CN101831403B - 体外扩增人脐带胎盘间充质干细胞的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种体外扩增人脐带胎盘间充质干细胞的方法，采用人脐带胎盘作为细胞来源，利用II型胶原酶消化组织，离心，弃去上清液，用D-Hank’s液洗涤3次后，即获得单细胞悬液，接种于培养板或培养瓶中，24-72小时细胞(P0)贴壁后全量换液，待细胞达到80％-90％融合时传代1次(P1)，然后按最低1400个细胞/cm²的密度将细胞接种至滚瓶中，对比不同培养体系间充质干细胞的生长状态、细胞倍增时间和成集落能力，获得了高效、稳定的扩增培养体系，并利用该最佳扩增体系在滚瓶中大规模扩增间充质干细胞。

Description

体外扩增人脐带胎盘间充质干细胞的方法

技术领域

本发明涉及一种高效、大规模扩增间充质干细胞的方法，尤其是一种体外扩增人脐带胎盘间充质干细胞的方法。

技术背景

间充质干细胞(Mysenchymal Stem Cell，MSC)作为一种成体干细胞广泛存在于全身多种组织中，可在体外大量培养扩增，并在特定条件下向内、中、外三个胚层来源的细胞分化。MSC是继胚胎干细胞和造血干细胞之后的又一科研热点，已成为二十一世纪治疗多种系统疾病的实用型干细胞，它在造血细胞移植、器官移植、骨和软骨组织修复、心肌梗死和肝脏损伤中具有潜在的应用价值，某些治疗措施已经进入临床试用阶段。近年来已逐步应用于心脑血管疾病、肝病、骨和肌肉衰退性疾病、脑及脊髓神经损伤、老年痴呆、系统性红斑狼疮和硬皮病等疾病的治疗，具有广泛的临床应用前景。

脐带是连于胚胎脐部与胎盘间的索状结构，其中富含造血、间充质、神经及内皮等多种干/祖细胞。与骨髓来源的间充质干细胞相比较，人脐带胎盘来源间充质干细胞的优势在于：收集过程相对简单、无创、胎盘屏障使脐带受病毒与细菌污染少、脐血免疫系统的原始性降低了移植后受体发生排斥反应的机率，在体外培养体系中能快速增殖，传代后3～5天能增殖4～5倍，传代培养10代以上细胞可增加5～10倍，且增殖速度无明显降低，传代稳定。此外，人脐带胎盘间充质干细胞不存在伦理学问题、较强的归巢能力和易于基因转染等优点使其成为实施细胞治疗的理想细胞，并在肿瘤的靶向治疗、组织工程和组织修复方面具有骨髓来源的间充质干细胞和其他成体干细胞无可比拟的优越性。

目前美国国家食品药品管(Food and Drug Administration，FDA)已经批准间充质干细胞输注进入Ⅱ期临床试验，以期减轻异基因骨髓移植中的移植物抗宿主反应(Graft versus Host Reaction，GVHR)。此外，FDA批准的有关MSC细胞治疗的临床方案包括：①MSC静脉输注治疗Crohn病；②MSC局部应用治疗牙周疾病；③MSC静脉输注治疗心肌梗死；④MSC修复半月板及⑤G-CSF动员的骨髓MSC治疗心肌梗塞等。国内的临床研究中适应证的选择更为广泛，利用自体或异体MSC预防或治疗GVHD、心肌梗死、骨或软骨缺损、糖尿病足坏疽、肝脏损伤或股骨头坏死等，多家单位的研究已经进入临床试用阶段。但是，必须指出的是，有些临床试验尚需要充分的理论支持，有关间充质干细胞体外培养体系的标准化以及体内植入存活及分化潜能等，仍需要通过严谨的实验进一步阐明。但由于初始接种细胞成分不同，培养体系组成的差异诸如血清浓度及血清种类以及生长因子的添加与否及添加成分等，这些均可影响最终细胞产品的纯度和具体功能。

