CN100999722B

CN100999722B - 卵巢组织块内不成熟卵母细胞的体外培养成熟方法

Info

Publication number: CN100999722B
Application number: CN2007100192425A
Authority: CN
Inventors: 冯定庆; 凌斌; 高婷; 周颖; 沈国栋; 朱园园; 姚凤球; 陈峥峥
Original assignee: Anhui Provincial Hospital
Current assignee: Anhui Provincial Hospital
Priority date: 2007-01-08
Filing date: 2007-01-08
Publication date: 2011-08-03
Anticipated expiration: 2027-01-08
Also published as: CN100999722A

Abstract

卵巢组织块内不成熟卵母细胞的体外培养成熟方法，其特征是选择雌性小鼠骨髓间充质干细胞MSC作为饲养细胞，以MSC条件培养液配制琼脂覆于其上作为培养支架，并按每毫升3个国际单位加入HCG，将卵巢组织块贴附于支架上进行培养。共培养体系中雌二醇、孕酮和黄体生成素含量明显上升；经培养，卵巢组织块有成熟卵母细胞排出。该方法的建立在珍稀及濒危动物保存、畜牧良种培育和商业化生产、胚胎干细胞的细胞生物学研究和建立人类“卵子库”，提供生殖保险等领域发挥重要作用。

Description

卵巢组织块内不成熟卵母细胞的体外培养成熟方法

技术领域

本发明属生殖医学和细胞生物学领域，具体涉及卵巢组织块内不成熟卵母细胞的体外培养成熟方法。

背景技术

未成熟卵母细胞体外培养成熟(IVM)技术是伴随人工辅助生殖技术(ART)的发展而出现的，IVM可以缩短生殖周期，最大限度利用优良遗传物质，用于珍稀或濒危动物的人工繁殖，及畜牧良种的培育和商业化生产；便于研究卵母细胞的发育机制，结合体外受精或孤雌激活技术获取大量胚胎干细胞用于科研；IVM在人类生殖领域拓宽了卵母细胞来源且不成熟卵母细胞更容易冻存，有助于建立“卵子库”，为女性提供生殖保险。

培养液是卵母细胞IVM技术的一项关键内容，但目前还没有一种价廉、稳定和安全的商品化的IVM培养液提供。目前IVM常用的基础培养液有Ham’s F-10、TCM-199、α-MEM、DMEM、HTF等，但单独使用这些培养液卵母细胞的成熟率非常低。英国《自然》杂志(nature，1965，208∶349)报道在这些基础培养基内添加高浓度的血清，体外培养的小鼠、绵羊、奶牛、恒河猴和人的卵母细胞可以向成熟方向分化，但大部分停滞于第一次减数分裂前期，仅低于30％的卵母细胞能达到MII期。目前常用的添加因子有类固醇激素类：FSH、Gn、LH、HCG、E2、P等，细胞因子类：转铁蛋白、IL-1、IL-6等，生长因子类：EGF、FGF、IGF等，英格兰牛津《人类生殖》(Human Reproduction，1998，13∶115)报道添加相关物质之后卵母细胞成熟率高达85.3％。但是这些物质非常昂贵，并且很不稳定，容易出现卵母细胞核浆成熟不一致的情况。英格兰剑桥《生殖》杂志(Reproduction，2001，121∶925)报道利用猴肾细胞、颗粒细胞和输卵管上皮细胞作为饲养细胞，利用细胞的分泌作用减少添加物质，提高卵母细胞的成熟率，但均没有达到促排时卵母细胞90％的成熟率，并且还存在病原体和外源基因污染的危险。

上述原因的存在，极大地限制了IVM技术优势的发挥和应用。

发明内容

本发明是为避免上述现有技术所存在的问题，提供一种卵巢组织块内不成熟卵母细胞的体外培养成熟方法，利用小鼠骨髓间充质干细胞MSC获取容易，分泌细胞因子和生长因子的多样性，建立以MSC作为饲养细胞和卵巢组织块内的卵母细胞体外培养成熟的方法，克服以往IVM培养液及饲养细胞的诸多缺陷和不足，同时提高培养成熟率，为IVM技术更好服务于珍稀及濒危动物保存、畜牧良种培育和商业化生产、胚胎干细胞的细胞生物学研究和建立人类“卵子库”，提供生殖保险开辟更为广阔的前景。

