CN106085946A

CN106085946A - 可以悬浮培养的猪睾丸细胞株st‑s及其获得方法与应用

Info

Publication number: CN106085946A
Application number: CN201610417309.XA
Authority: CN
Inventors: 倪小平; 刘国英; 刘敬涛; 郝鹏; 马子敏; 谢雪岑; 李同据; 史林凯; 郝洪吉; 刘国瑞
Original assignee: Beijing Niu Tek Biotechnology Co Ltd; Jinyu Baoling Bio-pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Beijing Niu Tek Biotechnology Co Ltd; Jinyu Baoling Bio-pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2016-06-13
Filing date: 2016-06-13
Publication date: 2016-11-09
Anticipated expiration: 2036-06-13
Also published as: CN106085946B

Abstract

本发明公开了可以悬浮培养的猪睾丸细胞ST‑S及其获得方法与应用。本发明将贴壁培养的ST细胞驯化为可以悬浮培养并稳定传代的ST细胞，命名为ST‑S，ST‑S细胞保持了对猪瘟病毒(CSFV)的敏感性，没有支原体污染。本发明提供了对ST‑S细胞进行大规模工业化悬浮培养方式，适应摇瓶和生物反应器培养。可以利用悬浮培养的ST‑S细胞生产疫苗或其它生物制品，从而简化了病毒生产工艺，增加了产品的稳定性，降低了血清用量和生产成本，提高了生产效率。

Description

可以悬浮培养的猪睾丸细胞株ST-S及其获得方法与应用

技术领域

本发明属于细胞工程技术领域，特别是涉及一种可以悬浮培养的猪睾丸细胞株ST-S及其获得方法，还涉及利用该细胞株进行批量悬浮培养ST-S细胞的方法，该ST-S细胞可以作为工程细胞用于猪瘟疫苗的工业化生产。

背景技术

猪睾丸细胞(swine testicular cell，ST)是于1966年最早分离、培养成系的一株成纤维细胞样贴壁细胞。ST细胞对多种病毒敏感，如猪瘟病毒、猪细小病毒、狂犬病毒、伪狂犬病病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪圆环病毒等。ST细胞常用于上述病毒的分离、培养和鉴定(Kemeny,L.J.(1981)Isolation of transmissible Gastroenteritis virus,pseudorabies virus,and porcine enterovirus from pharyngeal swabs taken frommarket-weight-swine.American journal of veterinary research 42，1987-1989；Potgieter,L.N.,Stair,E.L.,Morton,R.J.,and Whitenack,D.L.(1977)Isolation ofwine influenza virus in Oklahoma.Journal of the American Veterinary MedicalAssociation 171，758-760；Zhang,C.F.,Cui,S.J.,Hu,S.,Zhang,Z.,Guo,Q.,and Zell,R.(2010)Isolation and characterization of the first Chinese strain of porcineTeschovirus-8.Journal of virological methods 167，208-213)以及针对这些病毒的疫苗的研制和生产(Welter，M.W.(1998)Adaptation and serial passage of bovinecoronavirus in an established diploid swine testicular cell line andsubsequent development of a modified live vaccine.Advances in experimentalmedicine and biology 440，707-711；马良,田宇婧，周建民，潘春刚.(2012)采用潮汐式生物反应器进行ST细胞培养的研究.中国农学通报28，53-56)。与BHK21(仓鼠肾细胞)、Vero(非洲绿猴肾细胞)、PK15(猪肾细胞)等多种常用的工程细胞相比，ST细胞在细胞密度、病毒产量以及安全性等方面都具有显著优势。

ST细胞符合1987年世界卫生组织关于用于生物制品的传代细胞的规程要求，是世界卫生组织和中国生物制品规程批准可用作疫苗的基质(Welter，M.W.(1998)Adaptationand serial passage of bovine coronavirus in an established diploid swinetesticular cell line and subsequent development of a modified livevaccine.Advances in experimental medicine and biology 440，707-711)。国外也采用ST细胞生产丙肝、霍乱、猪流感疫苗等，目前，国外的生物制品企业已采用ST传代细胞生产猪伪狂犬病活疫苗，而国内的生物制品企业还没有采用ST传代细胞生产猪伪狂犬病活疫苗(尹秀凤,陈念劬,徐凯.(2013)STC细胞生产高效猪伪狂犬病活疫苗工艺.专利CN103060262 A)。农科院哈尔滨兽医研究所最早从国外引进ST细胞系从事猪二联苗、三联苗上游工艺的研究，随后，利用ST细胞进行疫苗及生产工艺的研究并在国内其它单位(如广东永顺、中牧等)得到推广(马良，田宇婧，周建民，潘春刚.(2012)采用潮汐式生物反应器进行ST细胞培养的研究.中国农学通报28,53-56；邱文英，方鹏飞，胥燕芳，潘华柱，徐静，郝伟伟.(2013)应用生物反应器培养猪传染性胃肠炎病毒.中国兽药杂志47，24-26)。

猪瘟是由猪瘟病毒(classical swine fever virus，CSFV)引起的猪的高致死率接触性传染病，三分之一猪的因病死亡均是由猪瘟引起的。我国把猪瘟规定为强制免疫的重大动物疫病，所有猪均需要进行猪瘟活疫苗免疫(谢文强.(2012)猪瘟活疫苗生产工艺改进现状.广东畜牧兽医科技37，5-7)。经家兔传代减毒培育而成的中国兔化弱毒株(Chinesestrain，简称“C株”)猪瘟疫苗对猪安全可靠，具有良好的免疫原性，已被国际上公认为效果最好的猪瘟弱毒疫苗。几乎所有欧洲国家和少数拉美国家采用猪瘟兔化弱毒“C株”疫苗消灭或控制了猪瘟。在我国，虽然针对猪瘟的免疫工作不断进行，但由于免疫程序与剂量等问题，猪场持续性猪瘟和其它血清学相关病毒(包括猪细小病毒、猪伪狂犬病毒、猪繁殖和呼吸道病毒等)感染常造成免疫失败，因此，猪瘟依然是威胁生猪生产的一大顽疾。

目前，根据生产工艺的不同，利用猪瘟兔弱化株生产的常用疫苗有猪瘟脾淋苗、猪瘟乳兔苗和猪瘟细胞苗。其中，猪瘟脾淋苗是通过接种成年家兔，收获脾脏和淋巴结病毒制备的，免疫效果好，但是成本高，国际上不再提倡用活体组织制备疫苗。而且当前我国缺乏制苗用家兔的质量标准，很难保证猪瘟兔脾淋苗的纯净性。此外，优质家兔数量有限，无法满足猪瘟防疫的需要。猪瘟细胞苗是用C株弱毒株病毒感染原代(如牛睾丸细胞)或传代细胞(贴壁培养的ST细胞)后获得的培养物。牛睾丸细胞苗采用初生犊牛睾丸细胞培养猪瘟兔化弱毒，安全、免疫效果良好，但是牛血清和牛睾丸细胞被牛病毒性腹泻病毒(BVDV)污染的现象越来越严重。而BVDV和CSFV同属于黄病毒科瘟病毒属，两种病毒之间有较密切的抗原性与血清学关系。两种病毒的高同源性会导致同源病毒抗体的产生。中国生产的牛睾丸细胞苗几乎存在100％的牛BVDV感染率，生产疫苗所用的牛睾丸细胞或牛血清会将BVDV或其抗体引入疫苗，造成免疫失败(万遂如.(2010)关于猪瘟牛睾丸细胞弱毒活疫苗的免疫问题.饲料与畜牧)。用ST传代细胞生产猪瘟活疫苗，可避免细胞外源病毒污染，减少其它病毒的干扰，生产工艺稳定，病毒滴度高，可明显提高疫苗的质量和产量(谢文强.(2012)猪瘟活疫苗生产工艺改进现状.广东畜牧兽医科技37，5-7；吴文福，岑小清，任向阳.(2009)猪瘟兔化弱毒疫苗的研究概况.广东畜牧兽医科技34，7-8)。

然而，ST细胞对培养基和牛血清要求比较严格，培养比较困难。目前，用于生产ST细胞的工业化培养方式包括转瓶培养和微载体反应器培养。国内兽用疫苗生产厂家绝大多数都采用转瓶培养方式进行细胞的扩增(马良，田宇婧，周建民，潘春刚.(2012)采用潮汐式生物反应器进行ST细胞培养的研究.中国农学通报28，53-56)。每个转瓶是一个独立的培养单位，每个转瓶中所培养的细胞状态都不相同，因此无法有效地控制由此生产的病毒的数量和质量。另外，采用转瓶培养方式需要先对细胞进行消化再传代，而且在接种病毒、添加及更换病毒维持液、添加NaHCO₃调节pH值以及最终收获培养物时，需要多次打开转瓶，受污染的风险大，因而每个转瓶都需要人工无菌操作，工作劳动强度和人为误差大，无法实现自动化生产。与转瓶培养方式相比，采用微载体反应器贴壁培养ST细胞能够大大提高单位体积培养细胞的产率,细胞生长环境均一，简化了培养条件的监测和控制(任德强，吴金，姜力，张智明，张立恒，戴秀莉，武佳斌，潘兴广，臧玉婷.(2012)应用生物反应器微载体培养ST细胞生产猪伪狂犬病病毒的方法.专利CN 102690791 A；姜力，藏玉婷，柴华，王彬，王琪，任德强，戴秀莉，张智明，武佳斌，张明艳，张婷婷.(2013)猪细小病毒灭活疫苗的制备方法及其产品.专利CN 102091329 B)。但是，微载体反应器培养成本昂贵，而且依然需要复杂的消化程序来分离、培养微载体上的细胞。

