CN106011083A - 一种在无血清全悬浮培养的mdck细胞生长的禽流感病毒的制备方法及获得的禽流感病毒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种适应在无血清全悬浮培养的MDCK细胞系生长的禽流感病毒的制备方法及通过该方法获得的禽流感病毒，包括以下步骤：1)制备待接种的MDCK细胞；2)准备毒种：准备鸡胚源禽流感病毒；3)F1代病毒驯化：4)F2代病毒驯化：取F1代中禽流感病毒血凝效价最高的时间点所留取的上清液样本，重复步骤3)；5)F3代病毒驯化：培养F3代病毒的温度为35℃；6)F4～F10代病毒驯化：重复步骤5)，得到驯化完成的禽流感病毒；本发明的驯化方法将禽流感病毒从使用鸡胚培养直接驯化到完全适应在无血清悬浮培养的MDCK细胞上高效繁殖，驯化效率高，禽流感病毒可在MDCK细胞中高效感染复制，病毒特性稳定。

Description

一种在无血清全悬浮培养的MDCK细胞生长的禽流感病毒的制 备方法及获得的禽流感病毒

技术领域

本发明涉及病毒培养驯化领域，具体涉及一种适应在无血清全悬浮培养的MDCK细胞系生长的禽流感病毒的制备方法及通过该方法获得的禽流感病毒。

背景技术

我国目前生产的H9亚型禽流感灭活疫苗都采用鸡胚作为病毒生长载体，疫苗成本偏高，且没办法应对急性大规模的禽流感流行。目前已有少数厂家采用贴壁MDCK细胞培养方法制备H5禽流感疫苗，然而，在单细胞层培养体系中，细胞的增殖受到基质表面积的限制，很难实现大规模培养，消化过程也增加了工艺的复杂性、生产时间和成本。无血清悬浮培养可以突破细胞生长表面的限制，无需昂贵的微载体和添加血清，还可以节约设备空间，提高设备的利用率，便于扩大生产规模。另外，因生产过程中无需微载体和消化液，从而可大大减少产品杂质的引入，简化产品的后期分离纯化过程，有效降低生产成本。故而，将鸡胚培养的禽流感病毒驯化为适应在无血清悬浮培养MDCK细胞上高效繁殖，对于提高禽流感病毒的生产效率，并且对于禽流感疫苗的生产，皆具有重大意义。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供一种适应在无血清全悬浮培养的MDCK细胞系生长的禽流感病毒的制备方法，本 发明的驯化到适应在无血清悬浮培养MDCK细胞上高效繁殖，完全摆脱了对鸡胚的依赖，也摆脱了贴壁细胞培养规模的限制，驯化效率高，禽流感病毒可在MDCK细胞中高效感染复制，病毒特性稳定。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：一种适应在无血清全悬浮培养的MDCK细胞系生长的禽流感病毒的制备方法，包括以下步骤：

1)制备待接种的适应无血清全悬浮培养的MDCK细胞：将MDCK细胞装入摇瓶，在转速130rpm，温度37℃、通入浓度为5％的CO₂的条件下，置于培养箱中培养；然后每12h取样一次，进行细胞计数；在MDCK细胞处于对数生长期时，用新鲜的无血清培养基稀释至MDCK细胞密度为0.5×10⁶cells/mL，并以此为MDCK细胞起始密度，然后将MDCK细胞培养72h，得到待接种的适应无血清全悬浮培养的MDCK细胞；

2)准备毒种：准备鸡胚源禽流感病毒；

3)F1代病毒驯化：按培养基体积的1‰接毒量将步骤2)的鸡胚源禽流感病毒接种于步骤1)中获得的待接种的MDCK细胞中，并加入5μg/mL的TPCK-胰酶进行培养；每12h检测病毒血凝效价和病毒滴度并留取F1代培养基上清液样本，连续观察96h；培养F1代病毒的温度为37℃；

4)F2代病毒驯化：取F1代中病毒血凝效价最高的时间点所留取的F1代培养基上清液样本，重复步骤3)的过程，即将F1代培养基上清液样本接种到新的待接种的MDCK细胞中，并检测病毒血 凝效价和病毒滴度和留取F2代培养基上清液样本；培养F2代病毒的温度为37℃；

