para dibujar un borde limpio alrededor de la sección del tejido. Lavar la sección del tejido con PBS dos veces para remover el OCT. Bloquear utilizando un suero de cabra u oveja al 5% + BSA al 1% + Triton-X al 0.1% en PBS por una hora a temperatura ambiente (la solución de bloqueo debe ser hecha dentro de tres días y almacenada a una temperatura de 4°C). La misma solución de bloqueo sin Triton-X puede ser utilizada para los marcadores de superficie. Incubar en anticuerpo primario en BSA al 1% durante la noche a una temperatura de 4°C. Lavar la sección 3X con PBS durante cinco minutos. Incubar en el anticuerpo secundario en BSA al 1% en PBS por una hora a temperatura ambiente. Remover el anticuerpo secundario. Teñir con el tinte nuclear [Hoechst (1:5000), DAPI (1:5000), ToPro-3 (1:200)]. Lavar la sección 3X con PBS por cinco minutos.

Marcadores de Biología Molecular. Los marcadores moleculares de la célula de la línea germinal incluyen, pero no están limitados a, VASA. Otros marcadores de expresión del gen para el análisis RT-PCR, PCR de tiempo real, o PCR Multiplex: marcadores de la célula de la línea germinal de la espermatogonia (SSEA-4, CD49f) y marcadores de células germinales (VASA, Equipo-c, GFR-a, y PLZF). Estos marcadores son usados en un ensayo para evaluar la presencia de diferentes tipos de células de la línea germinal y su potencial para restaurar la fertilidad.

Tipificación de H LA A/B/DR v Tipificación de ABO/Rh. La tipificación de ABO/Rh es realizada para confirmar la identidad del paciente. La tipificación de HLA es realizada utilizando métodos basados en el ADN para confirmar la identidad del paciente. Un tubo de sangre recolectada es enviado a un laboratorio aprobado por la ASHI para la tipificación de HLA. De un modo similar, un tubo de sangre recolectada es enviado a un laboratorio aprobado por la CLIA para la tipificación de ABO/Rh. Los tubos son enviados de la instalación de procesamiento de acuerdo con el protocolo.

La prueba de enfermedades infecciosas se realizará para asegurar la seguridad de la manera siguiente: Serológica: VIH-1/2, HTLV-I/II, HCV, HBsAg, HBc, Sífilis, CMV, Enfermedad de Chagas; NAT: VIH, VHC y WNV. Un tubo de sangre recolectada será enviado al laboratorio aprobado por la CLIA para la prueba de enfermedades infecciosas; hongos, prueba de cultivo de bacterias aeróbicas y anaeróbicas, prueba de susceptibilidad de especiación y antibióticos (si el cultivo es positivo); el cultivo microbiológico será realizado para asegurar la seguridad. Si el cultivo es positivo, la prueba de especiación y susceptibilidad se realizará de modo que el paciente puede ponerse en una terapia apropiada de antibióticos al momento del trasplante.

Crioconservación. Las células aisladas del procesamiento de tejidos son suspendidas en un medio especial que contiene crioprotectores de grado clínico diseñados para la crioconservación de células de la línea germinal. Un congelador de cantidad controlada es entonces utilizado para congelar lentamente las células en una cantidad de -1°C/minuto de +4°C a -60°C, y en -10°C/minuto de -60°C a -90°C. Las células son entonces colocadas en una fase de vapor de nitrógeno líquido de almacenamiento de cuarentena temporal entre -150°C y -196°C.

Almacenamiento de Cuarentena. Los productos crioconservados son almacenados en la fase de vapor de un tanque de nitrógeno líquido de cuarentena temporal entre -150°C y -196°C. En el caso de un producto contaminado por células del tumor, las bacterias aeróbicas, bacterias anaeróbicas, y hongos, o reactivos al VIH-1/2, HTLV-I/II, HCV, HBsAG, HBc, o WNV, el producto contaminado es removido a la fase de vapor de un tanque de nitrógeno líquido de cuarentena permanente. Cuando todos los productos en el tanque de cuarentena temporal están libres de contaminación, entonces el tanque de cuarentena temporal cambia el estado a un tanque de almacenamiento permanente.

Almacenamiento Permanente. Los productos que están libres de contaminación con microorganismos y que no son reactivos a VIH-1/2, HTLV-I/II, HCV, HBsAG, HBc, y WNV son almacenados en la fase de vapor del tanque del congelador de nitrógeno líquido de almacenamiento permanente entre -150°C y -196°C.

