CN102796701A - 体外3d无支架悬浮培养扩增人脐带间充质干细胞的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种体外3D无支架悬浮培养扩增人脐带间充质干细胞的方法，包括以下步骤：对检测合格的脐带组织进行清洗；剪切；接种于细胞培养皿中；不加培养液于培养箱内静置培养；加入完全培养基培养；加入胰酶-EDTA溶液进行消化处理；将消化液进行离心，沉淀得到脐带间充质干细胞；接种至微孔板中，加入完全培养基，置于培养箱内静置培养；转移至搅拌生物反应器中，连续搅拌培养；消化处理得到脐带间充质干细胞单细胞悬液；重复培养，实现脐带间充质干细胞的扩大再培养。本发明因不受培养表面积限制而实现了细胞体外扩增最大化，能统一控制各聚集体的生长进度，保证营养的最大吸收度，而且还节省了附加材料的成本。

Description

体外3D无支架悬浮培养扩增人脐带间充质干细胞的方法

技术领域

本发明涉及一种培养扩增间充质干细胞的方法，尤其涉及一种体外3D无支架悬浮培养扩增人脐带间充质干细胞的方法。 

背景技术

间充质干细胞（Mysenchymal Stem Cell，简称MSC）作为一种成体干细胞广泛在于全身多种组织中，可在体外大量培养扩增，并在特定条件下向内、中、外三个胚层来源的细胞分化。MSC是继胚胎干细胞和造血干细胞之后的又一科研热点，已成为二十一世纪治疗多种系统疾病的实用型干细胞，它在造血细胞移植、器官移植、骨和软骨组织修复、心肌梗死和肝脏损伤中具有潜在的应用价值，某些治疗措施已经进入临床试用阶段。近年来已逐步应用于心脑血管疾病、肝病、骨和肌肉衰退性疾病、脑及骨髓神经损伤、老年痴呆、系统性红斑狼疮和硬皮病等疾病的治疗，具有广泛的临床应用前景。 

脐带是连于胚胎脐部与胎盘间索状结构，其中富含造血、间充质、神经及内皮等多种干/祖细胞。与骨髓来源的间充质干细胞相对比较，人脐带间充质干细胞的优势在于：收集过程相对简单、无创、胎盘屏障使脐带受病毒与细菌污染少、脐血免疫系统的原始性降低了移植后受体发生排斥反应的机率，在体外培养体系中能快速增值，传代后3-5天能增值4-5倍，传代培养10代以上细胞可增加5-10倍，且增速速度无明显降低，传代稳定。此外，人脐带间充质干细胞不存在伦理学问题、较强的归巢能力和易于基因转染等优点使其成为实施细胞治疗的理想细胞，并在肿瘤的靶向治疗、组织工程和组织修复方面具有骨髓来源的间充质干细胞和其他成体干细胞无可比拟的优越性。 

目前美国国家食品药品管（Food and Drug Administration，FDA）已经批准 间充质干细胞输注进入II期临床试验，以期减轻异基因骨髓移植中的移植物抗宿主反应（Graft versus Host Reaction，GVHR）。此外，FDA批准的有关MSC细胞治疗的临床方案包括：①MSC静脉输注治疗Crohn病；②MSC局部应用治疗牙周疾病；③MSC静脉输注治疗心肌梗死；④MSC修复本月板及⑤G-CSF动员的骨髓MSC治疗心肌梗塞等。国内的临床研究中适应证的选择再为广泛，利用自体或异体MSC预防或治疗GVHD、心肌梗死、骨或骨缺损、糖尿病足坏、肝脏损伤或股骨头坏死等，多家单位的研究已经进入临床试用阶段。但是，必须指出的是，有些临床试验尚需要充分的理论支持，有关间充质干细胞体外培养体系的标准化以及体内植入存活及分化潜能等，仍需要通过严谨的试验进一步阐明。但由于初始接种细胞成分等，这些均可影响最终细胞产品的纯度和具体功能。 