5)F3代病毒驯化：取F2代中病毒血凝效价最高的时间点所留取的F2代培养基上清液样本，重复步骤3)的过程，即将F2代培养基上清液样本接种到新的待接种的MDCK细胞中，并检测病毒血凝效价和病毒滴度和留取F3代培养基上清液样本；培养F3代病毒的温度为35℃；

6)F4～F10代病毒驯化：重复步骤5)的过程培养F4～F10代，得到驯化完成的禽流感病毒。

作为本发明的一种优选的方案：步骤1)中，所述装入摇瓶并置于培养箱中培养的MDCK细胞为通过无血清培养基从MDCK贴壁细胞驯化为全悬浮培养的MDCK细胞。

作为本发明的一种优选的方案：所述全悬浮培养的MDCK细胞通过以下步骤得到：

Ⅰ)将需血清贴壁培养的MDCK细胞用培养基培养至细胞汇合度达到80～90％时，弃去培养MDCK细胞的培养基，用胰酶溶液清洗细胞层后弃去溶液；再次加入胰酶溶液至覆盖MDCK细胞进行消化5～15min；待细胞变圆后加入含胎牛血清的培养基终止消化；然后收集细胞悬液，并将细胞悬液离心后弃上清，获得细胞团；

Ⅱ)将步骤Ⅰ)中获得的细胞团用无血清培养基进行重悬至细胞密度1.3～1.6×10⁶cells/mL，获得细胞重悬液；

Ⅲ)将步骤Ⅱ)中获得的细胞重悬液加入方瓶，在转速30rpm、 温度37℃、5％CO₂的条件下置于摇床中并放入培养箱中培养，经过2代培养后将培养的细胞重悬液转入摇瓶，转速提升至120rpm；每隔48h用新鲜的无血清培养基将细胞重悬液稀释至细胞密度为1.3～1.6×10⁶cells/mL，进行传代，获得适应无血清全悬浮培养的MDCK细胞。

作为本发明的一种优选的方案：所述无血清培养基按浓度计，包括以下组分：

基础代谢营养物:

核苷酸:

维生素:

无机盐：

剪切力保护剂： 500～2500mg/L；

抗细胞结团剂： 20～150mg/L；

酸碱度缓冲剂：

碳酸氢钠 1000～3000mg/L；

酸碱度指示剂：

酚红 5～15mg/L；

流感病毒增殖促进剂：

其它添加物：

作为本发明的一种优选的方案：所述剪切力保护剂为嵌段式聚醚F68。

作为本发明的一种优选的方案：所述抗细胞结团剂为硫酸葡聚糖。

作为本发明的一种优选的方案：将原料混合后磨成细粉，然后将所得细粉于10～30℃溶剂中溶解，得到混合液；调节混合液的pH至6.3～6.7，定容后得到无血清培养基。

作为本发明的一种优选的方案：所述禽流感病毒为H9N2亚型禽流感病毒。

作为本发明的一种优选的方案：所述步骤2)中，鸡胚源禽流感病毒的病毒含量≥10^6.0EID₅₀/0.1mL。

本发明的另一个目的在于提供一种禽流感病毒，该禽流感病毒可 在MDCK细胞中高效感染复制，病毒特性稳定，病毒含量和HA血凝效价皆有所提高。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：通过上述的制备方法获得。

本发明的有益效果在于：

1、本发明的驯化方法将禽流感病毒从使用鸡胚培养直接驯化到完全适应在无血清悬浮培养的MDCK细胞上高效繁殖，无需经历贴壁细胞过程，完全摆脱了对鸡胚的依赖，也摆脱了贴壁细胞培养规模的限制，驯化效率高，禽流感病毒可在MDCK细胞中高效感染复制，病毒特性稳定；

2、本发明所使用的无血清培养基不含动物血清、成本低；支持MDCK单细胞高密度全悬浮培养并可同时用于禽流感病毒的细胞培养，其成分明确、容易配制并且使用方便；

3、本发明将需血清贴壁培养的MDCK贴壁细胞驯化为适应无血清全悬浮培养的MDCK细胞，驯化时间短，获得的全悬浮培养的MDCK细胞形态饱满，大小均一，活性大，有利于禽流感病毒的接种和培养；

