CN104630158A

CN104630158A - 低血清培养Vero细胞生产猪流行性腹泻CV777株病毒的方法

Info

Publication number: CN104630158A
Application number: CN201510097945.4A
Authority: CN
Inventors: 徐宏军; 胡来根; 牟和平; 岳丰雄; 任丽; 王洁清
Original assignee: CHENGDU TIANBANG BIOLOGICAL PRODUCTS Co Ltd
Current assignee: CHENGDU TIANBANG BIOLOGICAL PRODUCTS Co Ltd
Priority date: 2015-03-05
Filing date: 2015-03-05
Publication date: 2015-05-20

Abstract

本发明公开了低血清培养Vero细胞生产猪流行性腹泻CV777株病毒的方法，属于兽医生物学技术领域，它包括以下步骤：S1.制备用细胞的传代与培养；S2.驯化细胞适应低血清培养基；S3.驯化细胞适应低血清培养环境；S4.细胞毒种的繁殖；S5.制备毒液的繁殖。本发明提供的低血清培养Vero细胞生产猪流行性腹泻CV777株病毒的方法，可以显著降低生产成本，同时可以提高下游纯化的效率，并且能够快速稳定的扩大生产规模，质量易于实现均衡稳定。

Description

低血清培养Vero细胞生产猪流行性腹泻CV777株病毒的方法

技术领域

本发明属于兽医生物学技术领域，具体涉及低血清培养Vero细胞生产猪流行性腹泻CV777株病毒的方法。

背景技术

2010年下半年以来，猪流行性腹泻病又在我国出现新一轮的爆发流行。最早发生在广西，然后湖南、华北、华东、山东、河北等地普遍发病，呈现全国性大流行，造成哺乳猪仔的大量死亡，据农业部流行病学中心统计，2011年猪流行性腹泻(PED)病引起猪的死亡数已占据所有我国现有猪病的首位。

目前，国内猪流行性腹泻疫苗生产技术不论是传统的转瓶培养技术，还是先进的生物反应器悬浮培养技术，均采用高血清含量细胞培养技术。该传统工艺效率低、生产成本高；不同血清批次间差异显著；放大重现性较差；对下游纯化工艺要求高；容易出现血清出复杂成分导致的疫苗质量隐患，涉及生物安全和公共卫生问题。另外，目前全球血清供应趋紧，这大大影响了疫苗企业的生产效率。因此低血清培养技术的应用势在必行。经检索，未有关于低血清培养Vero细胞生产猪流行性腹泻CV777株病毒的相关文献报道。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺点，提供低血清培养Vero细胞生产猪流行性腹泻CV777株病毒的方法，该方法可以显著降低生产成本，同时可以提高下游纯化的效率，并且能够快速稳定的扩大生产规模，质量易于实现均衡稳定。

本发明的目的通过以下技术方案来实现：低血清培养Vero细胞生产猪流行性腹泻CV777株病毒的方法，它包括以下步骤：

S1.制备用细胞的传代与培养：

取T75瓶培养铺满单层Vero细胞，经EDTA-胰酶细胞分散液消化细胞，用细胞生长液吹打分散细胞，加入20ml细胞生长液，将Vero细胞置于温度为37±2℃的二氧化碳培养箱中培养72h，待形成良好的细胞单层时，进行放大培养,上述细胞生长液为10％血清含量的DMEM或MEM培养液；

S2.驯化细胞适应低血清培养基：包括以下子步骤：

S21.第一代细胞的驯化：

将步骤S1扩大培养的Vero细胞接种到第一代低血清培养基中进行驯化，所述第一代低血清培养基为含10％血清的DMEM或MEM培养液和含5％血清的默克MD低血清培养液的混合液，DMEM或MEM培养液与默克MD低血清培养液体积比为2:1，其中血清的含量为8.3％；

S22.第二代细胞的驯化：

将驯化的第一代Vero细胞接种到第二代低血清培养基中进行驯化，所述第二代低血清培养基为含10％血清的DMEM或MEM培养液和含5％血清的默克MD低血清培养液的混合液，DMEM或MEM培养液与默克MD低血清培养液体积比为1:1，其中血清的含量为7.5％；

