CN117062613A - 建立人类睾丸组织培养系统的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种用于识别在体外维持睾丸细胞的同一性、生长和存活的培养条件的迭代方法，还提供了一种用于支持人类精子发生和使用识别的培养条件进行培养的睾丸细胞培养系统。所述方法和培养条件可用于从可育和不育男性培养具有较低有害或新生突变或表观遗传扰动比率的、健康且有活力的精子，以供将来与辅助生殖技术一起使用。

Description

建立人类睾丸组织培养系统的方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2021年1月4日提交的临时申请号63/133,633的优先权，其全部内容通过引用并入本文作为参考。
发明领域
本申请提供了一种用于识别在体外维持睾丸细胞的同一性、生长和存活的培养条件的迭代方法，以及使用所识别的培养条件来支持人类精子生成和培养的睾丸细胞培养系统。
发明背景
一个关键的需求是以转录组规模方式分析所需的规模、并且以完全保留其精子生成的同一性和功能性的方式，长期培养人类生殖细胞的能力。然而，人类男性生育领域由于缺乏研究精子生成的工具而受到阻碍。目前还没有成功的方式来满足这些需求。
通过多种路径，理解小鼠体内配子发生和种系小生境通讯方面已经取得了相当大的进展。此外，已成功培养精原细胞，并开发了从培养的精原细胞中产生功能性精子的方法，这些精子能够成功进行体外受精并产生可存活和可育的小鼠。相比之下，在人类中，尽管对成人睾丸生理学有很好的描述，但对精原干细胞(SSC)、增殖精原细胞及其调节的了解还很少，还没有实现与基因组学方法相结合来长期培养人类精原细胞以确保其同一性。因此，需要体外培养睾丸生殖系细胞(精原细胞)的方法和系统，这是精子生成的前身。为了实现这一目标，需要一种新的方法。
发明内容
本申请的一个方面涵盖一种用于识别在体外支持睾丸生殖细胞(testiculargerm cells)和体细胞(somatic cells)生长的培养条件的迭代方法。该方法包括识别与直接从男性受试者的睾丸分离的单个睾丸细胞(testicular cells)中的RNA转录物的表达相比，在第一组条件下体外生长的单个睾丸细胞中差异表达的RNA转录物，其中所述差异表达的RNA转录物识别体外培养的细胞中一个或多个失调的生物路径(dysregulatedbiological pathways)。根据比较结果，睾丸细胞在第二组培养条件下生长以减轻已识别路径的失调，已识别路径的失调的减轻通过测试生长(growth)、存活(survival)、生理机能(physiology)或发育(development)的改善来确认。与直接从男性睾丸分离的细胞相比，在第二组培养条件下生长的细胞表现出适当的同一性(identity)、生长(growth)和存活(survival)。任选地，将上述步骤反复重复多次，以识别与直接从成年男性睾丸分离的细胞相比，培养的细胞具有适当的同一性(identity)、生长(growth)和存活的(survival)、在体外支持睾丸细胞生长的培养条件。
生长的细胞可以是分离的睾丸生殖细胞、包含一根或多根含有睾丸生殖细胞和睾丸体细胞的生精小管的睾丸组织、或者包含睾丸生殖细胞和支持细胞的类器官。在一些方面，所述睾丸组织是生精小管。类器官的支持细胞可包括塞托利(Sertoli)细胞、原代永生化塞托利细胞(primary immortalized Sertoli cells)、永生化塞托利细胞、莱迪希氏(Leydig)细胞、肌样细胞(myoid cells)、经识别可用于以类器官形式培养的细胞或其任意组合。在一些方面，所述类器官包括适当的生精小管组织和形态，包括永生化塞托利细胞或其组合。
所述迭代方法的生殖细胞可包括精原细胞(spermatogonia)、精母细胞(spermatocytes)、精细胞(spermatids)或其任意组合。精原细胞可以包括精原干细胞(spermatogonial stem cells)、增殖精原细胞或分化中的精原细胞(proliferativespermatogonia,or differentiating spermatogonia)。精原细胞还可以包含状态0、状态1、状态2、状态3、状态4精原细胞或其任意组合。状态0精原细胞对于标志物DDX4、UTF1、TSPAN33、PIWIL2、PIWIL4、EGR4、MSL3、TCF3、LM04、GNAS、ID1、ID4和LIN7B可以呈阳性。状态1精原细胞对于标志物DDX4、UTF1、SSEA4、CITED2、L1TD1、ZNGF462、GFRA1、GFRA2、MEF2C、TCF7L2、ID2、DPPA4、MYO6、SOCS1、ETV5呈阳性。状态2精原细胞对于细胞周期、复制等的标志物呈阳性，包括：CHAF1A、DMRT1、DMRTB1、MKI67、CCNA2、CENPA、TOP2A、PCNA。状态3精原细胞对于与ATP合成、线粒体、NADH脱氢酶复合物相关的许多标志物呈阳性，包括：ATP5E/J/L、NDUFA6、NDUFB1/6、BSG、KIT、LSM3/4、CDK1、CTCFL、SSX3。状态4精原细胞对于与减数分裂准备相关的标志物呈阳性。
所述精母细胞可以包括前细线期精母细胞、细线/偶线期精母细胞、粗线期精母细胞、双线期2°精母细胞或其任意组合，所述精细胞可以包括圆形精细胞、长形精细胞和精子(sperm,spermatozoa)或其任意组合。所述睾丸组织中的睾丸体细胞可包括塞托利细胞、莱迪希氏细胞、内皮细胞、肌样细胞或其任意组合。
在第二组培养条件下生长的细胞可包含与直接从成年男性睾丸分离的细胞的RNA转录物表达谱基本相似的RNA转录物表达谱。此外，在第二组培养条件下生长的细胞可以没有失调的路径。
在一些方面，在第一组条件下生长的睾丸细胞是健康成年受试者的睾丸细胞。所述睾丸细胞还可以是不育或生育力低下的成年受试者的睾丸细胞。所述睾丸细胞可以从尸体受试者(a cadaveric subject)中分离。
睾丸细胞培养系统能够在体外维持睾丸生殖细胞的同一性、生长、存活和复制。在一些方面，所述睾丸生殖细胞的同一性、生长、存活和复制可以从培养开始维持2周或更长时间。
第二组培养条件可以是进一步包括含有第一培养基的第一组培养条件，所述培养基补充了一种或多种减轻所识别的失调生物路径的失调的因子。所述一种或多种因子可包括缺氧诱导因子(HIF)的抑制剂、促性腺皮质激素(gonadocorticoid)、促性腺激素(gonadotropin)、GDNF家族配体(GFL)的成员、激活素、成纤维细胞生长因子受体(FGFR)蛋白配体、白细胞介素6细胞因子、趋化因子、视黄酸受体配体、或其任意组合。HIF可以是HIF-1α、VHL E3泛素连接酶(VHL)或其组合。HIF-1α抑制剂可以是聚酰胺(破坏HIF-1-DNA接口(the HIF-1–DNA interface))、吖啶黄(抑制HIF-1二聚化)、毛壳菌素(chetomin)(破坏HIF-1-p300相互作用)、YC1(灭活HIF-1α的转录活性)、两性霉素B(灭活HIF-1α的转录活性)、AJM290(灭活HIF-1α的转录活性)、AW464(灭活HIF-1α的转录活性)、PX-12(抑制HIF-1α蛋白水平)、PX-478(抑制HIF-1α蛋白水平)、氨基黄酮(抑制HIF-1α蛋白水平)、EZN-2968(HIF1α的RNA拮抗剂)、棘霉素(破坏HIF-1-DNA接口)或其任意组合。在一些方面，所述HIF-1α抑制剂是棘霉素、PX-12、牡荆素或其任意组合。在一个方面，所述HIF-1α抑制剂是棘霉素，并且培养基中棘霉素的浓度范围可以从约0.1nM至约100nM、约1nM至约50nM、或者约2nM至约7nM。
促性腺皮质激素可以是雄激素。雄激素可以是睾酮、FSH、hCG、LH、GDNF或其组合。在一些方面，所述雄激素是睾酮，并且培养基中睾酮的浓度范围从约10-5M至约10-9M、约10- 6M至约10-8M、或者约1.5×10-6M至约0.5×10-8M。
GFL的成员可以是GDNF。在一些方面，培养基中GDNF的浓度范围从约0.1ng/mL至约100ng/mL、约1ng/mL至约50ng/mL、或者约7ng/mL至约12ng/mL。
成纤维细胞生长因子受体(FGFR)蛋白配体可以是bFGF(FGF2)。在一些方面，培养基中bFGF的浓度范围从约0.1ng/mL至约100ng/mL、约1ng/mL至约50ng/mL、或者约7ng/mL至约12ng/mL。
促性腺激素可以是人绒毛膜促性腺激素(hCG)、黄体生成素(LH)或两者。激活素可以是激活素A。培养基中激活素A的浓度范围可以从约0.1ng/mL至约200ng/mL、约1ng/mL至约150ng/mL、或者约25ng/mL至约75ng/mL。
FGFR蛋白配体可以是FGF2。在一些方面，培养基中FGF2的浓度范围从约0.1ng/mL至约100ng/mL、约1ng/mL至约50ng/mL、或者约7ng/mL至约12ng/mL。
白细胞介素6细胞因子可以是白血病抑制因子(LIF)。
在一些方面，培养基中LIF的浓度范围从约1ng/mL至约500ng/mL、约10ng/mL至约200ng/mL、或者约75ng/mL至约125ng/mL。
趋化因子可以是CXCL12。在一些方面，培养基中CXCL12的浓度范围从约1ng/mL至约500ng/mL、约10ng/mL至约200ng/mL、或者约75ng/mL至约125ng/mL。
视黄酸受体配体可以是视黄酸。在一些方面，培养基中视黄酸的浓度范围从约10- 5M至约10-9M、约10-6M至约10-8M、或者约2.5×10-7M至约3.5×10-7M。
在一些方面，所述一种或多种因子包括棘霉素、睾酮、RA和FSH。在另一些方面，所述一种或多种因子包括棘霉素、睾酮和GDNF。在还一些方面，所述一种或多种因子包括棘霉素、睾酮、GDNF、HCG和FSH。
所述第一培养基可以是基础培养基。在一些方面，基础培养基是α-MEM+10％KSR。
所述单个睾丸细胞中的RNA转录物可以直接从男性受试者的睾丸中分离。
本发明的另一个方面涵盖一种用于支持人类精子体外生成的睾丸细胞培养系统。该系统包括睾丸生殖细胞和培养基。培养基包含基础培养基和一种或多种减轻在基础培养基中生长的睾丸细胞中失调的生物路径的失调的因子。所述因子使用上文描述的方法来识别。
本发明的再一个方面涵盖一种睾丸细胞组合物(A testicular cellcomposition)，其包含使用上文描述的经识别的培养条件、上述的睾丸细胞培养系统、或两者进行体外生长的生殖细胞、体外生长的睾丸组织或者体外生长的类器官。
本发明的还一个方面涵盖一种通过培养从可育和不育男性获得具有较低有害或新生突变(deleterious or de novo mutations)或表观遗传扰动比率(epigeneticperturbations)的精子的方法。该方法包括使用用上述方法识别的培养条件、上述的睾丸细胞培养系统或两者来培养超过一个精原干细胞(spermatogonial stem cell，SSC)，其中每个SSC单独培养。所述方法还包括识别包含由培养的SSC产生的精子的精原干细胞培养物。所述精子不包含有害的遗传突变和/或包含较低比率的新生突变，并且包含与SSC培养物中SSC的RNA转录物表达谱基本相似的RNA转录物表达谱。所述方法还包括从经识别的培养条件中收获精子。该方法还可以包括冷冻精子以供未来使用的步骤，和/或通过如宫内授精或体外受精的辅助生殖技术来使用精子的步骤。
本发明的一个方面涵盖一种产生有活力的精子的方法。该方法包括从受试者获得睾丸组织，并在用上述方法识别的培养条件下、上述的睾丸细胞培养系统或两者培养睾丸组织。
本发明的一个方面涵盖一种试剂盒，该试剂盒用于在用上述方法识别的条件下、上述的睾丸细胞培养系统或两者体外培养睾丸生殖细胞。
附图说明
图1A是人类胎儿和产后睾丸的单细胞转录组图谱及分析。来自胚胎、胎儿和婴儿人类睾丸(n＝30,045)的组合单细胞转录组数据(combined single-cell transcriptomedata)的降维展现(Dimension reductionpresentation)(通过UMAP)。每个点代表一个单细胞，并根据其年龄/捐赠者来源进行着色。对于每个细胞簇，主图中显示了1个细胞标志物，同时图8中还有一批其他标志物的图。也请参见图7A-7C和图8。
图1B是人类胎儿和产后睾丸的单细胞转录组图谱及分析。来自胚胎、胎儿和婴儿人类睾丸(n＝30,045)的组合单细胞转录组数据的降维展现(通过UMAP)。每个点代表一个单细胞，并根据其年龄/捐赠者来源进行着色。对于每个细胞簇(cell cluster)，主图中显示了1个细胞标志物，同时图8中还有一批其他标志物的图。也请参见图7A-7C和图8。
