CN104630138B

CN104630138B - 一种无血清软骨细胞培养液

Info

Publication number: CN104630138B
Application number: CN201310543110.8A
Authority: CN
Inventors: 田智泉
Original assignee: SHAANXI RUISHENG BIOLOGICAL SCIENCE AND TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: SHAANXI RUISHENG BIOLOGICAL SCIENCE AND TECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2013-11-06
Filing date: 2013-11-06
Publication date: 2017-11-14
Anticipated expiration: 2033-11-06
Also published as: CN104630138A

Abstract

一种无血清软骨细胞培养液，是在基础培养液中添加外源添加物。基础培养液是DMEM培养液或F12培养液或DMEM培养液与F12培养液的混合培养液，外源添加物为非必需氨基酸，葡聚糖，维生素C，谷氨酰胺，丙酮酸钠，胰岛素或胰岛素样生长因子，转铁蛋白，生长激素，三碘甲状腺氨酸，氢化可的松，地塞米松，亚硒酸钠，β‑巯基乙醇，脂类浓缩剂，孕酮，丁二胺，碱性成纤维生长因子，表皮生长因子，转化生长因子，骨形成蛋白，血小板衍生生长因子。该培养液不添加白蛋白，能避免使用血清造成的潜在隐患，提高软骨细胞分泌细胞外基质的能力，接近在含血清培养液中的生长增殖状态，对于低密度接种软骨细胞的去分化速率及基质分泌能力的提高，明显优于含血清培养液。

Description

一种无血清软骨细胞培养液

技术领域

本发明属于生物医学材料技术领域，具体涉及一种无血清软骨细胞培养液。

背景技术

因创伤或骨病导致的关节软骨缺损在临床十分常见。由于软骨无血供及神经，软骨细胞含量较低且为终末分化细胞，因此，软骨再生能力十分有限。经过十多年的临床应用及技术发展，自体软骨细胞移植（AutologousChondrocyteImplantation，ACI）技术已成为临床治疗软骨损伤最有效的方法，短、中、长期随访结果疗效优良率在75~95%。但因软骨细胞的体外扩增能力有限，如何获得足够的并保持细胞表型的种子细胞（即软骨细胞）已成为制约该技术临床应用的瓶颈。

大多数动物细胞都不同程度地依赖血清才能在体外生长增殖。常规的细胞培养，是在含有10%血清的DMEM或者DF12培养液条件下进行的，软骨细胞也是如此。血清除了供给细胞营养成分, 还能促使细胞合成DNA。而血清的使用也会带来以下诸多风险，例如血清成分复杂, 在对细胞产物进行分析或者提纯时会受到血清成分的干扰；不同批次血清的质量难以保持一致, 当实验周期较长、使用血清量较多时很难保证实验条件的一致性, 对实验数据的精度和可靠性必然产生一定影响；血清中还含有一定量的细胞毒性物质和抑制物质, 对细胞有去分化作用, 影响某些细胞功能的表达等。

在有血清的培养条件下，随着传代次数和数量的增大，软骨细胞很容易去分化产生成纤维细胞状态，无法分泌软骨细胞及软骨组织特异性胶原蛋白及蛋白聚糖，失去正常细胞表型，形成的“软骨组织”不能正常发挥生物活性，严重影响临床治疗效果。

研究结果表明，无血清培养液能够更好的维持细胞表型及其功能的发挥，在延缓细胞老化等诸多方面均优于有血清培养液。目前已有的无血清培养液主要用于培养以下几种细胞：中国仓鼠卵巢细胞、杂交瘤细胞、间充质干细胞、胚胎干细胞、表皮干细胞以及神经细胞、内皮细胞等。无血清培养液特异性很强，没有广泛的适应性。尽管国内外关于软骨细胞无血清培养的文献及专利报道较多，但由于可用于自体软骨细胞移植的起始软骨组织十分有限，并且在软骨细胞培养过程中，数量较少情况下易出现成活困难、去分化及易老化等现象，增加了软骨细胞培养特别是在无血清培养液条件下培养的难度。