S23.第三代细胞的驯化：

将驯化的第二代Vero细胞接种到第三代低血清培养基中进行驯化，所述第三代低血清培养基为含10％血清的DMEM或MEM培养液和含5％血清的默克MD低血清培养液的混合液，DMEM或MEM培养液与默克MD低血清培养液体积比为1:2，其中血清的含量为6.7％；

S24.第四代细胞的驯化：

将驯化的第三代Vero细胞接种到第四代低血清培养基中进行驯化，所述第四代低血清培养基为默克MD低血清培养基和血清的混合液，血清的含量为5％；

S3.驯化细胞适应低血清培养环境：

使用T75细胞瓶，37℃静态培养驯化的第四代Vero细胞，培养液为默克MD低血清培养基和血清的混合液，血清的含量为1～5％，即为生产用种子细胞；

S4.细胞毒种的繁殖：

用病毒培养液将猪流行性腹泻CV777株病毒毒种按1～5％(v/v)的比例接种到生产用种子细胞单层中进行培养，至细胞70％发生病变时收获毒液；将此毒液作为种毒，在生产用细胞上进行细胞适应性连续传代，直至TCID₅₀稳定，此时收获的毒液作为生产用种毒；

S5.制备毒液的繁殖：

待生产用种子细胞形成单层，按1～5％(v/v)的比例接入生产用种毒，置于培养温度为37±2℃的二氧化碳培养箱中培养，待70％以上细胞发生病变时收获病毒液。

进一步地，所述EDTA-胰酶细胞分散液为质量分数为0.10～0.25％的胰酶和0.02％的EDTA的Hank’s液的混合液。

进一步地，步骤S1中所述细胞生长液为低血清培养基和血清的混合液，其中血清的含量为1～5％。

进一步地，步骤S4和S5中所述的病毒毒种培养液为低血清培养基、血清和抗生素的混合液，其中，血清的含量为0～1％，抗菌素的含量为100～200IU/mL，且混合液的pH值为7.2～7.4。

上述技术方案中，低血清培养基为默克MD系列干粉低血清培养基，培养基在使用前，需按照说明书配成溶液，具体方法如下：1)将一袋培养基全部倒入一容器中，用少量注射用水将袋内残留培养基洗下，并入容器。加注射用水(水温20℃～30℃)到17.5升，轻微搅拌溶解；2)加入23克碳酸氢钠；3)轻微搅拌溶解，加注射用水至20升；4)如果必要，用1mol/L氢氧化钠溶液或1mol/L盐酸溶液调pH至7.2-7.4；5)用0.2μm滤膜正压过滤除菌；6)溶液应在2℃-8℃下避光保存。

本发明具有以下优点：本发明低血清培养Vero细胞生产猪流行性腹泻CV777株病毒生产疫苗中使用低血清培养基可有效降低培养液中的牛血清使用量，并能提高细胞密度及生物制品的产率；本发明Vero细胞在低血清培养基的生长情况甚至优于加入10％牛血清的传统培养基，且能提高细胞密度、提高病毒滴度，获取同样的细胞量，用低血清培养基将比用传统培养基缩短近1/3的时间，可提高生产效率。因此，本发明提供低血清培养Vero细胞生产猪流行性腹泻CV777株病毒的方法可以显著降低生产成本，同时可以提高下游纯化的效率，并且能够快速稳定的扩大生产规模，质量易于实现均衡稳定。