图1C是人类胎儿和产后睾丸的单细胞转录组图谱及分析。投影在UMAP图上的选定标志物的表达模式(图1A)。对于每个细胞簇，主图中显示了1个细胞标志物，同时图8中还有一批其他标志物的图。也请参见图7A-7C和图8。
图2A是人PGC发育为成年精原细胞期间的基因表达动态(agene expressiondynamics)。结合了婴儿生殖细胞和成人精原细胞状态(Guo等人,2018)、已在图中描画的生殖细胞(图1B中的簇12)的集中分析(Focused analysis)(t-SNE和拟时序(pseudotime))揭示了生殖细胞从胚胎到成体发育的单一拟发育轨迹(a single pseudo-developmentaltrajectory)。细胞根据捐赠者的年龄着色。差异基因表达水平使用由颜色键(thecolorkey)定义的Z分数(Z score)；相关的GO术语(GO terms)(使用DAVID 6.7版)在相应基因簇的右侧给出。也请参见图9和图10。
图2B是人PGC发育为成年精原细胞期间的基因表达动态。已知PGC和生殖细胞标志物的表达模式投影到tSNE图(tSNE plot)上(图2A)。也请参见图9和图10。
图2C是人PGC发育为成年精原细胞期间的基因表达动态。基因的k均值聚类(k-means clustering ofgenes)沿着生殖细胞拟发育轨迹表现出差异表达(n＝2,448)。每行代表一个基因，每列代表一个单细胞，列/细胞按照(图2A)中定义的拟时间顺序(thepseudotime order)放置。差异基因表达水平使用由颜色键定义的Z分数；相关的GO术语(使用DAVID 6.7版)在相应基因簇(gene clusters)的右侧给出。也请参见图9和图10。
图2D是人PGC发育为成年精原细胞期间的基因表达动态。第5至19周的样本中增殖(MKI67，黄色)、多能性(NANOG，品红色)和生殖细胞(DDX4，青色)标志物的蛋白质共免疫荧光以及它们相应的定量。也请参见图9和图10。
图2E是人PGC发育为成年精原细胞期间的基因表达动态。第8至17周的样本中生殖细胞(DDX4)和状态0(PIWIL4)标志物的蛋白质共免疫荧光。也请参见图9和图10。
图2F是人PGC发育为成年精原细胞期间的基因表达动态。量化第12-16周胎儿睾丸样本中PIWIL4+生殖细胞(DDX4+)的比例。每个重复(perreplicate)至少100个细胞，计数3个重复。每个重复来自一个独特的捐赠者。数据显示平均值±SEM(单因素方差分析，然后进行Tukey事后检验)。调整后*p＝0.0136、**p＝0.0048，***p％0.0008。也请参见图9和图10。
图3A是间质和塞托利谱系的特化(specification)。睾丸小生境细胞(testicularniche cells)(图1B中的簇1-11)的集中分析(UMAP和拟时序)，其中细胞根据捐献者的年龄着色。也请参见图11。
图3B是间质和塞托利谱系的特化。根据捐赠者的年龄对(图3A)中的图进行反卷积。也请参见图11。
图3C是间质和塞托利谱系的特化。睾丸小生境细胞(图1B中的簇1-11)的集中分析(在图3A中)，其中细胞根据年龄/捐赠者来源着色。也请参见图11。
图3D是间质和塞托利谱系的特化。已知祖细胞、间质/莱迪希氏和塞托利标志物的表达模式投影到图3A上。也请参见图11。
图4A是间质和塞托利谱系特化期间的基因表达动态。基因的k均值聚类沿着间质/莱迪希氏和塞托利特化表现出不同表达(n＝1,578)。每行代表一个基因，每列代表一个单细胞，列/细胞按照图3A中定义的拟时间顺序放置。差异基因表达水平使用由颜色键定义的Z分数，相关的GO术语(使用DAVID 6.7版)在相应基因簇的右侧给出。也请参见图12。
图4B是间质和塞托利谱系特化期间的基因表达动态。对第5至16周样本中的莱迪希氏标志物CYP17A1(青色)进行了免疫染色。也请参见图12。
图4C是间质和塞托利谱系特化期间的基因表达动态。分析揭示了莱迪希氏细胞从胎儿到婴儿阶段的分化过程中差异表达的基因。每个面板左侧的小提琴图显示倍数变化(x轴)和调整后的p值(y轴)。每个面板右侧部分代表富集的GO术语(enriched GO terms)和相关的p值。也请参见图12。
图4D是间质和塞托利谱系特化期间的基因表达动态。分析揭示了塞托利细胞从胎儿到婴儿阶段的分化过程中差异表达的基因。每个面板左侧的小提琴图显示倍数变化(x轴)和调整后的p值(y轴)。每个面板右侧部分代表富集的GO术语和相关的p值。也请参见图12。
图4E是间质和塞托利谱系特化期间的基因表达动态。对胎儿和产后睾丸样本中莱迪希氏标志物CYP17A1(青色)进行了免疫染色。也请参见图12。
图4F是间质和塞托利谱系特化期间的基因表达动态。胎儿间质细胞、青春期前莱迪希氏/肌样细胞以及成人莱迪希氏和肌样细胞的拟时序轨迹(Pseudotime trajectory)(结合Monocle分析)。细胞根据它们在拟时间(pseudotime)上的预测位置进行着色。新生儿数据来自Sohni等人，2019年；1岁和25岁数据来自Guo等人，2018年，7至14岁数据来自Guo等人，2020年。也请参见图12。
图4G是间质和塞托利谱系特化期间的基因表达动态。根据年龄/捐赠者来源对Monocle拟时序图(pseudotime plot)进行反卷积。也请参见图12。
图5A是涉及间质和塞托利细胞的特化的关键转录因子。对第6周和7周细胞的睾丸小生境祖细胞进行了主成分分析，揭示存在间质/莱迪希氏和塞托利谱系分叉。
图5B是涉及间质和塞托利细胞的特化的关键转录因子。关键因子的表达模式显示了祖细胞分化过程中的特定模式。
图5C是涉及间质和塞托利细胞的特化的关键转录因子。第5和8周样本中转录因子GATA3(青色)的染色。
图5D是涉及间质和塞托利细胞的特化的关键转录因子。第6和17周样本中转录因子GATA4(青色)的染色。
图5E是涉及间质和塞托利细胞的特化的关键转录因子。第5和8周样本中塞托利(DMRT1，洋红色)和生殖细胞(DDX4，青色)标志物的共染色。
图5F是涉及间质和塞托利细胞特化的关键转录因子。第5.5至17周样本中2个塞托利细胞标志物DMRT1和SOX9的共染色。
图6A是提议的用于产前和产后阶段的人种系发育和体细胞小生境细胞特化的模型。示意图概括了伴随人PGC分化为成人SSC的组合基因表达程序和细胞事件。
图6B是提议的用于产前和产后阶段的人种系发育和体细胞小生境细胞特化(somatic niche cell specification)的模型。用于胚胎、胎儿和产后阶段人类睾丸体细胞小生境细胞发育的时间线和提议的模型。独特的祖细胞细胞群向塞托利和间质/莱迪希氏谱系的特化始于受精后7周左右，即索(the cord)形成时。
图7A是人类胎儿和产后睾丸的单细胞转录组图谱及分析。基于年龄/捐赠者来源对图1A中的组合UMAP分析进行分区，来自每个捐赠者的细胞在不同的框中分别着色。与图1A-1C相关。
图7B的上图是人类胎儿和产后睾丸的单细胞转录组图谱和分析。柱状图显示每个样本/年龄的不同细胞类型/簇的细胞数。与图1相关。下图是人类胎儿和产后睾丸的单细胞转录组图谱和分析。柱状图显示每个样本/年龄的不同细胞类型/簇的相对比例。与图1A-1C相关。
图8是投影在UMAP图上的其他标志物的表达模式。与图1A-1C相关。
图9A是人PGC向状态f0的转变。基于年龄/捐赠者来源对图2A中的组合tSNE分析进行分区，来自每个捐赠者的细胞在不同的区块分别着色。与图2A-2F相关。
图9B是人PGC向状态f0的转变。基于年龄/捐赠者来源对图2A中的组合tSNE分析进行分区，来自每个捐赠者的细胞在不同的区块分别着色。与图2A-2F相关。
图9C是人PGC向状态f0的转变。基于年龄/捐赠者来源对图2A中的组合tSNE分析进行分区，来自每个捐赠者的细胞在不同的区块分别着色。与图2A-2F相关。
图9D是人PGC向状态f0的转变。胚胎、胎儿、产后和成人生殖细胞的拟时序轨迹(Monocle分析)。细胞根据预测的拟时间着色。第7天样本的数据来自Sohni等人，2019年，1岁和成人数据来自Guo等人，2018年。与图2A-2F相关。
图9E是人PGC向状态f0的转变。根据年龄/捐赠者来源对Monocle拟时序图进行反卷积。与图2A-2F相关。
图9F是人PGC向状态f0的转变。第5周人胚胎切片的H&E染色。黄色箭头表示生殖脊。根据显微镜检查方法部分中描述的方案拼接图像。与图2A-2F相关。
图9G是人PGC向状态f0的转变。第5和8周样本中增殖(MKI67，黄色)、多能性(NANOG，洋红色)和生殖细胞(DDX4，青色)标志物的蛋白质共免疫荧光的大视野图像。与图2A-2F相关。
图9H是人PGC向状态f0的转变。第12至16周样本中生殖细胞(DDX4，洋红色)和状态0(PIWIL4，青色)标志物的蛋白质共免疫荧光的大视野图像。与图2A-2F相关。
图10A是胎儿和产后生殖细胞发育期间的网络表达动态。WGCNA分析揭示的基因-基因网络在PGC(3A)、精原细胞(3B)或状态0(3C)中上调。突出显示了前10个中枢基因(hubgene)。与图2A-2F相关。
图10B是胎儿和产后生殖细胞发育期间的网络表达动态。WGCNA分析揭示的基因-基因网络在PGC(3A)、精原细胞(3B)或状态0(3C)中上调。突出显示了前10个中枢基因。与图2A-2F相关。
图10C是胎儿和产后生殖细胞发育期间的网络表达动态。WGCNA分析揭示的基因-基因网络在PGC(3A)、精原细胞(3B)或状态0(3C)中上调。突出显示了前10个中枢基因。与图2A-2F相关。
图10D是胎儿和产后生殖细胞发育期间的网络表达动态。前几个中枢基因的表达模式投影到图2A的tSNE图上。与图2A-2F相关。
图10E是胎儿和产后生殖细胞发育期间的网络表达动态。前几个中枢基因的表达模式投影到图2A的tSNE图上。与图2A-2F相关。
图10F是胎儿和产后生殖细胞发育期间的网络表达动态。前几个中枢基因的表达模式投影到图2A的tSNE图上。与图2A-2F相关。
图10G是胎儿和产后生殖细胞发育期间的网络表达动态。小提琴图显示在状态f0细胞中特异性表达的基因。根据标准统计截止值(a standard statistical cutoff)(倍数变化>2且p值<0.05)，识别了与PGC和状态0相比，在状态f0表达更高的11个基因。过滤掉在其他SSC状态(例如状态1-4)中也表现出高表达的基因后，得到了状态f0特异性的2个基因：ID3和GAGE12H。与图2A-2F相关。
图10H是胎儿和产后生殖细胞发育期间的网络表达动态。第4至25周样本中迁移、有丝分裂和有丝分裂停滞(mitotic-arrest)的胎儿生殖细胞的构成。数据来自Li等人,2017。与图2A-2F相关。
图10I是胎儿和产后生殖细胞发育期间的网络表达动态。小提琴图显示迁移、有丝分裂和有丝分裂停滞的胎儿生殖细胞中已知PGC和生殖细胞标志物的比例/百分比表达水平，来自Li等人，2017。与图2A-2F相关。
图11A是胚胎和胎儿阶段的体细胞小生境细胞特化。柱状图显示每个样本/年龄的睾丸小生境细胞中不同细胞类型/簇的细胞数。与图3A-3D、4A-4G和5A-5F相关。
图11B是胚胎和胎儿阶段的体细胞小生境细胞特化。在祖细胞分化过程中显示特定模式的关键因子的表达模式。与图3A-3D、4A-4G和5A-5F相关。
图11C是胚胎和胎儿阶段的体细胞小生境细胞特化。在第8至17周样本中两种塞托利细胞标志物DMRT1(青色)和SOX9(洋红色)的共染色大视野图像。比例尺表示40um。与图3A-3D、4A-4G和5A-5F相关。
图11D是胚胎和胎儿阶段的体细胞小生境细胞特化。第8至18周样本中莱迪希氏细胞标志物DMRT1(青色)和塞托利细胞标志物SOX9(洋红色)的共染色模式。比例尺表示50um。与图3A-3D、4A-4G和5A-5F相关。
图11E是胚胎和胎儿阶段的体细胞小生境细胞特化。胎儿(10周)和成人睾丸中的ACTA2染色模式。与成人睾丸中ACTA2+肌样细胞围绕生精小管不同，ACTA2表达在胎儿睾丸中是受限的(索边界用虚线标记)。尽管可以在胎儿索外检测到有限的ACTA2信号，但信号稀疏，并且表达ACTA2的细胞没有延长并形成环状结构。左侧的比例尺：大视野(50um)，插入(10um)。右侧比例尺：20um。与图3A-3D、4A-4G和5A-5F相关。
图12A是提议的胚胎、胎儿和产后阶段人类种系发育和体细胞小生境细胞特化的模型。代表性基因表现出在莱迪希氏细胞从胎儿到婴儿阶段分化期间的差异表达模式。与图4A-4G和5A-5F相关。