鉴于MSC在细胞治疗、基因治疗以及组织工程中的应用前景，其大规模、规范化培养和扩增成为应用的关键。动物细胞大规模培养技术是利用动物细胞生产基因工程药物、抗体药物、疫苗、基因治疗药物等产品的一项关键技术，其基础是细胞培养基。近年来，随着现代生物制药技术的快速发展，细胞培养基作为细胞生长的物质基础，被广泛应用于细胞生物学科和医学研究的各个领域。同时，为了实现规模化、产业化，达到精密控制生产过程、降低生产成本、便于下游工作及提高生物制品的质量以及安全性，使得不断优化细胞培养技术、优化和选择适宜的细胞培养基显得尤为重要。目前所报道的脐带间充质干细胞体外培养条件及培养效率不尽相同，尚缺乏统一标准。而且由于不同来源的间充质干细胞生物学特征尚有一定差异，因此建立人脐带胎盘间充质干细胞简便、高效的培养体系十分必要。

查阅大量国内外文献，用于人脐带胎盘间充质干细胞体外培养的体系包括低糖DMEM、DMEM/F12、间充质干细胞基础培养基和无血清培养体系。(1)DMEM培养基是为小鼠成纤维细胞设计的，含各种氨基酸、维生素和葡萄糖。最初的配方中葡萄糖含量为1.0g/L(低糖型)，后来为了某些细胞的生长需要，将葡萄糖含量又调整为4.5g/L(高糖型)。高糖型有利于细胞停泊于一个位置生长，适合于高密度悬浮细胞的培养。低糖型适于生长慢、依赖性贴壁细胞的培养。有研究表明目前常用的含10％胎牛血清的低糖DMEM不利于维持间充质干细胞的干细胞特性，在多次传代后发现其细胞粘附面积变大，铺展开呈不规则型，增殖能力及分化潜能均降低，细胞老化明显。(2)DMEM/F12是由DMEM和F12按1∶1混合而成的。其中F12的成分和DMEM有所不同，它与F10相比含有更多的维生素，肌醇，氨基酸，与DMEM混和后成分更为多样而均衡，营养成分丰富，且可以使用较少血清，或作为无血清培养基的基础培养基，适于原代细胞的培养。因此在收获脐带间充质干细胞时可以使用DMEM/F12培养液，但不适合其大规模的扩增使用。(3)目前广泛应用的人MSC培养体系多采用胎牛血清，它含有补体成分，残存的胎牛血清可能会导致患者的不良反应。在体外培养过程中，细胞的吞噬作用使牛血清中的蛋白分子细胞内在化，即使通过洗涤也不能清除牛血清蛋白，从而干扰治疗效果及其评估。为此，有人尝试应用已知人源或动物来源的蛋白或激素代替动物血清进行人MSC培养，结果发现在无血清体系中，细胞能保持其多向分化特性，增殖速度较传统体系下更为旺盛，此外，它能增加确定性、减少后期纯化和下游加工，提高制品安全性和质量。但是，血清替代品中多含有牛血清白蛋白，它是主要蛋白质成分之一，无血清培养体系虽能保证细胞培养批次及实验室间的稳定性，仍不能从根本上解决异种蛋白内在化问题。在无血清培养液中，MSC若不添加细胞因子将很难生长，可能与血清诱发MSC增殖与分化相关的胞内Ca²⁺流动有关。(4)MesenPRO RS^TM Medium的基础培养基及生长因子是专门为人类MSC体外培养所设计的、适合其生长的培养基。包含必需和非必需氨基酸、维生素、有机和无机化合物、激素、生长因子、微量矿物质和胎牛血清。这些辅助物质可帮助细胞的克隆化培养及维持某些特殊细胞系的生长，该培养基缓冲体系为重碳酸盐，在含体积分数为5％CO₂的细胞培养箱中pH值能准确被平衡为7.4，此pH值为MSC生长的最适值。该培养基的配方能够选择性的促进正常人类MSC体外培养中的增殖和生长，并为其达到最理想营养平衡状态提供数量上和质量上的保证。但其配方中现有成份组成比例适于在培养瓶中进行，不能满足大规模滚瓶培养的需要。

