CN111676185A - 一种全悬浮培养型mdck细胞系的驯化方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及细胞培养领域，特别涉及一种全悬浮培养型MDCK细胞系的驯化方法，本发明通过将贴壁型MDCK细胞驯化为低血清全悬浮培养型MDCK细胞系以及无血清全悬浮培养型MDCK细胞系，可以替代传统鸡胚生产禽流感病毒，提高后续分离纯化效率，推进工艺的进一步升级，降低成本的同时也简化了培养工艺且更易于产业化。

Description

一种全悬浮培养型MDCK细胞系的驯化方法
技术领域
本发明涉及细胞培养技术领域，具体涉及一种全悬浮培养型MDCK细胞系的驯化方法。
背景技术
禽流感(Bird Flu或Avian Influenza）是由甲型流感病毒的亚型(也称禽流感病毒）引起的一种急性传染病，能够感染人类，且人感染禽流感后的死亡率在30％以上。目前为止禽流感仍未找到理想的治疗药物，疫苗接种仍是当今防止疫病发生和流行的最有效手段。
禽流感疫苗的传统生产工艺是鸡胚培养法，这种以鸡胚作为生产基质的方式已使用多年，工艺成熟，但生产周期长、操作繁琐、工作量大、易污染，如遇禽流感大规模爆发，鸡胚的供应存在很大问题。以细胞作为介质是目前疫苗制备的趋势，犬肾(Madin-Darbycanine kidney cells，MDCK）细胞由Madin和Darby分离培育建立，培养容易、增殖快、流感病毒感染效率高，是国内外公认的最适合禽流感病毒培养的细胞系。其通常是以贴壁培养生长，细胞之间互相衔接或呈镶嵌状排列，并会在表面集合形成紧密的连接蛋白，从而形成单层贴壁细胞。但是，该培养方式存在一些缺陷，比如贴壁培养受基质表面积限制导致病毒产量下降；贴壁培养过程中换液等程序较为复杂繁琐，血清的使用易受微生物、病毒和支原体等的污染，无血清培养技术是阐明细胞生成、增殖、分化以及基因表达调控的基础问题的有效工具，但即使无血清贴壁培养也只适用于试验研究，不适用于大规模培养，不能满足病毒疫苗等实际生产需要。因此，驯化MDCK细胞使之适应低血清或无血清悬浮培养、以之作为载体生产禽流感病毒疫苗，是成为制备下一代安全、有效、质量可控的流感疫苗的关键。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种全悬浮培养型MDCK细胞系的驯化方法，使其适用于大规模悬浮培养，具有细胞密度大、放大倍数大、传代方便等优势，并且本发明简化了驯化过程，培养的MDCK细胞系可应用于禽流感疫苗的生产中。
为实现本发明的上述目的，采用如下技术方案：一种全悬浮培养型MDCK细胞系的驯化方法，包括如下步骤：
步骤一、将DMEM、F12和RPMI1640按照一定比例进行混合均匀，以此为基础培养基，分别添加12%、8%、5%、3%、1%、0%胎牛血清配置成有血清DMEM-F12-RPMI1640培养基或无血清DMEM-F12-RPMI1640培养基；
步骤二、复苏一支贴壁培养型MDCK细胞，用步骤一所述含12%胎牛血清的DMEM-F12-RPMI1640进行接种培养，培养条件为37℃，5%CO2，pH7.0-7.4；待细胞贴壁、培养瓶中单层汇合度达90%以上后，完全弃去培养液，用0.25%EDTA-胰酶消化分散，按照常规方法传代培养2-3代；
步骤三、将步骤二所获得的贴壁培养型MDCK细胞分别用含胎牛血清8%、5%、3%的DMEM-F12-RPMI1640培养基依次各培养3代，传代比例按1：3分瓶，培养条件为37℃，5%CO2，pH7.0-7.4，得到了低血清贴壁培养型MDCK细胞系；
步骤四、将10%前一阶段细胞培养离心后的上清液加入到含1%胎牛血清的DMEM-F12-RPMI1640培养基中制成混合培养基1，用所述混合培养基1将步骤三最后一代所获得的细胞密度调整至5×105cells/ml，培养条件为37℃，5%CO2，50r/min摇床培养；