Los productos que se encuentran que están contaminados con células de tumor, bacterias aeróbicas, bacterias anaeróbicas, u hongos, o reactivos a VIH-1/2, HTLV-I/II, HCV, HBsAG, HBc, y WNV, son almacenados permanentemente en la fase de vapor del tanque de nitrógeno líquido de cuarentena permanente entre una temperatura de -150°C y -196°C. Se requerirá el consentimiento para estudiar la inscripción para la hepatitis y la prueba de VIH. Cualesquiera resultados positivos serán descritos a las partes que dieron el consentimiento y se hará referencia para el consejo apropiado y se proporcionará el tratamiento.

El análisis del estudio incluirá la determinación de la pérdida de células y viabilidad para el procesamiento y crioconservación (comparación precongelación con postdeshielo); la determinación de la estabilidad del producto en el almacenamiento criogénico (análisis posterior a la descongelación en diferentes puntos del tiempo después de la congelación); determinación de la cantidad de infertilidad de varias indicaciones; determinación de la cantidad de reacción adversa o complicación para el procedimiento de recolección quirúrgica; determinación del efecto de la edad de los sujetos para la viabilidad de las células después de descongeladas; determinación del efecto del protocolo de crioconservación eficiente en la viabilidad después del deshielo.

Reglas para Detener el Protocolo, La acumulación de pacientes para el ensayo es suspendida o sometida a revisión por el IRB si existen algunas muertes o reacciones adversas severas directamente resultantes del procedimiento de recolección quirúrgica. Solamente si el IRB considera razonable volver a iniciar el ensayo de la acumulación de los pacientes que se vuelven a asumir.

Ejemplo 19 Recolección. Procesamiento. Crioconservación v Banco de Tejidos y Células de la Línea Germinal Humana Femenina Inscripción de los Pacientes: Los sujetos de investigación serán inscritos en el estudio por una recomendación de los médicos. Una vez que se determinó que los sujetos encajan con los criterios para el estudio al sujeto se completará el proceso de consentimiento (y accederá en el caso de un menor).

Recolección de Tejido del Ovario y Cirugía. El tejido del ovario es recolectado bajo condiciones diferentes. Durante la cirugía, una pequeña pieza del tejido de corteza del ovario con un peso de aproximadamente de 1 a 2 gramos es removida bajo condiciones estériles. Para condiciones que requieren ovariectomías u ovariohisterectomías tales como pacientes de quistes del ovario, se remueve una pieza más grande del tejido del ovario durante la cirugía para remover todo el crecimiento canceroso o el ovario completo, o ambos ovarios. Para pacientes de cáncer, talasemia o pacientes con otras indicaciones hematológicas no malignas que requieren el trasplante de células madre, se realiza una cirugía para remover la porción del tejido de los ovarios o de un ovario.

Embargue al Laboratorio de Procesamiento. El tejido es recolectado por un representante y transportado en la instalación de procesamiento. El tejido será colocado dentro de un embarcador previamente calificado con capacidad para mantener una temperatura de 2°C a 8°C durante 48 horas.

Procesamiento del Tejido: Una vez que el tejido se encuentra en la instalación de procesamiento, el tejido es digerido mecánicamente y enzimáticamente dentro de un gabinete de bioseguridad Clase II Tipo A2 dentro de un ambiente de habitación limpia ISO clase 7 bajo condiciones estériles. Primero, los medios de embarque son transferidos a un plato de Petri y los folículos flotantes y huevos son recolectados bajo un microscopio binocular. Para la congelación del tejido de los ovarios, la corteza del ovario es cortada en pequeñas piezas delgadas y es preparada para la crioconservación. Para cortar y aislar los folículos pequeños y las células, el ovario es cortado en piezas pequeñas y digerido enzimáticamente. Las células aisladas y los folículos son entonces procesados adicionalmente para la crioconservación. Todos los materiales necesarios para realizar el procesamiento del tejido son colocados dentro del gabinete de bioseguridad antes del procesamiento y cualesquiera partidas adicionales son esterilizadas si son necesarias. El operador, estando vestido de manera estéril, no toca nada fuera del gabinete de bioseguridad o algo que no haya sido esterilizado anteriormente. Un asistente ayuda al operador y asegura el paso apropiado de materiales dentro y fuera del gabinete de bioseguridad.