上述用转瓶和微载体反应器进行的细胞培养都属于贴壁培养的范畴，在大规模的工业生产中，贴壁培养需要大量的细胞培养基、胎牛血清或小牛血清以及昂贵的载体系统。在产物纯化过程中，需要增加将细胞与支持物分离的步骤，增加了工作难度，降低了工作效率。不依赖于支撑媒介的完全悬浮培养方式不仅克服了贴壁培养的弊端，还具有其它优势：1)有利于细胞培养基中的营养物质和气体充分接触，而且易于控制培养条件(温度、pH、氧和CO₂分压等)；2)易于在连续密闭的系统中进行，减少了操作步骤和污染的机会；3)培养条件稳定、均一，便于生产工艺的建立和优化；4)可长期连续培养，扩大生产量，节省人力；5)可实现细胞的高密度培养。

然而，自从ST细胞建系以来，在科学研究和工业生产中使用的ST细胞均为贴壁培养的，迄今为止，国内外均没有成功进行ST细胞悬浮培养的报道，限制了ST细胞的应用规模和生产效率。因此，急需一种ST细胞的悬浮培养方法，以适合大规模生物反应器生产的需要。

发明内容

为克服猪睾丸细胞(ST细胞)贴壁培养的不足，实现ST细胞的大规模悬浮培养，本发明的发明人长期致力于ST细胞的驯化研究，最终获得了可以悬浮培养的猪睾丸细胞株。

本发明的第一个目的是提供可以悬浮培养的猪睾丸细胞株，命名为ST-S，该细胞株ST-S已于2014年4月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为CGMCC No.9110。

本发明的细胞株ST-S具有以下特征：

A.保持了对猪瘟病毒(CSFV)的敏感性；

B.没有支原体污染；

C.具有2n＝38条染色体，模式数低于15％。

本发明的第二个目的是提供一种细胞株ST-S的获得方法，是通过研制个性化的培养基，优化驯化途径，最终获得了可以在低血清条件下完全悬浮培养的细胞株ST-S。

具体来讲，本发明所提供的细胞株ST-S的获得方法，可包括以下步骤：

1)贴壁培养的ST细胞在塑料培养方瓶中的驯化：不断优化RPMI 1640培养基，依次用RPMI 1640、STM01、STM02、STM03培养基在相同的培养条件(37℃、5％CO₂恒温培养箱)下，使贴壁培养的ST细胞的传代比例由通常的1：3驯化为1：5，传代20次，传代间隔(即细胞长满单层所需的时间)由120小时缩短至72小时，将驯化后的ST细胞命名为ST-1；

2)贴壁培养的ST-1细胞在玻璃转瓶中的驯化：用0.15％(W/V)聚赖氨酸乙酸溶液包被玻璃转瓶瓶壁，用STM04、STM05和STM06培养基依次在1升、10升和15升的转瓶中，将ST-1细胞1：3连续传代30次，获得了贴壁特性降低的ST细胞，命名为ST-2；

3)ST-2细胞在摇瓶中的初步悬浮驯化：在培养基中添加硫酸葡聚糖、Pluronic F-68和EDTA，继续连续悬浮培养ST-2细胞，进一步降低细胞的成团倾向，获得了初步具有悬浮特征的ST-2细胞；

4)ST-2细胞在摇瓶中继续悬浮驯化：通过改变培养基中活性因子的量得到ST-LSM-s培养基，用ST-LSM-s培养基继续驯化初步具有悬浮特征的ST-2细胞，获得了可以在含8％(V/V)新生牛血清的ST-LSM-s培养基中悬浮生长的ST细胞，命名为ST-3；

5)悬浮培养的ST-3细胞的低血清驯化继续驯化ST-3细胞，使其能够在含有3％(V/V)血清的ST-LSM-s的培养基中悬浮生长，将获得的适应3％(V/V)血清培养的ST细胞命名为ST-S；

所述STM01、STM02、STM03、STM04、STM05和STM06培养基组成如表1-1所示，ST-LSM-s的培养基组成如表1-2所示。

在上述细胞株ST-S的获得方法中，所述步骤3)中硫酸葡聚糖的添加量为3.75g/L，Pluronic F-68的添加量为1g/L，EDTA的添加量为0.01g/L。

本发明的细胞株ST-S经过冻存后仍然具备悬浮培养的特性。冻存的细胞株ST-S复苏后，不需要驯化过程，可以直接放大进行悬浮培养。

本发明的第三个目的是提供一种ST-S细胞在生物反应器中的悬浮培养方法。

本发明所提供的在5L生物反应器中悬浮培养猪睾丸ST-S细胞的方法，包括以下步骤：

(1)复苏冻存的细胞株ST-S，用含3％(V/V)新生牛血清的ST-LSM-s培养基恒温培养2-3天，得到复苏的ST-S细胞；

(2)将复苏的ST-S细胞按1：3传代转至逐级放大的培养容器，用含3％(V/V)新生牛血清的ST-LSM-s培养基恒温培养3天，进行逐级放大培养；

(3)放大后的ST-S细胞悬液300mL得到的细胞沉淀用2L含有3％(V/V)新生牛血清的ST-LSM-s培养基重悬后接种于5L生物反应器中，进行恒温悬浮培养扩增ST-S细胞；

(4)在第2天和第5天分别向生物反应器中加入2L和1L新鲜的含有3％(V/V)新生牛血清的ST-LSM-s培养基进行半流加式悬浮培养；

(5)悬浮培养后第6天-第8天收获ST-S细胞；

所述恒温培养或恒温悬浮培养条件为37℃、5％CO₂恒温培养箱中培养，转速为80-90rpm。

步骤(1)获得复苏的ST-S细胞的具体操作为：从液氮中取出1支ST-S细胞冻存管，在37℃水浴中迅速融化后置于预热的培养基中，离心，弃上清，获得ST-S细胞沉淀，将ST-S细胞沉淀用含3％(V/V)新生牛血清的ST-LSM-s培养基重悬后转移到125mL摇瓶中，瓶中添加30mL含3％(V/V)新生牛血清的ST-LSM-s培养基，置于37℃、5％CO₂恒温培养箱中进行细胞培养，摇瓶转速为80-90rpm，培养2-3天后，得到复苏的ST-S细胞。

步骤(2)将ST-S细胞放大培养的具体操作为：离心，弃上清，收集复苏的ST-S细胞，1：3传代至3个125mL摇瓶中，瓶中添加30mL含3％(V/V)新生牛血清的ST-LSM-s 培养基，置于37℃、5％CO₂恒温培养箱中进行细胞培养，摇瓶转速为80-90rpm；3天后，离心，弃上清，收集并混合ST-S细胞，将ST-S细胞重悬于300mL含3％(V/V)新生牛血清的ST-LSM-s培养基中，将这些细胞等量接种于2个500mL摇瓶中，置于37℃、5％CO₂恒温培养箱中继续培养3天，摇瓶转速为80-90rpm，细胞密度达到1.5-2×10⁶细胞/mL，1：3传代至6个500mL摇瓶，每瓶添加200mL含3％(V/V)新生牛血清的ST-LSM-s培养基，置于37℃、5％CO₂恒温培养箱中进行细胞培养，摇瓶转速为80-90rpm。

步骤(3)放大后的ST-S细胞在生物反应器中悬浮培养扩增的操作为：3天后，混合6个摇瓶中的ST-S细胞，细胞密度达到2×10⁶细胞/mL，取300mL细胞悬液，离心，弃上清，将ST-S细胞沉淀用2L含有3％(V/V)新生牛血清的ST-LSM-s培养基重悬后接种于5L生物反应器中，置于37℃、5％CO₂恒温培养箱中进行细胞培养，转速为80-90rpm。

本发明悬浮培养的ST-S细胞符合兽用疫苗生产的要求(中华人民共和国兽药典第三部)，使利用悬浮培养技术生产猪瘟疫苗等成为可能。因此，本发明的细胞株ST-S以及悬浮培养的ST-S细胞在制备猪瘟疫苗中的应用也属于本发明。

