CN117802039A - 一种无血清间充质干细胞三维培养基及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于干细胞培养技术领域，提供了一种无血清间充质干细胞三维培养基及其应用。所述三维培养基是在基础培养基中添加以下含量的添加剂：人血小板裂解液、胶原蛋白、纤连蛋白、NMN、IFN‑γ、TNF‑α、多种细胞因子和生长刺激物质。本发明提供的培养基无需三维载体，能有效防止细胞贴壁，后处理不需要胶原酶，进一步提升了体外培养扩增速度和细胞成活率，适于规模化生产制备间充质干细胞。
Description
技术领域
本发明属于干细胞培养技术领域，涉及一种无血清间充质干细胞三维培养基。
背景技术
公开该背景技术的信息旨在增加对本发明总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
间充质干细胞（mesenchymal stem cell，MSC）是一种源于中胚层的多能干细胞，能够无限制自我更新，多向分化。在合适的条件下，能在体外或者体内定向分化为脂肪细胞、软骨细胞、肌细胞等等，作为组织修复的种子细胞。MSCs免疫原性较低，不易引起机体的排斥反应；具有分化成其他中胚层细胞的潜能，能够分泌多种细胞因子；具有定向迁移能力。在器官移植时使用，可以降低免疫排斥，提高移植的成功率，同时加快手术创口的恢复。MSCs具有的这些优良特性使之在受损组织修复、组织工程、造血干细胞、器官移植、自体免疫性疾病治疗中具有广泛的应用前景。
在细胞组织领域的研究中，大量细胞的获取往往需要通过干细胞的体外培养实现。传统的含动物血清的细胞培养基给干细胞的生产与科研带来多种不利因素，由于批间差异大，血清来源成分不稳定，而且价格昂贵，成分不明确，容易被病毒和支原体感染等。无血清培养基一般由基础培养基和替代血清的添加剂两部分组成，能有效避免血清带来的诸多问题，也能满足体外细胞培养的要求。
进行间充质干细胞规模化扩增的主要方式是大规模二维细胞瓶培养，然而这种传统的培养方式使用大量细胞培养瓶增加了成本、容易污染，且这种传统的二维培养方式要求严格控制细胞密度，容易影响细胞质量和产量。为实现间充质干细胞的规模化培养，使用三维悬浮培养，将细胞置于生物反应器中进行培养，能更准确地模拟细胞在组织中的实际微环境，单位体积培养液可获得更高的细胞产量，培养基利用率高，容易放大，可从较低密度实现细胞大规模扩增，劳动成本低，培养系统体积小且不易污染，单位时间内可获得更多细胞。
传统的三维培养需要用网状支架或悬浮的微球作为载体，使干细胞在其表面附着生长。这些支架大多由高分子材料构成，具有一定的刚性结构，不可降解或降解缓慢，增加了细胞接种培养和回收的操作难度，而且载体材料的制作成本较高，涉及的合成工艺易产生毒性和免疫反应，影响细胞的质量。因此提供一种成分较简单、组分确定、防止细胞贴壁、细胞增殖速率高的无血清三维培养基以提高间充质干细胞的体外三维培养的效率具有重要意义。
发明内容
针对目前间充质干细胞三维培养中的问题，本发明提供一种无血清间充质干细胞培养基，成分确定、质量可靠，无动物血清成分，无异源蛋白污染；无需三维载体，后处理简单，适于规模化生产制备间充质干细胞。
本发明的另一目的是提供一种间充质干细胞三维培养的方法。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案。
一种无血清间充质干细胞三维培养基，在基础培养基中添加以下含量的添加剂：
人血小板裂解液 5%-25%（v/v），胶原蛋白 100-1000mg/L，纤连蛋白 100-1000mg/L，β-烟酰胺单核苷酸（NMN）0.1-10mg/L，重组人干扰素-γ（IFN-γ）1-100μg/L，肿瘤坏死因子-α（TNF-α）1-100μg/L，重组人表皮生长因子（EGF）1-50μg/L，重组血管内皮生长因子（VEGF）1-50μg/L，重组人血小板衍生生长因子（PDGF）1-50μg/L，重组人转化生长因子β1（TGF-β1）1-50μg/L，胰岛素 1-10U/mL，黄体酮 1-50mg/L，地塞米松 1-50nM，亚油酸 50-500mg/L，亚硒酸钠 1-100mg/L，腐胺 1-20mg/L，卵磷脂 1-50μg/L，L-谷氨酰胺 1-10mM，谷胱甘肽 0.5-2mg/L，转铁蛋白 1-100mg/L，维生素C 1-100mg/L，维生素E 1-100mg/L，维生素B1 1-20mg/L，维生素B2 1-20mg/L，维生素B6 1-20mg/L。