附图说明

图1为实施例3中血清添加比例为1％时Vero细胞的生长效果图，其中，图a的培养时间为24h，图b的培养时间为48h，图c的培养时间为72h；

图2为实施例3中血清添加比例为2％时Vero细胞的生长效果图，其中，图a的培养时间为24h，图b的培养时间为48h，图c的培养时间为72h；

图3为实施例3中血清添加比例为3％时Vero细胞的生长效果图，其中，图a的培养时间为24h，图b的培养时间为48h，图c的培养时间为72h；

图4为实施例3中血清添加比例为4％时Vero细胞的生长效果图，其中，图a的培养时间为24h，图b的培养时间为48h，图c的培养时间为72h；

图5为实施例3中血清添加比例为5％时Vero细胞的生长效果图，其中，图a的培养时间为24h，图b的培养时间为48h，图c的培养时间为72h；

图6为实施例3中对照组Vero细胞的生长效果图，其中，图a的培养时间为24h，图b的培养时间为48h，图c的培养时间为72h；

图7为实施例4中低血清培养液驯化的Vero细胞接种猪瘟病毒后病变情况，其中，图a的血清添加比例为1％，图b的血清添加比例为2％，图c的血清添加比例为3％，图d的血清添加比例为4％，图e的血清添加比例为5％,图f为对照组。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的描述，本发明的保护范围不局限于以下所述。

实施例1：低血清培养Vero细胞生产猪流行性腹泻CV777株病毒的方法，它包括以下步骤：S1.制备用细胞的传代与培养：

取T75瓶培养铺满单层Vero细胞，经EDTA-胰酶细胞分散液消化细胞，EDTA-胰酶细胞分散液为质量分数为0.15％的胰酶和0.02％的EDTA的Hank’s液的混合液；用细胞生长液吹打分散细胞，加入20ml细胞生长液，将Vero细胞置于温度为37±2℃的二氧化碳培养箱中培养72h，待形成良好的细胞单层时，进行放大培养,上述细胞生长液为10％血清含量的DMEM培养液；

S2.驯化细胞适应低血清培养基：包括以下子步骤：

S21.第一代细胞的驯化：

将步骤S1扩大培养的Vero细胞接种到第一代低血清培养基中进行驯化，所述第一代低血清培养基为含10％血清的DMEM培养液和含5％血清的默克MD低血清培养液的混合液，DMEM培养液与默克MD低血清培养液体积比为2:1，其中血清的含量为8.3％；

S22.第二代细胞的驯化：

将驯化的第一代Vero细胞接种到第二代低血清培养基中进行驯化，所述第二代低血清培养基为含10％血清的DMEM培养液和含5％血清的默克MD低血清培养液的混合液，DMEM培养液与默克MD低血清培养液体积比为1:1，其中血清的含量为7.5％；

S23.第三代细胞的驯化：

将驯化的第二代Vero细胞接种到第三代低血清培养基中进行驯化，所述第三代低血清培养基为含10％血清的DMEM培养液和含5％血清的默克MD低血清培养液的混合液，DMEM培养液与默克MD低血清培养液体积比为1:2，其中血清的含量为6.7％；

S24.第四代细胞的驯化：

S3.驯化细胞适应低血清培养环境：

S4.细胞毒种的繁殖：

用病毒培养液将猪流行性腹泻CV777株病毒毒种按1～5％(v/v)的比例接种到生产用种子细胞单层中进行培养，至细胞70％发生病变时收获毒液；将此毒液作为种毒，在生产用细胞上进行细胞适应性连续传代，直至TCID₅₀稳定，此时收获的毒液作为生产用种毒；病毒毒种培养液为DMEM、5％的血清和抗生素的混合液，其中，血清的含量为0.5％，抗生素的含量为100～200IU/mL，且混合液的pH值为7.2～7.4；

S5.制备毒液的繁殖：

待生产用种子细胞形成单层，按1～5％(v/v)的比例接入生产用种毒，置于培养温度为37±2℃的二氧化碳培养箱中培养，待70％以上细胞发生病变时收获病毒液，病毒毒种培养液为DMEM、5％的血清和抗生素的混合液，其中，血清的含量为0.5％，抗生素的含量为100～200IU/mL，且混合液的pH值为7.2～7.4。