猪睾丸细胞株ST-S的获得或悬浮培养猪睾丸ST-S细胞中所用的ST-LSM-s培养基也属于本发明，其组成如表1-2所示。

本发明的有益效果：猪睾丸细胞(swine testicular cell,ST)对包括猪瘟病毒在内的多种病毒敏感，常用于相关疫苗的生产。然而，ST细胞目前只能进行贴壁培养(包括微载体培养)，不能采用生物反应器进行完全悬浮培养，而完全悬浮培养对疫苗等生物制品的生产非常有利，这是因为全悬浮有利于细胞放大生产。现有技术和多个机构驯化ST细胞的失败尝试，使很多人认为ST细胞很难甚至不可能实现悬浮培养，即使能够悬浮培养，也不能保证ST细胞对病毒的敏感性。本发明的发明人将这种不可能变成了现实，通过不断优化培养基，添加电解质混合物并调整活性成分等，将贴壁培养的ST细胞驯化为可以悬浮培养并稳定传代的ST细胞，将此可以在生物反应器中完全悬浮培养的ST细胞命名为ST-S。ST-S细胞不仅可以采用悬浮培养方式进行大规模工业化培养(适应摇瓶和生物反应器培养)，细胞连续传代30代，细胞形态、悬浮特性和生长速度均没有明显的变化；ST-S细胞还保持了对猪瘟病毒(CSFV)的敏感性；ST-S细胞没有支原体污染。此外，染色体及核型分析结果表明，ST-S细胞具有2n＝38条染色体(表明ST-S细胞染色体正常)，模式数(是指染色体数目不等于染色体众数的比例)低于15％，符合兽用疫苗生产的要求，使利用悬浮培养技术生产猪瘟疫苗等成为可能。本发明的ST-S细胞不仅可以用于敏感病毒的分离鉴定，还可以利用悬浮培养的ST-S细胞生产疫苗(猪瘟疫苗等)或其它生物制品，从而简化了疫苗生产工艺，增加了产品的稳定性，降低了血清用量和生产成本，提高了生产效率，应用前景广阔。

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。

附图说明

图1为驯化前贴壁培养72小时的ST细胞；

图2为培养于T75塑料培养方瓶中的ST-1细胞；

图3为培养于15L玻璃转瓶中的ST-2细胞；

图4为ST-2细胞在摇瓶中的悬浮驯化；

图5为在ST-SLM-s培养基中悬浮培养的ST-3细胞；

图6为悬浮培养的ST-3细胞在低血清驯化过程中细胞数目的变化；

图7为在含有3％血清的ST-LSM-s培养基中悬浮培养的ST-S细胞(内嵌图10×放大)；

图8为在5L反应器中半流加悬浮培养8天的ST-S细胞的活率变化；

图9为悬浮培养的ST-S细胞接种CSFV脾毒后细胞浓度和活率的变化；

图10为ST-S细胞对猪瘟病毒敏感性的RT-PCR检测结果；

A：对猪瘟病毒感染不同时间的ST-S细胞的RT-PCR检测结果；

B：对不同来源猪瘟疫苗感染的ST-S细胞的RT-PCR检测结果；

图11为ST-S细胞对猪瘟病毒敏感性的原位免疫荧光检测结果；

图12为用PCR方法对ST-S细胞进行支原体检测结果；

图13为ST-S细胞的核型。

具体实施方式

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见：《Molecular Cloning:A Laboratory Manual》(Sambrook，J.，Russell，David W.，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，3rd edition，2001，NY，Cold SpringHarbor)。

所述百分比浓度如无特别说明均为质量/质量(W/W，单位g/100g)百分比浓度、质量/体积(W/V，单位g/100mL)百分比浓度或体积/体积(V/V，单位mL/100mL)百分比浓度。

实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种实验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为对本发明生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提示替换使用。

下述实施例中所用的试剂，如无特别说明，均为常规试剂，这些试剂都已经是商业化产品，可以通过商业途径获得。

实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，实施例将有助于理解本发明，但是本发明的保护范围不限于下述的实施例。

主要材料及来源

细胞株：贴壁培养ST细胞购自中国兽医药品监察所，该细胞具有贴壁依赖生长的特性，是对CSFV等多种病毒敏感的宿主细胞。

培养基：RPMI 1640购自北京钮因泰克生物技术公司。STM01、STM02、STM03、STM04、STM05、STM06等为驯化过程中的中间培养基，其配方见表1-1。

表1-1 中间培养基配方

其中：混合电解质F6是溶解多聚-L-赖氨酸和水合柠檬酸铁后的混合溶液，其中多聚-L-赖氨酸浓度为0.1g/L，水合柠檬酸铁浓度为1g/L。水合柠檬酸铁可购自北京国药集团；多聚-L-赖氨酸可购自北京Sigma公司。

STE：是抗坏血酸、转铁蛋白、胰岛素、EGF四种物质按上述浓度配制的混合母液。除菌后，实验时往培养基里面添加的组分，简称“STE”。

悬浮培养基ST-LSM-s：配方见表1-2。

表1-2 ST-LSM-s培养基配方

配制上述培养基所需要的试剂均可通过常规途径购得，配制方法采用本领域的常规方法。

新生牛血清：购自石家庄宏伟生物技术有限公司。

小牛血清：购自石家庄宏伟生物技术有限公司。

0.15％(W/V)聚赖氨酸乙酸溶液：将0.15g聚赖氨酸溶解于100mL乙酸中。

猪瘟病毒：CSFV脾毒为金宇保灵生物药品有限公司商品，CSFV细胞苗购自保定瑞普生物技术有限公司，CSFV组织苗购自保定瑞普生物技术有限公司，CSFV活疫苗购自保定瑞普生物技术有限公司。

实施例1、获得可以悬浮培养的ST-S细胞

本实施例通过研制个性化的培养基，优化驯化途径，最终获得了可以在低血清条件下完全悬浮培养的猪睾丸细胞株，命名为ST-S，具体来讲，本发明细胞株ST-S的获得方法，包括以下步骤：

一、贴壁培养的ST细胞在塑料培养方瓶中的驯化

通常在培养方瓶中贴壁培养的ST细胞的传代比例为1：3，即在1个T75塑料培养方瓶中细胞长满单层后，将用胰酶消化液(覆盖细胞表面为宜，约5mL)消化后获得的细胞悬液可以平均接种于3个T75塑料培养方瓶中(Welter,M.W.,Welter,C.J.,Chambers,D.M.,andSvensson,L.(1991)Adaptation and serial passage of porcine group C rotavirusin ST-cells,an established diploid swine testicular cell line.Archives ofvirology 120,297-304)。当传代比例高时，细胞刚开始生长缓慢，倍增时间延长，传代间隔加大。在某种条件下，比如存在优化的培养基时，细胞可以被驯化为高比例(1：4或1：5)传代，同时又保留了原有的传代间隔。本发明首先通过增大传代比例的方法确定培养基优化的方向和效果。

首先比较贴壁培养于方瓶中的1：3和1：4传代的细胞的代谢特点，并据此调整原有培养基配方，利用优化的培养基配方，使细胞在1：4和1：5传代的情况下，传代间隔不断降低。细胞经过20代的驯化适应后，在1：5传代的条件下，传代间隔与驯化前1：3传代时的传代间隔相同(72小时)。

培养基的优化

为获得具有更好传代性能的ST细胞，发明人对现有的RPMI 1640培养基(购自北京钮因泰克生物技术公司)进行了优化。

培养基优化的依据是细胞的代谢变化情况，优化的目标是满足细胞的营养要求而不产生细胞毒性。葡萄糖和谷氨酰胺是传代细胞生长的主要能源、碳源和氮源。葡萄糖通过有氧和厌氧代谢过程，产生用于细胞活动的能量以及中间产物，是培养基中不可缺少的成分之一。谷氨酰胺是动物细胞培养中一种很特殊的必需氨基酸，即可作为细胞生长的主要能源和氮源，又参与嘌呤、嘧啶、核酸、多肽和蛋白质的合成。进入细胞的谷氨酰胺在谷氨酰胺酶的作用下,水解成谷氨酸和氨。谷氨酸可与半胱氨酸和甘氨酸结合形成谷胱甘肽，参与细胞的氧化还原调节。谷氨酸也可转变成α-酮戊二酸，进入三羧酸循环，为细胞提供中间代谢产物和能量。事实上，传代细胞对谷氨酰胺具有依赖性：在常规谷氨酰胺浓度下，谷氨酰胺的耗尽常常是细胞开始死亡的直接原因，只是有一定的滞后期；肿瘤细胞不能在缺乏谷氨酰胺的培养基里生长，增加培养基里谷氨酰胺的浓度可刺激肿瘤细胞的生长。然而，这些营养物质在代谢过程中也会产生对细胞生长不利的一些副产物，这些副产物的积累是限制细胞密度及其存活时间的主要原因。具体来讲，葡萄糖通常经过有氧糖酵解过程转化为丙酮酸，然后还原为乳酸；高的葡萄糖浓度常会造成乳酸的快速积累，降低培养基pH值，抑制糖酵解，导致丙酮酸降低，以及谷氨酰胺消耗减少，最终引起细胞能量产生的减少，抑制细胞生长。谷氨酰胺参与生物量合成，并不产生游离的氨，但谷氨酰胺的水解是培养体系中主要毒性副产物氨的重要来源。谷氨酰胺酶水解的速度和培养体系的浓度、温度、酸碱度以及血清浓度有关。在通常的细胞培养条件下，水解的半衰期为9天左右。太高的谷氨酰胺浓度会产生大量氨离子，抑制细胞生长(辛艳，杨艳，李强，孔健，曹竹安.(2001)谷氨酰胺在杂交瘤细胞培养中的降解与代谢.生物工程学报17，478-480；郑杰.(2011)肿瘤生长的能量代谢特点及其临床应用.中国细胞生物学学报33)。