图12B是提议的胚胎、胎儿和产后阶段人类种系发育和体细胞小生境细胞特化的模型。代表性基因表现出在塞托利细胞从胎儿到婴儿阶段分化期间的差异表达模式。与图4A-4G和5A-5F相关。
图12C是提议的胚胎、胎儿和产后阶段人类种系发育和体细胞小生境细胞特化的模型。对第6和7周体细胞祖细胞的Monocle分析揭示了发育分叉。与图4A-4G和5A-5F相关。
图12D是提议的胚胎、胎儿和产后阶段人类种系发育和体细胞小生境细胞特化的模型。图12C中Monocle图的拟时序轨迹。与图4A-4G和5A-5F相关。
图12E是提议的胚胎、胎儿和产后阶段人类种系发育和体细胞小生境细胞特化的模型。投影到图12C的Monocle图上的关键因子的表达模式。与图4A-4G和5A-5F相关。
图13图示了复杂并有组织的人类精原干细胞小生境(niche)。
图14：培养的组织中生殖细胞(DDX4)、DNA合成(Edll)和核酸(DAPI)标志物的蛋白质共免疫荧光显示了体外分化中的精原细胞的增殖/复制，以及分化中的精原细胞增殖/复制并进入减数分裂的能力。
图15：培养的精小管中分化中的精原细胞(EdU+/UTF1-/SYCP3-)、分化中的精原细胞(EdU+/UTF1-/SYCP3-)、精母细胞(EdU+/SYCP3+)和核酸(DAPI)的标志物的蛋白质共免疫荧光显示了体外分化中的精原细胞的增殖/复制，以及分化中的精原细胞增殖/复制并进入减数分裂的能力。
图16：使用苏木精和伊红染色对培养的组织和直接从捐献者获得的组织进行免疫染色。
图17左侧：来自新鲜组织、培养1天的组织和培养4天的组织组合的单细胞转录组数据的降维展现(通过UMAP)。每个点代表一个单细胞，根据其来源组织进行着色，标记细胞类别并根据其细胞类型同一性进行着色。右侧：投影在UMAP图上的选定标志物的表达模式。对于每个细胞簇，在主图中显示了1个细胞标志物。
图18左侧：来自新鲜组织、培养1天的组织和培养4天的组织组合的单细胞转录组数据的降维展现(通过UMAP)。每个点代表一个单细胞，根据其来源组织进行着色，标记细胞类别并根据其细胞类型同一性进行着色。右图：精原干细胞小生境的示意图，供参考。
图19左上侧：图18中所示的降维展现(通过UMAP)突出显示了莱迪希氏和肌样细胞。右上侧：表现出差异表达的基因的k均值聚类(k-means clustering)(n＝2,448)。每行代表一个基因，每列代表一个单细胞，列/细胞根据细胞类型排列。差异基因表达水平使用由颜色键定义的Z分数；相关的GO术语(使用DAVID 6.7版)在相应基因簇的右侧给出。与GO术语相关的基因见表3。底部：莱迪希氏、培养的细胞和肌样细胞中所选基因表达水平的小提琴图(Violin-plots)。每个点代表每个图顶部所示基因在单个细胞内的表达水平。
图20左上侧：图18中所示的降维展现(通过UMAP)突出显示了内皮细胞。右上侧：表现出差异表达的基因的k均值聚类(n＝2,448)。每行代表一个基因，每列代表一个单细胞，列/细胞根据细胞类型排列。差异基因表达水平使用由颜色键定义的Z分数；相关的GO术语(使用DAVID 6.7版)在相应基因簇的右侧给出。与GO术语相关的基因见表4。底部：培养的细胞和内皮细胞中所选关键标志物基因表达水平的小提琴图。每个点代表每个图顶部所示基因在单个细胞内的表达水平。
图21显示了体细胞比生殖细胞受培养的影响更大。
图22左侧：在基本条件和添加棘霉素的基本条件下培养7天的组织的照片。右侧：培养的组织中精原细胞(EdU)和核酸(DAPI)标志物的蛋白质共免疫荧光。
图23：在不存在或存在棘霉素的情况下，培养7和14天的组织中生殖细胞(DDX4)、精原细胞(EdU)和核酸(DAPI)标志物的蛋白质共免疫荧光显示了体外分化中的精原细胞的增殖/复制，以及分化中的精原细胞增殖/复制并进入减数分裂的能力。
图24：在存在或不存在棘霉素和棘霉素、睾酮、FSH和EdU的RA以及核酸(DAPI)的情况下，培养14天的组织中的蛋白质共免疫荧光显示了体外分化中的精原细胞的增殖/复制，以及分化中的精原细胞增殖/复制并进入减数分裂的能力。
发明详述
本发明涵盖用于识别支持睾丸生殖细胞(种系和体细胞两者)在体外生长和发育的培养条件的方法。本发明提供了一种识别培养的细胞中失调的生物路径的基因组学方法，其可用于识别体外培养条件。令人惊讶的是，发现使用本发明方法识别的培养条件忠实地再现了精子生成和在体外维持睾丸生殖细胞的同一性、生长和存活所需的条件。因此，本发明还公开了包含所识别的可用于支持睾丸生殖细胞体外生长的培养条件的培养系统和组合物。所述方法和组合物可包含可用于不育症治疗的体外生长的精子和精原细胞。
所述方法可以识别生殖细胞生长和发育的培养条件，同时保持生殖细胞的同一性和存活。在识别的培养条件下的精子生成可用于获得有害或新生突变或表观遗传扰动比率较低的精子。该方法还可用于通过操纵生殖系来帮助治疗男性不育症，帮助儿童癌症幸存者恢复生育能力，并为研究人类生殖系提供有用的平台。
I.方法
本发明的一个方面涵盖一种用于识别支持睾丸生殖细胞体外生长和发育的培养条件的方法。该方法包括识别睾丸细胞在目前已知的培养条件下体外生长时失调的生物路径。该方法还包括通过改变培养条件来提供支持睾丸生殖细胞体外生长和发育的培养条件，从而减轻所识别的路径的失调。任选地，所述识别失调的生物路径和减轻路径失调的方法可以使用之前识别的培养条件来重复。
(a)睾丸生殖细胞的生长
所述方法包括在第一组条件下体外培养睾丸生殖细胞。睾丸细胞可以来自青春期前或成年的可育或不育男性。睾丸细胞可以来自活体受试者或尸体受试者。睾丸细胞也可以是新鲜获得的或可以是冷冻保存的细胞。例如，冷冻保存的细胞可以来自预计将接受损伤生殖细胞治疗(例如化疗)的受试者，以供未来与辅助生殖技术一起使用。在一些方面，睾丸生殖细胞可以来自青春期前的受试者。
人类精子生成涉及成人精原干细胞(SSCs)通过受睾丸小生境调节的复杂发育过程分化成成熟精子。人类SSCs必须小心平衡它们的自我更新和分化，然后在多种细胞状态和细胞过程之间经历小生境引导的转变，包括有丝分裂、减数分裂和精子成熟的后续阶段，这些阶段伴随着染色质重新包装和主要形态变化。精子生成还包括精母细胞和精细胞的产生，以及精细胞成熟为精子。
本发明的方法可用于识别可支持睾丸生殖细胞在发育过程的任一阶段在体外生长和发育的培养条件。因此，该方法可以识别支持精原干细胞转变为增殖精原细胞、从增殖精原细胞进入减数分裂、从分化中的精原细胞到初级和次级精母细胞、精细胞、贯穿精子成熟或其任意组合的培养条件。所识别的培养条件可以包括支持生殖细胞发育的所有阶段的单组培养条件。或者，所识别的培养条件可包括超过一组的培养条件，每组培养条件支持一个或多个发育阶段。
培养条件可以通过之前进行的一轮方法得知。更具体地说，当在该方法的第一次运行中发现了生物路径时，可以改变培养条件以减轻失调。新培养条件下失调的缓解可以通过测试生长、存活、生理机能或发育得到改善来确认。
在识别的培养条件下生长的生殖细胞可以在发育的所有阶段都维持同一性。当睾丸细胞包含生殖细胞以外的细胞，例如从受试者获得的组织中生殖细胞以外的细胞、或者类器官中生殖细胞以外的细胞时，在识别的培养条件下生长的细胞可以在发育的所有阶段都维持同一性。
发育阶段可以通过生殖细胞的不同转录/发育状态、或通过识别每种细胞类型的特异性标志物来识别和验证。每个发育阶段生殖细胞的同一性可以使用本领域已知的方法识别，可以如Guo等人在细胞·干细胞(Cell Stem Cell)2017、Guo等人在细胞研究(CellResearch)2018、以及Guo等人在细胞·干细胞2020中所述，所有这些文献的公开内容均全文并入本文作为参考。
所述方法包括在体外培养细胞。培养生殖细胞可以包括培养独立于其他睾丸组织的分离的生殖细胞。生殖细胞也可以与其他可以指导雄性生殖系存活和分化的细胞联合培养。在成人睾丸中，体细胞小生境细胞，包括塞托利、莱迪希氏和肌样细胞，为SSCs成功执行精子生成提供物理和激素支持(Guo等人,2018)。因此，生殖细胞也可以与睾丸组织联合培养。睾丸组织可以包含一根或多根带有或不带额外睾丸组织的生精小管。
生殖细胞也可以与包含睾丸生殖细胞和支持细胞的类器官联合培养。支持细胞可以包括睾丸体细胞小生境细胞、被识别为可用于以类器官形式培养生殖细胞的细胞、或其任意组合。被识别为可用于以类器官形式培养的细胞的非限制性实例包括：塞托利细胞、永生化塞托利细胞、肌样细胞、莱迪希氏细胞、或使用本发明的方法收集的信息识别或产生的细胞。
发明人惊奇地发现，本发明的方法可以识别允许生殖细胞培养的培养条件，其中生殖细胞在延长的时间段内维持生殖细胞的同一性、生长、存活和复制。例如，生殖细胞可以在识别的培养条件下培养1周或更长、2周或更长、3周或更长、1个月或更长、2个月或更长、1年或更长、或无限期培养。在一些方面，生殖细胞可以在识别的培养条件下培养2周或更长时间。
基础培养基
培养条件
(b)识别失调的生物路径
所述方法包括识别生殖细胞在不同发育阶段的失调路径。如上所述，本发明的方法中使用的睾丸组织可包含独立于其他睾丸组织的分离的生殖细胞、与睾丸组织相关的生殖细胞、或与类器官相关的生殖细胞。因此，除了识别生殖细胞在不同发育阶段的失调路径之外，所述方法还可以识别与生殖细胞相关的细胞中失调的路径。例如，所述方法可用于识别体细胞中失调的路径，包括塞托利细胞、莱迪希氏细胞、内皮细胞、肌样细胞或其任意组合。在一些方面，所述方法用于识别体细胞中的失调路径，包括培养的组织和直接从受试者获得的组织的塞托利细胞、莱迪希氏细胞、内皮细胞、肌样细胞或其任意组合。
当与直接从男性受试者睾丸分离的单个睾丸细胞中的RNA转录物的表达进行比较时，所述方法包括使用基因组学方法来识别在第一组条件下体外生长的单个睾丸细胞中的差异表达的RNA转录物。简而言之，从受试者获得包含精管的睾丸组织并在基础培养条件下培养。培养后，将细胞解离获得组织的所有睾丸细胞类型的单细胞。将培养细胞中每种细胞类型的RNA转录物与直接得自受试者的组织解离的相应细胞中的RNA转录物水平进行比较。在一些方面，直接从受试者获得的组织中每种细胞类型中RNA转录物的水平可以如Guo等人，2018中所述，其全部公开内容全文并入本文作为参考。
在一些方面，当与直接从捐赠者获得的组织中相应细胞类型中的RNA转录物水平进行比较时，所述方法使用单细胞RNA-seq(scRNA-seq)方法来识别每种细胞类型中差异表达的RNA转录物。例如，使用scRNA-seq来识别差异表达的RNA转录本可以如Guo等人在细胞·干细胞2017、Guo等人在细胞研究2018、以及Guo等人在细胞·干细胞2020中所述，所有这些文献的公开内容均全文并入本文作为参考。在一些方面，差异表达的RNA使用下文示例2中描述的方法识别。
差异表达的RNA转录物识别体外培养的细胞中的一种或多种失调的生物路径。使用来自scRNA数据的差异表达的RNA识别生物学路径的方法是本领域已知的，并且可以如下文I(c)部分中所述。在一些方面，生物路径使用下文示例2中描述的方法来识别。
所识别的失调路径可以是代谢路径、转录路径、信号传导路径、生存路径、细胞周期路径、生理学路径和发育路径等。在一些方面，失调的路径在培养的睾丸组织中识别，并且所识别的失调路径是与细胞外外泌体、细胞凋亡过程的负调节、细胞因子、对缺氧的反应、肌动蛋白细胞骨架、细胞外基质和肌肉收缩相关的路径。在一些方面，失调的路径在培养的睾丸组织中识别，并且所识别的失调路径是与缺氧反应相关的路径。
(c)识别培养条件
在第一培养条件下识别出失调的路径后，所述方法然后包括在减轻所识别路径的失调的第二组培养条件下培养睾丸细胞。可以减轻路径失调的培养条件可以并且将会根据特定路径、培养的睾丸细胞、培养条件以及其他变量而变化。减轻所识别路径的失调的培养条件可以是营养条件、生长条件(温度、氧气等)、单层细胞和粘附基质的差异使用，或者可以是可以补充培养基以缓解所识别路径的失调的一种或多种因子。
在一些方面，第一组培养条件包括第一培养基，第二组培养条件包括补充有一种或多种减轻所识别的失调生物路径的失调的因子的第一培养基。在一些方面，所识别的失调路径与细胞外外泌体、细胞凋亡过程的负调节、细胞因子、对缺氧的反应、肌动蛋白细胞骨架、细胞外基质和肌肉收缩相关。在这些方面，第二组培养条件包括补充有小分子的第一培养基，如示例2的图19中所述。