Ensayos de Potencia. Identidad, Pureza v Estabilidad (Pre-Conqelado v Posterior al Deshielo): Las células aisladas son contadas. Estos datos se deben correlacionar con la cantidad conocida de células por peso del tejido que son obtenidas del procesamiento de tejidos.

La estabilidad es la caracterización de las células de los ovarios después del procesamiento. Incluye la viabilidad y análisis morfológico. Aproximadamente menos de la mitad de un millón de células son utilizadas para probar y una vez al año por 10 años la muestra se vuelve a probar.

Las células aisladas son probadas para determinar el porcentaje de células que son viables. Esto se hace durante el proceso de cuenta con dos tipos de ensayos de viabilidad: el ensayo de viabilidad de exclusión de tinte azul tripano (muestras con <50% de viabilidad son congeladas criogénicamente solamente después de consultar con el director médico) y el ensayo citométrico de flujo 7AAD (muestras con <20% de viabilidad son congeladas criogénicamente solamente después de consultar con el director médico).

Las células son evaluadas bajo un microscopio de contraste de fase para el análisis morfológico para determinar la salud, calidad, tamaño y apariencia general de las células. También, la eficiencia de digestión del tejido a las células simples y la presencia de agrupamientos de células es analizada. Bajo las células saludables sostenidas bajo contraste de fase mantienen un brillo y estructura redonda y no parecen oscuras o fragmentadas. La información más detallada acerca de las estructuras intracelulares incluyendo el núcleo y el citoplasma pueden ser obtenidos por los microscopios Hoffmann o Normarski. La presencia de oocitos flotantes y sueltos posibles puede ser observada bajo un microscopio binocular. Los oocitos son células grandes redondas y dependiendo de su etapa de maduración nuclear pueden tener vesículas nucleares (GV) o estar acompañadas con un (MI) o dos cuerpos polares (Mil). Otras estructuras que pueden ser cortadas morfológicamente del ovario son folículos en diferentes etapas de desarrollo de los folículos primordiales y el folículo antral de varios tamaños. Los folículos contienen los oocitos en la parte media y una de varias capas de granulosa y células theca alrededor de ellas. Los folículos primordiales y principales varían de tamaño de 200 pm a 500 pm y los folículos antrales pueden alcanzar varios milímetros y el folículo grafiano puede alcanzar de 2 a 3 cm. Conforme los folículos son incrustados en el ovario y son adjuntados estrechamente al mismo, y la oportunidad de encontrarlos sin la disociación mecánica o enzimática es muy baja.

Las células serán teñidas y evaluadas con un citómetro de flujo de escritorio para determinar la salud, calidad, tamaño y características específicas de las células. Los marcadores de flujo de las células de la línea germinal incluyen, pero no están limitados a, VASA, Oct-4, Equipo-c, SSEA-4.

Los marcadores IHC de las células de oocitos incluyen, pero no están limitados a, GDF9, ZP1, ZP4, Scp3. Los marcadores IHC del granulo cortical incluyen, pero no están limitados a, PNA. Una combinación de estos marcadores son utilizados en un ensayo para evaluar la presencia de diferentes tipos de células del ovario, incluyendo células potenciales de la línea germinal, y su potencial para restaurar la fertilidad.

Los marcadores moleculares de la célula de la línea germinal incluyen, pero no están limitados a, VASA, Oct-4, Equipo-c, SSEA-4. Los marcadores moleculares de las células de oocitos incluyen, pero no están limitados a, BicD1, GDF9, ZP1, ZP4, Ybx2, Scp3. Los marcadores moleculares de gránulos corticales incluyen, pero no están limitados a, PNA. Una combinación de estos marcadores son utilizados en un ensayo para evaluar la presencia de tipos diferentes de células del ovario, incluyendo células de línea germinal potenciales, y su potencial para restaurar la fertilidad.

La tipificación de ABO/Rh es realizada para confirmar la identidad del paciente. La tipificación de HLA es realizada utilizando métodos basados en el ADN para conformar la identidad del paciente. Las muestras de sangre recolectadas al momento de la recolección del tejido son enviadas a un laboratorio aprobado para la ASHI para la tipificación de HLA y un laboratorio aprobado para la CLIA para la tipificación de ABO/Rh de acuerdo con los protocolos de laboratorio aprobados.