由于糖酵解和谷氨酰胺代谢遵循不同的途径，二者在提供细胞中间代谢产物和能量方面又相互影响，葡萄糖和谷氨酰胺的浓度及其比例影响细胞的生长及代谢。通常谷氨酰胺在较低的浓度下，更多地被用于生物量的合成；而在较高的浓度下，其更多的参与供能代谢。葡萄糖或者谷氨酰胺相对较多时，增大乳酸或氨的产生，抑制细胞的生长。因此为了得到更高的细胞密度和活力指数，要对培养系统中的葡萄糖和谷氨酰胺的浓度和比例进行优化，既能保证细胞生长的需要，又使副产物的积累在细胞的耐受程度以内(辛艳，杨艳，李强，孔健，曹竹安.(2001)谷氨酰胺在杂交瘤细胞培养中的降解与代谢.生物工程学报17,478-480；李东晓，张淑香，朱明龙，周燕，谭文松.(2003)葡萄糖和谷氨酰胺浓度对杂交瘤细胞生长代谢的影响.华东理工大学学报:自然科学版29,359-362)。

另一方面，当培养基中葡萄糖和谷氨酰胺的浓度和比例合适时，其它营养物，如氨基酸、维生素和脂类也会成为限制因素。在细胞培养过程中，氨基酸的利用是很不平衡的，通常亮氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、缬氨酸等是消耗较快的氨基酸，而丙氨酸、谷氨酸、天门冬氨酸等却常会发生积累。补加快速消耗的氨基酸并不能达到满意的效果，营养的平衡才是更重要的(张元兴，魏明旺，董志峰.(1997)杂交瘤细胞的大量培养.生物工程进展17，54-60)。另外，胰岛素能够刺激刺激葡萄糖的利用及RNA、蛋白和磷脂的合成，转铁蛋白是一种结合铁的糖蛋白，乙醇胺与细胞内的磷脂合成有关，亚硒酸钠中的硒作为一种微量元素，是一种谷胱甘肽过氧化物酶的辅因子，拥有抗过氧化物的能力，这些因子均能刺激细胞的生长。

在本实施例中，培养基的初期优化主要是通过调整葡萄糖和谷氨酰胺的量和比例来实现的，调整的依据是氨基酸各组分消耗的图谱、葡萄糖、谷氨酰胺、乳酸和谷氨酸的浓度以及葡萄糖和谷氨酰胺的比消耗率等。

在本实施例中，将购自中国兽医药品监察所的冻存ST细胞复苏放大培养在T75塑料培养方瓶中，连续进行1：3、1：4和1：5传代。在这个过程中，不断调整培养基成分。这种调整的依据是传代细胞内和培养上清中代谢产物的量。优化后的培养基的效果通过下一轮的细胞传代进行验证。优化过程中，对多种培养基配方进行了尝试，相应地有多条驯化培养的路线和结果。

本实施例介绍较优化的一种驯化培养方式，传代方案如表2所示，包括以下步骤：

1)驯化前贴壁培养ST细胞：复苏冻存的ST细胞(方法为：从液氮中取出冻存的ST细胞，在37℃水浴中迅速融化)，置于T25塑料培养方瓶(购自康宁公司)中，接种密度为4-5×10⁴细胞/cm²，用含8％(V/V)新生牛血清的RPMI 1640培养基进行贴壁培养，培养体积为8mL。培养条件为37℃、5％CO₂恒温培养箱(孵箱)。48小时后换新鲜培养基。72小时后，细胞汇合率达80％。将细胞用0.25％(W/V)胰蛋白酶液(购自sigma公司)在37℃、CO₂恒温培养箱中消化10-15分钟后，按4×10⁴细胞/cm²接种到T75塑料培养方瓶(购自康宁公司)中，在同样的培养条件下(培养体积为20mL)继续培养。72小时后，细胞明亮，界限分明(见图1，第1代细胞)。

2)在T75塑料培养方瓶中第一次传代的ST细胞(第1代细胞)培养120小时后(第2代细胞)，部分细胞用于测定培养上清和细胞内代谢产物的相关参数。其它细胞用0.25％(W/V)胰蛋白酶液在37℃、CO₂培养箱中消化15-20分钟后，分别按1:3、1：4传代于T75塑料培养方瓶中，培养基依然采用含8％(V/V)新生牛血清的RPMI 1640培养基，培养体积为20mL，培养条件不变。120小时后(第3代细胞)，取样测定培养上清和细胞内代谢产物的相关参数。比较1：3和1：4传代细胞代谢产物的变化，在RPMI 1640培养基基础上进行优化，得到培养基STM01。

3)120小时后(第4代细胞)，细胞达到70-80％单层，用0.25％(W/V)胰蛋白酶液在37℃、CO₂培养箱中消化15-20分钟后，1：4传代至4个T75塑料培养方瓶，其中两瓶(A1，A2)采用含8％(V/V)新生牛血清的RPMI 1640培养基，另外两瓶(B1，B2)采用含8％(V/V)新生牛血清的STM01培养基，培养体积为20mL，培养条件不变。

4)120小时后(第5代细胞ST-4，细胞达到70-80％单层。A1和B1用于测定细胞内和培养上清中的代谢产物。依据代谢产物的变化，调整培养基STM01的成分，得到培养基STM02。

5)A2和B2继续1：4传代，并分别在含8％(V/V)新生牛血清的RPMI 1640和含8％(V/V)新生牛血清的STM01培养基中培养，继续传代1次。96小时后(第6代细胞)，比较在RPMI1640和STM01培养基中的细胞的形态和数量。在STM01中培养的细胞密度高于在RPMI 1640中培养的细胞，停止细胞在RPMI 1640中的传代。培养于STM01中的细胞继续1：4传代，其中两瓶在含8％(V/V)新生牛血清的STM01培养基中培养，另外两瓶在新配制的含8％(V/V)新生牛血清的STM02培养基中培养，继续传代3次。

6)传至第9代(第9代细胞)，比较在STM01和STM02培养基中的细胞的形态和数量。在STM02中培养的细胞密度高于在STM01中培养的细胞，停止细胞在STM01中的传代。培养于STM02中的细胞继续1：4传代，在含8％(V/V)新生牛血清的STM02培养基中培养，继续传代1次。

7)传至第10代(第10代细胞)，培养于STM02中的细胞1：5传代，继续传代1次。

8)传至第11代(第11代细胞)，培养于STM02中的细胞继续1：5传代，其中两瓶在含8％(V/V)新生牛血清的STM02培养基中培养，另外三瓶在含8％(V/V)新生牛血清的更优化的培养基STM03中培养。细胞在含8％(V/V)新生牛血清的培养基STM02和含8％(V/V)新生牛血清的STM03中按1：5的比例在T75塑料培养方瓶中传代培养，继续传代2次。

9)传至第13代(第13代细胞)，比较在STM02和STM03培养基中的细胞的形态和数量。在STM03中培养的细胞密度高于在STM02中培养的细胞，停止细胞在STM02中的传代。细胞继续在含8％(V/V)新生牛血清的培养基STM03中按1：5的比例在T75塑料培养方瓶中传代培养。随着驯化的进行，传代间隔(即细胞长满单层所需的时间)不断减少至72小时。传至第20代时，细胞可以在1：5的传代比例下，传代间隔连续8代为72小时，细胞形态良好，细胞界限清晰，立体感强(见图2，第20代细胞)，这时的细胞被命名为ST-1细胞，部分冷冻保存(冻存)，建立细胞库，其它细胞转入1升转瓶中继续驯化培养(见步骤三)。

表2 ST细胞在含不同培养基的T75培养瓶中的传代方案

将ST-1细胞依次在1升、10升和15升的转瓶中继续驯化培养。通常在转瓶培养中，当传代比例为1：3时，传代间隔长达96小时。本发明经过长时间驯化和不断优化培养基，使ST-1细胞在1：3传代比例下，传代间隔达到72小时。以下步骤二和三记录了ST-1细胞在转瓶中的驯化过程。在这个过程中，采用均匀设计与神经网络模型优化等方法，对培养基的离子强度与电解质组成进行了优化，选择膜电荷与基质结合能力相匹配的培养基用于ST-1细胞在转瓶中的驯化培养。

二、电解质混合物F6促进ST-1细胞在玻璃器皿表面的生长

STM04培养基是将STM03培养基继续优化得到。该培养基STM04基本上可以满足ST细胞在贴壁培养方式下的稳定传代的要求，但是在转瓶培养过程中发现细胞的贴壁能力与生长速度都出现了显著的下降。分析发现主要原因在于细胞消化后与目前所使用的玻璃培养转瓶的材质不能较好的匹配，大大削弱了ST细胞的贴壁伸展能力。为此，需要从改善培养基质的生物相容性以及改善ST细胞的膜表面特性等方面入手，对培养基的离子强度与电解质组成进行优化，选择合适的方法包被玻璃培养瓶内壁。通过对30多个配方的比较，发现用0.15％(W/V)聚赖氨酸乙酸溶液包被玻璃培养瓶瓶壁能明显促进细胞的贴壁。

通过均匀设计与神经网络模型优化，设计了多种电解质混合物组合。这些混合物对细胞生长的影响通过其对培养于50mL T25玻璃培养方瓶中细胞的作用进行评估。试验结果表明，电解质混合物F6能极大地改善细胞在玻璃介质表面的培养性能。