所述一种或多种因子可以包括缺氧诱导因子(HIF)抑制剂、促性腺皮质激素、促性腺激素、GDNF家族配体(GFL)的成员、激活素、成纤维细胞生长因子受体(FGFR)蛋白配体、白细胞介素6细胞因子、趋化因子、视黄酸受体配体、或其任意组合。HIF可以是HIF-1α、VHL E3泛素连接酶(VHL)或其组合。HIF-1α抑制剂可以是聚酰胺(破坏HIF-1-DNA接口)、吖啶黄(抑制HIF-1的二聚化)、毛壳菌素(破坏HIF-1-p300相互作用)、YC1(灭活HIF-1α的转录活性)、两性霉素B(灭活HIF-1α的转录活性)、AJM290(灭活HIF-1α的转录活性)、AW464(灭活HIF-1α的转录活性)、PX-12(抑制HIF-1α蛋白水平)、PX-478(抑制HIF-1α蛋白水平)、氨基黄酮(抑制HIF-1α蛋白水平)、EZN-2968(HIF1α的RNA拮抗剂)、棘霉素(破坏HIF-1-DNA接口)或其任意组合。在一些方面，HIF-1α抑制剂是棘霉素、PX-12、牡荆素或其任意组合。在一个方面，HIF-1α抑制剂是棘霉素，并且培养基中棘霉素的浓度范围可以从约0.1nM至约100nM、约1nM至约50nM、或约2nM至约7nM。
促性腺皮质激素可以是雄激素。雄激素可以是睾酮、FSH、hCG、LH、GDNF或其组合。在一些方面，雄激素是睾酮，并且培养基中睾酮的浓度范围从约10-5M至约10-9M、约10-6M至约10-8M、或约1.5×10-6M至约0.5×10-8M。
GFL的成员可以是GDNF。在一些方面，培养基中GDNF的浓度范围从约0.1ng/mL至约100ng/mL、约1ng/mL至约50ng/mL、或约7ng/mL至约12ng/mL。
成纤维细胞生长因子受体(FGFR)蛋白配体可以是bFGF(FGF2)。在一些方面，培养基中bFGF的浓度范围从约0.1ng/mL至约100ng/mL、约1ng/mL至约50ng/mL、或约7ng/mL至约12ng/mL。
促性腺激素可以是人绒毛膜促性腺激素(hCG)、黄体生成素(LH)或两者。激活素可以是激活素A。培养基中激活素A的浓度范围可以从约0.1ng/mL至约200ng/mL、约1ng/mL至约150ng/mL、或约25ng/mL至约75ng/mL。
FGFR蛋白配体可以是FGF2。在一些方面，培养基中FGF2的浓度范围从约0.1ng/mL至约100ng/mL、约1ng/mL至约50ng/mL、或约7ng/mL至约12ng/mL。
白细胞介素6细胞因子可以是白血病抑制因子(LIF)。在一些方面，培养基中LIF的浓度范围从约1ng/mL至约500ng/mL、约10ng/mL至约200ng/mL、或约75ng/mL至约125ng/mL。
趋化因子可以是CXCL12。在一些方面，培养基中CXCL12的浓度范围从约1ng/mL至约500ng/mL、约10ng/mL至约200ng/mL、或约75ng/mL至约125ng/mL。
视黄酸受体配体可以是视黄酸。在一些方面，培养基中视黄酸的浓度范围从约10- 5M至约10-9M、约10-6M至约10-8M、或约2.5×10-7M至约3.5×10-7M。
在一些方面，所述一种或多种因子包括棘霉素、睾酮、RA和FSH。在其他方面，所述一个或多个因子包括棘霉素、睾酮和GDNF。在另一些方面，所述一种或多种因子包括棘霉素、睾酮、GDNF、HCG和FSH。
II.本发明的其他方面
本发明的另一方面涵盖一种用于支持人类精子体外生成的睾丸细胞培养系统。该系统包括睾丸生殖细胞和培养基。所述培养基包括基础培养基、一种或多种减轻在基础培养基中生长的睾丸细胞中失调的生物路径的失调的因子；其中所述因子使用上文第I节中描述的方法来识别。
本发明的另一个方面包括一种睾丸细胞组合物，其包含使用用上文第I节中描述的方法识别的培养条件、根据权利要求45的睾丸细胞培养系统，或两者进行体外生长的生殖细胞、体外生长的睾丸组织、或体外生长的类器官。
本发明的又一个方面涵盖一种通过培养从可育和不育男性获得精子的方法。该方法包括使用用上文第I节中描述的方法识别的培养条件来培养超过一个精原干细胞SSC。每个SSC均单独培养。该方法还包括识别包含由培养的SSC产生的精子的精原干细胞培养物。精子不含有害的遗传突变和/或包含较低比率的新生突变，并且包含与SSC培养物中SSC的RNA转录物表达谱基本相似的RNA转录物表达谱。另外，该方法包括从识别的培养条件中收获精子。该方法还可以包括冷冻精子以供未来使用的步骤。在一些方面，所述方法还包括通过如宫内授精或体外受精的辅助生殖技术来使用精子的步骤。
本发明的一个方面涵盖一种产生有活力的精子的方法。该方法包括从受试者获得睾丸组织；并在使用上文第I节中描述的方法识别的培养条件下、上文描述的睾丸细胞培养系统或两者培养睾丸组织。
本发明的另一方面涵盖一种试剂盒，该试剂盒用于在使用上文第I节中描述的方法识别的条件下、上文描述的睾丸细胞培养系统或两者体外培养睾丸生殖细胞。
定义
除另外定义外，本文中使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域的技术人员通常理解的含义。以下参考文献为本领域技术人员提供了本发明中使用的许多术语的一般定义：Singleton等人，微生物学和分子生物学词典(Dictionary of Microbiology andMolecular Biology,第二版，1994)；剑桥科技词典(The Cambridge Dictionary ofScience and Technology,Walker编辑，1988年)；遗传学术语表(The Glossary ofGenetics，第五版，R.Rieger等人编辑，Springer Verlag(1991)；以及Hale和Marham的《哈珀柯林斯生物学词典》(The Harper Collins Dictionary of Biology,1991年)。除另有说明外，本文所用的以下术语具有它们所赋予的含义。
在引入本发明的要素或其优选方面时，冠词“一”、“一个”、“该”和“所述”旨在表示存在一个或多个要素。术语“包括”、“包含”和“具有”旨在表示开放性的，意味着可以存在所列要素之外的其他要素。
由于在不脱离本发明范围的情况下可以对上述细胞和方法进行各种改变，因此以上描述和下面给出的示例中包含的所有内容均应被解释为说明性的，而非限制意义上的。
示例
本说明书中提及的所有专利和出版物均显示了本发明所属领域的技术人员的水平。所有专利和出版物均通过引用并入本文，如同每个单独的出版物被具体且单独地表明通过引用并入本文一样。
全文讨论的出版物仅是为了提供它们的公开在本申请的提交日期之前。本文中的任何内容均不应被解释为承认本发明无权凭借在先发明而早于此类公开。
本文包括以下示例以证明本发明。本领域技术人员应当理解，以下示例中公开的技术代表发明人发现的、在本发明的实践中发挥良好作用的技术。然而，鉴于本发明的公开内容，本领域技术人员应当理解，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以对本发明进行许多变化并仍然获得相近或相似的结果，因此所有陈述内容均应当被解释为说明性的，而非限制性的。
示例1.发育中人类睾丸的单细胞分析
产前生命中的人类睾丸发育涉及种系和体细胞同一性的复杂变化。为了更好地理解，对来自胚胎、胎儿和婴儿阶段的睾丸细胞的32,500个单细胞转录组进行了概括和分析。结果表明，受精后6-7周，随着睾丸索(the testicular cords)的建立，塞托利细胞和间质细胞源自共同的异质祖细胞库(a common heterogeneous progenitor pool)，然后分解为胎儿塞托利细胞(表达管形成(tube-forming)基因)或间质细胞(包括表达类固醇生成基因的莱迪希氏谱系细胞)。大约10周后，从受精后14-16周开始，雄性原始生殖细胞退出有丝分裂，下调多能性转录因子(pluripotent transcription factors)，并转变为与最初在婴儿和成人睾丸中定义的状态0精原细胞极为相似的细胞。因此，这些胎儿精原细胞被称为“状态f0”。总体而言，揭示了对胚胎、胎儿和产后雄性种系以及体细胞小生境的协调和时间发展的多种见解。
在发育中的胎儿睾丸小生境内，最近的基因组学图谱和免疫荧光(IF)成像法已揭示了雄性生殖细胞经历重大的发育变化(Gkountela等人，2013，2015；Guo等人，2015；Li等人，2017；Tang等人，2015)。值得注意的是，种系从迁移到发育中性腺的多能样PGC转变为性腺中的多能样和有丝分裂活性PGC(称为胎儿生殖细胞FGC或生殖母细胞)，然后转变为“有丝分裂停滞”生殖细胞，其在第14-18周/之后抑制多能性程序(Li等人,2017)。在这里，在涉及第14-18周期间出现的有丝分裂停滞的生殖细胞与产后SSCs之间关系的生殖系发育的这个阶段，一个关键的尚未解答的问题是：产前生殖细胞是与产后SSCs几乎相同，还是存在发生在产前阶段的其他重要发育阶段？值得注意的是，发明人之前对成人睾丸的研究工作识别了伴随人类精原细胞分化的五种不同的精原细胞状态(称为状态0-4)，其中状态0被识别为最幼稚和未分化的状态(Guo等人，2017、2018、2020)，这一结果得到了其他研究小组的单细胞RNA测序(scRNA-seq)图谱的支持(Hermann等人，2018；Li等人，2017；Shami等人，2020；Sohni等人，2019；Wang等人，2018)。与这一看法一致，状态0是婴儿睾丸中存在的主要SSC状态，状态0SSC表达数百种状态特异性标志物，包括PIWIL4、TSPAN33、MSL3和EGR4(Guo等人,2018)。在状态0SSCs中识别出的关键标志物也在其他人最近研究中识别的未分化精原细胞状态中表达，例如SSC1-B(Sohni等人,2019)或SPG-1成年精原细胞群体(Shami等人，2020)，以及由人类新生儿的精原细胞(Sohni等人，2019)和猕猴的未分化精原细胞(Shami等人，2020)。在这里，探讨了先前识别的有丝分裂停滞的产前生殖细胞是否在转录上与状态0产后精原细胞相似，或者说代表一种独特的前体，其在出生前经历了另外的产前变化。
睾丸小生境在引导雄性种系的存活和分化中发挥重要作用。在成人睾丸中，体细胞小生境细胞，包括塞托利、莱迪希氏和肌样细胞，为SSCs成功执行精子生成提供了物理和激素支持(Guo等人,2018)。功能性成年睾丸及其有组织的小管样结构的发育在青春期完成，在此期间所有体细胞小生境细胞发生最终特化和成熟化。发明人在之前的工作中使用了scRNA-seq来研究青春期期间的人类睾丸发育，揭示了莱迪希氏和肌样细胞的共同祖细胞，其存在于人类青春期之前，这类似于在胎儿小鼠中观察到的体细胞祖细胞(Guo等人，2020)。然而，在产前生命期间有几个关键问题仍然难以解释，例如人类睾丸小生境细胞谱系最初是如何特化的，它们是否具有共同的祖细胞，新生性腺最初如何形成索，以及小生境细胞在随后的胚胎发育阶段中如何进一步分化而达到产后状态。
为了解决这些问题，通过10x Genomics Chromium平台对来自胚胎、胎儿和产后样本的共32,500个未分类的单睾丸细胞进行了分析。这种无偏分析使我们能够检查体细胞小生境的特化方法以及种系和小生境细胞的发育；这使得能够对婴儿、青春期和成人睾丸的细胞类型和发育过程进行详细比较。
结果
人类胚胎、胎儿和产后睾丸的单细胞转录组
从3个胚胎阶段(受精后6、7和8周)、3个胎儿阶段(受精后12、15和16周)和1个幼婴阶段(出生后5个月)获得人睾丸组织，用于与较大婴儿、青少年和成人的先前数据集进行比较。为了系统地研究贯穿胚胎和胎儿阶段的生殖细胞和体细胞发育情况，由这些睾丸组织制备单细胞悬浮液，并使用10x Genomics平台进行scRNA-seq。对于胚胎和胎儿样本，每个样本分析了5,000个单细胞；对于幼婴样本，重复进行了2次，对2,500个单细胞进行了分析。在总共32,500个细胞中，有30,045个通过了标准质量控制数据集过滤器(standardquality control dataset filters)，并被保留用于下游分析(请参阅方法的详细信息)。获得了80,000-120,000个读数/细胞，这使得能够分析1,800-2,500个基因/细胞。
为了分析数据集，使用Seurat包首先对组合数据集进行了UMAP(uniformmanifold approximation andprojection dimension reduction analysis，统一流形逼近和投影降维分析)(图1A和图7A:Butler等人，2018)。有趣的是，观察到了一种趋势：来自第6周和第7周的细胞紧密聚集，同样地，来自第8、12、15和16周的细胞紧密聚集(图1A和图7A)，同时还显示了特定细胞类型随时间的变化(图7B和图7C)。进一步的聚类分析产生了17个主要簇或细胞类型(图1B)，随后使用已知的基因标志物对其进行注释(图1C和图8)。簇1-4是来自6周和7周胚胎的睾丸小生境细胞，它们独特地表达NR2F2和TCF21。簇5-9对应于来自8周以上样本的间质和莱迪希氏谱系的体细胞，它们表达DLK1。簇10-11是来自8周以上样本的塞托利谱系细胞，它们表达AMH和SOX9。簇12包括来自所有样本的生殖细胞，它们表达已知的生殖细胞标志物(例如，TFAP2C、DAZL)，有一个子集表达多能性标志物(例如，POU5F1、NANOG)。簇13-17分别对应于内皮细胞(簇13，PECAM1+)、巨噬细胞(簇14，CD4+)、平滑肌细胞(簇15，RGS5+)、红细胞(簇16，HBA1+)和胎儿肾细胞(簇17，CYSTM1+)。还提供了用于定义这些细胞类型的许多其他标志物的例子(图8)。
