CN114540292A

CN114540292A - 一种麻鸭鸭胚肝间充质干细胞的悬浮驯化方法及应用

Info

Publication number: CN114540292A
Application number: CN202210165910.XA
Authority: CN
Inventors: 严正龙; 陆豪杰; 张瑜; 秦英博
Original assignee: Suzhou Shuangru Biotechnology Co ltd
Current assignee: Suzhou Shuangru Biotechnology Co ltd
Priority date: 2022-02-23
Filing date: 2022-02-23
Publication date: 2022-05-27

Abstract

本发明公开了一种麻鸭鸭胚肝间充质干细胞的悬浮驯化方法。本发明将分离培养的贴壁生长的鸭胚肝间充质干细胞经过低血清驯化、无血清悬浮驯化，得到稳定生长的悬浮无血清鸭肝间充质干细胞。通过实验确定了不同水禽病毒的接种工艺如接种比例、培养时间，确定收获标准等关键技术，实现不同病毒的适应性生长和提高相应病毒的含量，为水禽疫苗的研究奠定基础。本发明选用无血清培养基大大降低了细胞培养的成本，减少了由于使用血清可能造成的内源性病毒污染的几率；悬浮培养的细胞不需要胰酶消化，传代过程快，对细胞创伤更小，更容易做到扩大培养，批量收获；病毒通过接种悬浮细胞不仅实现了扩大培养，而且在一定程度上提高了病毒的效价。

Description

一种麻鸭鸭胚肝间充质干细胞的悬浮驯化方法及应用

技术领域

本发明涉及一种麻鸭鸭胚肝间充质干细胞的悬浮驯化方法及应用，属于水禽生物疫苗技术领域。

背景技术

干细胞是一类具有无限的或者永生的自我更新能力的细胞且同时具备多向分化潜能。干细胞包括胚胎干细胞、骨髓和其他来源的间充质干细胞。间充质干细胞是一种多能干细胞，它具有干细胞的所有共性，即自我更新和多向分化能力，在临床应用也最多。

水禽疫病种类繁多复杂，疫苗预防各类疾病仍是目前的主要手段。而水禽病病毒大多数依靠传统的鸡胚培养技术或者在鸭胚成纤维和鸡胚成纤维等原代细胞上增殖。传统鸡胚接种成本高，生产过程易污染外源病毒，且对环境易造成污染。而原代细胞实质上也是采用胚体制备，工序复杂繁琐，病毒滴度较低，难以达到大规模生产的需求。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：现有技术以鸭胚成纤维细胞或鸡胚成纤维细胞增殖水禽病毒，存在成本高，易污染外源病毒，工序复杂以及病毒滴度较低等问题。

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种麻鸭鸭胚肝间充质干细胞的悬浮驯化方法，包括：

步骤1：取贴壁生长的鸭胚肝间充质干细胞进行低血清驯化；所述低血清驯化为：在培养基中胎牛血清浓度≤10％的条件下，逐步降低培养基中胎牛血清的浓度进行传代培养；

步骤2：低血清驯化所得的鸭胚肝间充质干细胞进行无血清悬浮驯化，得到悬浮无血清鸭胚肝间充质干细胞。

优选地，所述步骤1中低血清驯化的具体方法为：依次采用含10％FBS、8％FBS和6％FBS的DMEM/F12培养基培养两代，再依次采用含5％FBS、3％FBS、1％FBS、0.5％FBS的LMSC低血清培养基培养三代，期间观察细胞生长状态。

优选地，所述步骤2中无血清悬浮驯化的具体方法为：选取含0.5％FBS的LMSC低血清培养基稳定培养传代的细胞，用0.25％的胰酶消化，调整细胞数为0.6×10⁶个/mL重悬于LMSC无血清悬浮培养基中进行传代培养，期间每传代一次更换新鲜的培养基并观察细胞生长状态。