目前，国内建立了为数不多的几家间充质干细胞库，但是均尚未达到规模化生产。因此建立一种大规模扩增人脐带胎盘间充质干细胞的方法势在必行。目前国内用于生物制品大规模生产的培养容器主要是滚瓶(roller bottle)。滚瓶培养具有结构简单，投资少，技术成熟，重复性好，与传统静止单层培养相比，滚瓶具有以下五大优点：(1)旋转培养可形成的细胞单层面积大，单位面积所需培养基少，便于质量控制；(2)轻微的转动可以防止培养液中形成的某些成分对细胞生长可能产生的影响，使细胞交替接触培养液和空气，利于细胞充分吸收营养和进行代谢；(3)细胞接种在旋转的滚瓶中，大部分时间仅覆盖一薄层培养液，滚瓶内保持有相当大的上方空间，以维持合适的氧和pH水平，有利于细胞呼吸和发生氧化还原作用，有利于细胞的生长繁殖；(4)若需增加细胞产量，除可在增加滚瓶的数量和容积外，使滚瓶直径尽可能小，此时表面面积可因直径或长度的倍增而成倍增加；(5)微生物污染是大规模细胞培养的主要危险。滚瓶培养在显微镜下可直接观察到细胞的形态，这样有利于研究形态学的变化，如病毒感染后出现的细胞病理性改变(CPE)，放射线或抗癌药物引起的细胞形态变化及细胞诱导分化的形态改变等。

就大规模培养而言，高接种量就意味着在培养开始前要制备大量的种子细胞，这不仅使操作复杂化，而且细胞的生理状态和产物表达量也常常会因种子细胞制备过程中的连续传代扩增而有所下降(即所谓的“代次效应”)。基于上述滚瓶培养特点，可以实现在较低的细胞接种密度条件下获得较高的细胞产量的目标。目前商业上常见尺寸的滚瓶为850cm²和1750cm²。但是太大尺寸的滚瓶操作起来不是十分方便，而且微生物安全是细胞培养的关键环节。因此将滚瓶表面制成带皱纹的表面或插入多层隔板。以增加表面积。在细胞培养的过程中，包括接种、传代、收获细胞或生产细胞制剂，和其它细胞处理，滚瓶培养需要相对高水平的技巧，此外，还需考虑各种影响细胞生长的因素，包括接种参数(例如滚瓶装置的转动速度及培养基体积)，培养条件(最初的细胞接种密度，单位面积加入的培养基体积和培养时间)。这些因素限定着在大规模培养条件下细胞的同质性。同时，在大规模的滚瓶培养条件下的细胞需要检测其特定的表面标志物和细胞周期，这一点在细胞治疗中十分必要。

综上所述，应用高效、稳定的培养体系在滚瓶中大规模扩增间充质干细胞是满足临床需求的充分且必要条件。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，提供一种在滚瓶中高效、大规模体外扩增人脐带胎盘间充质干细胞的方法。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种体外扩增人脐带胎盘间充质干细胞的方法，包括脐带胎盘的机械切割，胶原酶消化，间充质干细胞的分离培养，间充质干细胞的体外扩增，所述间充质干细胞的体外扩增在滚瓶中进行，所用的培养体系为：所述培养体系，按体积百分比浓度包括如下成份：基础培养基占82-87％，生长因子占2％，FBS占10-15％，L-谷氨酰胺占0.99％，硫酸庆大霉素占0.01％。

所述基础培养基和生长因子均为MesenPRO RS^TM Medium。

所述的体外扩增人脐带胎盘间充质干细胞的方法，具体包括以下步骤：

1)将检测合格的脐带胎盘经过机械切割后，经过Ⅱ型胶原酶消化为单细胞悬液，洗涤去除胶原酶残留，将细胞悬液接种于培养瓶或培养板中；

2)获得的原代细胞待24-72小时细胞贴壁后全量更换培养液，2周后增长速度加快，成为形态相对均一的梭形细胞，呈平行排列生长或旋涡状生长；

3)待细胞达到80-90％融合时，经TrypLE^TM Select(GIBCO)传代1次，按1400-2000个细胞/cm²的密度将细胞接种至滚瓶中，在上述培养体系中体外扩增；