随着PGC退出有丝分裂并抑制多能性，状态0SSCs出现
通过分别从产前和产后(5个月)睾丸的体细胞中分离出生殖细胞并进行分析来考察雄性种系的发育(图1B的簇12)。为了将胚胎、胎儿和产后的生殖细胞置于更完整的发育时间表中并进行比较，将这些数据与发明人之前发表的工作(Guo等人，2018)中来自婴儿生殖细胞(1岁)和成人精原细胞状态(状态0-4)的数据合并，之前工作中的数据也是在10xGenomics平台上进行分析的。降维(通过t分布随机邻域嵌入[t-distributed stochasticneighbor embedding，t-SNE])和拟时序分析的组合揭示了七个定义的簇和单个拟发育轨迹，该轨迹对来自不同阶段的生殖细胞进行了排序和连接(图2A)。按照拟时间的顺序，观察到第一簇生殖细胞主要由6至12周的细胞以及部分15周的生殖细胞组成(图2A和图9A)。这个簇被称为“胚胎-胎儿组”。它们的转录同一性与PGC一致，包括TFAP2C、KIT、NANOG、POUF51、SOX17等的表达(图2B)，这与之前的scRNA-seq结果一致(Li等人,2017)。拟时间的下一个发育阶段由来自15周和16周胎儿样本的细胞组成，这些细胞与来自5个月和1岁出生后样本的细胞聚集在一起，因此被称为“胎儿-婴儿组”(图2A和图9B)。有趣的是，来自胎儿-婴儿组的细胞没有上述PGC标志物的表达，而是启动了之前在成人、婴儿和新生儿睾丸中定义的多个关键状态0特异性标志物(PIWIL4、EGR4、MSL3、TSPAN33等)的表达。随后的簇对应于来自成人的状态0-4精原细胞，其显示与后续发育状态相关的标志物的顺序表达：静止/未分化的(状态1；GFRA1+)、增殖的(状态2-3；MKI67+、TOP2A+)和分化中的(状态4；SYCP3+)(图2A、2B和图9C)，这与发明人之前的研究一致(Guo等人，2017、2018)。这一拟时序得到了正交的基于Monocle的拟时序分析(orthogonal Monocle-based pseudotime analysis)的进一步支持(图9D和图9E)。通过热图和聚类进行的更系统的分析产生了2,448个动态基因，并提供了一种格式来探索和显示同一性、基因本体(GO)术语以及显示沿该生殖细胞分化时间线的动态表达的基因量级(图2C)。胚胎-胎儿组(PGCs)表现出与信号传导、性腺和干细胞发育相关基因的高表达(簇1)，这些基因然后在第15周和第16周之间突然受到抑制，与随后向胎儿-婴儿组的过渡一致。在这里，还观察到胎儿-婴儿组中许多转录和同源盒相关基因的上调(簇2)，以及状态0精原细胞标志物的明显上调。有趣的是，从胎儿-婴儿组向状态0精原细胞转变的特点是状态0基因表达特征的加深和强化，而不是大量显示上调的新基因。例如，将胎儿生殖细胞与成人状态0精原细胞进行比较的差异基因表达分析仅识别出2个显示胎儿特异性表达的基因(ID3和GAGE12H，2倍，p＜0.05)(图10G)。与产前-产后相似性一致，观察到位于胎儿-婴儿和成人状态0簇中有来自幼婴和较大婴儿的生殖细胞。这些结果表明，存在于幼婴和较大婴儿中的精原细胞(称为状态0)与PGCs退出多能样状态后直接出现的胎儿生殖系细胞高度相似。鉴于这种相似性，这些细胞被称为胎儿(f)细胞状态f0。
为了在蛋白质水平验证scRNA-seq概况，进行了关键标志物的IF染色。从第5周至19周NANOG+(PGC标志物)和MKI67+(增殖标志物)的比例降低(图2D和图9G)，支持退出多能样状态和进入G0在时间上相关联的观点。值得注意的是，对于NANOG，基于转录谱的RNA信号丢失似乎比蛋白质丢失更为突然，这表明蛋白质丢失率存在不均匀性。关于状态0标志物的获取，在第8周和10周的样本中未检测到PIWIL4阳性；然而，从第14周开始，清楚地检测到了PIWIL4+细胞，特别是在DDX4+生殖细胞中(图2E、2F和图9H)。因此，对于关键多能性、增殖和测试的状态0标志物，IF染色结果验证了scRNA-seq结果。
胚胎、胎儿和产后生殖细胞发育期间的网络表达动态
为了定义与种系发育阶段和转变相关的候选关键基因和网络，进行了网络分析。使用加权基因共表达网络分析(weighted correlation network analysis，WGCNA)(Langfelder和Horvath，2008)，识别了显示PGC分化到状态f0精原细胞期间的动态表达模式的基因-基因相互作用。这里，对于PGC上调网络(“PGC网络”；图10A和10D)，识别了2,126个基因和122,360个相互作用，并且识别了前11个中枢基因(及其相互作用)。正如预期的那样，存在几种已知在PGC中表达的基因，包括POU5F1、NANOG、NANOS3、SOX15和TFAP2C(Gkountela等人，2015；Guo等人，2015；Tang等人，2015)，证实了即时分析的稳健性。此外，该分析显示PHLDA3、PDPN、ITM2C、RNPEP、THY1和ETV4是有丝分裂PGCs中的重要标志物，为未来分析提供了候选标志物。例如，PDPN、ITM2C和THY1编码细胞表面蛋白，PDPN已成功用于分离从人类多能干细胞分化而来的PGC(Sasaki等，2016)。关于伴随PGC分化为状态f0精原细胞的网络，大部分已识别的基因在所有后续精原细胞阶段中显示出相对广泛的表达，因此该网络被称为“精原细胞网络”(图10B和图10E)。识别了771个基因和31,557个相互作用，并列出了前10个中枢基因。在此，EGR4、DDX4、TCF3和MORC1在哺乳动物生殖细胞中的作用是众所周知的。有趣的是，分析还显示了几个值得进一步探索的其他因子(例如RHOXF1、STK31、CSRP2、ASZ1、SIX1、THRA)。例如，人类的RHOXF1突变会导致男性不育(Borgmann等人,2016)，而MORC1和ASZ1都通过抑制转座因子活性在保护种系基因组方面发挥重要作用(Ma等人,2009；Pastor等人,2014)，增加了它们可能与下述PIWIL4因子协调的可能性。还考察了仅在状态0SSC中表达的网络(“状态0网络”；图10C和图10F)。识别了190个基因和8,841个相互作用，并列出了前9个中枢基因。其中，EGR4、CAMK2B、MSL3、PLPPR5、APBB1和PIWIL4已在之前的研究工作中识别(Guo等人,2018；Sohni等人,2019)，而在这里，NRG2、RGS14和DUSP5作为附加因子出现。因此，即时分析证实了许多已知因子的作用，并列出了一些其功能在生殖细胞发育中研究较少的关键候选基因，为未来的研究提供了多种路径。
间质和塞托利谱系的胚胎特化和胎儿发育
细胞类型分析揭示，人胚胎和胎儿睾丸阶段主要由体细胞小生境细胞组成，包括塞托利细胞和间质细胞(包括莱迪希氏细胞)(图7B和7C)。值得注意的是，通过检查肌样标志物(包括ACTA2和MYH11)，没有观察到类似于胎儿肌样细胞的细胞，这与在小鼠中观察到的情况形成鲜明对比(Wen等人，2016)。在这里，早期胚胎(第6-7周)睾丸的图谱提供了考察塞托利细胞和间质/莱迪希氏细胞特化的机会。为此，解析出属于间质/莱迪希氏和塞托利谱系的胎儿体细胞小生境细胞，以及不确定细胞类型的早期细胞(图1B中的簇1-8和10)，并进行了进一步分析。有趣的是，重新聚类和随后的拟时序分析揭示了早期拟时间的一个细胞簇，其在拟时间后期转录分岔成两个不同的谱系(图3A)。值得注意的是，早期簇仅由第6-7周的细胞组成，而第7周以后的细胞沿着2条不同的路径排列(图3A、3B和11A)。对已知标志物的考察表明，2条发育路径分别代表塞托利(左轨迹线)或间质/莱迪希氏(右轨迹线)谱系(图3C和3D)，并且在第6-7周时存在异质细胞池，上述两条轨迹线均从异质细胞池起源，增加了体细胞共同祖细胞群的可能性。基于聚类分析，胚胎-胎儿间质和塞托利细胞发育被分为七个阶段(A-G)，从候选体细胞共同祖细胞(A)开始，分化为胚胎间质/莱迪希氏祖细胞(B)，这些祖细胞经历活跃增殖(表达高MKI67)。大多数处于静止状态的胚胎塞托利祖细胞在第7周左右出现(F)。胚胎间质祖细胞(A)似乎分化为胎儿间质祖细胞(C和D)以及胎儿莱迪希氏细胞(E)，胚胎塞托利祖细胞将分化为胎儿塞托利细胞(G)。因此，计算分析显示了一种异质多能祖细胞，其是6-7周时的间质细胞和塞托利细胞的祖细胞，之后在第7周和第8周之间分化为塞托利和间质(包括莱迪希氏)谱系。
为了进一步定义伴随男性性别决定的基因表达程序，进行了基因表达聚类分析(k均值)以识别沿着拟时序发育轨迹显示动态表达模式的基因组(图4A)。值得注意的是，候选祖细胞(第6-7周)表达多种值得注意的转录因子，包括GATA2、GATA3、NR2F1、HOXA和HOXC因子等，有大量的GO术语，包括信号传导和脉管系统发育。特别是，参与管发育的几个基因(例如，TBX3、ALX1、HOXA5)在这些候选祖细胞中特异性表达，这与在第6周时管开始形成以产生睾丸索一致(图4A和图11B)。
然后，该细胞群分岔成不同的转录程序，其与胚胎莱迪希氏细胞或塞托利细胞祖细胞一致。沿着塞托利细胞谱系，表达的基因与染色质组装、胞外域和丝形成相关。沿着莱迪希氏谱系，细胞首先表达与DNA复制、增殖和细胞周期相关的基因，表明莱迪希氏谱系扩增的阶段，与第8周及之后相较塞托利谱系，莱迪希氏谱系轨迹线上存在的细胞数量要高得多的情况一致(图3B、4A和11A)。在莱迪希氏谱系中，之后是与细胞外基质、细胞粘附和糖蛋白、以及与Notch和Hedgehog信号传导相关的组分和基因靶标相关的术语上调。与胎儿莱迪希氏细胞在小鼠雄激素产生中的已知作用一致(Shima等人，2013，2015)，置于拟时间末尾的胎儿莱迪希氏细胞表达高水平的与类固醇生物合成(例如，HSD3B2，图3D)和分泌相关的基因。有趣的是，这些细胞出现得很早，在第7周之前，并在剩余的考察阶段持续存在，这表明它们既具有早期作用，又具有持续作用。对于塞托利细胞谱系，胎儿塞托利细胞表达高水平的与结构功能相关的基因。为了验证类固醇生成基因的时间特征，进行了CYP17A1的IF染色，其是胎儿莱迪希氏细胞中高度表达的类固醇生成的标志物(Shima等人，2013；图4B和11D)。值得注意的是，发现在第5.5周时，CYP17A1在生殖嵴上皮细胞中不存在，而在R7周时，所有样本的间质(非索状)区域均观察到强烈的染色，这有力地表明莱迪希氏细胞特化发生在第7周左右，与本文的scRNA-seq结果一致。此外，观察到在第8周时，并非所有间质细胞都呈CYP17A1阳性。在此，推测胎儿CYP17A1-间质细胞可能是产生产后莱迪希氏和管周细胞的间质细胞群。
胎儿和婴儿莱迪希氏和塞托利细胞的关系
数据集提供了一个机会来比较和对比胎儿与出生后的人莱迪希氏细胞和塞托利细胞。当分别比较胎儿与婴儿莱迪希氏细胞时，发现396或703个基因有差异表达(分别上调或下调)(双峰检验(bimodal test)；调整后的p<0.01；|logFC|>0.25)(图4C)。随着莱迪希氏细胞从胎儿过渡到婴儿，与细胞外基质、分泌、细胞粘附和激素反应相关的基因上调，而与线粒体功能和类固醇生物合成相关的基因(例如CYP17A1、HSD3B2、STAR)下调(图4C)。类似地，在婴儿或胎儿塞托利细胞中分别发现了536或248个有差异表达的基因(图4D)。随着塞托利细胞从胎儿过渡到婴儿，与翻译和呼吸链相关的基因上调，具有内质网和类固醇生物合成的这些细胞下调(图4D)。为了确认，对CYP17A1进行了IF染色(Shima等，2013)，发现其表达在产后样本中未检测到(图4E)，这表明胎儿莱迪希氏细胞在人类出生后消失或分化，与小鼠身上的发现是一致的(Svingen和Koopman，2013)。结果表明，人类胎儿莱迪希氏和塞托利细胞均表现出类固醇生物合成基因的表达，而这种特性在测试的产后样本中被下调。
发明人之前基于青少年人类睾丸的研究工作表明，莱迪希氏和肌样细胞在青春期前的阶段共享共同的祖细胞(Guo等人，2020)。为了更深入地了解胎儿间质祖细胞和青春期前莱迪希氏/肌样祖细胞之间的关系，以及深入了解如何从胎儿和产后前体细胞中特化为莱迪希氏和肌样谱系的共同祖细胞，进行了额外的分析。这里，合并了来自胎儿间质细胞(图3C中的C、D和E簇)、新生儿莱迪希氏细胞(Sohni等人，2019)以及产后和成人莱迪希氏/肌样细胞(Guo等人,2020)的计算机模拟scRNA-seq数据集(in silico scRNA-seqdatasets)。细胞合并后，进行了Monocle拟时序分析，其目的是通过计算预测提供所分析细胞的发育顺序(图4F和4G)。这里，拟时序轨迹(由图4F中的虚线箭头描绘)与基于年龄的发育顺序非常一致(图4G)，表明胎儿间质祖细胞产生出生后和青春期前的莱迪希氏/肌样祖细胞。此外，分析表明，源自胎儿间质祖细胞的胎儿莱迪希氏细胞在产后和婴儿阶段不存在，这一结果得到了免疫染色数据的证实(图4E)。