在玻璃培养方瓶中的试验方法及结果如下：

ST-1细胞在玻璃培养方瓶中的培养：将在T75塑料培养方瓶培养的ST-1细胞，用0.25％(W/V)胰蛋白酶液在37℃、CO₂培养箱中消化10-15分钟后吹打成单细胞，按5×10⁴细胞/cm²密度接种于4个T25玻璃培养方瓶中。其中两个方瓶用含8％(V/V)新生牛血清的STM04培养基培养，另外两个方瓶用含8％(V/V)新生牛血清的STM05(STM04+F6)培养基培养，培养体积为5mL，培养方瓶用0.15％(W/V)聚赖氨酸乙酸溶液包被。在37℃、5％CO₂孵箱中培养，培养3天后，细胞长至单层，用0.25％(W/V)胰蛋白酶液在37℃、CO₂培养箱中消化15分钟后，倾去胰酶，加入含8％(V/V)新生牛血清的培养基(装STM04的方瓶加STM04；装STM05的方瓶加STM05来终止)，终止酶的作用。用移液管吹打分散细胞后用Cedex细胞计数仪计数。

细胞计数结果如表3所示，可以看出，培养基中加入F6不仅能提高细胞培养速度，更重要的是明显降低了细胞成团的倾向(细胞聚集度由9.3％降低到2.0％，平均粒径大小由13.3μm减小为12.7μm)。

表3 电解质混合物F6对培养于玻璃培养方瓶中的ST-1细胞的影响

在玻璃转瓶中的试验方法及结果如下：

ST-1细胞在玻璃转瓶中的培养：将在T75塑料培养方瓶培养的ST-1细胞，用0.25％(W/V)胰蛋白酶液在37℃、CO₂培养箱中消化10-15分钟后吹打成单细胞，按5×10⁴细胞/cm²密度接种于4个1升玻璃转瓶中。其中两个转瓶用含8％(V/V)新生牛血清的STM04培养基培养，另外两个转瓶用含8％(V/V)新生牛血清的STM05培养基培养，培养体积为100mL，转瓶用0.15％聚赖氨酸乙酸溶液(W/V)包被，在37℃、5％CO₂孵箱中培养。待细胞长至单层，用0.25％(W/V)胰蛋白酶液在37℃、CO₂培养箱中消化15分钟后，倾去胰酶，加入含8％(V/V)新生牛血清的培养基(装STM04的方瓶加STM04；装STM05的方瓶加STM05来终止)，终止酶的作用。用移液管吹打分散细胞后用Cedex细胞计数仪计数，细胞再按1：2传代，分别在STM04和STM05中培养，重复传代4次(表4中1-4代)。

传代时间、细胞密度和细胞聚集率检测结果如表4所示，可以看出，培养基中加入F6不仅能缩短传代间隔，也能有效地降低细胞经胰酶消化后的聚集倾向。

表4 电解质混合物F6对培养于转瓶中的ST-1细胞的影响

三、贴壁培养的ST-1细胞在玻璃转瓶中的驯化

将在T75塑料培养方瓶中经过多次1：5传代的ST-1细胞(步骤一获得)在玻璃转瓶中继续被驯化。分别在1升、10升和15升的转瓶中，ST-1细胞在优化的培养基中连续1：3传代，传代方案见表5。

ST-1细胞在玻璃转瓶中的驯化方法包括以下步骤：

1)将经过初步驯化的ST-1细胞，按5×10⁴细胞/cm²密度接种于2个1升转瓶中，培养基分别为含8％(V/V)新生牛血清的STM04和含8％(V/V)新生牛血清的STM05，培养体积为100mL，置于恒温培养箱中旋转培养，培养条件为37℃、5％CO₂，转瓶转速为80rpm。

2)经过96小时的培养，细胞长满单层。用0.25％(W/V)胰蛋白酶液在37℃、CO₂培养箱中消化15分钟后，用移液管尽量将细胞吹打为单细胞，按1：3的比例将细胞置入1升转瓶，在相应的培养基中进行传代培养。细胞再次长满单层后，再次进行1：3传代培养。

3)生长在STM04培养基中的ST-1细胞的传代间隔保持在96小时，而在生长STM05培养基中的ST-1细胞在1：3的传代比例下，传代时间降低至84小时。

4)经过4次传代，将培养在STM05培养基中的ST-1细胞用0.25％(W/V)胰蛋白酶液消化，接种到10升转瓶中继续培养。按1：3的比例连续传代，传代间隔保持在84小时。

5)传至16代时，驯化在更优化的STM06培养基(将STM05培养基继续优化得到)中进行。在10升转瓶中，其传代间隔由84小时降低到72小时。按上述方法，驯化继续在15升转瓶中进行。按1：3的比例连续传代8次后，传代间隔保持在72小时，细胞形态良好，边界清晰，贴壁特性明显降低(见图3，第24代细胞)，这时的细胞被命名为ST-2，部分冻存，建立细胞库，部分细胞直接进入下一步的驯化(步骤四)。

步骤二中经试验证明了电解质复合物F6的作用，其不仅能缩短传代间隔，也能有效地降低细胞经胰酶消化后的聚集倾向。如表5(STM04vs含有F6的STM05和STM06)所示，步骤三在1：3传代的情况下进一步验证了F6的作用。

表5 ST-1细胞在转瓶中的传代方案

四、ST-2细胞在摇瓶中的初步悬浮驯化

本发明的目的是要获得可以悬浮培养的ST细胞。由于贴壁培养的细胞，包括ST细胞，在被从附着介质上分离后，常常会聚集成团。细胞聚集造成的空间和代谢扩散的限制会导致团块内部的细胞由于得不到足够的营养而凋亡或坏死。因此降低悬浮物中成团细胞的数量，减小团块的大小，增大单个细胞的比例是获得悬浮培养成功的关键因素。监测驯化过程中团块和单细胞数目的变化是评估驯化效果的有效方法。消化和分散贴壁或成团的细胞是本领域所公知的方法，这些方法包括机械手段(提高摇瓶振荡速度、转瓶转速、生物发生器搅拌速度等)、酶学或非酶学的生化技术(加入胰蛋白酶，硫酸葡聚糖、表面活性剂二价阳离子螯合剂EDTA、EGTA等)。

在培养基中运动的气泡常会吸附大量细胞于气液界面，在其运动特别是聚集和破碎时，会严重破坏细胞，造成对细胞活性的严重影响。一些大分子聚合物和表面活性物质通过阻止细胞在气泡表面的吸附，可以保护细胞免受搅动和通气的不利影响；同时，培养基中补加非离子表面活性剂可以抑制细胞的成团倾向(Murhammer,D.W.,and Goochee,C.F.(1990)Structural features of nonionic polyglycol polymer moleculesresponsible for the protective effect in sparged animal cellbioreactors.Biotechnology progress 6，142-148；Papoutsakis,E.T.(1991)Mediaadditives for protecting freely suspended animal cells against agitation andaeration damage.Trends in biotechnology 9，316-324)。这些表面活性剂包括PluronicF68(嵌段式聚醚F-68)、甲基环氧乙烷聚合物、环氧乙烷的聚合物、聚乙二醇和聚丙二醇等。Condon等人在悬浮培养HEK293细胞时添加0.1％Pluronic F68(Condon,R.G.,Schaefer,E.J.,Santoro,M.,Longley,R.,Tsao,Y.S.,Zurawski,S.M.,and Liu,Z.(2003)Development of a Chinese Hamster Ovary Cell Line for Recombinant Adenovirus‐Mediated Gene Expression.Biotechnology progress 19，137-143)。有专利文献记载(Gorfien,S.F.,Fike,R.M.,Godwin,G.P.,Dzimian,J.L.,Epstein,D.A.,Gruber,D.,Mcclure,D.,and Price,P.J.(2012)Serum-free mammalian cell culture medium,anduses thereof.Google Patents；Shuler,M.L.,and Dee,K.U.(1998)Methods and culturemedia for inducing single cell suspension in insect cell lines.GooglePatents)，多聚阴离子复合物，尤其是硫酸葡聚糖(Dextran sulfate)、硫酸戊聚糖(Pentosan sulfate)、硫酸聚乙烯(Polyvinylsulfate)和肝素(Heparin)等，可以抵抗细胞凝集，促进细胞的悬浮培养。

为此，要获得低聚集的细胞悬浮物，在细胞驯化过程中可以考虑移除大的细胞团块，分离并富集单个悬浮细胞，向培养物中加入可以分散细胞的生化试剂。本发明的发明人经研究发现，分离富集单个悬浮细胞需要大量的培养物，这些重新培养的单个细胞在培养过程中还依然具有一定的聚集倾向，不能根本解决细胞的全悬浮培养问题。因而，在本步骤中，发明人不仅采用了机械手段，还在培养体系中加入了硫酸葡聚糖(作用是防止细胞聚集)、Pluronic F68(嵌段式聚醚，普朗尼克F68，作用是细胞膜的稳定制剂，用以防止细胞膜剪切并额外起到消泡剂的作用)、EDTA(乙二胺四乙酸，作用是防止细胞聚团)等成分以降低细胞的聚集倾向。