4、通过驯化方法获得的禽流感病毒在全悬浮培养MDCK细胞中可高效感染复制，病毒特性稳定，病毒含量和HA血凝效价皆有所提高，获得的禽流感病毒适用于生物反应器培养并制备禽流感疫苗半成品。

附图说明

图1为实施例4中贴壁状态下MDCK细胞形态图；

图2为实施例4中经本发明无血清培养基驯化下的MDCK细胞形态图；

图3为实施例4中采用Hyclone公司无血清培养基SFM4 Mega Vir通过直接驯化法得到的悬浮培养的MDCKS细胞形态图；

图4为实施例4中采用Gibco公司开发的商业无血清培养基SMI F8间接法驯化得到的MDCK.SUS2细胞形态图；

图5为实施例5中活细胞密度和细胞活性曲线图。

具体实施方式

下面，结合具体实施方式，对本发明做进一步描述：

一、制备无血清培养基：

所述无血清培养基按浓度计，包括以下组分：

基础代谢营养物:

核苷酸:

维生素:

无机盐：

剪切力保护剂：

嵌段式聚醚F68 500～2500mg/L；

抗细胞结团剂：

硫酸葡聚糖 20～150mg/L；

酸碱度缓冲剂：

碳酸氢钠 1000～3000mg/L；

酸碱度指示剂：

酚红 5～15mg/L；

流感病毒增殖促进剂：

其它添加物：

其中，核苷酸中选用次黄嘌呤和胸苷，能促进MDCK细胞的核苷酸合成，保证细胞的生长；次黄嘌呤和胸苷成分太高，会抑制细胞生长；

其中，其他添加物中选用柠檬酸铁铵，用以替代转铁蛋白发挥其原有作用，不影响细胞生长与铁代谢，且能减少无血清培养基中的动物蛋白成分，降低培养基成本和对生产的不确定性和不安全性；柠檬酸铁铵依靠二价金属离子通道DMT1吸收铁，转铁蛋白通过转铁蛋白受体吸收铁，前者比后者提高了MDCK细胞对铁的吸收速率；柠檬酸铁铵成分浓度过高会抑制MDCK细胞生长；浓度太低，MDCK细胞对铁的吸收不足；

其中，其它添加物中胰岛素的浓度在2～15mg/L，能促进葡萄糖代谢，保证MDCK细胞的生长和维持MDCK细胞的活性；

其中，其它添加物中大豆水解物的浓度在1000～5000mg/mL，能保证维生素、金属离子、氨基酸等其他辅因子的供给，提高MDCK细胞对氨基酸的摄取；

将原料混合后磨成细粉，然后将所得细粉于10～30℃溶剂中溶解，得到混合液；调节混合液的pH至6.3～6.7，定容后得到无血清培养基。

二、制备全悬浮培养的MDCK细胞：

Ⅰ)将需血清贴壁培养的MDCK细胞用培养基培养至细胞汇合度达到80～90％时，弃去培养MDCK细胞的培养基，用胰酶溶液清 洗细胞层后弃去溶液；再次加入胰酶溶液至覆盖MDCK细胞进行消化5～15min；待细胞变圆后加入含胎牛血清的培养基终止消化；然后收集细胞悬液，并将细胞悬液离心后弃上清，获得细胞团；

Ⅱ)将步骤Ⅰ)中获得的细胞团用无血清培养基进行重悬至细胞密度1.3～1.6×10⁶cells/mL，获得细胞重悬液；

Ⅲ)将步骤Ⅱ)中获得的细胞重悬液加入方瓶，在转速30rpm、温度37℃、5％CO₂的条件下置于摇床中并放入培养箱中培养，经过2代培养后将培养的细胞重悬液转入摇瓶，转速提升至120rpm；每隔48h用新鲜的无血清培养基将细胞重悬液稀释至细胞密度为1.3～1.6×10⁶cells/mL，进行传代，获得适应无血清全悬浮培养的MDCK细胞。