La prueba de enfermedades infecciosas se realizará para asegurar la seguridad. Para las pruebas serológicas: VIH-1/2, HTLV-I/II, HCV, HBsAg, HBc, Sífilis, CMV, NAT, VIH, HCV y WNV, las muestras de sangre recolectadas al momento de la recolección del tejido son enviadas al laboratorio aprobado por la CLIA para la prueba de acuerdo con el protocolo del laboratorio apropiado. Los hongos, la prueba del cultivo de bacterias aeróbicas y anaeróbicas, la prueba de susceptibilidad de especiación y antibióticos (si el cultivo es positivo) son realizadas para asegurar la seguridad. Si el cultivo es positivo, entonces antes de cualquier trasplante autológo futuro del tejido o células del ovario, la prueba de susceptibilidad de especiación y antibióticos es realizada para erradicar cualquier microorganismo.

Crioconservación. Las células aisladas del procesamiento del tejido son suspendidas en un medio especial que contiene los crioprotectores diseñados para la crioconservación de las células y tejidos del ovario. Un congelador de cantidad controlada entonces es utilizado para congelar lentamente las células en -1°C/minuto de +4°C a -60°C, y de -60°C a -90°C, la cantidad de congelación se encontrará en -10°C/minuto. Para células más grandes, folículos y tiras de tejido del ovario, otros métodos de crioconservación tales como la vitrificación son utilizados. Las células entonces son colocadas en fase de vapor de nitrógeno líquido en almacenamiento de cuarentena a una temperatura entre -150°C y -196°C.

Almacenamiento de Cuarentena: Los productos crioconservados son almacenados en un tanque de nitrógeno líquido de cuarentena temporal a una temperatura entre -150°C y -196°C. En el caso de un producto contaminado por las células de tumor, bacterias aeróbicas, bacterias anaeróbicas, u hongos, o reactivos al VIH-1/2, HTLV-I/II, HCV, HBsAG, H Be, o WNV, el producto contaminado es removido de la fase de vapor del tanque de nitrógeno líquido de cuarentena permanente. Cuando todos los productos en el tanque de cuarentena temporal están libres de contaminación, entonces los cambios de estado del tanque de cuarentena temporal a un tanque de almacenamiento permanente a una temperatura entre -150°C y -196°C.

Almacenamiento Permanente: Los productos que están libres de contaminación con bacterias aeróbicas, bacterias anaeróbicas, y hongos, y no son reactivos al VIH-1/2, HTLV-I/II, HCV, HBsAG, HBc, y WNV son almacenados en la fase de vapor de un tanque congelador de nitrógeno líquido de almacenamiento permanente a una temperatura ente -150°C y -196°C.

Los productos que se encuentran que están contaminados con células de tumor, bacterias aeróbicas, bacterias anaeróbicas, u hongos, o son reactivos al VIH-1/2, HTLV-I/II, HCV, HBsAG, HBc, y WNV, son almacenados permanentemente en la fase de vapor de un tanque de nitrógeno líquido de cuarentena permanente a una temperatura entre -150°C y -196°C. Se requiere confirmarse para estudiar la inscripción para la prueba de hepatitis y VIH. Cualesquiera resultados positivos se describen para las partes que consintieron y se hará referencia para el consejo apropiado y los tratamientos son proporcionados.

El análisis del estudio incluirá la determinación de la pérdida de células y la viabilidad para el procesamiento y crioconservación (pre-congeladas en comparación con post-desheladas), determinación de la estabilidad del producto en almacenamiento criogénico (análisis post-descongelado en diferentes puntos del tiempo después de la congelación), la determinación de la cantidad de infertilidad para varias indicaciones, la determinación de la cantidad de reacción o complicación adversa para el procedimiento de recolección quirúrgica, la determinación del efecto de la edad de los sujetos para la viabilidad de las células después de descongeladas, y la determinación del efecto del protocolo de crioconservación eficiente en la viabilidad después de descongeladas.

Reglas para Detener el Protocolo: La acumulación de pacientes para el ensayo es suspendida y sometida a revisión por el IRB si existen cualesquiera muertes o reacciones adversas severas directamente resultantes del procedimiento de recolección quirúrgica. Solamente si el IRB considera que es razonable volver a iniciar el ensayo de la acumulación de los pacientes que se vuelven a asumir.