在15升转瓶中经过多次稳定1：3传代的ST-2细胞在125mL摇瓶中继续被驯化。驯化采用连续悬浮培养的方式。为降低细胞的成团性，在STM06培养基中加入3.75g/L硫酸葡聚糖、1g/L Pluronic F68和0.01g/L EDTA。悬浮培养中团块的数目、大小以及存活单细胞的比例用于评估驯化效果。采用STM06培养基，摇瓶体积125mL，接种体积30mL，驯化过程中置于恒温培养箱中旋转培养，37℃、5％CO₂，转瓶转速为85rpm或90rpm。

具体驯化方法包括以下步骤：

1)将步骤三中经过多次连续传代的ST-2细胞，用0.25％(W/V)胰蛋白酶液在37℃、CO₂培养箱中消化15-20分钟后，1000rpm离心5分钟去除胰酶，加入10mL培养基吹成单个细胞悬液，培养基为含8％(V/V)新生牛血清的STM06，向培养基中添加3.75g/L硫酸葡聚糖、1g/L Pluronic F68和0.01g/L EDTA，按3×10⁵细胞/mL的密度接种于125mL的摇瓶中培养，培养体积为30mL，置于恒温培养箱中培养，培养条件为37℃、5％CO₂，摇速为85rpm。培养连续进行，取样并在显微镜下记数培养物中的大细胞团(10个以上细胞)、小细胞团(2-10个细胞)、单个活细胞和单个死细胞的数目。

2)摇瓶中的细胞连续悬浮培养21天后，停止培养，800rpm离心5分钟获得的细胞用5mL 0.25％(W/V)胰蛋白酶液在37℃、CO₂培养箱中消化15-20分钟。1000rpm离心5分钟去除胰酶后，加入10mL新鲜的不含血清的STM06培养基，吹成单个细胞悬液，如步骤1)重新接种于125mL摇瓶中，继续进行连续悬浮培养，计数大、小细胞团和单个活、死细胞的数目。

3)连续悬浮培养14天后，自然沉降细胞团后，收集含有单细胞的上清液。800rpm离心5分钟，收集细胞，如步骤1)重新接种于125mL摇瓶中，在培养基中再加入0.01g/LEDTA(步骤1)和步骤3)都要添加，目的是在悬浮细胞驯化中防止细胞聚团)，继续进行连续悬浮培养，计数大、小细胞团和单个活、死细胞的数目。

4)连续悬浮培养21天后，细胞团和单细胞的数目变化不大，但ST-2细胞初步具备了悬浮特征。

随着驯化的进行，细胞团总数、小细胞团的比例以及单个细胞的数目和单个细胞的比例如图4所示，图4记录了ST-2细胞在硫酸葡聚糖、Pluronic F68和EDTA存在的情况下细胞聚集程度的变化，可以看出细胞分散的比较好，单个细胞增多并且细胞形态饱满、边缘清晰、折光性好，表明硫酸葡聚糖和EDTA对细胞聚集起到了抑制作用，同时Pluronic F68也保证了细胞活力不受剪切力的影响。在连续培养过程中的每个阶段总的细胞团块数(实心圆表示)在减小，而团块中小团块比例(空心圆表示)在增高。

五、ST-2细胞在摇瓶中继续悬浮驯化

为获得更好的悬浮效果，改变了STM06培养基中活性因子(包括胰岛素、乙醇胺、维生素等)以及一些电解质的浓度，研制了ST-LSM-s培养基，配方见表1-2。用ST-LSM-s培养基对初步具备悬浮特征的ST-2细胞继续进行驯化，方法为：收集步骤四中初步具备悬浮特征的ST-2细胞，用0.25％(W/V)胰蛋白酶液消化后，按3×10⁵细胞/mL的密度接种于125mL的摇瓶中培养，培养基为ST-LSM-s，接种体积30mL，同时添加8％(V/V)新生牛血清。驯化过程中置于恒温培养箱中旋转培养，37℃、5％CO₂，摇速为85rpm。

在培养过程中，培养物中单细胞数目和活细胞比例升高，成团细胞数在减小(见图5之A)；吹打后，细胞比较容易分散(图5之B)。连续培养30天后，绝大多数细胞为悬浮的活细胞，细胞呈圆形，形态饱满，边界清楚，表明得到了可以悬浮生长的ST细胞，命名为ST-3细胞，冻存。

六、悬浮培养的ST-3细胞的低血清驯化

本步骤的目的是降低培养体系中的血清含量，以利于更好地将ST细胞应用于工业化生产。使细胞从含有高血清的培养基连续适应到低血清的培养基，可以通过本领域公知的方法逐渐进行。在含有高浓度血清的第一培养基中的细胞可以用于接种含有稍少血清的第二培养基。一旦第二培养基中的细胞生长到给定细胞密度，就可以将它们又用于接种含有更少血清的第三培养基，重复该方法直到细胞在含有所希望量的血清的培养基中生长。

首先将经过驯化的可以在含8％(V/V，以下同)新生牛血清的ST-LSM-s培养基中悬浮生长的ST细胞(ST-3)在摇瓶中进行连续传代培养，然后降低培养基中的血清含量到5％和3％，获得能够在低血清(3％)培养的ST细胞(ST-S)。

ST-3细胞的低血清驯化方法包括以下步骤：

1)复苏冻存的ST-3细胞(方法为：从液氮中取出冻存的ST-3细胞，在37℃水浴中迅速融化)，置于T25玻璃培养方瓶中，用含有8％新生牛血清的ST-LSM-s培养基进行贴壁培养，培养体积为8mL，在37℃、5％CO₂培养箱中进行培养，摇速为85rpm。48小时后换新鲜培养基。72小时后，细胞用0.25％(W/V)胰蛋白酶液在37℃、CO₂培养箱中消化15-20分钟后，1000rpm离心5分钟去除胰酶，加入10mL培养基吹成单个细胞悬液，按3×10⁵细胞/mL的密度接种到T75玻璃培养方瓶中继续传代培养，培养基为含有8％新生牛血清的ST-LSM-s培养基，培养体积为20mL，48小时后换新鲜培养基。

2)将在T75玻璃培养方瓶中培养72小时的细胞，细胞用0.25％(W/V)胰蛋白酶液在37℃、CO₂培养箱中消化10-15分钟后，1000rpm离心5分钟去除胰酶，加入10mL培养基吹成单个细胞悬液，按3×10⁵细胞/mL的密度接种到125mL摇瓶中继续传代培养，培养基为含有8％新生牛血清的ST-LSM-s培养基，培养体积为30mL，在37℃、5％CO₂培养箱中进行培养，摇瓶转速为85rpm。

3)对摇瓶中悬浮的细胞1000rpm离心5分钟，对收集的细胞用5mL 0.25％(W/V)胰蛋白酶液在37℃、CO₂培养箱中消化10-15分钟。1000rpm离心5分钟去除胰酶后，加入10mL新鲜培养基，吹成单个细胞悬液，进行传代，传代时接种密度为2-2.75×10⁵细胞/mL，培养条件为37℃、5％CO₂培养箱，摇瓶转速为85rpm。驯化过程中细胞的活率均在90％以上。

4)在含8％新生牛血清的ST-LSM-s培养基中连续传代4次后，1000rpm离心5分钟收集细胞，对收集的细胞用5mL 0.25％(W/V)胰蛋白酶液在37℃、CO₂培养箱中消化10-15分钟。1000rpm离心5分钟去除胰酶后，按2.75×10⁵细胞/mL的密度接种于125mL摇瓶中继续培养，培养基为ST-LSM-s培养基，培养体积为30mL，培养基中新生牛血清的浓度降为5％，培养条件为37℃、5％CO₂培养箱，摇瓶转速为85rpm。细胞连续传代，接种密度为2.5×10⁵细胞/mL或5×10⁵细胞/mL。

5)在含5％新生牛血清的ST-LSM-s培养基中连续传代6次后，如步骤4)，悬浮的ST细胞在125mL摇瓶中用含3％新生牛血清的ST-LSM-s培养基继续连续传代培养，培养体积为30mL，培养条件为37℃、5％CO₂培养箱，摇瓶转速为85rpm。细胞培养48小时后换新鲜培养基，细胞密度达1.2-2.0×10⁶细胞/mL时传代。驯化过程中细胞数目的变化见图6，连续传代6次后，细胞形态饱满、边缘清晰、折光性好(图7),命名为ST-S。

ST-3细胞经过由8％到5％血清浓度，再由5％到3％血清浓度两个驯化过程，成为可以在含有3％新生牛血清的ST-LSM-s培养基中连续悬浮培养的猪睾丸细胞(ST-S细胞)。

该ST-S细胞即为所期望的猪睾丸细胞株ST-S(种子细胞)。

6)冻存ST-S细胞，建立种子细胞库。采用本领域公知的方法冷藏细胞，即将ST-S细胞培养到指数生长期(指数生长期是指细胞增殖最旺盛、活力最好的时期)，收集细胞并用添加了10％冷冻保护剂(DMSO)和20％稳定剂(新生牛血清)的ST-LSM-s培养基悬浮，细胞密度达到2.0×10⁶细胞/mL，逐步冷冻于液氮中。