优选地，上述无血清间充质干细胞三维培养基，在基础培养基中添加以下含量的添加剂：
人血小板裂解液 5%-20%（v/v），胶原蛋白 300-1000mg/L，纤连蛋白 500-700mg/L，NMN 2-10mg/L，IFN-γ 20-50μg/L，TNF-α 20-100μg/L，EGF 10-30μg/L，VEGF 10-30μg/L，PDGF 10-30μg/L，TGF-β1 10-30μg/L，胰岛素 3-8U/mL，黄体酮 5-20mg/L，地塞米松 5-30nM，亚油酸 50-300mg/L，亚硒酸钠 20-60mg/L，腐胺 5-20mg/L，卵磷脂 10-30μg/L，L-谷氨酰胺 3-8mM，谷胱甘肽 1-2mg/L，转铁蛋白 50-60mg/L，维生素C 60-100mg/L，维生素E50-100mg/L，维生素B1 5-20mg/L，维生素B2 5-10mg/L，维生素B6 5-10mg/L。
更为优选地，无血清间充质干细胞三维培养基，在基础培养基中添加以下含量的添加剂：
人血小板裂解液 15%（v/v），胶原蛋白 500mg/L，纤连蛋白 500mg/L，NMN 2mg/L，IFN-γ 50μg/L，TNF-α 50μg/L，EGF 10μg/L，VEGF 10μg/L，PDGF 10μg/L，TGF-β1 10μg/L，胰岛素 5U/mL，黄体酮 10mg/L，地塞米松 20nM，亚油酸 100mg/L，亚硒酸钠 50mg/L，腐胺5mg/L，卵磷脂 20μg/L，L-谷氨酰胺 5mM，谷胱甘肽 1mg/L，转铁蛋白 50mg/L，维生素C60mg/L，维生素E 50mg/L，维生素B1 10mg/L，维生素B2 10mg/L，维生素B6 10mg/L。
所述基础培养基选自DMEM、DMEM/F12、Advanced DMEM/F12、MEM培养基、IMDM培养基、Ham’s F-12K培养基或RPIM1640培养基。上述培养基可以根据需要选择葡萄糖的浓度配制为高糖或低糖基础培养基。
一种三维培养间充质干细胞的方法，包括以下步骤：
（1）将间充质干细胞接种至上述无血清间充质干细胞三维培养基中，搅拌培养；
（2）培养至一定扩增倍数，将培养液稀释后，按照步骤（1）的接种密度分装并传代培养；
（3）按照步骤（1）和（2）的方法扩增培养。
所述间充质干细胞的来源并不限定，可以来源于任何可分离间充质干细胞的组织、器官，如：骨髓、血液、脐带、胎盘、脂肪、羊膜、羊水、牙髓、皮肤、尿液等。为了保证获取的数量，可以选择骨髓、血液、脐带、胎盘、脂肪，血液可以选择脐带血或外周血。
所述间充质干细胞可以是直接分离获得的或者由直接分离的干细胞传代后获得的。一般的，现有技术中，干细胞可传代至15次左右仍能够保持较好的医学用途。本发明提供的培养方法将分离获得的原代骨髓干细胞、原代脂肪干细胞和由细胞库购买的脐带干细胞经过10-15代的培养后，通过表面抗原，如CD105、CD44、CD90、CD73、CD34、CD45、HLA-DR检测，三系分化和干性基因表达，如Sox2、Oct4、Nanog检测，仍能够保持非常好的干细胞干性，通过旁分泌，如免疫调节因子表达的检测证明能够保持较好的干细胞活性。
接种的密度为每毫升104-106，在上述数量级的范围内均能够良好生长；在一些实施例中，接种密度为5×104-105/mL。
步骤（1）中，搅拌速度为30-60转/分钟（rpm）。
步骤（2）中，所述扩增倍数为30-150倍，如30倍、40倍、50倍、60倍、65倍、70倍、80倍、85倍、90倍、100倍、120倍、150倍，或者上述任一数值之间的倍数；在一些实施例中，为了有效利用培养基并保持较好的细胞活力，扩增倍数为40-100倍，还可以为50-80倍。
步骤（2）中，稀释采用的为上述无血清间充质干细胞三维培养基。