中国专利200780027449.5公开的用于培养成纤维细胞、特别是关节软骨细胞的无血清培养液，添加了一种或者多种IL-6家族细胞因子，而文献报道该家族细胞因子对关节软骨细胞代谢具有干预作用，主要表现为抑制透明软骨特征性Ⅱ、Ⅳ型胶原的合成，而促进Ⅰ、Ⅲ型胶原的合成使软骨细胞变性，抑制软骨细胞增殖和蛋白多糖的合成。同时，对关节软骨的降解作用主要表现在促进软骨细胞合成和分泌金属蛋白酶，并提高软骨基质中溶解蛋白分子酶类的活性。

中国专利200580037602.3、200710096843.6、200510030198.9、200910265976.0、200610024459.0公开的可用于细胞培养的无血清培养液，在制备过程中部分添加了植物蛋白，这些成分尚无符合细胞培养标准的，增加了制备难度；同时，发明未针对特异性细胞，其对软骨细胞的培养效果未见报道，而研究结果表明，使用确定的无血清培养液对于软骨细胞的体外分离培养扩增及其基质分泌特别有利，能够维持该细胞表型。

中国专利201310003115.1发明的用于成纤维细胞培养的无血清培养液，是针对成纤维细胞的特异性培养液，该培养液未针对软骨细胞培养的特点，调整细胞因子添加量，会造成软骨细胞去分化速率加快，软骨细胞表型无法维持。

其他用于细胞培养的无血清培养液也存在诸如以下问题：添加血清白蛋白及多种贴壁因子等，导致培养液成本升高。另外，由于临床及临床前研究过程中，可获得的软骨组织量有限。而临床对软骨细胞种子细胞量要求较大，在软骨细胞培养前期，采用低密度单层培养，前3代细胞增殖迅速，但很快去分化，传代之后增殖缓慢，细胞表型大部丢失，无法维持正常软骨细胞表型，因此对软骨细胞正常功能的发挥及其在临床应用造成较大困难。

发明内容

本发明的目的是提供一种针对低密度软骨细胞培养的无血清培养液，其中不添加白蛋白，能避免使用血清造成的潜在隐患，同时，能够延缓软骨细胞的去分化速率，提高软骨细胞分泌细胞外基质的能力，达到人软骨细胞增殖速率，接近在含血清培养液中的生长增殖状态。

本发明所提出的无血清软骨细胞培养液，是在基础培养液中添加外源添加物，其中，基础培养液是指DMEM培养液或F12培养液或DMEM培养液与F12培养液的混合培养液（V:V=1:1）；外源添加物为：葡聚糖为5～20g/L，脂类浓缩剂为0.1~1mL/L，丙酮酸钠为50~100mg/L，三碘甲状腺氨酸（T3）为0.01～2μM，氢化可的松为0.05～5mg/L，地塞米松为0.1～10μg/L，亚硒酸钠为1～5μg/L，β-巯基乙醇为25～50μM，维生素C（V_C）为10～100mg/L，谷氨酰胺为50～500μg/mL，转铁蛋白为1～20 mg/L，胰岛素或胰岛素样生长因子（IGF）为5～100μg/L，生长激素（GH）为10~200μg/L、孕酮为5~20nM，丁二胺为20~100μM，非必需氨基酸为1%，细胞生长因子添加成分为：碱性成纤维生长因子（bFGF）为5～50μg/L，表皮生长因子（EGF）为0.5～25μg/L，转化生长因子（TGF-β）为1～25μg/L，骨形成蛋白（BMP）为1~10μg/L，血小板衍生生长因子（PDGF）为1～20μg/L。

为了提高低密度条件下软骨细胞体外扩增能力、维持软骨细胞表型及其细胞外基质分泌能力，细胞生长因子添加成分可优选为：碱性成纤维生长因子（bFGF-2）为10～25μg/L，表皮生长因子（EGF）为10～20μg/L，转化生长因子（TGF-β）为5～15μg/L，骨形成蛋白（BMP）为5~10μg/L，血小板衍生生长因子（PDGF）为5～10μg/L。