7)建库后，取一支种子细胞，复苏，方法液氮罐中取出细胞，快速放在37℃水浴锅中融化，然后1000rpm离心5分钟后接种于125mL的摇瓶中进行连续传代培养，接种密度为3×10⁵细胞/mL，培养基为含3％新生牛血清的ST-LSM-s，培养体积为30mL，培养条件为37℃、5％CO₂培养箱，摇瓶转速为85rpm，3天后细胞密度达到2.1±0.2×10⁶细胞/mL，连续传代30次，在此过程中，细胞生长形态、悬浮特性和生长速度均没有明显变化，表明ST-S细胞具有较好的悬浮稳定性。细胞的稳定性对该细胞的应用非常重要。可以悬浮培养是ST-S细胞的重要性质，这一性质的稳定性通过细胞株ST-S的冷冻和复苏过程步骤7)得到了初步验证。冻存的ST-S细胞株复苏后，不用进一步适应就能在培养基中悬浮培养。

用上述方法获得的可以悬浮培养的细胞株ST-S，已于2014年4月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为CGMCC No.9110。

实施例2、在5L生物反应器中悬浮培养ST-S细胞

本发明的ST-S细胞株经过冻存后仍然具备悬浮培养的特性。冻存的ST-S细胞株复苏后，不需要驯化过程，可以直接放大进行悬浮培养。本实施例提供了ST-S细胞株复苏后在5L生物反应器中的半流加悬浮培养方法。

在5L反应器中悬浮培养ST-S细胞包括以下步骤：

1)复苏冻存的ST-S细胞株，方法为：从液氮中取出1支冻存的ST-S细胞株(实施例1得到的)，在37℃水浴中迅速融化，加入预先准备(将培养基在37℃预热10分钟)的含5mLST-LSM-s培养基的10mL离心管中，1000rpm离心5分钟，倾去上清，用ST-LSM-s培养基重悬细胞，转移细胞到125mL摇瓶中，添加30mL含有3％(V/V)新生牛血清的ST-LSM-s培养基后，置于37℃、5％CO₂恒温培养箱中进行细胞培养，摇瓶转速为85rpm，培养2-3天后，得到复苏的ST-S细胞。

2)将ST-S细胞转至更大的培养容器进行放大培养，方法可为：培养3天后，1000rpm离心5分钟收集ST-S细胞，1：3传代至3个125mL摇瓶中，每瓶添加30mL含有3％(V/V)新生牛血清的ST-LSM-s培养基，置于37℃、5％CO₂恒温培养箱中进行细胞培养，摇瓶转速为85rpm。培养3天，1000rpm离心5分钟收集并混合细胞，重悬于300mL含有3％(V/V)新生牛血清的ST-LSM-s培养基中。这些细胞等量接种于2个500mL摇瓶中，置于37℃、5％CO₂恒温培养箱中继续培养3天，摇瓶转速为85rpm，细胞密度达到1.5-2×10⁶细胞/mL，1：3传代至6个500mL摇瓶，每瓶添加200mL含3％(V/V)新生牛血清的ST-LSM-s培养基，置于37℃、5％CO₂恒温培养箱中进行细胞培养，摇瓶转速为85rpm。

3)3天后，混合6个摇瓶中的ST-S细胞，细胞密度达到2×10⁶细胞/mL。取300mL细胞悬液，1000rpm离心5分钟，弃上清，将ST-S细胞沉淀用2L含有3％(V/V)新生牛血清的ST-LSM-s培养基重悬并接种于5L生物反应器(购自广州齐志生物技术有限公司)中培养，参数设定：温度设定值：37℃；pH设定：7.2；DO设定：40；转速：85rpm。

4)ST-S细胞在生物反应器中进行半流加悬浮培养：在第2天和第5天分别加入2L和1L新鲜的含有3％(V/V)新生牛血清的ST-LSM-s培养基。

5)ST-S细胞在生物反应器中连续培养的前6天，细胞活率均在90％以上(图8)，连续培养8天后，细胞活率降低(低于80％，图8)，终止培养。

第6-8天的细胞均可收获，得到悬浮培养的ST-S细胞。

实施例3、检测ST-S细胞对猪瘟病毒的敏感性

本实施例用于了解悬浮培养的ST-S细胞对猪瘟病毒(CSFV)的敏感性，并与贴壁培养的ST细胞做比较。

一、CSFV病毒感染细胞

1、CSFV病毒感染贴壁ST细胞：冻存的贴壁ST细胞，在T25玻璃培养方瓶复苏培养后，接种到T75玻璃培养方瓶中，接种密度为3×10⁴细胞/cm²，培养基为含3％小牛血清的ST-LSM-s培养基，培养体积为20mL。培养细胞至70-80％汇合率时按0.4％(M/V)接种CSFV脾毒(购自金宇宝灵生物制药有限公司)。

2、CSFV病毒感染悬浮ST细胞(ST-S)：冻存的ST-S细胞(实施例2方法悬浮培养得到的)复苏培养后接种到125mL摇瓶中，在含有3％小牛血清的ST-LSM-s培养基中培养，培养体积为30mL。培养条件为37℃、5％CO₂恒温培养箱，摇瓶转速为85rpm。培养48小时后，按2％(M/V)接种CSFV脾毒。

接种CSFV脾毒后，悬浮ST细胞(ST-S细胞)的浓度和活率变化如图9(病毒连续培养过程中存活的细胞数(空心圆)和细胞的活率(实心圆))所示，它们虽然有所降低，但能维持到4收(指接种CSFV脾毒后第4次收获上清液)，表明该细胞可以用于CSFV的连续培养。

二、用RT-PCR方法测定ST-S细胞对猪瘟病毒的敏感性

由于CSFV为非裂解型病毒，可以通过检测CSFV的核酸来确定病毒是否可以有效地感染待测细胞。

在接种CSFV脾毒后的1-5天内分别取上清、细胞样进行CSFV检测。第5天进行第一次收毒，此后每4天收毒一次。

采用RT-PCR的方法检测样品中CSFV的基因组片段并通过DNA电泳检测483bp的目的条带(猪瘟病毒基因)是否存在，从而确定细胞是否被CSFV感染。具体方法如下：

a.采用异硫氰酸法提取样品RNA，提取方法以下：

a)直接取样无需处理，取400μL样品置于1.5mL离心管中，加裂解液(配方：4mol/L异硫氰酸胍，25mmol/L柠檬酸钠·2H₂O，0.5％(W/V)月桂基磺酸钠，0.1mol/Lβ-巯基乙醇)600μL，充分摇匀。

b)加200μL氯仿(购自国药集团)和200μL Tris饱和酚(购自索莱宝)，摇匀后置-20℃10分钟，然后13000rpm离心10分钟。

c)取上清600μL置于新离心管中，加异丙醇(购自北京化工)600μL，摇匀后置室温15分钟，然后13000rpm离心10分钟。

d)弃上清液，用1mL 75％(V/V)冷乙醇(购自北京化工)洗涤，13000rpm离心10分钟。

e)弃上清，吸干乙醇后，加30μL无RNA酶水溶解待用。

b.将RNA反转录为cDNA。25μL反应体系包括：2μL RNA模板,5μL 5×反应缓冲液(购自：Takara)，2μL dNTP混合物(10mM，购自Takara)，1μL M-MLV+HPRT(购自Takara)，0.75μL引物1(序列：5’-ACATTGTATTTTGTGCACCGTCTG-3’)，0.75μL引物2(序列：5’-TCCAAACCCCTTTTTATCTTT-3’)，13.5μL ddH₂O。反转录在条件为：42℃40分钟。

c.PCR扩增。25μL反应体系包括：2μL反转录产物(cDNA)，2.5μL 10×反应缓冲液(购自：Takara)，2μL dNTP混合物(2.5mM，购自Takara)，0.5μL rTaq酶(购自Takara)，0.5μL引物3(5’-ACATTGTATTTTGTGCACCGTCTG-3’)，0.5μL引物4(5’-TCCAAACCCCTTTTTATCTTT-3’)，17μL ddH2O。PCR反应条件为：94℃预变性4分钟；然后，94℃30秒，57℃30秒，72℃50秒，30个循环；最后，72℃延伸7分钟。反应结束后，取5μL PCR反应扩增产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳检测。

d.更进一步地，本发明还验证了ST-S细胞对其它来源的猪瘟病毒株的敏感性。这些猪瘟病毒株包括：金宇宝灵公司的猪瘟病毒脾淋苗、保定瑞普公司的猪瘟病毒的细胞苗和组织苗。这些毒株感染ST-S细胞96h后，也用上述相同方法进行RT-PCR检测。

对猪瘟病毒感染不同时间的ST-S细胞的RT-PCR检测结果如图10A所示，PCR扩增出的目的DNA片段(猪瘟病毒基因)大小为480bp。在感染CSFV后的1-13天贴壁培养的ST细胞和悬浮培养的ST-S细胞均有CSFV产生(均扩增出480bp的DNA片段)，表明贴壁培养的ST细胞和悬浮培养的ST-S细胞对感染不同时间的CSFV都具有敏感性。对不同来源猪瘟疫苗感染的ST-S细胞的RT-PCR检测结果如图10B所示，结果均扩增出482bp的DNA片段，表明贴壁培养的ST细胞和悬浮培养的ST-S细胞对不同来源的CSFV都具有敏感性。对PCR扩增产物进行测序，结果PCR扩增片段的序列如序列表中序列1所示，用NCBI Blast工具进行序列比对，结果PCR扩增产物和CSFV相应序列的同源性为99％，表明PCR扩增产物来自于CSFV基因组(GenBank：AY663656.1)。