本发明解决技术问题所采用的技术方案是：

本发明方法的特点是选择雌性小鼠骨髓间充质干细胞MSC作为饲养细胞，以MSC条件培养液配制的重量体积比为0.4％的琼脂覆于其上，并按每毫升3个国际单位加入HCG作为培养支架，将卵巢组织块贴附于所述支架上进行培养。

本发明方法是按如下步骤进行操作：

a、获取MSC：获取8-10周龄雌性小鼠骨髓腔冲洗液，利用密度梯度离心结合贴壁培养法分离纯化原代MSC，培养至原代MSC80％铺满培养瓶底，再以重量体积比为0.25％的胰蛋白酶消化传代获得二代MSC；所述二代MSC在含体积比为10％的胎牛血清的DMEM、37℃、体积比为5％的CO₂条件下培养3天后离心取上清即为条件培养液；以条件培养液为溶液，配制重量体积比为0.4％的琼脂；

b、二代MSC以1×10⁵/ml细胞密度接种6孔板，待细胞贴壁后倾去培养液，覆盖冷至37-42℃左右的重量体积比为0.4％的琼脂3ml，按每毫升3个国际单位加入HCG，获得卵巢组织块培养支架；

c、无菌条件下取出8-10周龄雌性昆明种小鼠两侧卵巢，切成1-2mm厚的薄片，贴于制备好的培养支架上，轻压使组织块嵌入琼脂，37℃、体积比为5％的CO₂条件下培养直至成熟。

其中：

DMEM为由Dulbecco改良的MEM，即Dulbecco’s modified Eagle’s medium

MSC为小鼠骨髓间充质干细胞，即mesenchymal stem cell

本发明中原代和二代MSC的培养基均为DMEM，并在其中添加有体积比为10％的胎牛血清、10mmol/L HEPES、100U/mL青霉素和100U/mL链霉素。其它适合MSC生长的培养基，如RPMI-1640、Ham’sF-12等也可以用于本发明。

本发明中离体的卵巢组织需放在4℃预冷的含体积比为10％的胎牛血清的DMEM内，制作卵巢组织薄片的过程也必须在冰水混合的冰浴上进行，温度过高会加速细胞代谢，导致代谢产物蓄积，组织坏死，改变卵母细胞发育的环境。

与已有技术相比，本发明有益效果体现在：

1、本发明所采用的饲养细胞为MSC，不仅具有多向分化潜能，而且对周围细胞有很重要的营养作用和抑制细胞凋亡作用。MSC能合成并分泌IL-1、IL-6、EGF、FGF、IGF-1、HGF、LIF、TGF-β等多种生物活性物质，其中很多都是卵母细胞体外成熟培养所必需添加的。另外，MSC还可以促进颗粒细胞合成和分泌多种激素，如E2、P、LH、卵泡液减数分裂激活固醇(FF-MAS)，增强其突触与卵母细胞胞浆相互作用，促进卵母细胞核浆同步成熟。

2、本发明方法对于未成熟卵母细胞成熟率高，重复性好，结果稳定。

3、本发明方法操作简便、安全，极大降低了IVM的成本，在对珍稀及濒危动物保存、畜牧良种培育和商业化生产、胚胎干细胞的细胞生物学研究和建立人类“卵子库”，提供生殖保险等方面有着广阔的应用前景。

4、本发明利用重量体积比为0.4％的琼脂作为卵巢组织块培养的支架，MSC及其分泌的生物活性物质可以随培养液在琼脂内自由流动，供给卵巢组织营养，卵巢组织块一侧暴露于空气较高的氧分压下有利于氧气的弥散，可以长时间保持组织活性。