优选地，所述于LMSC无血清悬浮培养基中进行传代培养的具体条件为：在37℃、含5％CO₂的环境中于150rpm搅拌条件下培养3日。

本发明还提供了上述的麻鸭鸭胚肝间充质干细胞的悬浮驯化方法所得的悬浮无血清鸭胚肝间充质干细胞在接种水禽病毒中的应用。

优选地，所述的水禽病毒包括鸭甲型肝炎病毒DHAV1型和鸭坦布苏病病毒JS-F10株。

优选地，所述水禽病毒的接种工艺包括：将水禽病毒在贴壁生长的鸭胚肝间充质干细胞中适应性培养后接种于悬浮无血清鸭胚肝间充质干细胞中增殖培养。

本发明分离纯化了SPF麻鸭鸭胚的肝间充质干细胞，细胞呈长梭形贴壁生长，在体外可培养至52代。细胞经过低血清驯化、无血清驯化和悬浮驯化得到稳定生长的悬浮无血清鸭肝间充质干细胞，并建立悬浮无血清鸭肝间充质干细胞系。按照不同MOI接种鸭甲型肝炎病毒DHAV1型(DHAV-1)和鸭坦布苏病病毒(JS-F10株)，通过研究病毒接种比例、培养时间，确定收获标准等关键技术，实现病毒的适应性生长和提高病毒含量，为水禽疫苗的研究奠定基础。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

1.本发明将贴壁生长的鸭胚间充质干细胞通过改变培养基，降低血清含量，改变培养方式的方法将其驯化成无血清悬浮培养细胞；选用无血清培养基大大降低了细胞培养的成本，减少了由于使用血清可能造成的内源性病毒污染的几率；悬浮培养的细胞不需要胰酶消化，传代过程快，对细胞创伤更小，更容易做到扩大培养，批量收获；

2.水禽病毒通过接种悬浮细胞不仅实现了扩大培养，而且在一定程度上提高了病毒的效价；例如，鸭坦布苏病病毒的组织毒效价为10^5.83ELD₅₀/0.1mL，贴壁细胞培养的病毒效价为10^8.16ELD₅₀/0.1mL，而无血清悬浮细胞接种的病毒效价可以达到10^8.5ELD₅₀/0.1mL，这为疫苗的规模化生产奠定了良好的基础。

具体实施方式

为使本发明更明显易懂，兹以优选实施例，作详细说明如下。

本发明的实施例中的主要试剂和鸭胚肝脏来源如下：

DMEM/F12，0.25％胰酶购自GIBCO公司；

胎牛血清(FBS)和PBS缓冲液由Lonsera公司提供；

IV型胶原酶、人重组干细胞因子(SCF)、人重组白细胞抑制因子(LIF)购自上海生工；

人重组碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)购自上海近岸生物科技有限公司；LMSC低血清培养基和LMSC无血清悬浮培养基由Lonsera公司提供。

F12全培养基成分：DMEM/F12+10ng/mL SCF+10ng/mL LIF+10ng/mL bFGF+10％FBS；

6％～8％FBS的DMEM/F12培养基成分：DMEM/F12+6％～8％FBS；

鸭胚肝脏来源：选取10日龄的SPF(Specific pathogen Free，无特定病原体)麻鸭鸭胚(SPF麻鸭购自哈兽研)；取出胚胎，用手术镊小心剥离出肝脏，去除包膜并用PBS清洗3次。