4)待细胞达到80-90％融合时，经胰酶消化，将单细胞悬液接种至滚瓶中，经过初期融合和细胞倍增，进行大规模的体外扩增。

所述的步骤4)中滚瓶培养系统细胞倍增时间为24-48h。

所述的滚瓶培养系统在细胞贴壁前使用的转数为10-15转/小时，转动2-4小时；贴壁后减少转动速度至5-10转/小时。

所述滚瓶的直径为275mm，高度120mm，表面积为850cm²。

所述滚瓶在接种细胞前不需基质的包被。

本发明的有益效果是：本发明方法制备的间充质干细胞在5-6天的培养周期中，细胞量可增殖20倍，可得到大量富有活性的间充质干细胞，并能够长时间保存而不失其活性，且操作简单易行，并且经过流式细胞仪检测、细胞周期检测以及体外分化实验鉴定，获得的间充质干细胞纯度和细胞活性较高，具有良好增殖潜力，并且使用滚瓶作为扩增介质，结合滚瓶在细胞培养上的优势-初始接种细胞数量少、单位面积所需培养液少及细胞在滚瓶中良好的生长增殖能力，可快速建立细胞库，成本低廉，可直接用于科学实验研究和临床上的辅助治疗，富有应用前景。

附图说明

图1是原代细胞贴壁前、后及传代1次(P1)后的细胞形态。其中，A为原代细胞贴壁前的形态，B为贴壁后的形态，C为原代细胞经过1次传代后的形态。

图2为本发明在最佳滚瓶培养条件下大规模扩增的人脐带胎盘间充质干细胞。A为MesenPRO RS^TM Medium培养的细胞经过胰酶消化后，细胞可以完全贴壁且细胞倍增时间较短；B为MesenPRO RS^TM Medium培养的细胞初期融合时间短，单位面积下细胞密度较高。

图3为本发明在最佳滚瓶培养体系中扩增的间充质干细胞(P4)的形态及免疫表型检测和细胞周期检测。其中，A为在扩增介质滚瓶中获得的形态均一、平行排列生长或旋涡状生长的梭形间充质干细胞；B为免疫表型检测，阳性标记物的表达均在99％以上，阴性标记物的表达均在1％以下，表明所扩增的细胞为纯度较高的间充质干细胞；C为细胞周期检测，处于G0/G1期的细胞在94％以上，表明其具有强大的增殖潜能。

图4为本发明经过最佳滚瓶培养体系中扩增的间充质干细胞与75cm²培养瓶在细胞产量上的差异。其中，1表示为75cm²培养瓶，2表示为850cm²滚瓶；A为1瓶75cm²培养瓶和1瓶850cm²滚瓶收获的细胞数量的对比；B为75cm²培养瓶和850cm²滚瓶在相同的生长表面积条件下收获的细胞数量的对比。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步的说明，但本发明并不受限于下述实施例。

实施例1：

人脐带胎盘间充质干细胞的制备：

经产妇知情同意，采集足月剖宫产健康胎儿脐带或胎盘。脐带或胎盘采集之前产妇需做艾滋病病毒抗体、乙型肝炎病毒抗体、丙型肝炎病毒抗体、梅毒螺旋体抗体、谷丙转氨酶、支原体等检测，全部合格以确保安全性后方可采集。

1、脐带或胎盘自手术台取下后，浸入含抗生素的0.9％生理盐水中，4℃保存；

2、在操净台内取出脐带或胎盘，用D-PBS冲洗净表面残余血液；

3、将脐带或胎盘剪成1mm³大小的组织块后放入200mL蓝盖试剂瓶，加入质量/体积比为0.1％的Ⅱ型胶原酶30mL，置于恒温振荡仪内持续消化6h；

4、100目筛网过滤收集细胞；

5、加入D-Hank’s液冲洗细胞3次，用含体积分数为10％胎牛血清的DMEM/F12重悬细胞，调整细胞密度为(4.8×10³～1×10⁴)/cm²，接种于6孔板内，于37℃、体积分数为5％的CO₂孵箱内培养，24-72h后换液，图1。

实施例2：

MesenPRO RS^TM Medium培养体系的优化

作为人脐带胎盘间充质干细胞体外培养的最佳培养体系MesenPRO RS^TM Medium，考虑到以下因素，我们在原有培养基的基础上补加终浓度10％-15％FBS、2mM L-谷氨酰胺及硫酸庆大霉素：(1)胎牛血清含有丰富的细胞生长所必要的营养成分。它在细胞接种后的作用大致有以下几点。①保护细胞免受损伤；②促进细胞黏附；③促进细胞增殖：多种生长因子，尤其血小板促生长因子能促进细胞分裂，是主要的促进细胞增殖因子。另外，血清中的胰岛素，能促进细胞摄取葡萄糖和氨基酸，与促细胞分裂有关；类胰岛素生长因子，能与细胞表达的胰岛素受体结合，从而具有与胰岛素相同的作用；促生长激素，具有细胞增殖的效应。胎牛血清中的氢化可的松，可能兼有促细胞贴附和增殖并诱导其分化作用。(2)L-谷氨酰胺在细胞培养时是重要的，脱掉氨基后，L-谷氨酰胺可作为培养细胞的能量来源，参与蛋白质的合成和核酸代谢；(3)体外培养细胞缺乏抗感染能力，所以防止污染是决定培养成功或失败的首要条件。在一切操作中最大可能地保证无菌的条件下，仍然需要补加一定量的硫酸庆大霉素。