三、一种适应在无血清全悬浮培养的MDCK细胞系生长的禽流感病毒的制备方法，包括以下步骤：

1)制备待接种的适应无血清全悬浮培养的MDCK细胞：将MDCK细胞装入摇瓶，在转速130rpm，温度37℃、通入浓度为5％的CO₂的条件下，置于培养箱中培养；然后每12h取样一次，进行细胞计数；在MDCK细胞处于对数生长期时，用新鲜的无血清培养基稀释至MDCK细胞密度为0.5×10⁶cells/mL，并以此为MDCK细胞起始密度，然后将MDCK细胞培养72h，得到待接种的适应无血清全悬浮培养的MDCK细胞；

2)准备毒种：准备鸡胚源H9N2亚型禽流感病毒；禽流感病毒的病毒含量≥10^6.0EID₅₀/0.1mL；

3)F1代病毒驯化：按培养基体积的1‰接毒量将步骤2)的鸡胚源禽流感病毒接种于步骤1)中获得的待接种的MDCK细胞中，并加入5μg/mL的TPCK-胰酶进行培养；每12h检测病毒血凝效价和病毒滴度并留取F1代培养基上清液样本，连续观察96h；培养F1代病毒的温度为37℃；

4)F2代病毒驯化：取F1代中病毒血凝效价最高的时间点所留取的F1代培养基上清液样本，重复步骤3)的过程，即将F1代培养基上清液样本接种到新的待接种的MDCK细胞中，并检测病毒血凝效价和病毒滴度和留取F2代培养基上清液样本；培养F2代病毒的温度为37℃；

5)F3代病毒驯化：取F2代中病毒血凝效价最高的时间点所留取的F2代培养基上清液样本，重复步骤3)的过程，即将F2代培养基上清液样本接种到新的待接种的MDCK细胞中，并检测病毒血凝效价和病毒滴度和留取F3代培养基上清液样本；培养F3代病毒的温度为35℃；

6)F4～F10代病毒驯化：重复步骤5)的过程培养F4～F10代，得到驯化完成的禽流感病毒。

具体实施例

实施例1-3用于说明无血清培养基的效果：

实施例1

所述无血清培养基按浓度计，包括以下组分：

基础代谢营养物:

核苷酸:

维生素:

无机盐：

剪切力保护剂：

嵌段式聚醚F68 1600mg/L；

抗细胞结团剂：

硫酸葡聚糖 50mg/L；

酸碱度缓冲剂：

碳酸氢钠 2200mg/L；

酸碱度指示剂：

酚红 8mg/L；

流感病毒增殖促进剂：

其它添加物：

将原料混合后磨成细粉，然后将所得细粉于10～30℃溶剂中溶解，得到混合液；调节混合液的pH至6.5，定容后得到无血清培养基。

实施例2

所述无血清培养基按浓度计，包括以下组分：

基础代谢营养物:

核苷酸:

维生素:

无机盐：

剪切力保护剂：

嵌段式聚醚F68 1000mg/L；

抗细胞结团剂：

硫酸葡聚糖 25mg/L；

酸碱度缓冲剂：

碳酸氢钠 2200mg/L；

酸碱度指示剂：

酚红 8mg/L；

流感病毒增殖促进剂：

其它添加物：

将原料混合后磨成细粉，然后将所得细粉于10～30℃溶剂中溶解，得到混合液；调节混合液的pH至6.4，定容后得到无血清培养基。

实施例3

所述无血清培养基按浓度计，包括以下组分：

基础代谢营养物:

核苷酸:

维生素:

无机盐：

剪切力保护剂：

嵌段式聚醚F68 2200mg/L；

抗细胞结团剂：

硫酸葡聚糖 100mg/L；

酸碱度缓冲剂：

碳酸氢钠 2200mg/L；

酸碱度指示剂：

酚红 8mg/L；

流感病毒增殖促进剂：

其它添加物：

将原料混合后磨成细粉，然后将所得细粉于10～30℃溶剂中溶解，得到混合液；调节混合液的pH至6.7，定容后得到无血清培养基。

将实施例1-3获得的培养基培养MDCK细胞并进行特性试验：

1、仪器：Bio-Bundle生物反应器(购自荷兰Applikon Biotechnology公司)，罐体体积为3L；

2、用于对照的MDCK细胞通过商品化无血清培养基SFM4 Mega Vir(购自Hyclone公司)培养得到；

3、培养方法：以0.5×10⁶cells/mL的细胞密度接种细胞至生物反应器中，在37℃、通入浓度为5％的CO²的条件下进行批培养，每24h取样进行活细胞计数，并计算细胞生长速率；结果如表1、表2所示：