在本申请中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本申请中具体公开。
本发明中，人血小板裂解液起到替代血清的作用；胶原蛋白和纤连蛋白的作用是增加培养基粘稠度，结合细胞表面的粘附分子(CAM)，辅助细胞悬浮生长，同时模拟体内的细胞基质微环境；β-烟酰胺单核苷酸（NMN）为细胞的生长代谢提供能量辅助；重组人干扰素-γ（IFN-γ）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）调节间充质干细胞的表面受体，增加抑炎因子的分泌，重组人表皮生长因子（EGF）、重组血管内皮生长因子（VEGF）、重组人血小板衍生生长因子（PDGF）和重组人转化生长因子β1（TGF-β1）促进间充质干细胞增殖；胰岛素、黄体酮、地塞米松、亚油酸、亚硒酸钠、腐胺、卵磷脂、L-谷氨酰胺、谷胱甘肽和转铁蛋白能够促进细胞生长代谢，改善细胞生长微环境；维生素C、维生素E、维生素B1、维生素B2、维生素B6等调节控制细胞生长状态，抗衰抗凋亡。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
本发明间充质干细胞培养基无动物血清成分，成分确定，质量可靠，无异源蛋白污染；本发明的间充质干细胞三维培养基为干细胞三维悬浮培养提供了更为稳定的环境，有效防止细胞贴壁，后处理不需要胶原酶，进一步提升了体外培养扩增速度和细胞成活率；本发明提供的培养基无需三维载体，后处理简单，适于规模化生产制备间充质干细胞。
附图说明
图1是实施例1中三维培养基培养过程中的生长曲线；
图2是3种培养方法的增殖曲线；
图3是3种培养方法的增殖倍数比较；
图4是实施例1配方1的P10代MSCs细胞的表面抗原流式图；
图5是实施例1配方1的P10代MSCs细胞的三系分化图；
图6是3种培养方法的P10代MSCs细胞的干性基因相对表达量；
图7是3种培养方法的P10代MSCs细胞的炎性抑制因子的相对表达量。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明；如无特别说明，实施例中的试剂均为商业购买或者按照本领域公知的方法获得。
实施例1 间充质干细胞的三维培养基的制备及应用
1. 三维培养基的制备
按照表1中的成分和浓度向DMEM/F12培养基中添加添加剂制备间充质干细胞的三维培养基，然后混合均匀、过滤除菌，得到无血清间充质干细胞三维培养基。
表1 间充质干细胞三维培养基添加物
添加剂在基础培养基中搅拌混匀，过滤除菌，得到无血清间充质干细胞三维培养基。
2. 细胞培养
将无菌获取的脂肪组织用生理盐水清洗并去除筋膜组织及小血管，转移至15 mL离心管中，用眼科剪刀将脂肪组织块剪碎，加入1体积倍的0.1%胶原酶液，37℃水浴振荡约30 min消化，直至细胞混合物成乳状浓稠液体，期间吹打脂肪组织，辅助消化；250×g，4℃，离心5min，吸除上层油脂，再加入5mL含5%血清替代物的DMEM-F12培养基，重悬沉淀，过40μM细胞筛到新的离心管中，再次离心5min，重复洗涤一次；加入8mL含5%血清替代物的DMEM-F12培养基重悬沉淀，转移至6孔板中，置于37℃，5%CO2培养，待细胞贴壁生长48h后换液去除未贴壁的细胞，以后每3天半量换液一次，细胞汇合达80%左右时，0.25%胰蛋白酶消化，按1传3比例传代，将传代2次的第3代细胞（P3）用于三维培养：
在1L生物反应器中预先加入500mL预热至37℃的各配方的无血清间充质干细胞三维培养基，以5×104/mL，2×105/mL，5×105/mL密度接种，60rpm搅拌悬浮培养；每天取3组1mL含细胞培养液，洗涤后用细胞计数仪检测计数，乘以总体积获得细胞总数，把5天中的细胞数对数值绘成图，即为细胞生长曲线。结果如图1所示，配方1-3分别以5×104/mL，2×105/mL，5×105/mL密度接种细胞，连续培养5天，每天进行细胞计数，得出三种配方的细胞生长曲线，细胞生长扩增趋势相似。说明，本发明的配方可用于三维培养MSCs细胞，且细胞生长良好、能够正常增殖。
对比例1 间充质干细胞培养基的制备