因此，作为优化，MesenPRO RS^TM Medium补加FBS至终浓度10-15％，L-谷氨酰胺(200mM)至终浓度2mM(0.99％)，硫酸庆大霉素(4万U/ml)至终浓度80U/ml(0.01％)，所述浓度为体积百分比浓度。我们将原有的MesenPRO RS^TM Medium和经过优化的MesenPRO RS^TM Medium进行体外生长对比实验：

1)将待原代培养的脐带胎盘间充质干细胞贴壁并传代1次(P1)后，在6孔板中进行培养体系的生长对比实验；

2)采用连续适应法使细胞由原代培养时使用的DMEM/F12分别逐步过渡到MesenPRORS^TM Medium和优化的MesenPRO RS^TM Medium培养体系，即用含体积分数为10％胎牛血清的DMEM/F12培养基和相应的上述两种培养基按1∶1(v∶v)混合培养细胞，通过下列混合培养基的方式，连续几代减少当前培养基的量，即1∶2，1∶4，1∶16和100％替代培养基，每次适应改变培养体系时，传代细胞一两次。

3)细胞形态学观察和细胞倍增时间测定

结果发现经过优化的MesenPRO RS^TM Medium培养的细胞仅需较短的初期融合时间和细胞倍增时间，在5-6天的培养周期中，细胞量可增殖20倍，可得到大量富有活性的脐带胎盘间充质干细胞，并能够长时间保存而不失其活性，且具有较强的克隆形成能力，更适于人脐带胎盘间充质干细胞的体外扩增。

实施例3：

在最佳滚瓶培养条件下大规模扩增人脐带胎盘间充质干细胞

1、使用MesenPRO RS^TM Medium培养体系培养的间充质干细胞待细胞密度达到80％-90％时，胰酶消化，制备单细胞悬液；

2、将悬液接种于表面积为850cm²的滚瓶中，细胞总数为1×10⁶(1400个细胞/cm²)，加入MesenPRO RS^TM Medium培养液至100ml，垂直晃动悬液后再水平缓慢转动滚瓶1周，目的是使细胞平均分布于滚瓶，然后将滚瓶放置于INCUDRIVE D-I CO₂培养箱转动系统，为了使最佳温度稳定，尽可能使滚瓶位于培养箱后方，在4个位置上以较宽的轴向距离驱动；

3、在37℃下，以12转/小时，转动2小时，使细胞均匀贴壁，见图2A；

4、减少转动速度至5转/小时并连续培养；

5、2-3天后即可达到90％融合，见图2B，加入10ml胰酶后将滚瓶放回上述转动系统，待转动1周后即可取出，加入20ml 10％FBS的培养液终止消化；

6、离心后弃上清，加入MesenPRO RS^TM Medium培养液继续培养，即转入扩大再培养。

由于间充质干细胞对生长环境的改变较为敏感，细胞容易成团，因此，为维持细胞正常均匀生长，我们在操作过程中，使细胞均匀分散贴壁、维持稳定的温度、酸碱度和适当的转动速度。

对于按照本发明上述方法制备的间充质干细胞，按照“国际细胞疗法协会”(ISCT)制定的标准进行生物学表型鉴定，表现出以下技术特征：

1)在最佳培养体系条件下细胞贴壁生长，可形成CFU-F集落，形态相对均一，呈平行排列生长或旋涡状生长的梭形细胞；

2)表达粘附分子受体标记物CD29、CD44，间质细胞标记CD73、CD105，干细胞标记物CD90；而不表达内皮细胞标记物CD31和造血干细胞标志CD34，也不表达HLA-DR；