如无特殊说明，除气体百分含量为体积百分含量外，其余各试剂的百分含量均表示质量百分含量。

实施例

本实施例提供了一种麻鸭鸭胚肝间充质干细胞的悬浮驯化方法及应用：

1、麻鸭鸭胚肝间充质干细胞的悬浮驯化方法包括如下步骤：

(1)鸭胚肝间充质干细胞的提取和培养

将鸭胚肝脏剪碎，加入适量的0.1％的IV型胶原酶，置于37℃消化20分钟，每五分钟摇晃一次。倒掉胶原酶，加入F12全培养基(DMEM/F12+10ng/mL SCF+10ng/mL LIF+10ng/mL bFGF+10％FBS)终止消化，反复吹打，用300目细胞筛过滤后，700g，离心8分钟。弃上清，用PBS重悬，500×g离心5分钟收集细胞。通过细胞计数板计数，细胞数为6×10⁶个/mL，接种25cm²含F12全培养基的细胞方瓶中于37℃，5％CO₂培养箱中培养。第二天观察细胞，细胞已长至80％左右，呈椭圆形，长梭形，并更换新鲜培养液。继续培养，待48小时，用0.25％的胰酶消化细胞，并以1:2扩大培养。细胞前30代平均48小时传代一次，形态呈典型的长梭形且立体感较强，随着代次的增加，细胞生长放缓，细胞核变大，细胞变得扁平有空洞，传至50代左右细胞几乎停止生长。在传代过程中，选取细胞代次靠前，形态良好的批次进行冻存。

(2)细胞的低血清驯化

用DMEM/F12(10％FBS，F12全血清培养基)复苏冻存的第三代细胞，于细胞长满后，传代培养两代，待细胞稳定后，逐步降低血清含量继续培养，具体为DMEM/F12(8％FBS)培养两代，DMEM/F12(6％FBS)培养两代；更换低血清培养基继续培养细胞，首先用含5％FBS胎牛血清的LMSC低血清培养基培养三代，细胞生长良好，逐步降低血清含量为3％、1％、0.5％，各代次细胞仍可以正常生长。培养条件为：在37℃，5％CO₂培养箱中培养48h。

(3)细胞的无血清悬浮驯化

选取0.5％低血清培养基稳定培养传代的细胞，用0.25％的胰酶消化，调整细胞数为0.6×10⁶个/mL重悬于20mL的LMSC无血清悬浮培养基，并转移至一次性三角锥瓶，置37℃、含5％CO₂的细胞培养箱中150rpm条件下培养3日。用细胞计数板计数约为2.0×10⁶个/mL，细胞大小均匀，透亮，无结团。继续传代培养，收集摇瓶培养的细胞悬液离心，弃上清，每3天按照0.6×10⁶个/mL的细胞数传代，期间观察细胞形态，状态良好，继续传代，大约可连续传代至60代左右。同样选取细胞代次靠前，形态良好的批次进行冻存。

2、接种水禽病毒

2.1接种鸭甲型肝炎病毒DHAV-1

(1)细胞毒的适应性培养

取一瓶(25cm²)已生长成良好单层的鸭肝间充质干细胞，用PBS清洗2次，接种病毒含量为10^6.0ELD₅₀/0.1mL的胚毒0.2mL，置37℃吸附1.5h，弃去毒液，添加2％的DMEM/F12维持液。每天观察细胞，48小时，细胞开始拉网，收缩，产生病变。收获此时的细胞培养物，冻融2次。500×g，4℃，离心10min，收集上清作为F1代病毒。继续传代病毒，直至传至20代，期间按同样方法收获病毒液，于-70℃保存。

将各代次的病毒液用灭菌生理盐水进行10倍倍比稀释，然后选取适宜的稀释度接种9-11日龄的SPF鸡胚尿囊腔，0.1mL/胚，每天照胚，观察至120h，弃去24小时内的非特异性死亡的鸡胚，统计死胚数量计算ELD₅₀。结果显示，病毒液病毒含量为10^8.0ELD₅₀/0.1mL。

(2)悬浮细胞接种病毒

取生长状态良好的鸭肝间充质干细胞悬浮细胞，细胞密度应不低于5×10⁶个/mL，各100mL，转移至新的三角锥瓶中，加入LMSC无血清悬浮培养基100mL，同时按终体积(200mL)的1/10000比例加入F12代细胞毒DHAV-1(病毒含量不低于10^8.0ELD₅₀/0.1mL)，和TPCK胰酶浓度为2μg/mL(终体积200mL)，置35℃、150rpm含5％CO₂的培养箱内培养72～84h，取样对细胞进行镜检，细胞已基本裂解，死亡。收获感染毒液，冻融后测定病毒含量。按照上述步骤(1)中的病毒含量测定方法计算ELD₅₀。结果显示，72小时收获的病毒液病毒含量为10^8.32ELD₅₀/0.1mL。