鉴于MSC在细胞治疗、基因治疗以及组织工程中的应用前景，其大规模、规范化培养抗体药物、疫苗、基因治疗药物等产品的一项关键技术，其基础是细胞培养基。近年来，随着现代生物制药技术的快速发展，细胞培养基作为细胞生长的物质基础，被广泛应用于细胞生物学科和医学研究的各个领域。同时，为了实现规模化、产业化，达到精密控制生产过程、降低生产成本、便于下游工作及提高生物制品的质量以及安全性，使得不断优化细胞培养技术、优化和选择适宜的细胞培养基显得尤为重要。目前所报道的脐带间充质干细胞体外培养条件及培养效率不尽相同，尚缺乏统一标准。而且由于不同来源的间充质干细胞生物学特征尚有一定差异，因此建立人脐带间充质干细胞简便、高效的培养体系十分必要。 

目前，通常采用酶消化法从脐带组织中获取MSCs，其原理为：细胞外含有多种胞外蛋白将细胞间粘连，可用胶原酶消化，使动物组织细胞间的胶原纤维 和胞外蛋白酶解，获得单个细胞。但胶原酶消化过度会导致细胞表面一些活性物质的改变进而影响细胞活力，对细胞具有损伤作用。对酶消化脐带组织的时间有一定的要求，消化时间过长会影响破坏所得细胞的活性，消化时间过短又会影响细胞得率，加之待消化的脐带组织又不是一个完全均一的体系，很难保证所有细胞消化程度的统一性，因此也很难把握最佳的消化时间，影响了所得细胞的数量和质量，进而影响以后的研究及使用。另由于现有胶原酶来源于动物内脏，应用酶消化法在分离培养时存在动物源蛋白和动物源病体的污染，增加了临床应用干细胞的风险。 

间充质干细胞具有自我增殖及多向分化潜能，因此具有广泛的临床应用价值。传统的体外MSC扩增培养通常都采用单层二维贴壁培养，但这种方法受表面积的限制，其扩增规模很难达到产业化要求，同时随着体外培养时间的延长，往往很容易丢失某些间充质干细胞的特性，并且二维培养采用的是不用载体的MSC的生镜，因而未能真实模拟人体内环境的相关行为及功能模式。因此建立一种大规模并有效模拟在体人脐带间充质干细胞的扩增方法势在必行。另外，目前国内用于生物制品大规模生产的培养容器主要是滚瓶（roller bottle），但滚瓶仍然受表面积的限制，也存在扩增规模很难达到产业化要求的问题。 