表1最高活细胞密度(10⁶cells/mL)

表2细胞生长速率及倍增时间

与对照组商业化无血清培养基SFM4 Mega Vir悬浮培养的MDCK细胞相比，采用本发明所提供的无血清培养基，在培养过程中支持的活细胞密度有大幅度的增长；此外，在非指数生长期细胞的比生长速率从对照的0.57d^-1最大增长到实施例1中的0.91d^-1，细胞倍增时间则从对照的0.79d最大缩短至实施例1中的0.32d。可见采用本发明的无悬浮培养基获得的MDCK细胞，在细胞生长速率和细胞活性均有较大的提高。

实施例4-5说明用于禽流感病毒驯化的MDCK细胞驯化过程及细胞特性：

实施例4

一、制备无血清培养基：

采用实施例1制得的无血清培养基；

二、制备全悬浮培养的MDCK细胞：

Ⅰ)将需血清贴壁培养的MDCK细胞用培养基培养至细胞汇合度达到80～90％时，弃去培养MDCK细胞的培养基，用胰酶溶液清洗细胞层后弃去溶液；再次加入胰酶溶液至覆盖MDCK细胞进行消化 5～15min；待细胞变圆后加入含胎牛血清的培养基终止消化；然后收集细胞悬液，并将细胞悬液离心后弃上清，获得细胞团；

Ⅱ)将步骤Ⅰ)中获得的细胞团用无血清培养基进行重悬至细胞密度1.3～1.6×10⁶cells/mL，获得细胞重悬液；

Ⅲ)将步骤Ⅱ)中获得的细胞重悬液加入方瓶，在转速30rpm、温度37℃、5％CO₂的条件下置于摇床中并放入培养箱中培养，每隔48h用新鲜的无血清培养基将细胞重悬液稀释至细胞密度为1.3～1.6×10⁶cells/mL，进行传代，获得MDCK细胞。

通过贴壁培养和通过本实施例获得的MDCK细胞形态比较如图1-4所示：

图1为贴壁状态下MDCK细胞贴附于培养介质表面，呈铺路石状；

图2为本实施例悬浮培养的MDCK细胞的形态，细胞呈单个分散状，无结团现象，细胞形态完整，边界光滑清晰，大小均一；

图3为采用Hyclone公司无血清培养基SFM4 Mega Vir通过直接驯化法得到的悬浮培养的MDCKS细胞，图片来源：张良艳,姚志东,等.MDCK细胞的悬浮驯化及初步应用.生物技术通讯.2013,24(3):382-384；图中可见，多个细胞聚集成团，少见单个细胞，细胞大小不均一；

图4为采用Gibco公司开发的商业无血清培养基SMIF8间接法驯化得到的MDCK.SUS2细胞；图片来源：V.Lohr,Y.Genzel,et al.A new MDCK suspension linecultivated in a fully defined med ium in stirred-tank and wavebioreactor.Vaccine.2010,28(3):6256-6264；图中所见，在该无血清培养基中悬浮培养时细胞形态也呈聚集状，但聚团较小，细胞大小不均一，状态略欠。

在本实施例将贴壁培养的MDCK细胞驯化为悬浮培养状态，该细胞呈单个分散生长，细胞形态饱满，大小均一；细胞质量高。

实施例5

对得到的全悬浮培养的MDCK细胞测定活细胞密度和细胞活性，结果如图5所示:MDCK贴壁细胞在无血清培养基中驯化6代以后(驯化后第13d)，细胞生长逐渐稳定，细胞活性保持在95％以上。由此可以证明，通过本发明的对MDCK贴壁细胞驯化的方法使MDCK贴壁细胞适应悬浮培养并稳定生长只需2周，大大缩短了MDCK细胞由贴壁细胞驯化成无血清的全悬浮细胞驯化时间。