A menos que se indique lo contrario, todos los números que expresan cantidades de ingredientes, propiedades tales como peso molecular, condiciones de reacción, y así sucesivamente utilizados en la descripción y las reivindicaciones deberá quedar entendido como que son modificados en todos los casos por el término "aproximadamente". Por consiguiente, a menos que se indique lo contrario, los parámetros numéricos establecidos en la siguiente descripción y las reivindicaciones adjuntas son aproximaciones que pueden variar dependiendo de las propiedades deseadas previstas para ser obtenidas por la presente invención. Finalmente, y no como un intento para limitar la aplicación de la doctrina de los equivalentes al alcance de las reivindicaciones, cada parámetro numérico deberá ser al menos interpretado a la luz del número de dígitos importantes reportados y por la aplicación ordinaria de técnicas de redondeo. No obstante, que los rangos numéricos y parámetros establecen el alcance amplio de la invención son aproximaciones, los valores numéricos establecidos en los ejemplos específicos son reportados tan precisamente como es posible. Sin embargo, cualesquiera valores numéricos, contienen ciertos errores inherentemente necesarios resultantes de la desviación estándar encontrada en sus respectivas pruebas y mediciones.

Los términos "un", "una", "el/la" y referentes similares usados en el contexto de la descripción de la invención (especialmente en el contexto de las reivindicaciones siguientes) deberán ser interpretados como que cubren tanto el singular como el plural, a menos que se indique en esta descripción lo contrario o se contradiga claramente por el contexto. La mención de rangos de valores en esta descripción únicamente pretende servir como un método rápido de referencia individual a cada valor separado que se encuentra dentro del rango. A menos que se indique de otra manera en esta descripción, cada valor individual es incorporado dentro de la descripción como si fuera individualmente mencionado en la misma. Todos los métodos aquí descritos se pueden llevar a cabo en cualquier orden adecuado a menos que se indique lo contrario en esta descripción o de otra manera se contradiga claramente por el contexto. El uso de cualquiera y todos los ejemplos, o lenguaje de ejemplo (es decir, "tal como") aquí proporcionados pretenden únicamente ilustrar mejor la invención y no imponer una limitación en el alcance de la invención reivindicada de otra manera. Ningún lenguaje de la descripción debe ser interpretado como que indica cualquier elemento esencial no reivindicado para la práctica de la invención.

Los agrupamientos de elementos o modalidades alternativas de la presente invención descritas en este documento no deberán ser interpretadas como limitaciones. Nos podemos referir a cada elemento del grupo e individualmente reivindicado o en cualquier combinación con otros elementos del grupo u otros elementos aquí encontrados. Se anticipa que uno o más elementos de un grupo pueden estar incluidos en, o eliminados de, un grupo por razones de conveniencia y/o capacidad para patentarlos. Cuando ocurre cualquiera de dicha inclusión o eliminación, la descripción se considera que contiene en este caso el grupo como fue modificado llenando de esta manera la descripción escrita de todos los grupos de Markush utilizados en las reivindicaciones adjuntas.

Ciertas modalidades de la presente invención aquí descritas, incluyendo el mejor método conocido por los inventores de llevar a cabo la invención. Por supuesto, aquellos expertos en la técnica apreciarán variaciones de estas modalidades al leer la descripción anterior. El inventor espera que los expertos en la técnica empleen dichas variaciones como apropiadas, y los inventores pretenden que la invención sea practicada de otra manera a la descrita específicamente en este documento. Por consiguiente, la presente invención incluye todas las modificaciones y equivalentes del asunto materia mencionados en las reivindicaciones adjuntas permitidos por la ley aplicable. Además, cualquier combinación de los elementos descritos anteriormente y todas las variaciones posibles de los mismos están comprendidas por la invención a menos que se indique lo contrario en esta descripción o se contradiga claramente de otra manera por el contexto.

Además, se han hecho numerosas referencias a patentes y publicaciones impresas en toda esta descripción. Cada una de las referencias citadas anteriormente y publicaciones impresas están incorporadas en su totalidad individualmente a la presente descripción como referencia.

Las modalidades específicas aquí descritas pueden ser limitadas adicionalmente en las reivindicaciones utilizando el lenguaje de consistente de o esencialmente consistente de. Cuando son usados en las reivindicaciones, ya sea que son presentados o agregados por enmienda, el término de transición "consistente de" excluye cualquier paso, elemento, o ingrediente no especificado en las reivindicaciones. El término de transición "consistente esencialmente de" limita el alcance de una reivindicación a los materiales o pasos especificados y aquellos que no afectan materialmente las características básicas y novedosas. Las modalidades de la presente invención asi reivindicadas son inherentemente o expresamente descritas y habilitadas en esta descripción.