在500mL基础DMEM-F12培养液中加入50mL胎牛血清（FBS），加入重组人表皮生长因子（EGF）20μg/L，重组血管内皮生长因子（VEGF）20μg/L，重组人血小板衍生生长因子（PDGF）20μg/L，L-谷氨酰胺5mM，混匀过滤除菌，得到间充质干细胞二维培养基。
实施例2 间充质干细胞的三维培养
从液氮罐中取出一支冻存人脐带来源间充质干细胞（HUC-MSCs）种子细胞的冻存管，在37℃水浴中快速融化后，将HUC-MSCs转移到20mL DMEM/F12培养基中，离心后将上清弃掉，在对比例1的培养基中重悬，计数后调整细胞密度，获得工作种子细胞悬液。按照以下方法对人脐带来源间充质干细胞进行贴壁培养和三维培养：
1. 贴壁培养
按照5×104/mL的密度将种子细胞悬液加入含30mL培养基的T175培养瓶中培养过夜，第二天换液并检查HUC-MSCs间充质干细胞的密度。
待细胞达到80%以上融合，吸除培养基，加入适量0.25%的胰酶，充分摇晃均匀，置于37℃培养箱中放置5min，注意观察细胞形态变化，发现细胞收缩，摇晃培养瓶有片状细胞脱落时，立即加入10-15mL对比例1的培养基终止反应，用吸管吹打使细胞完全脱落，然后将细胞悬液移入离心管中，300×g离心10min，再加入生理盐水10mL，离心洗涤，反复3次后，计数活细胞，用对比例1的培养基稀释，收集细胞进行传代培养：按一传三的比例进行传代培养。
2. 载体三维培养
购买无菌Cytodex 3微载体干粉在无Ca2+和Mg2+的PBS（pH 7.4）中溶胀3次，以预热的对比例1的培养基漂洗后按照微载体用量3g干重/L转移至生物培养容器中，加入对比例1中的培养基，预热至37℃；
按照5×104/mL的密度进行接种，首先接种细胞至终体积1/3的培养基中30rpm搅拌，增加细胞与微载体接触的机会；
约5天后，缓慢加入对比例1的培养基至工作体积，并且增加搅拌速度保证完全均质混合；随着细胞增殖，微球变得越来越重，需逐渐增加搅拌速率至60rpm；
经过3d左右，培养液开始呈酸性，需换液：停止搅拌，让微球沉淀5min，弃掉1/2体积的培养液，缓慢加入预热的新鲜培养基（37℃），重新开始搅拌；
当微球直径生长接近1000μm时收获细胞，首先排干培养液，用PBS缓冲液漂洗1遍，然后加入胶原酶，100rpm搅拌30min左右进行解离，通过直径100微米的过滤器过滤收集细胞。
3. 三维培养
在1L生物反应器中预先加入500mL预热至37℃的实施例1配方2的无血清间充质干细胞三维培养基，以5×104/mL密度接种，60rpm搅拌悬浮培养；
培养至扩增倍数约100倍，即细胞密度约5×106/mL，加入新鲜三维培养基将培养液稀释后，按照5×104/mL密度接种分装并传代培养。
收获细胞时加入PBS缓冲液（pH 7.4）稀释，离心或过滤收集细胞。
4. 细胞增殖速度测定
将上述三种培养体系中的P4代细胞每24h取样进行细胞数量的测定：
（1）贴壁培养计数：将间充质干细胞接种到24孔板用二维培养基培养。24孔分7组，每组3孔，培养一周，期间逐日酶消化细胞用细胞计数仪检测一组计数。把7天中的细胞数值绘成图，即为细胞增殖曲线。
（2）载体三维培养计数：三维载体培养体系接种间充质干细胞后培养一周，每天取3组1mL含细胞培养液，酶消化后用细胞计数仪检测计数，乘以总体积获得细胞总数，把7天中的细胞数值绘成图，即为细胞增殖曲线。
（3）三维培养基培养计数：三维培养基中接种间充质干细胞后培养一周，每天取3组1mL含细胞培养液，洗涤后用细胞计数仪检测计数，乘以总体积获得细胞总数，把7天中的细胞数值绘成图，即为细胞增殖曲线。
对三种体系下培养的间充质干细胞进行细胞计数、作图，结果如图2所示，三种不同培养方式在细胞起始接种密度相同的情况下，用三维培养基培养的HUC-MSCs生长速度显著高于普通载体三维培养体系（p<0.05）和二维培养体系（p<0.01）。
将上述三种方法培养的细胞进行再传代，直到收获P5代，计算细胞总数增长量的倍数，结果如图3所示：三种不同培养方式从P4代接种到P5代收获时，用本三维培养基培养的HUC-MSCs细胞生长速度显著快于普通三维体系培养下的HUC-MSCs（p<0.05）。
实施例3 长期传代后MSCs的干性和活性
