CN104593335B - 低血清培养Marc‑145细胞生产猪繁殖与呼吸道综合征CH‑1R株病毒的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了低血清培养Marc‑145细胞生产猪繁殖与呼吸道综合征CH‑1R株病毒的方法，属于兽医生物学技术领域，它包括以下步骤：S1.制备用细胞的传代与培养；S2.驯化细胞适应低血清培养基；S3.驯化细胞适应低血清培养环境；S4.细胞毒种的繁殖。本发明提供的低血清培养Marc‑145细胞生产猪繁殖与呼吸道综合征CH‑1R株病毒的方法，可以显著降低生产成本，同时可以提高下游纯化的效率，并且能够快速稳定的扩大生产规模，质量易于实现均衡稳定。
Description
技术领域
本发明属于兽医生物学技术领域，具体涉及低血清培养Marc-145细胞生产猪繁殖与呼吸道综合征CH-1R株病毒的方法。
背景技术
目前我国动物疫苗生产工艺相对落后，生产病毒所用的细胞绝大部分来自转瓶培养，且主要采用最基础的合成细胞培养基，甚至天然培养基(如水解乳蛋白)加入10％左右新生牛血清,这些动物来源成分带来的疫苗安全、质量和成本等问题已经凸显。主要表现在：①牛血清用量大，使细胞的生长状况对血清的依赖性大，但是血清是一种成分不确定的混合物，批与批之间的组分存在差异，直接影响产品质量的稳定性；②增加生产成本；③血清来源于动物，有可能携带传染源，对正在生长的细胞或者产品带来危险。在生产过程中控制和减少动物来源成分已成为一种趋势。美国FDA和美国农业部已经严密控制在细胞培养中胎牛血清的使用，以降低动物血清可能携带的传染源对细胞和制品带来的风险。降低新生牛血清的用量甚至不使用新生牛血清已成为目前生物制品发展的方向。
Marc-145细胞即恒河猴胚肾上皮细胞，广泛用于猪繁殖与呼吸综合征疫苗的生成，目前，国内各厂家使用的是传统的转瓶培养工艺生成该疫苗。微载体悬浮培养技术将逐步代替传统技术，但是进口微载体的价格较高。不论是传统的转瓶培养技术，还是先进的生物反应器悬浮培养技术，均采用高血清含量细胞培养技术。该传统工艺效率低、生产成本高；不同血清批次间差异显著；放大重现性较差；对下游纯化工艺要求高；容易出现血清出复杂成分导致的疫苗质量隐患，涉及生物安全和公共卫生问题。另外，目前全球血清供应趋紧，这大大影响了疫苗企业的生产效率。因此低血清培养技术的应用势在必行。经检索，未有关于低血清培养Marc-145细胞生产猪繁殖与呼吸道综合征CH-1R株病毒的相关文献报道。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺点，提供低血清培养Marc-145细胞生产猪繁殖与呼吸道综合征CH-1R株病毒的方法，该方法可以显著降低生产成本，同时可以提高下游纯化的效率，并且能够快速稳定的扩大生产规模，质量易于实现均衡稳定。
本发明的目的通过以下技术方案来实现：低血清培养Marc-145细胞生产猪繁殖与呼吸道综合征CH-1R株病毒的方法，它包括以下步骤：
S1.制备用细胞的传代与培养：
取T75瓶培养铺满单层Marc-145细胞，经EDTA-胰酶细胞分散液消化细胞，用细胞生长液吹打分散细胞，加入20ml的细胞生长液，将Marc-145细胞置于温度为37±2℃的二氧化碳培养箱中培养72h，待形成良好的细胞单层时，进行放大培养，上述细胞生长液为10％血清含量的DMEM或MEM培养液；
S2.驯化细胞适应低血清培养基：包括以下子步骤：
S21.第一代细胞的驯化：
将步骤S1扩大培养的Marc-145细胞接种到第一代低血清培养基中进行驯化，所述第一代低血清培养基为含10％血清的DMEM或MEM培养液和含5％血清的默克MD低血清培养液的混合液，DMEM或MEM培养液与默克MD低血清培养液体积比为2:1，其中血清的含量为8.3％；
S22.第二代细胞的驯化：
将驯化的第一代Marc-145细胞接种到第二代低血清培养基中进行驯化，所述第二代低血清培养基为含10％血清的DMEM或MEM培养液和含5％血清的默克MD低血清培养液的混合液，DMEM或MEM培养液与默克MD低血清培养液体积比为1:1，其中血清的含量为7.5％；
S23.第三代细胞的驯化：
将驯化的第二代Marc-145细胞接种到第三代低血清培养基中进行驯化，所述第三代低血清培养基为含10％血清的DMEM或MEM培养液和含5％血清的默克MD低血清培养液的混合液，DMEM或MEM培养液与默克MD低血清培养液体积比为1:2，其中血清的含量为6.7％；