2.2接种鸭坦布苏病病毒JS-F10株

(1)细胞毒的适应性培养

取一瓶(25cm²)已生长成良好单层的鸭肝间充质干细胞，用PBS清洗2次，接种病毒含量为10^5.83ELD₅₀/0.1mL的组织毒0.2mL，置37℃吸附1.5h，弃去毒液，添加2％的DMEM/F12维持液，每天观察细胞。延续传代病毒，直至传至20代。将各代次的细胞培养物，冻融2次，500×g，4℃，离心10min，收集上清。F1代病毒在细胞120h内并未产生病变，F2代病毒在细胞72h时开始收缩，拉网，死细胞增多，产生病变。期间按同样方法收获病毒液，于-70℃保存。

将各代次的病毒液用灭菌生理盐水进行10倍倍比稀释，然后选取适宜的稀释度接种9-11日龄的SPF鸭胚尿囊腔，0.1mL/胚，每天照胚，观察至120h，弃去24小时内的非特异性死亡的鸭胚，统计死胚数量计算ELD₅₀。结果显示，病毒液病毒含量为10^8.16ELD₅₀/0.1mL。

(2)悬浮细胞接毒

选取生长状态良好的鸭肝间充质干细胞悬浮细胞，细胞密度应不低于5×10⁶个/mL，各100mL，转移至新的三角锥瓶中，加入LMSC无血清悬浮培养基100mL，同时按终体积(200mL)的1/10000比例加入F15代细胞毒(病毒含量不低于10^8.0ELD₅₀/0.1mL)，和TPCK胰酶浓度为2μg/mL(终体积200mL)，置35℃、150rpm含5％CO₂的培养箱内培养72～120h，取样对细胞进行镜检，细胞已基本裂解，死亡。收获感染毒液，冻融后测定病毒含量。按照前述同样的病毒含量测定方法计算ELD₅₀。结果显示，120小时收获的病毒液病毒含量为10^8.5ELD₅₀/0.1mL。

上述实施例仅为本发明的优选实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种麻鸭鸭胚肝间充质干细胞的悬浮驯化方法，其特征在于，包括：

2.如权利要求1所述的麻鸭鸭胚肝间充质干细胞的悬浮驯化方法，其特征在于，所述步骤1中低血清驯化的具体方法为：依次采用含10％FBS、8％FBS和6％FBS的DMEM/F12培养基培养两代，再依次采用含5％FBS、3％FBS、1％FBS、0.5％FBS的LMSC低血清培养基培养三代，期间观察细胞生长状态。

3.如权利要求1所述的麻鸭鸭胚肝间充质干细胞的悬浮驯化方法，其特征在于，所述步骤2中无血清悬浮驯化的具体方法为：选取含0.5％FBS的LMSC低血清培养基稳定培养传代的细胞，用0.25％的胰酶消化，调整细胞数为0.6×10⁶个/mL重悬于LMSC无血清培养基中进行传代培养，期间每传代一次更换新鲜的LMSC无血清培养基并观察细胞生长状态。

4.如权利要求3所述的麻鸭鸭胚肝间充质干细胞的悬浮驯化方法，其特征在于，所述于LMSC无血清培养基中进行传代培养的具体条件为：在37℃、含5％CO₂的环境中于150rpm搅拌条件下培养3日。

5.权利要求1～4中任意一项所述的麻鸭鸭胚肝间充质干细胞的悬浮驯化方法所得的悬浮无血清鸭胚肝间充质干细胞在接种水禽病毒中的应用。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的水禽病毒包括鸭甲型肝炎病毒DHAV1型和鸭坦布苏病病毒JS-F10株。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述水禽病毒的接种工艺包括：将水禽病毒在贴壁生长的鸭胚肝间充质干细胞中适应性培养后接种于悬浮无血清鸭胚肝间充质干细胞中增殖培养。