软骨形成是极其复杂的过程，生长因子作为信号物质参与软骨形成的精细调节。目前认为，生长因子不仅指对细胞生长发育具有促进作用的物质，同时也包括对细胞生长具有抑制作用的因子，他们共同参与软骨细胞的增殖、分化和基质代谢活动，在软骨形成过程中发挥重要调控作用。TGF-β广泛存在于各种组织内，在骨和软骨的表达尤其高，它具有诱导软骨形成的能力。BMP家族的成员，可以在非骨骼部位诱导软骨和骨形成。成骨素还能使体外培养中已经表现反分化的软骨细胞恢复软骨表型，重新表达软骨细胞特异性物质。EGF、PDGF、bFGF与BMP结合，可产生协同作用，加强成骨素对软骨细胞反分化的逆转效果，使已反分化的软骨细胞重新表达Ⅱ型胶原蛋白。研究表明，IGF、TGF-β、PDGF、bFGF和EGF等能增加人关节软骨细胞DNA合成，促进软骨细胞增殖。但是，生长因子对于细胞分裂增殖的影响可以是促进作用，也可以是抑制作用。因此，需要根据软骨细胞表型进行调整。

本发明所制备的软骨细胞无血清培养液，能够维持软骨细胞在低密度条件下正常生长扩增能力和软骨细胞表型，促进细胞功能的发挥。该培养体系在软骨细胞的原代分离培养及传代培养过程中，与在含血清培养液中的培养效果一致；并对于低密度接种软骨细胞的去分化速率控制及基质分泌能力的提高，明显的优于有血清培养液。

本发明无血清软骨细胞培养液的制备方法为：采用超纯水配制基础培养液；在基础培养液中先加入葡聚糖搅拌溶解，再分别加入脂类浓缩剂、丙酮酸钠、T3、氢化可的松、地塞米松、亚硒酸钠、β-巯基乙醇、V_C、谷氨酰胺、bFGF、EGF、TGF-β、PDGF、BMP、转铁蛋白、IGF、GH、孕酮、丁二胺、非必需氨基酸；调pH7.2，定容后用滤膜过滤除菌，4℃保存。

采用本发明无血清软骨细胞培养液培养原代细胞按以下操作：将消化后获得的软骨细胞用PBS溶液清洗干净，离心后用无血清软骨细胞培养液重悬，按0.5×10⁴～5×10⁴个/cm²的细胞密度接种培养；2）培养2～5天后换液，之后每2~3天换液一次；3）待细胞生长汇合至70％时，可进行传代。

采用本发明培养液进行软骨细胞传代培养，按以下操作：1）胰酶消化原代软骨细胞，将消化后获得的细胞用PBS溶液清洗，离心后用无血清培养液重悬细胞，按0.2×10⁴～5×10⁴个/cm²的细胞密度接种培养；2）每2~3天换液一次，待细胞生长汇合至75~85％时，进行传代。

本发明是针对软骨细胞培养的特异性培养液，能够解决低密度软骨细胞难培养、扩增效率低、细胞表型较难维持等问题，其特点如下：①该培养液无任何动物来源蛋白成分及贴壁因子，适用于软骨细胞的原代和传代培养，而且原代培养不添加血清，原代细胞在本发明培养液中能够保持较好的细胞形态，呈多边形，轮廓清晰，折光率良好，伸展良好；②能满足多次传代需要，培养代数较长，本发明培养液能维持软骨细胞从原代传至5~8代，且能保持软骨细胞形态特征，细胞在培养液中伸展良好，呈多边形；③可满足软骨细胞低密度条件下的培养要求；④软骨细胞在该无血清培养过程中，能够维持软骨细胞特性，保持良好的细胞外基质分泌能力，能够形成良好的组织工程移植物；⑤可在无血清培养条件下增强细胞的附着力及增殖，维持软骨细胞表达软骨特异性表型的能力，该培养液可以提供一种可用于基础研究直至用于软骨损伤患者的细胞培养体系。

附图说明

附图1为采用本发明无血清培养液与含血清培养液培养的原代软骨细胞效果对比照片，其中A为无血清培养组（无血清组），B为含血清培养组（血清组）；通过观察两组细胞形态，可知软骨细胞在本发明培养液中也能够正常的贴壁生长，该结果表明说明无血清培养液能够满足并维持软骨细胞的良好生长。

附图2为采用本发明无血清培养液与含血清培养液培养的传代软骨细胞生长状态对比的照片，其中C为含血清组的第3代软骨细胞形态，D为无血清组的第3代软骨细胞形态；E为含血清组的第6代软骨细胞形态，F为无血清组的第6代软骨细胞形态；可以看出，C图中软骨细胞呈细长状，有成纤维样细胞存在，D图中软骨细胞呈多边形，细胞立体感强，随着传代次数的增加，E图中软骨细胞呈成纤维样细胞形态，细胞失去软骨细胞表型，F图中软骨细胞呈多边形，软骨细胞表型维持良好，这说明本发明制备的软骨细胞无血清培养液对软骨细胞形态维持及细胞特性保持具有良好的效果，且能够成功实现体外扩增。