S24.第四代细胞的驯化：
将驯化的第三代Marc-145细胞接种到第四代低血清培养基中进行驯化，所述第四代低血清培养基为默克MD低血清培养基和血清的混合液，血清的含量为5％；
S3.驯化细胞适应低血清培养环境：
使用T75细胞瓶，37℃静态培养驯化的第四代Marc-145细胞，培养液为默克MD低血清培养基和血清的混合液，血清的含量为1～5％，即为生产用种子细胞；
S4.细胞毒种的繁殖：
用病毒培养液将猪繁殖与呼吸道综合征CH-1R株病毒种毒按2％(v/v)的比例接种到生产用种子细胞单层中进行培养，培养66～80h后收获病毒。
进一步地，所述EDTA-胰酶细胞分散液为质量分数为0.10～0.25％的胰酶和0.02％的EDTA的Hank’s液的混合液。
进一步地，步骤S1中所述的低血清培养Marc-145细胞生产猪繁殖与呼吸道综合征CH-1R株病毒的方法，其特征在于，步骤S1中所述细胞生长液为低血清培养基和血清的混合液，其中血清的含量为1～5％。
进一步地，步骤S4中所述的低血清培养Marc-145细胞生产猪繁殖与呼吸道综合征CH-1R株病毒的方法，其特征在于，步骤S4中所述的病毒毒种培养液为低血清培养基、血清和抗生素，其中，血清的含量为0～1％，抗菌素的含量为100～200IU/mL，且混合液的pH值为7.2～7.4。
上述技术方案中，低血清培养基为默克MD系列干粉低血清培养基，培养基在使用前，需按照说明书配成溶液，具体方法如下：1)将一袋培养基全部倒入一容器中，用少量注射用水将袋内残留培养基洗下，并入容器。加注射用水(水温20℃～30℃)到17.5升，轻微搅拌溶解；2)加入23克碳酸氢钠；3)轻微搅拌溶解，加注射用水至20升；4)如果必要，用1mol/L氢氧化钠溶液或1mol/L盐酸溶液调pH至7.2-7.4；5)用0.2μm滤膜正压过滤除菌；6)溶液应在2℃-8℃下避光保存。
本发明具有以下优点：本发明低血清培养Marc-145细胞生产猪繁殖与呼吸道综合征CH-1R株病毒生产疫苗中使用低血清培养基可有效降低培养液中的牛血清使用量，并能提高细胞密度及生物制品的产率；本发明Marc-145细胞在低血清培养基的生长情况甚至优于加入10％牛血清的传统培养基，且能提高细胞密度、提高病毒滴度，获取同样的细胞量，用低血清培养基将比用传统培养基缩短近1/3的时间，可提高生产效率。因此，本发明提供低血清培养Marc-145细胞生产猪繁殖与呼吸道综合征CH-1R株病毒的方法可以显著降低生产成本，同时可以提高下游纯化的效率，并且能够快速稳定的扩大生产规模，质量易于实现均衡稳定。
附图说明
图1为实施例3中血清添加比例为1％时Marc-145细胞的生长效果图，其中，图a的培养时间为24h，图b的培养时间为48h，图c的培养时间为72h；
图2为实施例3中血清添加比例为2％时Marc-145细胞的生长效果图，其中，图a的培养时间为24h，图b的培养时间为48h，图c的培养时间为72h；
图3为实施例3中血清添加比例为3％时Marc-145细胞的生长效果图，其中，图a的培养时间为24h，图b的培养时间为48h，图c的培养时间为72h；
图4为实施例3中血清添加比例为4％时Marc-145细胞的生长效果图，其中，图a的培养时间为24h，图b的培养时间为48h，图c的培养时间为72h；
图5为实施例3中血清添加比例为5％时Marc-145细胞的生长效果图，其中，图a的培养时间为24h，图b的培养时间为48h，图c的培养时间为72h；
图6为实施例3中对照组Marc-145细胞的生长效果图，其中，图a的培养时间为24h，图b的培养时间为48h，图c的培养时间为72h；
图7为实施例4中低血清培养液驯化的Marc-145细胞接种猪繁殖与呼吸道综合征CH-1R株病毒后病变情况，其中，图a细胞培养液的血清添加比例为1％，图b细胞培养液的血清添加比例为2％，图c细胞培养液的血清添加比例为3％，图d细胞培养液为对照组，图e细胞培养液的血清添加比例为4％，图f细胞培养液的血清添加比例为5％。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的描述，本发明的保护范围不局限于以下所述。
实施例1：低血清培养Marc-145细胞生产猪繁殖与呼吸道综合征CH-1R株病毒的方法，它包括以下步骤：