发明内容

本发明的目的就在于为了解决上述问题而提供一种不受培养表面积限制而实现了细胞体外扩增最大化的体外3D无支架悬浮培养扩增人脐带间充质干细胞的方法。 

为了达到上述目的，本发明采用了以下技术方案： 

本发明包括以下步骤： 

（1）对检测合格的脐带组织进行清洗； 

（2）将清洗后的脐带组织进行剪切； 

（3）将剪切后的脐带组织接种于细胞培养皿中； 

（4）不加培养液，直接将细胞培养皿放置于培养箱内静置培养； 

（5）向培养箱内加入完全培养基，培养至细胞汇合度达70%-85%； 

（6）加入胰酶-EDTA溶液进行消化处理后，再加入完全培养基，然后过滤，去除组织块，保留消化液； 

（7）将消化液进行离心，保留沉淀即脐带间充质干细胞； 

（8）将脐带间充质干细胞接种至微孔板中，加入完全培养基，离心旋转使脐带间充质干细胞集于微孔板的微孔中，将微孔板置于培养箱内静置培养； 

（9）将微孔内的均一聚集体转移至搅拌生物反应器中，连续搅拌培养； 

（10）收集脐带间充质干细胞聚集体，加入胰酶-EDTA溶液进行消化处理后，得到脐带间充质干细胞单细胞悬液； 

（11）重复步骤（8）-步骤（10），实现脐带间充质干细胞的扩大再培养。 

作为优选，所述步骤（1）中，清洗的方法为：用0.9%的生理盐水反复冲洗干净，去掉残留的血液，获得干净的脐带组织； 

所述步骤（2）中，剪切后的脐带组织的直径为0.5-1.5mm； 

所述步骤（4）中，培养箱内的温度为37℃，CO₂的浓度为5%，静置培养时间为30min； 

所述步骤（5）中，加入8-10mL完全培养基，培养至细胞汇合度达80%； 

所述步骤（6）中，胰酶-EDTA溶液的浓度为0.25%，消化处理时间为3-5min，加入完全培养基8-10mL，经200目滤网过滤； 

所述步骤（7）中，离心过程中，离心机的转速为1000rpm，离心时间为5min； 

所述步骤（8）中，将脐带间充质干细胞按2×10⁵个/cm²接种至微孔板中，每孔加入2mL完全培养基，在200g加速度下离心旋转5min，培养箱内的温度为37℃，CO₂的浓度为5%，静置培养时间为18小时； 

所述步骤（9）中，搅拌生物反应器的搅拌速度为30rpm，培养时间为7天，每三天换一次完全培养基； 

所述步骤（10）中，胰酶-EDTA溶液的浓度为0.25%。 

进一步，所述步骤（2）中，先将脐带转移至培养皿内，剪成直径为1-2cm大小的组织块，用浓度为0.9%的生理盐水反复冲洗，进一步去除残留血液，再将直径为1-2cm大小的脐带组织块剪成直径为0.8-1.2cm大小的组织块。 

所述步骤（5）、所述步骤（6）和所述步骤（8）中，完全培养基由两种原料组成：A、DMEM与F12的体积比为1:1的液体培养基，占完全培养基的体积百分比为90%，B、胎牛血清，占完全培养基的体积百分比为10%。 

所述步骤（8）中，微孔板的微孔规格为400μm×400μm。 

所述步骤（3）中，细胞培养皿的规格为150mm×25mm，每个细胞培养皿中接种80-100个脐带组织块，接种多个培养皿。 

本发明的有益效果在于： 

用本发明制备间充质干细胞，最大量可增殖50倍，能得到大量富有活性的间充质干细胞，并能够长时间保存而不失其活性，且操作简单易行，并且经过流式细胞检测、以及体外分化实验鉴定，获得的间充质干细胞纯度和细胞活性较高，具有良好增殖潜力，通过使用微孔板和搅拌式生物反应器作为扩增介质，结合各自在细胞培养上的优势：微孔板中可形成大小均一的聚集体、搅拌式生物反应器能突破细胞培养表面积的限制，最终实现扩增效率最大化，运用于临床医疗，满足产业化生产的要求。 

附图说明

图1是本发明所述间充质干细胞汇合度达80%时的状态示意图； 

图2A是本发明所述间充质干细胞的单一聚集体的整体示意图； 

图2B是本发明所述间充质干细胞的单一聚集体的局部放大图； 

图3是本发明所述间充质干细胞的多个聚集体示意图； 

图4是本发明所述间充质干细胞的CFU-F集落示意图； 

图5是本发明所述间充质干细胞的免疫表型检测结果示意图； 

图6A是本发明所述间充质干细胞的成骨分化潜能检测结果示意图； 

图6B是本发明所述间充质干细胞的成脂分化潜能检测结果示意图。 

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步具体描述： 

实施例： 

1、人脐带间充质干细胞的制备： 

（1）经产妇知情同意，采集足月剖宫产健康胎儿脐带。脐带采集之前产妇需做艾滋病病毒抗体、乙型肝炎病毒抗体、丙型肝炎病毒抗体、梅毒螺旋体抗体、谷丙转氨酶、支原体等检测，全部合格以确保安全性后方可采集。 