步骤五、待细胞密度达到1×106cells/ml时，将10%前一阶段细胞培养离心后的上清液加入到含1%胎牛血清的DMEM-F12-RPMI1640培养基中制成混合培养基2，用所述混合培养基2按1：2比例分瓶培养；待细胞密度达到2×106cells/ml时，用含1%胎牛血清的DMEM-F12-RPMI1640培养基和无血清的DMEM-F12-RPMI1640培养基等体积混合制成混合培养基3，用所述混合培养基3按1：3比例分瓶培养；连续传代五次后，驯化得到低血清全悬浮培养型MDCK细胞系。
其中，所述DMEM、F12和RPMI1640是按照2-3∶1-2∶0.5-1的比例进行混合均匀作为基础培养基。
进一步的，所述DMEM、F12和RPMI1640是按照3∶1∶1的比例进行混合均匀作为基础培养基。
进一步的，所述一种全悬浮培养型MDCK细胞系的驯化方法，还包括如下步骤：
步骤六、用无血清的DMEM-F12-RPMI1640培养基将步骤五中最后一代低血清全悬浮培养型MDCK细胞直接稀释到密度5×105cells/ml，继续培养5-7代，培养条件为37℃，5%CO2，110r/min摇床培养，驯化得到无血清全悬浮培养型MDCK细胞系。
本发明还提供全悬浮培养型MDCK细胞在无血清培养基中的培养方法，包括如下步骤：
1）复苏一支全悬浮培养型MDCK细胞，加25ml无血清的DMEM-F12-RPMI1640培养基，培养条件为50r/min、37℃、5％CO2摇床培养；
2）当细胞生长至2×106cells/ml以上时，用无血清的DMEM-F12-RPMI1640培养基将细胞稀释至密度为5×105cells/ml，培养条件为70-120r/min、37℃、5％CO2摇床培养；
3）重复3-5次；转入3L生物反应器培养；
4）接种密度为8×105cells/ml，加入2L无血清的DMEM-F12-RPMI1640培养基进行扩大培养，培养条件为110r/min、温度37℃、溶氧20-70％、pH7.0-7.4。
本发明的另一个目的在于提供一种全悬浮培养型MDCK细胞系，该MDCK细胞系的细胞密度高，呈单个分散生长，形态饱满，大小均一，活性大，适用于生物反应器无血清悬浮培养。
本发明的另一个目的在于提供一种全悬浮培养型MDCK细胞系在制备禽流感病毒疫苗中的应用。
本发明提供的一种全悬浮培养型MDCK细胞系的驯化方法中，主要包括贴壁培养型MDCK细胞系的培养，确定在细胞生长正常的情况下再用于驯化；然后依次进行低血清贴壁培养型MDCK细胞系的驯化、低血清全悬浮培养型MDCK细胞系的驯化以及无血清全悬浮培养型MDCK细胞系的驯化。通过逐步降低血清添加比例、增加无血清培养基的比例，而使细胞逐步适应无血清培养，达到在无血清培养基中细胞悬浮培养活力高、结团少、均一性好的目的。
相比于现有技术，本发明的有益效果为：本发明提供的细胞驯化方法及得到的可全悬浮培养的MDCK细胞，该细胞可适应低血清和无血清全悬浮培养，培养批次内细胞密度大，有利于培养基中的营养物质和细胞充分接触，而且易于在连续密闭的系统中进行，减少了污染的几率，悬浮培养的细胞仍保持原本对病毒的敏感性和生物学特性；此外还便于连续扩大生产，容易控制培养条件如温度、pH和CO2等，安全性有保证，能够大幅度降低实际生产中的场地和人力投入，有利于大规模生产，产生可观地经济效益。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。
图1为驯化前贴壁培养型MDCK细胞形态图；
图2为经低血清培养基驯化的悬浮培养型MDCK细胞形态图；
图3为经无血清培养基驯化的悬浮培养型MDCK细胞形态图。
具体实施方式
以下介绍本发明的全悬浮培养型MDCK细胞系的驯化方法的具体实施方式，应该指出，本发明的实施不限于以下的实施方式。
实施例
1、实验材料 冻存的贴壁培养型MDCK细胞系，DMEM、F12、RPMI1640培养基，0.25%EDTA胰蛋白酶，台盼蓝染色液，细胞方瓶，细胞摇瓶，移液器。