5、本发明方法适用于各种哺乳动物。在用于牛、羊等体形较大动物时，MSC和卵母细胞均可通过针刺获取，创伤甚小。

附图说明

图1为洗去悬浮细胞后的原代MSC×200。

图2为与MSC共培养4天卵巢组织块表面的窦卵泡×100。

图3为与MSC共培养的卵巢组织块排出的未成熟卵母细胞×100。

图4为与MSC共培养的卵巢组织块排出的未成熟卵母细胞发育到MII期×100。

以下结合具体实施方式对本发明作进一步说明。

具体实施方式

本发明方法按如下步骤进行操作：

1、MSC的分离、培养：获取8-10周龄雌性小鼠骨髓腔冲洗液，等比例加到离心管内密度为1.077的无菌Percol液上方，2000转/分钟离心20分钟，收集两液层间的单个核细胞层，10倍体积1×PBS 1200转/分钟离心10分钟洗涤2次。含体积比为10％的胎牛血清DMEM重悬细胞，2×10⁶/ml细胞密度接种培养瓶，37℃、体积比为5％的CO₂培养。3天后轻晃培养瓶，倾去未贴壁细胞，1×PBS洗2次即获得纯化的原代MSC，加含体积比为10％的胎牛血清DMEM继续培养至80％铺满瓶底(图1所示)，重量体积比为0.25％的胰蛋白酶消化传代，6×10⁵/ml细胞密度接种6孔板即为二代MSC，培养3天后收集培养上清液即为条件培养液。

2、重量体积比为0.4％的琼脂支架的制备：二代MSC以1×10⁵/ml细胞密度接种6孔板，待细胞贴壁后倾去培养液；以条件培养液配制重量体积比为0.4％的琼脂，待冷至37℃-42℃吸3ml铺于MSC上，37℃、体积比为5％的CO₂平衡过夜后用于卵巢组织块培养。

3、卵巢组织块的培养：无菌条件下取出8-10周龄雌性昆明种小鼠两侧卵巢，置于4℃预冷的含体积比为10％的胎牛血清的DMEM内，冰水混合的冰浴上迅速制成1-2mm作用薄片，贴于37℃、体积比为5％的CO₂过夜的含MSC的重量体积比为0.4％的琼脂上，轻压使组织块嵌入琼脂，同时加入3IU/mlHCG；部分卵巢组织薄片放于无MSC的条件液配制的0.4％琼脂上；部分卵巢组织薄片放于无MSC的含体积比为10％的胎牛血清的DMEM配制的重量体积比为0.4％的琼脂上；两者也同时加入3IU/mlHCG，37℃、体积比为5％的CO₂条件下培养。

4、体视显微镜下观察卵母细胞的形态学变化：胞浆匀称，色浅，颗粒均匀，在卵周隙可见第一极体判定卵母细胞成熟，即MII期卵母细胞。

5、结果：

与MSC共培养的卵巢组织块第4天可见卵巢组织表面有许多窦卵泡形成(图2所示)，排出的卵母细胞100％发育到M II期(图3、4所示)；无MSC的条件液配制的重量体积比为0.4％的琼脂和无MSC的含体积比为10％的胎牛血清DMEM配制的重量体积比为0.4％的琼脂上培养的卵巢组织第4天也可见少数窦卵泡形成，但没有卵母细胞排出，也没有卵母细胞能够发育到MII期。

卵巢组织在有MSC的重量体积比为0.4％的琼脂上或无MSC的条件培养液配制的重量体积比为0.4％的琼脂上培养，E2、P、LH水平上升明显，而卵巢组织在无MSC的含体积比为10％的胎牛血清的DMEM配制的重量体积比为0.4％的琼脂上培养，前述三种激素上升不明显。

Claims

1.卵巢组织块内不成熟卵母细胞的体外培养成熟方法，其特征是选择雌性小鼠骨髓间充质干细胞MSC作为饲养细胞，以MSC条件培养液配制的重量体积比为0.4％的琼脂覆于其上、按每毫升3个国际单位加入HCG，获得卵巢组织块培养支架，将哺乳动物卵巢组织块贴附于所述培养支架上进行培养；

所述MSC条件培养液的配制方法为：

a、以8-10周龄雌性小鼠骨髓腔冲洗液，利用密度梯度离心结合贴壁培养法分离纯化原代MSC，培养至原代MSC80％铺满培养瓶底；

b、以重量体积比为0.25％的胰蛋白酶消化传代获得二代MSC；

c、二代MSC在含体积比10％胎牛血清的DMEM、37℃、体积比为5％的CO₂条件下培养3天后离心取上清即为条件培养液。