（2）脐带自手术台取下后，浸入含抗生素的0.9%生理盐水中，4℃保存待用。 

（3）取出脐带，于50ml离心管内用0.9%生理盐水反复冲洗，去除表面残余血液。 

（4）将脐带转移至培养皿内，剪成直径为1-2cm大小的组织块，0.9%生理盐水反复冲洗，进一步去除残留血液。 

（5）进一步将脐带组织继续剪碎至直径为1cm左右大小的组织块。 

（6）接种于细胞培养皿，不加培养液，直接放置于培养箱内，培养箱内的温度为37℃，CO₂的浓度为5%，静置培养时间为30min。 

（7）向培养箱内加入8-10mL完全培养基，置于培养箱内培养，培养箱内的温度为37℃，CO2的浓度为5%；完全培养基由两种原料组成：A、DMEM与F12的体积比为1:1的液体培养基，占完全培养基的体积百分比为90%，B、胎牛血清，占完全培养基的体积百分比为10%；下述完全培养基均与此相同。 

（8）每三天换一次完全培养基，待细胞汇合度达80%时，间充质干细胞的状态见图1所示。 

（9）加入浓度为0.25%的胰酶-EDTA溶液进行3-5min的消化处理后，再加入8-10mL完全培养基，然后经200目滤网过滤，去除组织块，保留消化液。 

（10）将消化液进行离心，离心机的转速为1000rpm，离心时间为5min，然后保留沉淀即脐带间充质干细胞。 

2、微孔板诱导间充质干细胞3D聚集体的形成： 

（1）将脐带间充质干细胞按2×10⁵个/cm²接种至微孔规格为400μm×400μm的微孔板中。 

（2）加入2mL完全培养基，在200g加速度下离心旋转5min，使脐带间充质干细胞集于微孔板的微孔中，将微孔板置于培养箱内静置培养，培养箱内的温度为37℃，CO₂的浓度为5%。 

（3）静置培养18小时后的间充质干细胞的单一聚集体示意图见图2A和图2B所示，图中图2A为间充质干细胞的单一聚集体的整体示意图，图 2B为间充质干细胞的单一聚集体的局部放大图。 

3、大规模扩增脐带间充质干细胞： 

（1）将微孔内的均一聚集体转移至搅拌生物反应器中，连续搅拌培养，搅拌生物反应器的搅拌速度为30rpm，温度为37℃，培养时间为7天，每三天换一次完全培养基，使间充质干细胞进一步扩增。 

（2）收集脐带间充质干细胞聚集体，间充质干细胞的多个聚集体见图3所示；加入浓度为0.25%的胰酶-EDTA溶液进行消化处理后，得到脐带间充质干细胞单细胞悬液。 

（3）重复上述步骤2和步骤3，实现脐带间充质干细胞的扩大再培养。对于按照上述方法制备的间充质干细胞，按照“国际细胞疗法协会”（ISCT）制定的标准进行生物学表型鉴定，表现出以下技术特征： 

（1）通过本发明扩增得到的单细胞，在重新接种至传统2D培养皿或培养瓶中后，可形成CFU-F集落，形态相对均一，呈平行排列生长或旋涡状生长的梭状细胞； 

（2）流式细胞检测间充质干细胞标记CD73、CD90、CD105，其阳性率大于95%；CD34、CD45、CD19、CD14及HLA-DR的阳性率低于2%； 

（3）体外可诱导分化为成骨细胞和脂肪细胞。 

在搅拌式生物反应器培养条件下，3D无支架悬浮培养扩增的脐带间充质干细胞的特征如下： 

1、细胞形态学观察： 

利用此方法培养获得的保持了塑料表面贴壁性，且形态相对均一，呈平行排列生长或旋涡状生长的梭状细胞。 

2、细胞倍增时间及CFU-F集落（Colony Forming unit fibroblast）测定： 

2.1细胞倍增时间是指有增殖能力的细胞通过有丝分裂使细胞增加一倍所需要的时间。体外传代培养细胞的倍增时间可以通过测量计算而得。细胞倍增时间因细胞种类而异，对同种细胞而言其倍增时间是相对恒定的。因而细胞倍增时间直接反映细胞增殖的快慢，当环境因素使细胞倍增时间发生改变时，则意味着细胞周期进程发生了改变。因此，细胞倍增时间也是观察细胞周期进程变化的重要参数。况且，此参数的测定简而易行，更有实际意义。 