2、仪器和设备 CO2培养箱、轨道式振荡器、倒置显微镜、Countstar 细胞计数仪、低速冷冻离心机。
3、方法
3.1 MDCK细胞无血清全悬浮驯化
步骤一、将DMEM、F12和RPMI1640按照3∶1∶1的比例进行混合均匀，以此为基础培养基，分别添加12%、8%、5%、3%、1%、0%胎牛血清配置成有血清DMEM-F12-RPMI1640培养基或无血清DMEM-F12-RPMI1640培养基；
步骤二、复苏一支贴壁培养型MDCK细胞，用步骤一所述含12%胎牛血清的DMEM-F12-RPMI1640进行接种培养，培养条件为37℃，5%CO2，pH7.2；待细胞贴壁、培养瓶中单层汇合度达95%后，完全弃去培养液，用0.25%EDTA-胰酶消化分散，按照常规方法传代培养3代，细胞边缘清晰，形态扁平，生长正常可用于驯化；
步骤三、将步骤二所获得的贴壁培养型MDCK细胞分别用含胎牛血清8%、5%、3%的DMEM-F12-RPMI1640培养基依次各培养3代，传代比例按1：3分瓶，培养条件为37℃，5%CO2，pH7.2，得到了低血清贴壁培养型MDCK细胞系；
步骤四、将10%前一阶段细胞培养离心后的上清液加入到含1%胎牛血清的DMEM-F12-RPMI1640培养基中制成混合培养基1，用所述混合培养基1将步骤三最后一代所获得的细胞密度调整至5×105cells/ml，培养条件为37℃，5%CO2，50r/min摇床培养；
步骤五、待细胞密度达到1×106cells/ml时，将10%前一阶段细胞培养离心后的上清液加入到含1%胎牛血清的DMEM-F12-RPMI1640培养基中制成混合培养基2，用所述混合培养基2按1：2比例分瓶培养；待细胞密度达到2×106cells/ml时，用含1%胎牛血清的DMEM-F12-RPMI1640培养基和无血清的DMEM-F12-RPMI1640培养基等体积混合制成混合培养基3，用所述混合培养基3按1：3比例分瓶培养；连续传代五次后，驯化得到低血清全悬浮培养型MDCK细胞系；
步骤六、用无血清的DMEM-F12-RPMI1640培养基将步骤五中最后一代低血清全悬浮培养型MDCK细胞直接稀释到密度5×105cells/ml，继续培养6代，培养条件为37℃，5%CO2，110r/min摇床培养，驯化得到无血清全悬浮培养型MDCK细胞系。
3.2 全悬浮培养型MDCK细胞的检定
1）无菌检验：全悬浮培养型MDCK细胞培养的上清液接种到硫乙醇酸盐培养基、酪胨琼脂培养基(斜面)和葡萄糖蛋白胨培养基中培养均为阴性；
2）支原体检验：全悬浮培养型MDCK细胞培养的上清液接种到支原体液体培养基和支原体固体培养基中培养均为阴性。
3.3 不同接种密度下MDCK细胞的生长特性
设置组1、2、3分别以5×105cells/ml、7.5×105cells/ml、10×105cells/ml对无血清全悬浮培养型MDCK细胞进行接种培养，培养条件为37℃、5％CO2和110r/min摇床培养，每24h取样观察计数。
4、结果
4.1将MDCK细胞经滚瓶培养，长满单层得到贴壁状态的MDCK细胞。并按照试验例所述方法驯化培养全悬浮的MDCK细胞，对驯化后的MDCK细胞形态与贴壁培养的细胞进行对比，结果如图1-3所示。图1显示需血清贴壁培养状态下MDCK细胞贴附于培养介质表面，呈镶嵌的铺路石状；图2显示本发明低血清培养基培养的全悬浮MDCK细胞有结团现象，细胞形态较饱满，边界较光滑，细胞大小均一；图3显示本发明无血清培养基培养的全悬浮MDCK细胞呈单个分散生长状，无结团现象，细胞形态饱满完整，边界光滑清晰，细胞大小均一，质量高。
4.2以5×105cells/ml、7.5×105cells/ml、10×105cells/ml对无血清全悬浮培养型MDCK细胞进行接种培养，由表1可见在5-10×105cells/ml接种范围内细胞活率都保持在90%以上，并保持较快生长速率。但由于随着细胞密度的增加，营养物质消耗速度加快，为了给予MDCK细胞充足的营养环境并降低成本，最适宜的接种密度可选择7.5×105cells/ml。