三、用原位免疫荧光法测定ST-S细胞对猪瘟病毒的敏感性

也可以同通过检测病毒蛋白的方法来确定ST-S细胞对猪瘟病毒的敏感性。用原位免疫荧光技术检测ST细胞对CSFV的敏感性，具体方法如下：

a.取摇瓶中培养的ST-S细胞，按2-3×10⁴细胞/cm²的密度，接种于在24孔板中放置的载玻片上。4-6小时后(此时细胞沉淀下去并贴附于载玻片上)接种CSFV脾毒，接种比例为0.4％(W/V)。

b.细胞接毒后再继续培养24小时，培养基为含3％新生牛血清的ST-LSM-s，培养体积为30mL，培养条件为37℃、5％CO₂培养箱，摇瓶转速为85rpm，然后，弃掉培养基，添加1.5％(W/V)的海藻酸钠(购自北京化工)固定细胞，固定后再加入1mL新鲜的ST-LSM-S培养基。

c.在37℃、5％CO₂恒温培养箱条件下，继续培养4-5天，用200μL等体积混合的丙酮(购自国药集团)和甲醛(购自国药集团)室温固定培养物15分钟。

d.用预冷的PBS(配方：3.4919g/L Na₂HPO₄·12H₂O，0.2g/L KH₂PO₄，0.2g/L KCl，0.2g/L NaCl)冲洗细胞片2次，用含0.15％(V/V)Triton X-100(购自北京化工)的PBS室温孵育10分钟。

e.加入用含1％BSA的PBS稀释1000倍的鼠抗CSFV多抗(一抗，购自上海远慕生物科技有限公司)，在湿盒内孵育细胞，37℃、5％CO₂恒温培养箱1小时。

f.缓慢弃去一抗，用PBS清洗细胞片3次，每次5分钟。

g.用1：1000稀释的FITC标记的羊抗鼠IgG(二抗，购自上海远慕生物科技有限公司)继续在湿盒内孵育细胞，37℃、5％CO₂恒温培养箱1小时。

h.缓慢弃去二抗，用PBS清洗细胞片3次，每次5分钟。

i.滴加1滴固定液(含20％甘油的PBS)，镜下计数荧光细胞和总细胞，计算感染率。

结果如图11所示，图中的绿色亮点为感染有CSFV的细胞，表明ST-S对CSFV是敏感的。

实施例4、ST-S细胞的支原体检测

为检查ST-S细胞是否感染支原体，对ST-S细胞培养上清液进行支原体DNA检测，具体方法包括以下步骤：

1)在5L摇瓶中连续培养ST-S细胞(方法见实施例2)。在培养的第2天、第5天和第8天分别取1mL细胞悬液，1000rpm离心5min后取上清，用于支原体DNA的PCR检测。

2)将5μL细胞培养上清与试剂盒中的40μL Ready to use PCR Mix(1.25×)和5μLPCR Primer Mix混合，得到PCR反应混合物。以5μL试剂盒中的Positive Control template作为阳性对照，以5μL去离子水作为阴性对照。

3)PCR反应条件：先95℃10分钟(DNA变性)；然后，52℃2分钟(退火)，72℃2分钟(延伸)，共30个循环。

4)PCR反应结束后，取50μL PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测。

检测结果如图12所示，阳性对照扩增出872bp的目的条带(支原体某特异基因)，而ST-S培养上清和阴性对照均未出现该条带，表明ST-S细胞没有感染支原体。

实施例5、ST-S细胞的染色体及核型分析

用本领域的常规方法(丁国杰等：中国兽药杂志2008，42(4)：32-34)对ST-S细胞进行染色体和核型分析：

1)培养细胞：在125mL摇瓶中悬浮培养ST-S细胞，添加30mL含有3％(W/V)新生牛血清的ST-LSM-s培养基后，置于37℃、5％CO₂恒温培养箱中进行细胞培养，摇瓶转速为90rpm。细胞培养至指数生长期时，培养基中加入终浓度为0.1μg/mL的秋水仙素。

2)细胞继续培养5小时后，1600rpm离心10min收集细胞，加入预温至37℃的75mMKCl溶液。在37℃、5％CO₂恒温培养箱中静置50分钟后，1000rpm离心5min收集细胞。

3)低渗处理后的细胞中加入1mL新鲜的固定液(醋酸:甲醇＝1:3，体积比)，用吸管吹打分散细胞进行预固定。2分钟后，1000rpm离心8min收集细胞。

4)加入5mL新鲜的固定液重悬细胞，固定10分钟后，1000rpm离心8min收集细胞。

5)重复步骤4)2次。1000rpm离心8min后，小心吸弃上清，根据悬液中细胞密度的大小，留取适量固定液(0.5-1mL)，吹打均匀，制成浊度适中(经验值，无参数)的细胞悬液。

6)用吸管滴上2-3滴细胞悬液于预冷的干净载玻片上，滴片时的距离在1米左右，将载玻片用电吹风吹干，室温干燥。

7)干燥后的细胞，用Giemsa染料染色：取Giemsa原液(购自Sigma公司)1份加9份PBS(pH 6.8)混合配成染色液，染色30分钟后流水冲洗，用电吹风吹干玻片。

8)在10×100倍显微镜下，选取铺展良好，边缘清晰的中期分裂相进行观察计数。照相后，用Photoshop进行核型分析，计算染色体的相对长度(某染色体长度/总长度)和臂比值(染色体长臂的长度/染色体短臂)。

ST-S细胞的染色体数目如表6所示，具有2n＝38条染色体的细胞数达到92％，仅有8％的细胞的染色体数为39条，表明ST-S染色体的数目为2n＝38。

核型分析结果如图13和表7所示。由图13可以看出细胞的核型为(38，XY)，核型与报道的猪细胞核型一致(表7和图13)。

表6 ST-S细胞的染色体数目

表7 ST-S细胞的核型分析结果

*：n＝5。

Claims

1.可以悬浮培养的猪睾丸细胞株ST-S，保藏编号为CGMCC No.9110。

2.根据权利要求1所述的猪睾丸细胞ST-S，其特征在于：所述ST-S细胞具有以下特征：

A.具有对猪瘟病毒(CSFV)的敏感性；

B.没有支原体污染；

C.具有2n＝38条染色体，模式数低于15％。

3.权利要求1或2所述的猪睾丸细胞株ST-S的获得方法，包括以下步骤：

3)ST-2细胞在摇瓶中的初步悬浮驯化：在培养基中添加硫酸葡聚糖、PluronicF-68和EDTA，继续连续悬浮培养ST-2细胞，进一步降低细胞的成团倾向，获得了初步具有悬浮特征的ST-2细胞；

5)悬浮培养的ST-3细胞的低血清驯化继续驯化ST-3细胞，使其能够在含有3％(V/V)血清的ST-LSM-s的培养基中悬浮生长，将获得的适应3％血清培养的ST细胞命名为ST-S；

4.根据权利要求3所述的猪睾丸细胞株ST-S的获得方法，其特征在于：所述步骤3)中硫酸葡聚糖的添加量为3.75g/L，Pluronic F-68的添加量为1g/L，EDTA的添加量为0.01g/L。

5.ST-LSM-s培养基，用于权利要求3或4所述猪睾丸细胞株ST-S的获得方法中，或权利要求6至9任一所述悬浮培养猪睾丸ST-S细胞的方法中，其组成如表1-2所示。

6.一种在5L生物反应器中悬浮培养猪睾丸ST-S细胞的方法，包括以下步骤：

(1)复苏冻存的权利要求1或2所述的细胞株ST-S，用含3％(V/V)新生牛血清的ST-LSM-s培养基恒温培养2-3天，得到复苏的ST-S细胞；

(5)悬浮培养后第6天-第8天收获ST-S细胞；

7.根据权利要求6所述悬浮培养猪睾丸ST-S细胞的方法，其特征在于：

8.根据权利要求6或7所述悬浮培养猪睾丸ST-S细胞的方法，其特征在于：

步骤(2)将ST-S细胞放大培养的具体操作为：离心，弃上清，收集复苏的ST-S细胞，1：3传代至3个125mL摇瓶中，瓶中添加30mL含3％(V/V)新生牛血清的ST-LSM-s培养基，置于37℃、5％CO₂恒温培养箱中进行细胞培养，摇瓶转速为80-90rpm；3天后，离心，弃上清，收集并混合ST-S细胞，将ST-S细胞重悬于300mL含3％(V/V)新生牛血清的ST-LSM-s培养基中，将这些细胞等量接种于2个500mL摇瓶中，置于37℃、5％CO₂恒温培养箱中继续培养3天，摇瓶转速为80-90rpm，细胞密度达到1.5-2×10⁶细胞/mL，1：3传代至6个500mL摇瓶，每瓶添加200mL含3％(V/V)新生牛血清的ST-LSM-s培养基，置于37℃、5％CO₂恒温培养箱中进行细胞培养，摇瓶转速为80-90rpm。

9.根据权利要求6或7或8所述悬浮培养猪睾丸ST-S细胞的方法，其特征在于：

10.权利要求1-或2所述的猪睾丸细胞株ST-S或权利要求6至9任一所述方法获得的猪睾丸ST-S细胞在制备猪瘟疫苗中的应用。