将第2-8代细胞以相同的细胞密度即2×10⁵个/cm²接种于微孔板中，待聚集体形成后转入搅拌式生物反应器培养体系。每隔24h取间充质干细胞聚集体10个，消化成单细胞后，计数。用patterson公式计算对数生长期细胞群体倍增数，（PDT＝（t×［lg2/lg(Nt/No)］），No为首次记下的细胞数，Nt为t时间后的细胞数。一般No在接种细胞24小时后进行。应用该公式，我们计算出脐带来源的间充质干细胞在本发明的培养体系中的细胞群体倍增时间为36小时。 

2.2CFU-F集落： 

将第2-8代细胞以1.5个/cm²接种于55cm²的培养皿中，连续培养14天，每三天换液，弃培养基，PBS洗三次，100%乙醇固定5min，0.4%吉姆萨染色，倒置显微镜观察细胞群落大于50个作为一个CFU-F克隆，见图4所示。 

综上所述，使用培养的间充质干细胞仅需较短的初期融合时间和细胞倍增时间，且具有较强的CFU-F克隆形成能力，更适于脐带间充质干细胞的体外扩增。无论从细胞培养角度还是从产业化角度看，间充质干细胞的3D无支架搅拌式悬浮培养是理想的培养体系。 

3、免疫表型检测（CD14、CD45、CD73、CD90、CD105、CD19、HLA-DR）： 

将第4-7代人脐带来源的间充质干细胞悬滴接种于搅拌式生物反应器中，培养7天后，收集间充质干细胞聚集体，用浓度为0.25%的胰酶-EDTA溶液消化 成单细胞悬液，将细胞悬液转入50ml离心管中并以1000rmp离心分离3分钟。离心之后，弃上清，PBS洗涤2次，分成每管1*106细胞，第一管为空白对照（只含间充质干细胞），用于调节流式细胞仪的电压，第二管加入同型对照抗体（PE-Mouse IgG/FITC-Mouse IgGl/APC-Mouse IgG1k）10ul,其余管中加入其它相应抗体10ul,混匀，4℃避光孵育30分钟，PBS洗涤1次，离心后弃上清，加入500ulPBS重悬，混匀，即可上机（流式细胞仪FACSAria,BD公司）检测。细胞免疫表型为：CD73、CD90、CD105阳性率均大于95%，CD34、CD45、CD14、CD19、HLA-DR阳性率均低于2%，见图5所示。 

4、细胞的成骨及成脂分化潜能及分化后鉴定： 

消化体外扩增的第4-7代间充质干细胞，按2×10⁵个/孔接种于6孔板中，每孔加2ml完全培养基。在细胞达到60%-80%融合时，更换相应的诱导分化培养基。 

4.1成骨诱导分化： 

诱导分化培养基为 Chondrogenesis Differentiation Kit，每隔2天换液1次，培养14天，PBS洗涤细胞1次，4%多聚甲醛固定10分钟，茜素红S染色鉴定钙结节的产生。显微镜下观察，茜素红S染色可见细胞浆中有大量的钙沉积，表明该方法获得的间充质干细胞就有成骨分化潜能，见图6A所示。 

4.2成脂诱导分化： 

诱导分化培养基为 

Osteogenesis Differentiation Kit。操作方法参考试剂盒使用说明书：收集扩增培养的间充质干细胞聚集体，用浓度为0.25%的胰酶-EDTA溶液消化成单细胞后，以合适密度接种于12孔板，用完全培养基培养至细胞汇合度约80%时，更换分化诱导液，以后每隔2天换液次，培养2周。油红O染色鉴定分化结果。显微镜下，可见红色脂滴广泛分布，表明该方 法获得的间充质干细胞就有成脂分化潜能，见图6B所示。 