S1.制备用细胞的传代与培养：
取T75瓶培养铺满单层Marc-145细胞，经EDTA-胰酶细胞分散液消化细胞，EDTA-胰酶细胞分散液为质量分数为0.15％的胰酶和0.02％的EDTA的Hank’s液的混合液；用细胞生长液吹打分散细胞，加入20ml细胞生长液，将Marc-145细胞置于温度为37±2℃的二氧化碳培养箱中培养72h，待形成良好的细胞单层时，进行放大培养；细胞生长液为DMEM和新生牛血清，DMEM与新生牛血清体积比为9:1，其中血清的含量为10％；
S2.驯化细胞适应低血清培养基：包括以下子步骤：
S21.第一代细胞的驯化：
将步骤S1扩大培养的Marc-145细胞接种到第一代低血清培养基中进行驯化，所述第一代低血清培养基为含10％新生牛血清的DMEM培养液和含5％新生牛血清的默克MD低血清培养液的混合液，DMEM培养液与默克MD低血清培养液体积比为2:1，其中血清的含量为8.3％；
S22.第二代细胞的驯化：
将驯化的第一代Marc-145细胞接种到第二代低血清培养基中进行驯化，所述第二代低血清培养基为含10％新生牛血清的DMEM培养液和含5％新生牛血清的默克MD低血清培养液的混合液，DMEM培养液与默克MD低血清培养液体积比为1:1，其中血清的含量为7.5％；
S23.第三代细胞的驯化：
将驯化的第二代Marc-145细胞接种到第三代低血清培养基中进行驯化，所述第三代低血清培养基为含10％新生牛血清的DMEM培养液和含5％新生牛血清的默克MD低血清培养液的混合液，DMEM培养液与默克MD低血清培养液体积比为1:2，其中血清的含量为6.7％；
S24.第四代细胞的驯化：
将驯化的第三代Marc-145细胞接种到第四代低血清培养基中进行驯化，所述第四代低血清培养基为默克MD低血清培养基和新生牛血清的混合液，血清的含量为5％；
S3.驯化细胞适应低血清培养环境：
使用T75细胞瓶，37℃静态培养驯化的第四代Marc-145细胞，培养液为默克MD低血清培养基和新生牛血清的混合液，血清的含量为1～5％，即为生产用种子细胞；
S4.细胞毒种的繁殖：
用病毒培养液将猪繁殖与呼吸道综合征CH-1R株病毒种毒按2％(v/v)的比例接种到生产用种子细胞单层中进行培养，培养66～80h后收获病毒。
实施例2：低血清培养Marc-145细胞生产猪繁殖与呼吸道综合征CH-1R株病毒的方法，它包括以下步骤：
S1.制备用细胞的传代与培养：
取T75瓶培养铺满单层Marc-145细胞，经EDTA-胰酶细胞分散液消化细胞，EDTA-胰酶细胞分散液为质量分数为0.15％的胰酶和0.02％的EDTA的Hank’s液的混合液，用细胞生长液吹打分散细胞，加入20ml细胞生长液，将Marc-145细胞置于温度为37±2℃的二氧化碳培养箱中培养72h，待形成良好的细胞单层时，进行放大培养；细胞生长液为MEM和新生牛血清的混合液，MEM与新生牛血清体积比为9:1，其中血清的含量为10％；
S2.驯化细胞适应低血清培养基：包括以下子步骤：
S21.第一代细胞的驯化：
将步骤S1扩大培养的Marc-145细胞接种到第一代低血清培养基中进行驯化，所述第一代低血清培养基为含10％新生牛血清的MEM培养液和含5％新生牛血清的默克MD低血清培养液的混合液，MEM培养液与默克MD低血清培养液体积比为2:1，其中血清的含量为8.3％；
S22.第二代细胞的驯化：
将驯化的第一代Marc-145细胞接种到第二代低血清培养基中进行驯化，所述第二代低血清培养基为含10％新生牛血清的MEM培养液和含5％新生牛血清的默克MD低血清培养液的混合液，MEM培养液与默克MD低血清培养液体积比为1:1，其中血清的含量为7.5％；
S23.第三代细胞的驯化：
将驯化的第二代Marc-145细胞接种到第三代低血清培养基中进行驯化，所述第三代低血清培养基为含10％新生牛血清的MEM培养液和含5％新生牛血清的默克MD低血清培养液的混合液，MEM培养液与默克MD低血清培养液体积比为1:2，其中血清的含量为6.7％；
S24.第四代细胞的驯化：
将驯化的第三代Marc-145细胞接种到第四代低血清培养基中进行驯化，所述第四代低血清培养基为默克MD低血清培养基和新生牛血清的混合液，血清的含量为5％；
S3.驯化细胞适应低血清培养环境：
使用T75细胞瓶，37℃静态培养驯化的第四代Marc-145细胞，培养液为默克MD低血清培养基和新生牛血清的混合液，血清的含量为1～5％，即为生产用种子细胞；