表1 不同接种密度下MDCK细胞培养结果表
Figure DEST_PATH_IMAGE001
以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制，但凡采用等同替换或等效变换的形式所获得的技术方案，均应落在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种全悬浮培养型MDCK细胞系的驯化方法，其特征在于，包括如下步骤：
1) 利用DMEM、F12和RPMI1640的混合培养基进行贴壁MDCK细胞的传代与培养；
2) 利用有血清及无血清的DMEM、F12和RPMI1640的混合培养基将贴壁细胞进一步驯化为全悬浮细胞。
2.根据权利要求1所述一种全悬浮培养型MDCK细胞系的驯化方法，其特征在于，具体包括如下步骤：
步骤一、将DMEM、F12和RPMI1640按照2-3∶1-2∶0.5-1比例进行混合均匀，以此为基础培养基，分别添加12%、8%、5%、3%、1%、0%胎牛血清配置成有血清DMEM-F12-RPMI1640培养基或无血清DMEM-F12-RPMI1640培养基；
步骤二、复苏一支贴壁培养型MDCK细胞，用步骤一所述含12%胎牛血清的DMEM-F12-RPMI1640进行接种培养，培养条件为37℃，5%CO2，pH7.0-7.4；待细胞贴壁、培养瓶中单层汇合度达90%以上后，完全弃去培养液，用0.25%EDTA-胰酶消化分散，按照常规方法传代培养2-3代；
步骤三、将步骤二所获得的贴壁培养型MDCK细胞分别用含胎牛血清8%、5%、3%的DMEM-F12-RPMI1640培养基依次各培养3代，传代比例按1：3分瓶，培养条件为37℃，5%CO2，pH7.0-7.4，得到了低血清贴壁培养型MDCK细胞系；
步骤四、将10%前一阶段细胞培养离心后的上清液加入到含1%胎牛血清的DMEM-F12-RPMI1640培养基中制成混合培养基1，用所述混合培养基1将步骤三最后一代所获得的细胞密度调整至5×105cells/ml，培养条件为37℃，5%CO2，50r/min摇床培养；
步骤五、待细胞密度达到1×106cells/ml时，将10%前一阶段细胞培养离心后的上清液加入到含1%胎牛血清的DMEM-F12-RPMI1640培养基中制成混合培养基2，用所述混合培养基2按1：2比例分瓶培养；待细胞密度达到2×106cells/ml时，用含1%胎牛血清的DMEM-F12-RPMI1640培养基和无血清的DMEM-F12-RPMI1640培养基等体积混合制成混合培养基3，用所述混合培养基3按1：3比例分瓶培养；连续传代五次后，驯化得到低血清全悬浮培养型MDCK细胞系。
3.根据权利要求2所述一种全悬浮培养型MDCK细胞系的驯化方法，其特征在于，还包括如下步骤：
步骤六、用无血清的DMEM-F12-RPMI1640培养基将步骤五中最后一代低血清全悬浮培养型MDCK细胞直接稀释到密度5×105cells/ml，继续培养5-7代，驯化得到无血清全悬浮培养型MDCK细胞系。
4.根据权利要求3所述一种全悬浮培养型MDCK细胞系的驯化方法，其特征在于，所述步骤六中，培养条件为110r/min摇床培养、温度37℃、溶氧20-70％、pH7.0-7.4。
5.根据权利要求1-4任一项所述的驯化方法得到的全悬浮培养型MDCK细胞系。
6.一种根据权利要求1-4任一项所述的驯化方法获得的MDCK细胞系在制备流感病毒疫苗中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，所述的流感病毒为禽流感病毒。
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