与间质和塞托利谱系的胚胎特化相关的关键因素
尽管第8至16周的睾丸小生境细胞表达了高级间质或塞托利细胞谱系的转录因子特征，但来自第6周性腺的细胞缺乏这些晚期标志物，其最初出现在第7周(图3A-3C)。为了更好地理解体细胞特化期间表达的基因，解析了第6和7周的细胞(图3A)并进行了更详细的分析。这里，第6和7周细胞的主成分分析(PCA)显示，大部分细胞没有显示出间质或塞托利细胞特有的标志物(图5A)，这表明存在塞托利和莱迪希氏/间质前体在其中出现的异质群体。通过Monocle的正交分析也证实了类似的模式和特性(图12C-12E)。基于基因表达模式(图5B)，可以将底部的细胞指定为胚胎间质/莱迪希氏谱系(表达DLK1和TCF21)，将右上角的细胞指定为胚胎塞托利细胞谱系(表达SRY、DMRT1、SOX9、AMH等)。
接下来，设法识别可能参与初始体细胞谱系特化的候选关键转录因子(图5B)。有趣的是，一组GATA家族因子显示出连续且基本上不重叠的模式：GATA3表达最早，位于PCA图的顶部和左边缘(主要是7周)，GATA2开始表达稍晚，GATA4在朝着塞尔托利谱系发展的稍晚群体中表达。许多其他因子也表现出顺序表达。例如，NR2F1、MAFB和TCF21显示相对较早的表达(类似于GATA2)，而TCF21表达在莱迪希氏谱系的发育过程中持续存在，在塞托利谱系中则不然。值得注意的是，ARX和NR0B1均在分岔阶段表达。对于塞尔托利谱系，这些早期标志物停止了在谱系特化中的表达，之后是SRY和DMRT1作为谱系的最早标志物的表达，然后是SOX9。
最后，进行广泛的IF以验证基因组学发现。GATA3在第5周时在整个生殖嵴上皮中都观察到了，其在第6-7周时变得仅限于间质细胞的亚群，到第8周时，GATA3蛋白变得检测不到(图5C)。另外，从第6周以后，GATA4表达在索内部和外部都很明显(图5D和图11B)。为了评估塞托利谱系特化，对DMRT1与生殖细胞标志物(DDX4)或额外的塞托利细胞标志物(SOX9)一起进行染色(图5E和5F)。正如所预期的，DMRT1和SOX9蛋白在第5周含有DDX4+PGCs的GATA3/GATA2+生殖嵴上皮中检测不到(图5E)。然而，到第8周时(索形成后)，DMRT1+和SOX9+塞托利细胞被识别出来(图5F)。总而言之，IF染色结果证实了通过基因组学方法发现的关键标志物，并为胚胎和胎儿阶段睾丸索发育的生理学提供了更多见解。
讨论
PGC在早期胚胎中被特化，随后迁移至生殖嵴(Chen等人，2019；Tang等人，2016；Witchi，1948)。然后，生殖脊经历精细的发育编程，形成睾丸小生境的体细胞，其支持胎儿期间雄性种系的存活和分化。尽管先前对小鼠的研究提供了关于胚胎睾丸的形成和谱系特化的丰富知识(综述在Svingen和Koopman中，2013)，但对人类胚胎和胎儿睾丸发育的了解却少得多，特别是在体细胞谱系的特化方面。在这里，通过对未选择的睾丸细胞进行单细胞测序，并结合IF染色，提供了人类胎儿睾丸发育的详细分子学概述，以帮助描绘人类胚胎和胎儿睾丸发育和进一步分化所涉及的时间分子学变化。
要解决的一个关键问题是PGCs向精原细胞的转变，特别是在胎儿期间男性人类PGCs分化为产后状态0SSCs的转录关系，状态0SSC已被识别为人类婴儿和成人(Guo等人，2018；Sohni等人，2019)以及灵长类动物(Shami等人，2020)中最未分化的男性种系干细胞。结合之前的工作(Guo等人,2017、2018、2020；Sohni等人,2019)，当前的工作为横跨胚胎、胎儿、婴儿、青春期和成年阶段的人类种系发育提供了循证详细模型(图6A)。在受精后6-12周内，随着雄性体细胞谱系的特化，人类雄性PGCs表达高水平的与多能性相关的转录因子(例如POU5F1、NANOG)，以及典型的充分表征的PGC转录因子(例如SOX17、TFAP2C)，并且具有增殖性。第14周时，PGCs亚群启动对多能性样程序的抑制，并消除早期PGC基因的表达(Li等，2017)，同时开启状态f0精原细胞程序(例如，PIWIL4、MSL3、EGR4、TSPAN33)。这些状态f0精原细胞在转录上与状态0精原细胞高度相似，并且从胎儿阶段到婴儿在生精索内都存在。有趣的是，当考察先前FGC数据集中许多关键PGC或状态f0标志物的表达模式时(Li等，2017；图10H)，发现有丝分裂停滞的FGC表现出状态0基因(例如PIWIL4、EGR4、MSL3、TSPAN33)的特异性和高表达以及PGC基因(例如POU5F1、NANOG、TFAP2C、SOX17)的低表达。这一观察结果强烈表明，先前定义的有丝分裂停滞的FGC(Li等人，2017)也在受精后14周出现(图10I)，很可能与研究中定义的状态f0是相同的细胞。在这里，本研究中先前对婴儿状态0细胞同一性的推导及已证明的它们与胎儿群体的相似性定义了一个关键的联系：随着PGCs在胎儿生殖细胞和产后生殖细胞之间的转变，PGCs分化并转变为状态f0精原细胞，并且强化了它们的状态0样转录组。到第5个月时，所有生殖细胞均显示状态0精原细胞转录组，并且具有PGC转录组的细胞低于检测限。与第5个月时和婴儿中的观察结果一致，状态0标志物也在人类新生儿生殖细胞中表达(Sohni等人,2019)。研究表明，状态0样精原细胞起源于胎儿阶段第14-16周左右的PGCs，并持续存在于整个产前和产后发育阶段，以在成人中提供未分化的精原细胞库，用于小生境引导的向更加分化的精原细胞状态的转变并最终形成配子(图6A)。
先前在小鼠模型中的研究工作已经揭示了在小鼠睾丸体细胞的谱系特化和进展中起重要作用的若干因子和路径(Liu等人，2016；Svingen和Koopman，2013；Yao等人，2002)。最近，scRNA-seq已被证明是研究胚胎和新生小鼠睾丸发育的强大工具(Stevant等，2019；Tan等，2020)。在这里，研究工作表明，早期体细胞谱系中的几个关键因子(例如WT1、NR2F1、SOX9、SRY、DMRT1)是人类和小鼠共有的。此外，通过单细胞图谱和IF染色对产前人类睾丸进行的系统性考察为未来的表征提供了许多额外的候选因子，并揭示了多种人鼠差异。例如，通过生殖嵴上皮的IF染色，在受精后6周之前没有发现塞托利细胞或莱迪希氏细胞同一性的证据。然后，从第6周开始，无偏/无选择的单细胞转录组图谱(the unbiased/unselected single cell transcriptome profiling)识别出罕见的胎儿莱迪希氏和塞托利样细胞。在拟时间分析中还识别出了一个大型、密切相关的细胞群，它们对发育转录因子，特别是NR2F1、GATA3和GATA4 RNA呈异质阳性。GATA3蛋白分析表明，GATA3在受精后第5周、塞托利和莱迪希氏细胞特化之前在生殖嵴上皮均匀表达。值得注意的是，在第6周，当索开始形成时，GATA3表达仅限于间质中的细胞亚群。与之对照的是，GATA4表达在受精后6-7周时明显而广泛，并且在受精后17周时仍然可检测到。在小鼠胚胎中，已知GATA4对于生殖脊的形成至关重要，如果没有GATA4，双能性腺就不会形成(Hu等人,2013)。鉴于GATA3在GATA4之前在生殖嵴上皮中表达，推测GATA3可能在特化人类生殖嵴中发挥作用，而GATA4则可能是在受精后6周，当GATA3表达降低时，参与体细胞谱系的维持。在小鼠中，NR5A1(也称为SF1)是特化生殖嵴上皮所需的另一种主要转录因子(Hatano等人，1996；Luo等人，1994)。然而，在GATA3+人类祖细胞中没有观察到NR5A1的清晰表达，这提供了人类胚胎中生殖脊上皮的形成似乎与小鼠不同的第二个例子(图11B)。第6-7周时间点的分析表明，莱迪希氏和塞托利细胞的特化发生在相同或接近相同的发育时间。第7周的IF研究显示了索中的塞托利细胞和索外的莱迪希氏细胞。这一结果反映了与小鼠的主要区别，在小鼠中，塞托利细胞先被特化，接着莱迪希氏细胞随后被特化(Svingen和Koopman，2013)。考虑到人类胎儿睾丸的大小按比例比小鼠大得多，人类睾丸祖细胞可能在发育早期出现，随后出现增殖波，这可能部分解释了发育的差异。
除了在对等发育阶段被指定之外，还通过瞬时表达(在一小部分细胞中)关键转录因子，包括ARX、NR0B1或SRY，发现了第6和7周体细胞小生境祖细胞表达与它们分化为间质/莱迪希氏和塞托利谱系的能力一致的标志物。这种特性在第8周，当所有细胞都可区分为间质/莱迪希氏或塞托利谱系细胞时得到进一步加强。值得注意的是，雄性体细胞谱系在胚胎睾丸中的建立发生在PGCs开始分化为状态f0(第14-18周)之前近2个月。相比之下，在小鼠中，雄性小生境细胞分化的时间(第12天)到小鼠PGC开始分化为前精原细胞(prospermatogonia)(胚胎第14天)仅延迟了2天(Saitou和Yamaji，2012；Svingen和Koopman，2013；Western等人，2008)。延迟2个月而避免人类PGCs在曲细精管索小生境开始分化为状态f0精原细胞的目的可能与需要通过增殖来增加雄性生殖细胞的数量有关，因为这些细胞是MKI67+，在状态f0分化和雄性特异性表观遗传重编程开始之前(图6B)。
睾丸通过连续的小生境引导的SSCs分化在成年男性中产生配子，需要深入了解这一生物学来改善男性生殖健康。这里，研究工作为定义人类睾丸形成的时间和策略及其出生前后的发育提供了重要见解。值得注意的是，胎儿时期15周时出现的状态f0生殖细胞与婴儿和成人状态0细胞具有显著的相似性，因此使我们能够关联并描述PGCs到成人状态0细胞的完整发育进程。此外，还提供了共同体细胞祖细胞库的详细分子特征及其扩增和向睾丸小生境细胞的转变、以及对睾丸索形成和在指导生殖细胞发育中的可能作用的初步见解。这些结果应该为未来的假设驱动研究提供基础，也会有助于指导人类早期睾丸的体外重建和研究。
方法
关键资源表
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实验模型和受试者详情
受精后6至16周的产前雄性性腺获自华盛顿大学出生缺陷研究实验室(BDRL)、图宾根大学和卡罗林斯卡学院的三个合作实验室。在BRDL，产前性腺是在华盛顿大学IRB批准的人类受试者协议的监管监督下获得的，并附有联邦政府的保密证书。该研究项目还得到了图宾根大学研究伦理委员会的批准。所有同意的材料都是匿名捐赠的，并且不带有个人识别信息。在母亲书面的知情同意并选择手术终止妊娠后，收集人类妊娠早期组织。瑞典斯德哥尔摩地区人类伦理委员会批准了这种收集(Dnr 2007/1477-31，有2011/1101-32和2013/564-32补充许可。进行性腺研究的伦理批准：Dnr2013/457-31/4)。BDRL和图宾根大学结合产前摄入量和卡内基分期将发育年龄记录为受精后的天数。卡罗林斯卡学院根据英格兰图谱(atlas ofEngland)，通过检查神经系统、四肢、眼睛和性腺发育等解剖学标志，将发育年龄记录为受精后的天数。来自生物库样本、没有潜在睾丸病变的福尔马林固定和石蜡包埋的成人睾丸是在卡罗林斯卡学院病理学系和卡罗林斯卡大学医院获得的(伦理批准：Dnr2014/267-31/4)。
产后人类睾丸样本(5个月大)通过犹他大学男科学实验室和Donor-Connect获得。这个样本从同意器官捐赠用于移植和研究的已故个体身上移除。
方法详情
样本运输及储存
将在BDRL收集的用于单细胞转录组图谱的产前样本在HBSS中连同冰袋一起过夜运送，以便在洛杉矶立即处理。来自图宾根大学的样本在手术后24-48小时内运送到加州大学洛杉矶分校UCLA。
将出生后的整个睾丸在盐水中冰敷运送到研究实验室，并在通过手术取出后1小时内进行处理。使用剪刀将每个睾丸的大约90％分成更小的部分(每个500mg-1g)，并直接转移到冷冻管里(Corning，目录号403659)的含有10％DMSO(Sigma-Aldrich，目录号D8779)、15％胎牛血清(FBS)(GIBCO，目录号10082147)的DMEM培养基(Life Technologies，目录号11995073)中，并以受控慢速冷冻保存在Mr.Frosty容器(Thermo FisherScientific，目录号5100-0001)中，在-80℃下保存过夜。将冷冻管转移至液氮中以长期储存。
用于单细胞RNA测序的人类睾丸样本制备