综上所述，本发明的内容并不局限在上述的实施例中，相同领域内的技术员能够在本发明的技术指导思想之内轻易提出其他的实施例，但这种实施例都包括在本发明的保护范围之内。 

Claims (6)

1.一种体外3D无支架悬浮培养扩增人脐带间充质干细胞的方法，其特征在于：包括以下步骤：

（1）对检测合格的脐带组织进行清洗；

（2）将清洗后的脐带组织进行剪切；

（3）将剪切后的脐带组织接种于细胞培养皿中；

（4）不加培养液，直接将细胞培养皿放置于培养箱内静置培养；

（5）向培养箱内加入完全培养基，培养至细胞汇合度达70%-85%；

（6）加入胰酶-EDTA溶液进行消化处理后，再加入完全培养基，然后过滤，去除组织块，保留消化液；

（7）将消化液进行离心，保留沉淀即脐带间充质干细胞；

（8）将脐带间充质干细胞接种至微孔板中，加入完全培养基，离心旋转使脐带间充质干细胞集于微孔板的微孔中，将微孔板置于培养箱内静置培养；

（9）将微孔内的均一聚集体转移至搅拌生物反应器中，连续搅拌培养；

（10）收集脐带间充质干细胞聚集体，加入胰酶-EDTA溶液进行消化处理后，得到脐带间充质干细胞单细胞悬液；

（11）重复步骤（8）-步骤（10），实现脐带间充质干细胞的扩大再培养。

2.根据权利要求1所述的体外3D无支架悬浮培养扩增人脐带间充质干细胞的方法，其特征在于：

所述步骤（1）中，清洗的方法为：用0.9%的生理盐水反复冲洗干净，去掉残留的血液，获得干净的脐带组织；

所述步骤（2）中，剪切后的脐带组织的直径为0.5-1.5mm；

所述步骤（4）中，培养箱内的温度为37℃，CO₂的浓度为5%，静置培养时间为30min；

所述步骤（5）中，加入8-10mL完全培养基，培养至细胞汇合度达80%；

所述步骤（6）中，胰酶-EDTA溶液的浓度为0.25%，消化处理时间为3-5min，加入完全培养基8-10mL，经200目滤网过滤；

所述步骤（7）中，离心过程中，离心机的转速为1000rpm，离心时间为5min；

所述步骤（8）中，将脐带间充质干细胞按2×10⁵个/cm²接种至微孔板中，每孔加入2mL完全培养基，在200g加速度下离心旋转5min，培养箱内的温度为37℃，CO₂的浓度为5%，静置培养时间为18小时；

所述步骤（9）中，搅拌生物反应器的搅拌速度为30rpm，培养时间为7天，每三天换一次完全培养基；

所述步骤（10）中，胰酶-EDTA溶液的浓度为0.25%。

3.根据权利要求1或2所述的体外3D无支架悬浮培养扩增人脐带间充质干细胞的方法，其特征在于：所述步骤（2）中，先将脐带转移至培养皿内，剪成直径为1-2cm大小的组织块，用浓度为0.9%的生理盐水反复冲洗，进一步去除残留血液，再将直径为1-2cm大小的脐带组织块剪成直径为0.8-1.2cm大小的组织块。

4.根据权利要求1或2所述的体外3D无支架悬浮培养扩增人脐带间充质干细胞的方法，其特征在于：所述步骤（5）、所述步骤（6）和所述步骤（8）中，完全培养基由两种原料组成：A、DMEM与F12的体积比为1:1的液体培养基，占完全培养基的体积百分比为90%，B、胎牛血清，占完全培养基的体积百分比为10%。

5.根据权利要求1或2所述的体外3D无支架悬浮培养扩增人脐带间充质干细胞的方法，其特征在于：所述步骤（8）中，微孔板的微孔规格为400μm×400μm。

6.根据权利要求1所述的体外3D无支架悬浮培养扩增人脐带间充质干细胞的方法，其特征在于：所述步骤（3）中，细胞培养皿的规格为150mm×25mm，每个细胞培养皿中接种80-100个脐带组织块，接种多个培养皿。

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