实施例6

本实施例用于说明适应在无血清全悬浮培养的MDCK细胞系生长的禽流感病毒的制备方法及通过该方法获得禽流感病毒特性：

一种适应在无血清全悬浮培养的MDCK细胞系生长的禽流感病毒的制备方法，包括以下步骤：

1)制备待接种的适应无血清全悬浮培养的MDCK细胞：将MDCK细胞装入摇瓶，在转速130rpm，温度37℃、通入浓度为5％的CO₂的条件下，置于培养箱中培养；然后每12h取样一次，进行细胞计数；在MDCK细胞处于对数生长期时，用新鲜的无血清培养基稀释至MDCK细胞密度为0.5×10⁶cells/mL，并以此为MDCK细胞 起始密度，然后将MDCK细胞培养72h，得到待接种的适应无血清全悬浮培养的MDCK细胞；

2)准备毒种：准备鸡胚源H9N2亚型禽流感病毒；禽流感病毒的病毒含量≥10^6.0EID₅₀/0.1mL；

3)F1代病毒驯化：按培养基体积的1‰接毒量将步骤2)的鸡胚源禽流感病毒接种于步骤1)中获得的待接种的MDCK细胞中，并加入5μg/mL的TPCK-胰酶进行培养；每12h检测病毒血凝效价和病毒滴度并留取F1代培养基上清液样本，连续观察96h；培养F1代病毒的温度为37℃；

4)F2代病毒驯化：取F1代中病毒血凝效价最高的时间点所留取的F1代培养基上清液样本，重复步骤3)的过程，即将F1代培养基上清液样本接种到新的待接种的MDCK细胞中，并检测病毒血凝效价和病毒滴度和留取F2代培养基上清液样本；培养F2代病毒的温度为37℃；

5)F3代病毒驯化：取F2代中病毒血凝效价最高的时间点所留取的F2代培养基上清液样本，重复步骤3)的过程，即将F2代培养基上清液样本接种到新的待接种的MDCK细胞中，并检测病毒血凝效价和病毒滴度和留取F3代培养基上清液样本；培养F3代病毒的温度为35℃；

6)F4～F10代病毒驯化：重复步骤5)的过程培养F4～F10代，得到驯化完成的禽流感病毒。

禽流感病毒的血凝效价检测结果如表3所示：

表3MDCK细胞驯化病毒血凝效价

禽流感病毒经过MDCK细胞驯化至F6代，血凝效价明显提高；并且在48-72h的血凝效价达到9-10log2。驯化至F7代，血凝效价稳定达到10log2，连续传代到9-10代，血凝效价可达到11log2。

从各代次的禽流感病毒感染MDCK细胞72h后收取培养基上清液样本，测量血凝效价及病毒含量，结果如表4所示：

表4驯化毒血凝效价和病毒含量测定

驯化禽流感病毒第F10代后72h血凝效价达11log2,病毒含量稳定提升，在F10代达到10^8.8EID₅₀/0.1mL。

对于本领域的技术人员来说，可根据以上描述的技术方案以及构思，做出其它各种相应的改变以及变形，而所有的这些改变以及变形都应该属于本发明权利要求的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种适应在无血清全悬浮培养的MDCK细胞系生长的禽流感病毒的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1)制备待接种的适应无血清全悬浮培养的MDCK细胞：将MDCK细胞装入摇瓶，在转速130rpm，温度37℃、通入浓度为5％的CO₂的条件下，置于培养箱中培养；然后每12h取样一次，进行细胞计数；在MDCK细胞处于对数生长期时，用新鲜的无血清培养基稀释至MDCK细胞密度为0.5×10⁶cells/mL，并以此为MDCK细胞起始密度，然后将MDCK细胞培养72h，得到待接种的适应无血清全悬浮培养的MDCK细胞；

2)准备毒种：准备鸡胚源禽流感病毒；

3)F1代病毒驯化：按培养基体积的1‰接毒量将步骤2)的鸡胚源禽流感病毒接种于步骤1)中获得的待接种的MDCK细胞中，并加入5μg/mL的TPCK-胰酶进行培养；每12h检测病毒血凝效价和病毒滴度并留取F1代培养基上清液样本，连续观察96h；培养F1代病毒的温度为37℃；