在妊娠终止后24-48小时内处理产前组织。到达UCLA后，用PBS轻轻洗涤组织，并将其置于含有胶原酶IV 10mg/ml(Life Technologies，#17104-019)、分散酶II 250ug/ml(Life Technologies，#17105041)、DNA酶I1:1000(Sigma4716728001)、10％FBS(LifeTechnologies 10099141)的1x PBS解离缓冲液。每5分钟，用P1000移液器将组织轻轻移至Eppendorf管底部。这个过程重复3次，总共15分钟。然后，将细胞以500g离心5分钟，将沉淀物重悬于含有0.04％BSA的1x PBS中，通过40mm滤网过滤，并使用自动细胞计数器(ThermoFisher,Countess II)计数。将细胞浓度调整至每微升800-1200个细胞，并立即用于scRNA-seq。对于产后组织，快速解冻1个冷冻管的组织，然后用PBS清洗两次，并按照先前所述进行消化(Guo等人,2018)。将组织在1x PBS中清洗两次并切成小块以获得更好的消化结果。然后将组织用胰蛋白酶/乙二胺四乙酸(EDTA；Invitrogen目录号25300054)和IV型胶原酶(SigmaAldrich目录号C5138-500MG)在37℃处理20-25分钟。用70mm(Fisher Scientific目录号08-771-2)和40mm(Fisher Scientific目录号08-771-1)滤网过滤获得单睾丸细胞。细胞通过600g离心15分钟沉淀并用PBS洗涤两次。使用血细胞计数器对细胞数进行计数，然后将细胞以1,000个细胞/uL的浓度重悬于PBS+0.4％BSA(Thermo Fisher Scientific目录号AM2616)中，准备用于单细胞测序。
单细胞RNA-seq性能、文库制备和测序
目标是捕获6,000-7,000个细胞。产前测序在UCLA进行，产后测序在犹他大学进行。简而言之，按照制造商的说明将细胞稀释，并使用Chromium单细胞3'v3试剂将总计33.8mL混合缓冲液与细胞一起加载到10x Chromium控制器中。测序文库按照制造商的说明进行制备，使用13个cDNA扩增循环，然后用100ng cDNA进行12个循环的文库扩增。然后将所得文库在Illumina Novaseq 6000仪器上进行2X 150循环的双末端测序。
单细胞RNA-seq数据的处理
使用mkfastq应用程序(Cell Rangerv2.2.0)对原始数据进行多路分解(weredemultiplexed)以制作Fastq文件。Fastq文件之后用计数应用程序(Cell Rangerv2.2.0)使用默认设置运行，其执行比对(使用STAR比对软件)、过滤和UMI计数(UMI counting)。UMI计数表(UMI count)用于进一步分析。
睾丸组织的免疫染色
在平台摇床上将完整的睾丸在室温下固定在4％PFA中2小时。将组织用PBS洗涤3次，每次洗涤10分钟，然后放入石蜡块(Histogel，Thermo Scientific HG4000012)中以在载玻片上形成切片。将切片脱蜡并分别在二甲苯和乙醇系列(100％、95％、70％、50％、水)中再水合。抗原修复(Antigen retrieval)在Tris-EDTA溶液(pH9.0)或柠檬酸钠溶液(pH6.0)中在热水浴(95℃)中进行40分钟。将切片在PBS、0.2％Tween-20(PBS-T)中洗涤3次，每次5分钟，然后在PBS、0.05％Trition X-100中透化20分钟。将切片用封闭液(10％正常驴血清(NDS)、PBS-T)在室温的潮湿室中封闭30分钟。一抗在2.5％NDS、PBS-T中以适当稀释度进行稀释(参见关键资源表)，并在潮湿室中于4℃下孵育过夜。在PBS-T中洗涤3次后(每次5分钟)添加二抗并在潮湿室中室温孵育1小时。在PBS-T中洗涤3次后，将DAPI添加到切片中约5分钟，然后在PBS-T中洗涤3次，每次5分钟。将Prolong Gold防褪色封片剂(InvitrogenP10144)加到切片上。将盖玻片放在载玻片上，然后用指甲油密封。让载玻片在室温下在黑暗中固化过夜，然后储存在4℃下直至准备成像。对于用PIWIL4抗体染色的切片，使用的封闭缓冲液是Superblock封闭缓冲液(Thermo Scientific 37580)。此外，使用SignalBoost免疫反应增强试剂盒(Millipore 407207)稀释一抗和二抗，以进行涉及PIWIL4抗体的实验。
显微镜检查
使用配备有Plan-Apochromat 203/0.8NA和Plan-Apochromat 633/1.4NA M27油浸物镜、具有由Zen Black软件控制的Airyscan的Zeiss LSM 880来获取共聚焦图像。使用Imaris文件转换器(Bitplane)将保存的CZI文件转换为Imaris格式文件(.ims)，然后使用图像分析软件IMARIS 9.3(Bit-plane)进行处理。使用Olympus BX-61光学显微镜检查苏木精和伊红(H&E)染色的载玻片。ImageJ拼接功能使用图像集合中的相似特征/结构来制作融合图像，因此每个图像与前一个拍摄的图像有一些重叠。简而言之，H&E图像是用20x物镜拍摄的。ImageJ中在“插件”(Plugins)下拉框中，选择“拼接”(Stitching)插件，然后选择“网格/集合拼接”(Grid/Collection Stitching)功能。在“类型”框中选择“未知位置”，并为“顺序”选择“目录中的所有文件”。使用的融合方法选择线性混合。回归阈值(theRegression threshold)设置为0.30。最大/平均位移阈值(the Max/avg displacementthreshold)设置为2.50，绝对位移阈值(the Absolute displacement threshold)设置为3.50。拼接的图像是使用ImageJ2(NIH)网格/集合拼接插件构建的。
量化和统计分析
Seurat程序被用作第一分析包。首先，使用Read10X函数将来自全部四个青少年捐赠者的两个重复的UMI计数表加载到R中，并根据每个实验构建Seurat对象。每个实验都使用默认设置进行过滤和标准化。具体来说，只有当细胞包含>500个表达基因并且映射到线粒体基因组的读数<25％时，细胞才会被保留。首先对每个重复进行t-SNE和聚类分析，从而产生相似的t-SNE图。然后将来自不同捐赠者和重复的数据矩阵(data matrices)与之前公开的婴儿和成人数据(Guo等人，2018)相结合。接下来，按照教程中的说明，将细胞标准化至总UMI读取计数。使用显示最显著p值的前6,000个高度可变基因和1-30个PCs在结合的数据上进行t-SNE和聚类分析。
使用Monocle包(v2.10.1)按照默认设置进行不同细胞类型的详细拟时序分析。确定了拟时间坐标/顺序后，进行基因聚类分析以确定拟时序的准确性。在这里，细胞(列)按其拟时间排序，基因(行)使用Cluster 3.0通过k均值聚类进行聚类。执行不同的k均值数以达到最佳聚类数。使用scran程序R包,v1.6.5进行细胞周期分析。
加权基因共表达网络分析WGCNA
WGCNA发现了PGC、精原细胞和状态0中的中枢基因。在寻找PGC和精原细胞中的中枢基因时，从scRNA-seq数据的UMI计数表中随机提取分别来自PGC和状态0的40个细胞的基因表达数据。通过选择在超过20个细胞中表达的基因来过滤基因，因为scRNA-seq数据具有较高的缺失(drop-out)比率，而低表达基因可能代表噪音。然后通过总读取数(x*10000/总读取数)对计数进行标准化，然后进行对数转换(log2(x+1))。随后进行了一步网络搭建和模块检测。在这一步中，选择的参数包括有符号混合网络类型(signed hybrid network)、皮尔逊相关性方法和默认的软阈值b(soft-thresholdpowerb)，以实现无标度网络拓扑(scale-free network topology)。为了识别与PGC或精原细胞显著相关的模块，使用了双权重中度相关(bi-weight mid-correlation)(robustY＝FALSE)。通过模块特征基因(module eigengenes)和感兴趣的特征之间的强相关性以及基因模块成员资格(genemodule membership)和基因-特征相关性(gene-trait correlation)之间的强相关性来检查模块的质量。最后，从具有最高模块内连接性(the highest intramodularconnectivity)(模块内边权重之和(sum ofin-module edge weights))的前40个基因中选择这些模块内的中枢基因。具体来说，为了寻找状态0而非精原细胞中的中枢基因，加入了来自状态l的40个细胞的基因表达数据，以排除在状态0-4中广泛表达的基因并进行相同的分析来确定与状态0显著相关的模块。按照相同的标准选择了10个中枢基因。最后，使用Cytoscape Software 3.7.2对网络进行了可视化。
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示例2.建立人睾丸组织培养系统
为了识别支持睾丸生殖细胞(种系和体细胞两种)体外生长和发育的培养条件，使用了一种基因组方法来识别培养的细胞中失调的生物路径，其可用于识别体外培养条件。从健康成年受试者获得包含精管的睾丸组织，并使用下述方法在基本培养条件下培养。分离细胞以获得所有睾丸类型的单细胞。将培养的细胞中每种细胞类型的RNA转录物与从直接从受试者获得的组织分离的相应细胞中的RNA转录物水平进行比较。
发现分化中的精原细胞能够在体外增殖/复制并且分化中的精原细胞能够增殖/复制并进入减数分裂(图14和15)。然而，尽管生殖细胞在基本培养条件下增殖，但在开始培养后14天发现的细胞很少。使用一种免疫组织化学方法，发现培养7天后生殖细胞小生境发生改变(图16)。
使用下图中详述的方法，将使用scRNA-seq的基因组方法用于进一步揭示培养的睾丸组织的分子变化。
结果表明在培养后，体细胞而不是生殖细胞显示出的改变最多(图16、17和21)。使用上述基因组方法，发现与以下方面相关的基因的表达在培养的莱迪希氏和肌样细胞中发生了改变：细胞外外泌体、细胞凋亡过程的负调节、细胞因子、对缺氧的反应、肌动蛋白细胞骨架、细胞外基质和肌肉收缩(图19；表3)。还发现了与以下方面相关的基因的表达在培养的内皮细胞中发生了改变：核糖体、焦点粘附、细胞外基质和血管生成(图20；表4)
考虑到上述情况，对上述方法使用了小分子抑制剂以确定其是否可以逆转培养的影响并维持睾丸组织结构。为了实现这一目标，使用了表1中描述的测试方法和小分子抑制剂。使用如下图所示的方法以及下文进一步描述的参数，发现HIF-1抑制剂棘霉素有助于维持睾丸组织结构(图22和23)并有助于生殖细胞存活(图24)，甚至在培养开始后2周。因此，结果表明培养的体细胞处于低氧压力下。
表1.小分子抑制剂
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培养基还补充有配体(表2)，该配体由本文的基因组工作告知并且是发明人之前发现的(Guo等人，细胞干细胞，2017；Guo等人，细胞研究，2018；和Guo等人，细胞干细胞，2020)。
表2
配体 浓度
睾酮 1X10-6M
激活素A 50ng/ml
FSH 1ng/ml
GDNF 20ng/ml
FGF2 10ng/ml
LIF 100ng/ml
RA 3.3X10-7M
CXCL12 100ng/ml
发现当不添加棘霉素时，这些配体是有效的，但不足以恢复组织结构。相反，当将棘霉素、睾酮、FSH和RA添加到培养基中时，与单独的棘霉素或单独的配体相比，得到更好的生殖细胞增殖(图24)。
睾丸组织培养
材料
·培养皿(Genesee Scientific#32103)
·CytoOne 6孔TC板(USA scientific#CC7682-7506)
·αMEM(STEMCELL Technologies#36453)
·KnockOutTM血清替代品(KSR；Gibco#10828010)
·棘霉素(Millopore Sigma#SML0477)
·睾酮(授权药房#49696)
·GDNF(重组人胶质细胞系源性神经营养因子；研发系统#212-GD-010)
·bFGF(碱性成纤维细胞生长因子；BD Biosciences#354060-10)
·Click-iT Edu(Thermo Fisher Scientific#C10337)
·IV型胶原酶(Sigma Aldrich目录号C5138-500MG)