Para terminar, deberá quedar entendido que las modalidades de la presente invención aquí descritas son ilustrativas de los principios de la presente invención. Otras modificaciones que pueden ser empleadas se encuentran dentro del alcance de la presente invención. Por lo tanto, a modo de ejemplo, pero no de limitación, se pueden utilizar configuraciones alternativas de la presente invención de acuerdo con las enseñanzas de esta descripción. Por consiguiente, la presente invención no está limitada a lo mostrado y descrito precisamente.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para el guardado en bancos de células madre de la línea germinal que comprende: la recolección de tejidos de las gónadas de un mamífero en riesgo de pérdida de la fertilidad; el transporte del tejido de las gónadas a una instalación bancaria central; el procesamiento del tejido de las gónadas; la crioconservación de dicho tejido de las gónadas; y la determinación del potencial de fertilidad de dicho tejido de las gónadas crioconservado.

2. El método tal y como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque el tejido de las gónadas es el tejido testicular.

3. El método tal y como se describe en la reivindicación 2, caracterizado porque el procesamiento del tejido testicular comprende preparar piezas de aproximadamente 0.5 mm2 a 2.0 mm2 del tejido testicular.

4. El método tal y como se describe en la reivindicación 2, caracterizado porque el procesamiento del tejido testicular comprende: digerir el tejido testicular con al menos una enzima seleccionada del grupo consistente de colagenasa, DNasa, hialuronidasa y tripsina; y desactivar dicha al menos una enzima, obteniendo de este modo una suspensión de células testiculares disociadas.

5. El método tal y como se describe en la reivindicación 4, caracterizado porque comprende además el paso de aislar las células madre de la línea germinal del macho de dichas células testiculares disociadas, en donde las células madre de la línea germinal del macho son caracterizadas en que ellas no expresan el receptor de hormona leutinizante.

6. El método tal y como se describe en la reivindicación 4, caracterizado porque comprende además el paso de aislar las células madre de la línea germinal del macho de las células testiculares disociadas, en donde las células madre de la línea germinal del macho son caracterizadas en que expresan las células SSEA-4.

7. El método tal y como se describe en la reivindicación 6, caracterizado porque las células madre de la línea germinal del macho expresan además GFR-a1 y VASA.

8. El método tal y como se describe en la reivindicación 2, caracterizado porque al determinar el potencial de fertilidad es la capacidad de dicho tejido testicular para diferenciarse en esperma madura in vitro.

9. El método tal y como se describe en la reivindicación 2, caracterizado porque la determinación del potencial de fertilidad es determinar las características de las células testiculares por al menos uno de la expresión meiótica y los marcadores postmeióticos y el tamaño y morfología.

10. El método tal y como se describe en la reivindicación I, caracterizado porque el tejido de las gónadas es tejido del ovario.

11. El método tal y como se describe en la reivindicación 10, caracterizado porque el procesamiento del tejido del ovario comprende preparar piezas de aproximadamente 0.5 mm2 a 3.0 mm2 del tejido del ovario.

12. El método tal y como se describe en la reivindicación II, caracterizado porque el procesamiento comprende además: digerir dichas piezas del tejido del ovario con al menos una enzima seleccionada del grupo consistente de colagenasa, DNasa, hialuronidasa y tripsina; y desactivar dicha al menos una enzima, obteniendo de esta manera una suspensión de células del ovario disociadas.

13. El método tal y como se describe en la reivindicación 10, caracterizado porque la determinación del potencial de fertilidad es realizada por la habilidad del tejido del ovario para diferenciar en óvulos maduros ¡n vitro.

14. El método tal y como se describe en la reivindicación 10, caracterizado porque al determinar el potencial de fertilidad es determinar las características de las células del ovario por al menos uno de la expresión meiótica y los marcadores postmeióticos y el tamaño y morfología.

15. El método tal y como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque comprende además el paso de implantar dicho tejido de las gónadas crioconservado en tejido residual de las gónadas en el mismo individuo del cual fue aislado el tejido de las gónadas.

16. Un sistema de banco de células madre de la línea germinal que comprende: medios para recolectar el tejido de las gónadas; medios para transportar el tejido de las gónadas; medios para procesar el tejido de las gónadas para aislar las células madre de la línea germinal; medios para crioconservar el tejido de las gónadas o dichas células madre de la línea germinal; medios para determinar el potencial de fertilidad del tejido de las gónadas crioconservado o dichas células madre de la línea germinal crioconservadas.