S4.细胞毒种的繁殖：
用病毒培养液将猪繁殖与呼吸道综合征CH-1R株病毒种毒按2％(v/v)的比例接种到生产用种子细胞单层中进行培养，培养66～80h后收获病毒。
实施例3：低血清培养基驯化Marc-145细胞效果
使用T75细胞瓶，37℃静态培养适应低血清培养基第四代Marc-145细胞，血清添加比例为1％，2％，3％，4％，5％五个梯度，并设立使用血清含量为10％的DMEM液培养的Marc-145细胞为对照组，结果如图1、图2、图3、图4、图5、图6所示，细胞培养过程中各指标见表1。
表1：MD系列低血清培养基驯化Marc-145细胞效果
由表1可知，实验组的细胞平均收获量、细胞平均活性和平均比生长率均高于对照组的。
实施例4：MD系列低血清培养基驯化得到的Marc-145细胞接种猪繁殖与呼吸道综合征CH-1R株病毒后效价检测
MD系列低血清培养基培养Marc-145细胞接种猪繁殖与呼吸道综合征CH-1R株病毒，接毒比例为2％(v/v)，对照(血清含量为10％的DMEM)组病毒维持液血清浓度为2％，试验组病毒维持液血清浓度为0～1％，接毒后66～80h收获病毒，实验结果如图7所示，三次试验结果平均值见表2。
表2：驯化后Marc-145细胞繁殖猪繁殖与呼吸道综合征CH-1R株病毒情况
实施例5：成本估算和比较
以100L培养体积为例，对血清价格上涨前及使用低血清工艺前后的成本，进行估算和比较，具体结果如下：
表3：成本估算
上述实施例中MD为默克MD系列低血清培养基。
Claims (1)
1.低血清培养Marc-145细胞生产猪繁殖与呼吸道综合征CH-1R株病毒的方法，其特征在于，它包括以下步骤：
S1. 制备用细胞的传代与培养：
取T75瓶培养铺满单层Marc-145细胞，经EDTA-胰酶细胞分散液消化细胞，用细胞生长液吹打分散细胞，加入20ml细胞生长液，将Marc-145细胞置于温度为37±2℃的二氧化碳培养箱中培养72h，待形成良好的细胞单层时，进行放大培养，上述细胞生长液为10%血清含量的DMEM或MEM培养液；
S2. 驯化细胞适应低血清培养基：包括以下子步骤：
S21. 第一代细胞的驯化：
将步骤S1扩大培养的Marc-145细胞接种到第一代低血清培养基中进行驯化，所述第一代低血清培养基为含10%血清的DMEM或MEM培养液和含5%血清的默克MD低血清培养液的混合液，DMEM或MEM培养液与默克MD低血清培养液体积比为2:1，其中血清的含量为8.3%；
S22. 第二代细胞的驯化：
将驯化的第一代Marc-145细胞接种到第二代低血清培养基中进行驯化，所述第二代低血清培养基为含10%血清的DMEM或MEM培养液和含5%血清的默克MD低血清培养液的混合液，DMEM或MEM培养液与默克MD低血清培养液体积比为1:1，其中血清的含量为7.5%；
S23. 第三代细胞的驯化：
将驯化的第二代Marc-145细胞接种到第三代低血清培养基中进行驯化，所述第三代低血清培养基为含10%血清的DMEM或MEM培养液和含5%血清的默克MD低血清培养液的混合液，DMEM或MEM培养液与默克MD低血清培养液体积比为1:2，其中血清的含量为6.7%；
S24. 第四代细胞的驯化：
将驯化的第三代Marc-145细胞接种到第四代低血清培养基中进行驯化，所述第四代低血清培养基为默克MD低血清培养基和血清的混合液，血清的含量为5%；
S3. 驯化细胞适应低血清培养环境：
使用T75细胞瓶，37℃静态培养驯化的第四代Marc-145细胞，培养液为默克MD低血清培养基和血清的混合液，血清的含量为1～5%，即为生产用种子细胞；
S4. 细胞毒种的繁殖：
用病毒培养液将猪繁殖与呼吸道综合征CH-1R株病毒毒种按2%（v/v）的比例接种到生产用种子细胞单层中进行培养，培养66～80h后收获病毒；
其中，所述EDTA-胰酶细胞分散液为质量分数为0.10～0.25%的胰酶和0.02%的EDTA的Hank’s液的混合液；
步骤S1中所述细胞生长液为低血清培养基和血清的混合液，其中低血清培养基中血清的含量为1～5%；
步骤S4中所述的病毒培养液为低血清培养基、血清和抗菌素的混合液，其中，血清的含量为0～1%，抗菌素的含量为100～200IU/mL，且混合液的pH值为7.2～7.4。
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