方法
组织制备：由DonorConnect工作人员从尸体器官捐献者中取出整个睾丸，由犹他团队去取后在冰上运送到研究实验室。使用手术剪刀和镊子将睾丸组织切成直径3-5毫米大小。
培养基制备：基础培养基为αMEM+10％KSR。我们首先在基础培养基中测试不同浓度的各种小分子抑制剂/配体来培养睾丸组织。然后，我们根据形态变化和生殖细胞增殖状态选择使用具有更好结果的抑制剂/配体组合(即通过生殖细胞增殖维持睾丸大小；更多细节见下文)。我们目前最有效的组合是棘霉素(HIF抑制剂；浓度：5nM)+睾酮(浓度：10-7M)+GDNF(浓度：10ng/mL)+bFGF(浓度：10ng/mL)。
组织培养：将三块睾丸组织放入6孔板的一个孔中，每个孔中有2ml培养基。组织应完全浸入培养基中。将板置于34℃、5％CO2的培养箱中，每隔一天更换培养基。
形态学检查：测量培养的睾丸组织在不同时间点的尺寸，包括第1天、第7天、第14天和第21天。然后固定样本进行H&E染色。详细的方法已在之前描述过(Guo等人,2018,2020)。
生殖细胞增殖检查：在第0天、第6天、第13天、第20天的不同时间点添加Edu(每孔2ul)。24小时后收获组织用于生殖细胞增殖测试。样本用PBS洗涤3次，并在37℃下用IV型胶原酶消化成分离的小管。然后用PBS洗涤3次以终止消化，并用Edu和DDX4/UTF1/SYCP3对小管进行整体染色。详细的方法已在之前描述过(Gassei等人,2014)。
培养的组织的单细胞RNA测序图谱：获得了最有效组合中培养的睾丸组织的单细胞转录组。组织解离和测序执行的详细方法已在之前描述过(Guo等人,2018,2020)。我们比较了培养的睾丸组织概况与非培养的健康睾丸概况，这使我们能够通过测试更多的小分子抑制剂/配体来完善我们的培养基。
参数
提取睾丸体细胞用于tSNE/UMAP分析
·tsne.method
tsne.method＝“tSNE：使用Rtsne包Barnes-Hut执行tSNE
tsne.method＝“FIt-SNE”：使用基于FFT加速插值的t-SNE
·简化(降维)
PCA或ICA
各细胞类型的差异表达分析
·用于识别差异表达基因的测试：
test.use＝“wilcox”：Wilcoxon秩和检验
test.use＝“ROC”：ROC分析
test.use＝“t”：学生t检验
test.use＝“negbinom”：基于负二项式广义线性模型的方法
test.use＝“DESeq2”：使用负二项式分布的DESeq2分析
test.use＝“poisson”：基于泊松广义线性模型的方法
test.use＝“MAST”：基于为scRNA-seq数据定制的障碍模型的方法
·min.pct(在min.pct细胞的最小部分中检测到的基因)
min.pct设置：从0.1到0.5
·logfc.threshold(将基因限制为至少X倍差异(对数刻度))
logfc.threshold设置：从0.25到0.5
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表3.图19的热图中基因的GO术语。
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表4.图20的热图中基因的GO术语
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Claims (51)

1.一种用于识别在体外支持睾丸生殖细胞和体细胞生长的培养条件的迭代方法，该方法包括
a.识别与直接从男性受试者的睾丸分离的单个睾丸细胞中的RNA转录物的表达相比，在第一组条件下体外生长的单个睾丸细胞中差异表达的RNA转录物，其中所述差异表达的RNA转录物识别体外培养的细胞中一个或多个失调的生物路径；
b.根据(a)中的比较结果，睾丸细胞在第二组培养条件下生长以减轻已识别路径的失调，已识别路径的失调的减轻通过测试生长、存活、生理机能或发育的改善来确认；
c.任选地，将步骤(a)和(b)反复重复多次，以识别与直接从成年男性睾丸分离的细胞相比，培养的细胞具有适当的同一性、生长和存活的、在体外支持睾丸细胞生长的培养条件，
其中与直接从男性睾丸分离的细胞相比，在第二组培养条件下生长的细胞表现出适当的同一性、生长和存活。
2.根据权利要求1的迭代方法，其中所述生长的细胞是分离的睾丸生殖细胞、包含一根或多根含有睾丸生殖细胞和睾丸体细胞的生精小管的睾丸组织、或者包含睾丸生殖细胞和支持细胞的类器官。
3.根据权利要求2的迭代方法，其中所述睾丸组织是生精小管。
4.根据权利要求2的迭代方法，其中所述类器官的支持细胞包括塞托利细胞、原代永生化塞托利细胞、永生化塞托利细胞、莱迪希氏细胞、肌样细胞、经识别可用于以类器官形式培养的细胞或其任意组合。
5.根据权利要求1的迭代方法，其中所述生殖细胞包括精原细胞、精母细胞、精细胞或其任意组合。
6.根据权利要求5的迭代方法，其中所述精原细胞包括精原干细胞、增殖精原细胞或分化中的精原细胞。
7.根据权利要求6的迭代方法，其中所述精母细胞包括前细线期精母细胞、细线/偶线期精母细胞；粗线期精母细胞；双线期2°精母细胞或其任意组合。
8.根据权利要求6的迭代方法，其中所述精细胞包括圆形精细胞、长形精细胞和精子。
9.根据权利要求2的迭代方法，其中所述睾丸组织中的睾丸体细胞包括塞托利细胞、莱迪希氏细胞、内皮细胞、肌样细胞或其任意组合。
10.根据权利要求1的迭代方法，其中步骤(b)的生长的睾丸细胞包含与直接从成年男性睾丸分离的细胞的RNA转录物表达谱基本相似的RNA转录物表达谱。
11.根据权利要求1的迭代方法，其中在所述第二组培养条件下生长的细胞没有失调的途径。
12.根据权利要求1的迭代方法，其中在第一组条件下生长的睾丸细胞是健康成年受试者、不育或生育力低下的成年受试者、青春期前受试者的睾丸细胞。
13.根据权利要求1的迭代方法，其中所述睾丸细胞培养系统能够在体外维持所述睾丸生殖细胞的同一性、生长、发育、存活和复制。
14.根据权利要求1的迭代方法，其中所述第一组培养条件包括第一培养基，所述第二组培养条件包括补充有一种或多种减轻所识别的失调生物途径的失调的因子的所述第一培养基。
15.根据权利要求14的培养系统，其中所述一种或多种因子包括缺氧诱导因子(HIF)的抑制剂、促性腺皮质激素、促性腺激素、GDNF家族配体(GFL)的成员、激活素、成纤维细胞生长因子受体(FGFR)蛋白配体、白细胞介素6细胞因子、趋化因子、视黄酸受体配体或其任意组合。
16.根据权利要求15的培养系统，其中HIF是HIF-1α、VHL E3泛素连接酶(VHL)或其组合。
17.根据权利要求16的培养系统，其中所述HIF-1α抑制剂是聚酰胺(破坏HIF-1-DNA接口)、吖啶黄(抑制HIF-1二聚化)、毛壳菌素(chetomin)(破坏HIF-1-p300相互作用)、YC1(灭活HIF-1α的转录活性)、两性霉素B(灭活HIF-1α的转录活性)、AJM290(灭活HIF-1α的转录活性)、AW464(灭活HIF-1α的转录活性)、PX-12(抑制HIF-1α蛋白水平)、PX-478(抑制HIF-1α蛋白水平)、氨基黄酮(抑制HIF-1α蛋白水平)、EZN-2968(HIF1α的RNA拮抗剂)、棘霉素(破坏HIF-1-DNA接口)或其任意组合。
18.根据权利要求16的培养系统，其中所述HIF-1α抑制剂是棘霉素、PX-12、牡荆素或其任意组合。
19.根据权利要求16的培养系统，其中所述HIF-1α抑制剂是棘霉素。
20.根据权利要求19的培养系统，其中所述培养基中棘霉素的浓度范围从约0.1nM至约100nM、约1nM至约50nM、或者约2nM至约7nM。
21.根据权利要求15的培养系统，其中所述促性腺皮质激素是雄激素。
22.根据权利要求21的培养系统，其中所述雄激素是睾酮、FSH、hCG、LH、GDNF或其组合。
23.根据权利要求15的培养系统，其中所述雄激素是睾酮。
24.根据权利要求23的培养系统，其中所述培养基中睾酮的浓度范围从约10-5M至约10- 9M、约10-6M至约10-8M、或者约1.5×10-6M至约0.5×10-8M。
25.根据权利要求15的培养系统，其中所述GFL的成员是GDNF。
26.根据权利要求25的培养系统，其中所述培养基中GDNF的浓度范围从约0.1ng/mL至约100ng/mL、约1ng/mL至约50ng/mL、或者约7ng/mL至约12ng/mL。
27.根据权利要求15的培养系统，其中所述成纤维细胞生长因子受体(FGFR)蛋白配体是bFGF(FGF2)。
28.根据权利要求27的培养系统，其中所述培养基中bFGF的浓度范围从约0.1ng/mL至约100ng/mL、约1ng/mL至约50ng/mL、或者约7ng/mL至约12ng/mL。
29.根据权利要求15的培养系统，其中所述促性腺激素是人绒毛膜促性腺激素(hCG)、黄体生成素(LH)或两者。
30.根据权利要求15的培养系统，其中所述激活素是激活素A。
31.根据权利要求30的培养系统，其中所述培养基中激活素A的浓度范围从约0.1ng/mL至约200ng/mL、约1ng/mL至约150ng/mL、或者约25ng/mL至约75ng/mL。
32.根据权利要求15的培养系统，其中所述FGFR蛋白配体是FGF2。
33.根据权利要求41的培养系统，其中所述培养基中FGF2的浓度范围从约0.1ng/mL至约100ng/mL、约1ng/mL至约50ng/mL、或者约7ng/mL至约12ng/mL。
34.根据权利要求15的培养系统，其中所述白细胞介素6细胞因子是白血病抑制因子(LIF)。
35.根据权利要求34的培养系统，其中所述培养基中LIF的浓度范围从约1ng/mL至约500ng/mL、约10ng/mL至约200ng/mL、或者约75ng/mL至约125ng/mL。
36.根据权利要求15的培养系统，其中所述趋化因子是CXCL12。
37.根据权利要求36的培养系统，其中所述培养基中CXCL12的浓度范围从约1ng/mL至约500ng/mL、约10ng/mL至约200ng/mL、或者约75ng/mL至约125ng/mL。
38.根据权利要求15的培养系统，其中所述视黄酸受体配体是视黄酸。
39.根据权利要求38的培养系统，其中所述培养基中视黄酸的浓度范围从约10-5M至约10-9M、约10-6M至约10-8M、或者约2.5×10-7M至约3.5×10-7M。
40.根据权利要求14的培养系统，其中所述一种或多种因子包括棘霉素、睾酮、RA和FSH。
41.根据权利要求14的培养系统，其中所述一种或多种因子包括棘霉素、睾酮和GDNF。
42.根据权利要求14的培养系统，其中所述一种或多种因子包括棘霉素、睾酮、GDNF、HCG和FSH。
43.根据权利要求14的培养系统，其中所述基础培养基是αMEM+
10％KSR。
44.根据权利要求1的培养系统，其中单个睾丸细胞中的RNA转录物直接从男性受试者的睾丸中分离。
45.一种用于支持人类精子体外生成的睾丸细胞培养系统，该系统包括：
a.睾丸生殖细胞；和
b.培养基，包含
i.基础培养基，和
ii.一种或多种减轻在基础培养基中生长的睾丸细胞中失调的生物路径的失调的因子，
其中所述因子使用权利要求1的方法来识别。
46.一种睾丸细胞组合物，其包含使用用权利要求1的方法识别的培养条件、权利要求45的睾丸细胞培养系统、或两者进行体外生长的生殖细胞、体外生长的睾丸组织或者体外生长的类器官。
47.一种通过培养从可育和不育男性获得精子的方法，该方法包括：
a.使用用权利要求1的方法识别的培养条件、权利要求45的睾丸细胞培养系统或两者，培养超过一个精原干细胞SSC，其中每个SSC单独培养；
b.识别包含由培养的SSC产生的精子的精原干细胞培养物，其中所述精子不包含有害的遗传突变和/或包含较低比率的新生突变，并且所述不含有害的遗传突变和/或包含较低比率新生突变的精子包含与SSC培养物中SSC的RNA转录物表达谱基本相似的RNA转录物表达谱；和
c.从步骤(b)识别的培养物中收获精子。
48.根据权利要求47的获得精子的方法，还包括冷冻所述精子以供未来使用的步骤。
49.根据权利要求47或48的获得精子的方法，还包括通过例如宫内授精或体外受精的辅助生殖技术来使用所述精子的步骤。
50.一种产生有活力的精子的方法。该方法包括：
a.从受试者获得睾丸组织，和
b.在用权利要求1的方法识别的培养条件下、权利要求45的睾丸细胞培养系统或两者培养睾丸组织。
51.一种试剂盒，该试剂盒用于在用权利要求1的方法识别的条件下、权利要求45的睾丸细胞培养系统或两者体外培养睾丸生殖细胞。
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