3)体外可诱导分化为成骨细胞、肝系细胞及心肌细胞。

实施例4：

在最佳滚瓶培养条件下扩增的人脐带胎盘间充质干细胞的细胞特征

1、细胞形态学观察

MesenPRO RS^TM Medium培养的间充质干细胞连接紧密，可形成CFU-F集落，形态相对均一，呈平行排列生长或旋涡状生长的梭形细胞，见图3A。

2、细胞倍增时间测定

细胞倍增时间是指有增殖能力的细胞通过有丝分裂使细胞增加一倍所需要的时间。体外传代培养细胞的倍增时间可以通过测量计算而得。细胞倍增时间因细胞种类而异，对同种细胞而言其倍增时间是相对恒定的。因而细胞倍增时间直接反映细胞增殖的快慢，当环境因素使细胞倍增时间发生改变时，则意味着细胞周期进程发生了改变。因此，细胞倍增时间也是观察细胞周期进程变化的重要参数。况且，此参数的测定简而易行，更有实际意义。

将第2-8代细胞以相同的细胞密度(1400个细胞/cm²)接种于滚瓶中，待细胞贴壁后加入上述三种培养体系。每隔24h用胰酶消化1个滚瓶，收集细胞计数。用Patterson公式计算对数生长期细胞倍增时间，(Td＝t×[lg2/lg(Nt/No)])，t为细胞数由No增至Nt所用时间(h)，No为首次记下的细胞数，Nt为t时间后的细胞数。一般No在接种细胞24小时后进行。应用该公式我们计算出脐带胎盘来源的间充质干细胞在MesenPRO RS^TM Medium中的细胞倍增时间为42小时。

综上所述，使用MesenPRO RS^TM Medium培养的间充质干细胞仅需较短的初期融合时间和细胞倍增时间，且具有较强的克隆形成能力，更适于脐带胎盘间充质干细胞的体外扩增。无论从细胞培养角度还是从产业化角度看，MesenPRO RS^TM Medium是理想的培养体系。

3、免疫表型检测CD29，CD44，CD73，CD90，CD105，CD31，CD34，HLA-DR(见表1)。将第4-7代人脐带胎盘来源的间充质干细胞接种于滚瓶中，待细胞达到80-90％融合时使用10ml胰酶消化，瓶子以12转/小时在滚动系统上转动1周后停止消化，向瓶中加入20-30ml含10％FBS的培养基，将细胞悬液转入50ml离心管中并以1000rpm离心3分钟。离心之后，弃掉上清，PBS洗涤2次，分成每管1×10⁶细胞，第一管为空白对照(只含间充质干细胞)，用于调节流式细胞仪的电压，第二管加入同型对照抗体(PE-MOUSE IgG1/FITC-MOUSE IgG1/APC-Mouse IgG1κ)10μl，其余管中加入其它相应抗体10μl，混匀，4℃避光孵育30分钟，PBS洗涤1次，离心后弃上清，加入500μl PBS重悬，混匀，即可上机(流式细胞仪FACSAria，BD公司)检测，见图3B。细胞免疫表型为：CD29，CD44，，CD73，CD90，CD105为阳性标记，CD31，CD34，HLA-DR为阴性标记(见表2)。