按照实施例2的方法对人脐带来源间充质干细胞进行贴壁培养、载体三维培养和三维培养，且采用以下三维培养基配方进行三维培养：
人血小板裂解液 15%（v/v），胶原蛋白 500mg/L，纤连蛋白 500mg/L，NMN 2mg/L，IFN-γ 50μg/L，TNF-α 50μg/L，EGF 10μg/L，VEGF 10μg/L，PDGF 10μg/L，TGF-β1 10μg/L，胰岛素 5U/mL，黄体酮 10mg/L，地塞米松 20nM，亚油酸 100mg/L，亚硒酸钠 50mg/L，腐胺5mg/L，卵磷脂 20μg/L，L-谷氨酰胺 5mM，谷胱甘肽 1mg/L，转铁蛋白 50mg/L，维生素C60mg/L，维生素E 50mg/L，维生素B1 10mg/L，维生素B2 10mg/L，维生素B6 10mg/L。
1. MSCs的干性检测
a. 表面抗原
将3种方法传代9次的P10细胞用BD Calibur流式细胞仪进行表面抗原CD105、CD44、CD90、CD34和HLA-DR检测，结果如表2所示。三维培养的流式图如图4所示。
表2 不同培养方法的P10细胞表面抗原检测
结果表明，采用三种培养基得到的HUC-MSCs的CD105、CD44和CD90的表达量均高于90％，CD34和HLA-DR低于1％，说明3种培养基培养得到的HUC-MSCs间充质干细胞均为发生分化、保持了较好的干性。
b. 三系分化
使用三维培养基对HUC-MSCs进行培养并对传代9次的P10细胞以试剂盒（上海佰利莱，Cat. BLL-S7740G；上海埃泽思，Cat. AC-1001027；上海埃泽思，Cat. AC-1001028）进行HUC-MSCs向脂肪细胞，骨细胞和软骨细胞三系分化的检测实验，结果如图5所示：用本三维培养基长期培养的HUC-MSCs细胞仍然具备良好的间充质干细胞的分化潜能。
c. 干性基因表达
Sox2、Oct4、Nanog均为干细胞的干性基因，在间充质干细胞HUC-MSCs中有表达。将三种培养方法获得的P10代MSCs以试剂盒（Solarbio，Cat. R1200）提取总RNA，SYBR GreenI法进行qPCR检测，以GAPDH为内参基因，引物如表3所示。
表3 qPCR引物
结果如图6所示，用三维培养基培养的HUC-MSCs表达的Sox2、Oct4、Nanog的基因水平显著高于普通支架三维培养体系（p<0.05）和二维培养体系（p<0.05），这说明用本三维培养基培养的HUC-MSCs细胞干性比普通三维体系培养下的HUC-MSCs干性保持更好。
2. 干细胞活性
PGE2、TGF-β1、IL-10均为炎性抑制因子，在免疫炎性调节中发挥着重要的作用。三种培养方法获得的P10代MSCs以ELISA试剂盒（上海研玘，Cat. YQ-50426K；武汉吉立德，Cat. J20226；武汉吉立德，Cat. J20265），按照操作说明检测上述三种细胞因子。
ELISA结果如图7所示，用本三维培养基培养的HUC-MSCs分泌的PGE2、TGF-β1、IL-10的量均显著高于普通支架三维培养体系（p<0.05）和二维培养体系（p<0.01），说明长期培养下，用本三维培养基培养的HUC-MSCs的细胞抑炎因子分泌能力显著高于普通三维体系培养下的HUC-MSCs。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种无血清间充质干细胞三维培养基，其特征在于，在基础培养基中添加以下含量的添加剂：
人血小板裂解液 5%-25%v/v，胶原蛋白 100-1000mg/L，纤连蛋白 100-1000mg/L，β-烟酰胺单核苷酸 0.1-10mg/L，重组人干扰素-γ 1-100μg/L，肿瘤坏死因子-α 1-100μg/L，重组人表皮生长因子 1-50μg/L，重组血管内皮生长因子 1-50μg/L，重组人血小板衍生生长因子 1-50μg/L，重组人转化生长因子β1 1-50μg/L，胰岛素 1-10U/mL，黄体酮 1-50mg/L，地塞米松 1-50nM，亚油酸 50-500mg/L，亚硒酸钠 1-100mg/L，腐胺 1-20mg/L，卵磷脂 1-50μg/L，L-谷氨酰胺 1-10mM，谷胱甘肽 0.5-2mg/L，转铁蛋白 1-100mg/L，维生素C 1-100mg/L，维生素E 1-100mg/L，维生素B1 1-20mg/L，维生素B2 1-20mg/L，维生素B6 1-20mg/L。