附图3为采用本发明无血清培养液培养的软骨细胞形成的软骨细胞复层化结构组织学检测图，采用本发明制备的无血清软骨细胞培养液培养的软骨细胞，在传代细胞100%汇合后继续培养，形成的膜状软骨细胞复层结构。图中可见明显的软骨细胞及其分泌的细胞外基质，并具有明显的软骨组织结构特征，由此可知，采用本发明制备的培养液能够维持软骨细胞表型并促进其细胞外基质的分泌。

具体实施方式

以下结合实例说明本发明技术方案的具体实施方式和使用效果。

实例中所使用的DMEM商用培养液和F12商用培养液均购自Gibco公司，细胞生长因子均购自Peprotech及Gibco、Sigma公司，脂类浓缩剂购自Gibco公司，其余试剂均购自Sigma公司。

实施例1、

将获得的人软骨组织采用酶消化法获取原代软骨细胞并计算细胞活率及数量，PBS清洗后分别采用培养液A(培养液A为DMEM和F12按照体积比1:1的混合培养液，再加入10%FBS)和本实例配制的无血清软骨细胞培养液进行重悬，按2×10⁴个/cm²接种至培养瓶中，置入培养箱在37℃、5％CO₂条件下培养；48~72h后半量换液，继续培养，之后每隔48h换液一次。无血清组和血清组的原代人软骨细胞48h内贴壁率均可达约60%，待软骨细胞汇合率达到50%左右，即可进行传代培养。

本实例使用的无血清培养液为：基础培养液是DMEM和F12按照体积比1:1的混合培养液；加入20g/L的葡聚糖搅拌溶解，再分别加入1mL/L的脂类浓缩剂、50mg/L的丙酮酸钠、2μM的T3、5mg/L的氢化可的松、0.1μg/L的地塞米松、5μg/L的亚硒酸钠、30μM的β-巯基乙醇、75mg/L的V_C、500μg/mL的谷氨酰胺、5μg/L的bFGF、5μg/L的EGF、18μg/L的TGF-β、12μg/L的PDGF、2μg/L的BMP、10mg/L的转铁蛋白、50μg/L的IGF、50μg/L的GH、10nM的孕酮、20μM的丁二胺、1%的非必需氨基酸；用Na₂CO₃/HCI溶液调pH至7.2，定容后用0.22μm滤膜过滤除菌，4℃保存。

原代软骨细胞在本实例无血清培养液培养条件和在含血清的培养液条件下均能够正常贴壁，贴壁细胞形态良好，成多边形，细胞轮廓清晰，立体感较强，无血清培养条件下的细胞贴壁率与含血清组均能达到80%左右（参见图1），说明本实例配置无血清培养液能够达到同有血清培养液一致的培养效果。

实施例2、

将获取的人软骨组织采用酶消化法过夜消化，离心收集原代软骨细胞，采用培养液A(培养液A为DMEM和F12按照体积比1:1的混合培养液，再加入10%FBS)悬浮后，按照0.5x10⁴/cm²细胞密度接种至细胞培养瓶中，置于37℃、5％CO₂条件培养箱进行培养；待细胞达到60%~80%汇合时采用胰蛋白酶消化法进行传代，第一组采用培养液A继续培养，第二组采用本实例的无血清培养液进行培养，分别在传至第3代和第6代时进行观察。

本实例使用的无血清培养液为：基础培养液是DMEM和F12按照体积比1:1的混合培养液；加入6g/L的葡聚糖搅拌溶解，再分别加入0.5mL/L的脂类浓缩剂、75mg/L的丙酮酸钠、0.1μM的T3、0.05 mg/L的氢化可的松、0.5μg/L的地塞米松、1μg/L的亚硒酸钠、25μM的β-巯基乙醇、50mg/L的V_C、100μg/mL的谷氨酰胺、50μg/L的bFGF、20μg/L的EGF、4μg/L的TGF-β、2μg/L的PDGF、1μg/L的BMP、5mg/L的转铁蛋白、10μg/L的IGF、100μg/L的GH、5nM的孕酮、50μM的丁二胺、1%的非必需氨基酸；用Na₂CO₃/HCI溶液调pH至7.2，定容后用0.22μm滤膜过滤除菌，4℃保存。