表1本发明优选检测人脐带胎盘间充质干细胞的表面标志物

序号    物品名称                    标记     Cat.No.     数量      来源

1       PE Mouse Anti-Human CD29    阳性     MCA1949PET  25TESTS   serotec

2       APC Mouse Anti-Human CD44   阳性     559942      100tests  BD公司

3       PE Mouse Anti-Human CD73    阳性     550257      100tests  BD公司

4       FITC anti-human CD90        阳性     MCA90FT     25μg     serotec

5       PE labeled anti-human CD105 阳性     MCA1557PET  25TESTS   serotec

6       FITC labeled anti-human CD31阴性     MCA1738FT   25μg     serotec

7       APC Mouse Anti-Human CD34   阴性     555824      100tests  BD公司

        FITC labeled anti-human HLA 阴性     MCA71F      1ml       serotec

8

        DR

9       MOUSE IgG1：RPE             同型对照 MCA928PE    100TESTS  serotec

10      MOUSE IgG1：FITC            同型对照 MCA928F     100TESTS  serotec

11      APC-Mouse IgG1κ            同型对照 555751      100tests  BD公司

表2人脐带胎盘间充质干细胞表面标志物的检测结果

4、细胞周期检测

消化体外扩增的第5代间充质干细胞，离心弃上清后，300μl PBS制备1×10⁶细胞悬液，逐滴加入-20℃冰预冷的700μl无水乙醇，漩涡振荡仪上混悬，4℃固定1-2小时，离心弃上清后，加入500μl PBS(含50ug/mL碘化丙啶溶液，100ug/mL RNase A)，室温避光孵育30分钟，离心弃上清后PBS洗涤1次，500μl PBS重悬，混匀，即可上机检测。流式细胞仪检测细胞周期显示，第4代细胞中约有94％处于G0/G1期，结果表明，体外培养的间充质干细胞具有干细胞的生长特征，大部分细胞处于静止期，见图3C。

5、细胞的成骨及成心肌分化潜能及分化后鉴定

消化体外扩增的第4-6代间充质干细胞，以5×10⁴细胞总数接种于6孔板中，每孔加2ml上述MesenPRO RS^TM Medium培养液。在细胞达到60％-80％融合时，更换相应的诱导分化培养基。

5.1成骨诱导分化

诱导分化培养基为含有100nmol/L的地塞米松，10mmol/L的β-甘油磷酸钠，50μmol/L维生素C和10％FBS的DMEM/F12培养液，每隔2天换液1次，培养21天，PBS洗涤细胞1次，70％乙醇固定10分钟，行碱性磷酸酶定性检测、茜素红染色、丨型胶原的免疫荧光检测、四环素荧光检测及Von Kossa染色，鉴定钙结节的产生。显微镜下观察，碱性磷酸酶染色及茜素红染色可见细胞浆中有大量的钙沉积，丨型胶原和四环素的荧光检测可见在形成钙结节的位置有红色荧光信号，Von Kossa染色可见黑色矿化物沉积。

5.2成心肌诱导分化

诱导分化培养基为含有10μmol/L的5-氮胞苷和10％FBS的DMEM/F12培养液，加入诱导液24小时后，立即更换为10％FBS的DMEM/F12培养液，以后每隔2天换液1次，培养8周。提取细胞的RNA，进行real-time PCR检测人心肌转录因子GATA4和NKX2.5，心肌肌浆网钙ATP酶，肌钙蛋白I，α-横纹肌肌动蛋白的表达。结果表明这些基因均有一定程度的表达。

综上所述，本发明的内容并不局限在上述的实施例中，相同领域内的有识之士可以在本发明的技术指导思想之内可以轻易提出其他的实施例，但这种实施例都包括在本发明的范围之内。

Claims (2)

1.一种体外扩增人脐带胎盘间充质干细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)将检测合格的脐带胎盘经过机械切割后，经过质量体积比为0.1％的II型胶原酶消化为单细胞悬液，洗涤去除胶原酶残留，将细胞悬液接种于培养瓶或培养板中；

2)获得的原代细胞待24-72小时细胞贴壁后全量更换培养液，2周后增长速度加快，成为形态相对均一的梭形细胞，呈平行排列生长或旋涡状生长；

3)待细胞达到80-90％融合时，经TrypLE^TM Select(GIBCO)传代1次，按1400-2000个细胞/cm²的密度将细胞接种至滚瓶中，在培养体系中体外扩增；

4)待细胞达到80-90％融合时，经胰酶消化，将单细胞悬液接种至滚瓶中，经过初期融合和细胞倍增，细胞倍增时间为24-48h，进行大规模的体外扩增；

所述培养体系，按体积百分比浓度包括如下成份：基础培养基占82-87％，生长因子占2％，FBS占10-15％，L-谷氨酰胺占0.99％，硫酸庆大霉素占0.01％，其中基础培养基和生长因子均为MesenPRO RS^TM Medium；

所述滚瓶的直径为275mm，高度120mm，表面积为850cm²，滚瓶培养系统为初始接种细胞数为1400个细胞/cm²，加入MesenPRO RS^TM Medium培养液至100ml；

所述的滚瓶培养系统在细胞贴壁前使用的转数为10-15转/小时，转动2-4小时；贴壁后减少转动速度至5-10转/小时。

2.根据权利要求1所述的体外扩增人脐带胎盘间充质干细胞的方法，其特征在于，所述滚瓶在接种细胞前不需基质的包被。

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