2.根据权利要求1所述的无血清间充质干细胞三维培养基，其特征在于，在基础培养基中添加以下含量的添加剂：
人血小板裂解液 5%-20%v/v，胶原蛋白 300-1000mg/L，纤连蛋白 500-700mg/L，β-烟酰胺单核苷酸 2-10mg/L，重组人干扰素-γ 20-50μg/L，肿瘤坏死因子-α 20-100μg/L，重组人表皮生长因子 10-30μg/L，重组血管内皮生长因子 10-30μg/L，重组人血小板衍生生长因子 10-30μg/L，重组人转化生长因子β1 10-30μg/L，胰岛素 3-8U/mL，黄体酮 5-20mg/L，地塞米松 5-30nM，亚油酸 50-300mg/L，亚硒酸钠 20-60mg/L，腐胺 5-20mg/L，卵磷脂10-30μg/L，L-谷氨酰胺 3-8mM，谷胱甘肽 1-2mg/L，转铁蛋白 50-60mg/L，维生素C 60-100mg/L，维生素E 50-100mg/L，维生素B1 5-20mg/L，维生素B2 5-10mg/L，维生素B6 5-10mg/L。
3.根据权利要求1所述的无血清间充质干细胞三维培养基，其特征在于，在基础培养基中添加以下含量的添加剂：
人血小板裂解液 15%v/v，胶原蛋白 500mg/L，纤连蛋白 500mg/L，β-烟酰胺单核苷酸2mg/L，重组人干扰素-γ 50μg/L，肿瘤坏死因子-α 50μg/L，重组人表皮生长因子 10μg/L，重组血管内皮生长因子 10μg/L，重组人血小板衍生生长因子 10μg/L，重组人转化生长因子β1 10μg/L，胰岛素 5U/mL，黄体酮 10mg/L，地塞米松 20nM，亚油酸 100mg/L，亚硒酸钠50mg/L，腐胺 5mg/L，卵磷脂 20μg/L，L-谷氨酰胺 5mM，谷胱甘肽 1mg/L，转铁蛋白 50mg/L，维生素C 60mg/L，维生素E 50mg/L，维生素B1 10mg/L，维生素B2 10mg/L，维生素B610mg/L。
4.根据权利要求1-3任一所述的无血清间充质干细胞三维培养基，其特征在于，所述基础培养基选自DMEM、DMEM/F12、Advanced DMEM/F12、MEM培养基、IMDM培养基、Ham’s F-12K培养基或RPIM1640培养基。
5.根据权利要求1-3任一所述的无血清间充质干细胞三维培养基，其特征在于，所述基础培养基根据需要选择葡萄糖的浓度，配制为高糖或低糖基础培养基。
6.一种三维培养间充质干细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将间充质干细胞接种至权利要求1-5任一所述的无血清间充质干细胞三维培养基中，搅拌培养；
（2）培养至一定扩增倍数，将培养液稀释至接种密度、分装并传代培养；
（3）按照步骤（1）和（2）的方法扩增培养。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述间充质干细胞的来源于骨髓、血液、脐带、胎盘、脂肪、羊膜、羊水、牙髓、皮肤或尿液。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述间充质干细胞是直接分离获得的或者由直接分离的干细胞传代后获得的；传代的次数为15代以内。
9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，接种的密度为每毫升104-106；扩增倍数为30-150倍。
10.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤（1）中，接种密度为5×104-105/mL；搅拌速度为30-60转/分钟；
步骤（2）中，稀释采用的为权利要求1-5任一所述的无血清间充质干细胞三维培养基；接种密度为5×104-105/mL。
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