4)F2代病毒驯化：取F1代中病毒血凝效价最高的时间点所留取的F1代培养基上清液样本，重复步骤3)的过程，即将F1代培养基上清液样本接种到新的待接种的MDCK细胞中，并检测病毒血凝效价和病毒滴度和留取F2代培养基上清液样本；培养F2代病毒的温度为37℃；

5)F3代病毒驯化：取F2代中病毒血凝效价最高的时间点所留取的F2代培养基上清液样本，重复步骤3)的过程，即将F2代培养基上清液样本接种到新的待接种的MDCK细胞中，并检测病毒血凝效价和病毒滴度和留取F3代培养基上清液样本；培养F3代病毒的温度为35℃；

6)F4～F10代病毒驯化：重复步骤5)的过程培养F4～F10代，得到驯化完成的禽流感病毒。

2.如权利要求1所述的适应在无血清全悬浮培养的MDCK细胞系生长的禽流感病毒的制备方法，其特征在于：步骤1)中，所述装入摇瓶并置于培养箱中培养的MDCK细胞为通过无血清培养基从需血清贴壁培养的MDCK细胞驯化为全悬浮培养的MDCK细胞。

3.如权利要求2所述的适应在无血清全悬浮培养的MDCK细胞系生长的禽流感病毒的制备方法，其特征在于：所述全悬浮培养的MDCK细胞通过以下步骤驯化得到：

Ⅰ)将需血清贴壁培养的MDCK细胞用培养基培养至细胞汇合度达到80～90％时，弃去培养MDCK细胞的培养基，用胰酶溶液清洗细胞层后弃去溶液；再次加入胰酶溶液至覆盖MDCK细胞进行消化5～15min；待细胞变圆后加入含胎牛血清的培养基终止消化；然后收集细胞悬液，并将细胞悬液离心后弃上清，获得细胞团；

Ⅱ)将步骤Ⅰ)中获得的细胞团用无血清培养基进行重悬至细胞密度1.3～1.6×10⁶cells/mL，获得细胞重悬液；

Ⅲ)将步骤Ⅱ)中获得的细胞重悬液加入方瓶，在转速30rpm、温度37℃、5％CO₂的条件下置于摇床中并放入培养箱中培养，经过2代培养后将培养的细胞重悬液转入摇瓶，转速提升至120rpm；每隔48h用新鲜的无血清培养基将细胞重悬液稀释至细胞密度为1.3～1.6×10⁶cells/mL，进行传代，获得适应无血清全悬浮培养的MDCK细胞。

4.如权利要求1-2任一所述的适应在无血清全悬浮培养的MDCK细胞系生长的禽流感病毒的制备方法，其特征在于：所述无血清培养基按浓度计，包括以下组分：

基础代谢营养物:

核苷酸:

维生素:

无机盐：

酸碱度缓冲剂：

碳酸氢钠 1000～3000mg/L；

酸碱度指示剂：

酚红 5～15mg/L；

流感病毒增殖促进剂：

其它添加物：

5.如权利要求4所述的适应在无血清全悬浮培养的MDCK细胞系生长的禽流感病毒的制备方法，其特征在于：所述剪切力保护剂为嵌段式聚醚F68。

6.如权利要求4所述的适应在无血清全悬浮培养的MDCK细胞系生长的禽流感病毒的制备方法，其特征在于：所述抗细胞结团剂为硫酸葡聚糖。

7.如权利要求1-2任一所述的适应在无血清全悬浮培养的MDCK细胞系生长的禽流感病毒的制备方法，其特征在于：所述无血清培养基通过以下步骤制得：

将原料混合后磨成细粉，然后将所得细粉于10～30℃溶剂中溶解，得到混合液；调节混合液的pH至6.3～6.7，定容后得到无血清培养基。

8.如权利要求1所述的适应在无血清全悬浮培养的MDCK细胞系生长的禽流感病毒的制备方法，其特征在于：所述禽流感病毒为H9N2亚型禽流感病毒。

9.如权利要求1所述的适应在无血清全悬浮培养的MDCK细胞系生长的禽流感病毒的制备方法，其特征在于：所述步骤2)中，所述鸡胚源禽流感病毒的病毒含量≥10^6.0EID₅₀/0.1mL。

10.一种禽流感病毒，其特征在于：通过权利要求1-9任一所述的制备方法获得。