在培养过程中发现，第一组和第二组的传代软骨细胞均能够正常贴壁，贴壁后增长效率及细胞形态差异较大，当两组软骨细胞培养至第3代时，通过观察可见，第一组（血清组）细胞增殖缓慢，形态较差，有分化为成纤维细胞趋势，细胞立体感较差，质核不清晰，第二组（无血清组）软骨细胞轮廓清晰，立体感及折光率强，细胞呈多边形，软骨细胞表型维持良好（参见图2C和图2D）；当传至第6代时，第一组软骨细胞出现明显去分化现象，细胞成纤维化，胞质不明显，细胞呈现平铺状，增殖速率明显降低，第二组细胞轮廓清晰，成多边形，立体感较强，具有明显软骨细胞特征，细胞在传代过程中能够保持较强的增殖效率，表型维持良好，明显优于有血清组（参见图2E和图2F）。

实施例3、

将获取的人软骨组织采用酶消化法过夜消化，离心收集原代软骨细胞，采用培养液B(培养液B为DMEM基础培养液，再加入10%FBS)悬浮后，按照0.5x10⁴/cm²细胞密度接种至细胞培养瓶中，置于37℃、5％CO₂条件培养箱进行培养；待细胞达到60%~80%汇合时采用胰蛋白酶消化法进行传代，采用本实例的无血清培养液进行培养。

本实例使用的无血清培养液为：基础培养液是DMEM作为基础培养液；加入15g/L的葡聚糖搅拌溶解，再分别加入0.1mL/L的脂类浓缩剂、55mg/L的丙酮酸钠、0.5μM的T3、0.1mg/L的氢化可的松、5μg/L的地塞米松、2μg/L的亚硒酸钠、25μM的β-巯基乙醇、100mg/L的V_C、50μg/mL的谷氨酰胺、25μg/L的bFGF、10μg/L的EGF、10μg/L的TGF-β、5μg/L的PDGF、5μg/L的BMP、1mg/L的转铁蛋白、100μg/L的IGF、125μg/L的GH、20nM的孕酮、75μM的丁二胺、1%的非必需氨基酸；用Na₂CO₃/HCI溶液调pH至7.2，定容后用0.22μm滤膜过滤除菌，4℃保存。

采用本实例的无血清软骨细胞培养液培养的软骨细胞，细胞轮廓清晰明显，呈多角形形态，局部细胞分布较多时，呈“铺路石”状，细胞传至第8代时，细胞表型仍能够维持，细胞外基质分泌能力较强，在传代细胞100%汇合后继续培养，形成的膜状软骨细胞复层结构，具有明显的软骨组织结构特征（参见图3）。

Claims

1.一种无血清软骨细胞培养液，是由基础培养液与外源添加物组成，其特征在于，基础培养液是指DMEM培养液或F12培养液或DMEM培养液与F12培养液按照体积比为1:1的混合培养液；外源添加物为：葡聚糖为5～20g/L，脂类浓缩剂为0.1~1mL/L，丙酮酸钠为50~100mg/L，三碘甲状腺氨酸为0.01～2μM，氢化可的松为0.05～5mg/L，地塞米松为0.1～10μg/L，亚硒酸钠为1～5μg/L，β-巯基乙醇为25～50μM，维生素C为10～100mg/L，谷氨酰胺为50～500μg/mL，转铁蛋白为1～20 mg/L，胰岛素或胰岛素样生长因子为5～100μg/L，生长激素为10~200μg/L、孕酮为5~20nM，丁二胺为20~100μM，非必需氨基酸为1%，细胞生长因子添加成分为：碱性成纤维生长因子为5～50μg/L，表皮生长因子为0.5～25μg/L，转化生长因子为1～25μg/L，骨形成蛋白为1~10μg/L，血小板衍生生长因子为1～20μg/L。

2.根据权利要求1所述的无血清软骨细胞培养液，其特征在于，所述的细胞生长因子添加物为：碱性成纤维生长因子为10～25μg/L，表皮生长因子为10～20μg/L，转化生长因子为5～15μg/L，骨形成蛋白为5~10μg/L，血小板衍生生长因子为5～10μg/L。