收获病毒液的处理：收获的病毒液经过两到三次冻融后，离心或过滤除去细胞碎片后置于-70℃保存备用。

实施例2：低血清培养Vero细胞生产猪流行性腹泻CV777株病毒的方法，它包括以下步骤：S1.制备用细胞的传代与培养：

取T75瓶培养铺满单层Vero细胞，经EDTA-胰酶细胞分散液消化细胞，EDTA-胰酶细胞分散液为质量分数为0.15％的胰酶和0.02％的EDTA的Hank’s液的混合液，用细胞生长液吹打分散细胞，加入20ml细胞生长液，将Vero细胞置于温度为37±2℃的二氧化碳培养箱中培养72h，待形成良好的细胞单层时，进行放大培养,上述细胞生长液为10％血清含量的MEM培养液；

S2.驯化细胞适应低血清培养基：包括以下子步骤：

S21.第一代细胞的驯化：

将步骤S1扩大培养的Vero细胞接种到第一代低血清培养基中进行驯化，所述第一代低血清培养基为含10％血清的MEM培养液和含5％血清的默克MD低血清培养液的混合液，MEM培养液与默克MD低血清培养液体积比为2:1，其中血清的含量为8.3％；

S22.第二代细胞的驯化：

将驯化的第一代Vero细胞接种到第二代低血清培养基中进行驯化，所述第二代低血清培养基为含10％血清的MEM培养液和含5％血清的默克MD低血清培养液的混合液，MEM培养液与默克MD低血清培养液体积比为1:1，其中血清的含量为7.5％；

S23.第三代细胞的驯化：

将驯化的第二代Vero细胞接种到第三代低血清培养基中进行驯化，所述第三代低血清培养基为含10％血清的MEM培养液和含5％血清的默克MD低血清培养液的混合液，MEM培养液与默克MD低血清培养液体积比为1:2，其中血清的含量为6.7％；

S24.第四代细胞的驯化：

S3.驯化细胞适应低血清培养环境：

S4.细胞毒种的繁殖：

用病毒培养液将猪流行性腹泻CV777株病毒毒种按1～5％(v/v)的比例接种到生产用种子细胞单层中进行培养，至细胞70％发生病变时收获毒液；将此毒液作为种毒，在生产用细胞上进行细胞适应性连续传代，直至TCID₅₀稳定，此时收获的毒液作为生产用种毒；病毒毒种培养液为MEM、5％的血清和抗生素的混合液，其中，血清的含量为0.5％，抗生素的含量为100～200IU/mL，且混合液的pH值为7.2～7.4；

S5.制备毒液的繁殖：

待生产用种子细胞形成单层，按1～5％(v/v)的比例接入生产用种毒，置于培养温度为37±2℃的二氧化碳培养箱中培养，待70％以上细胞发生病变时收获病毒液。病毒毒种培养液为MEM、5％的血清和抗生素的混合液，其中，血清的含量为0.5％，抗生素的含量为100～200IU/mL，且混合液的pH值为7.2～7.4。

实施例3：低血清培养基驯化Vero细胞效果

使用T75细胞瓶，37℃静态培养适应低血清培养基第四代Vero细胞，血清添加比例为1％，2％，3％，4％，5％五个梯度，并设立使用血清含量为10％的DMEM液培养的Vero细胞为对照组，结果如图1、图2、图3、图4、图5、图6所示，细胞培养过程中各指标见表1。

表1：MD系列低血清培养基驯化Vero细胞效果

由表1可知，实验组的细胞平均收获量、细胞平均活性和平均比生长率均高于对照组的。实施例4：MD系列低血清培养基驯化得到的Vero细胞接种猪流行性腹泻病毒后效价检测

MD系列低血清培养基培养Vero细胞接种猪流行性腹泻病毒。接毒比例为2％(v/v)，对照(血清含量为10％的DMEM)组病毒维持液血清浓度为2％，试验组病毒维持液血清浓度为0.5％，接毒后细胞病变70％以上时，实验结果如图7所示，三次试验结果平均值见表2。

表2：驯化后Vero细胞繁殖猪流行性腹泻病毒情况

实施例5：成本估算和比较

以100L培养体积为例，对血清价格上涨前及使用低血清工艺前后的成本，进行估算和比较，具体结果如下：

表3：成本估算

上述实施例中MD系列为默克MD系列低血清培养基。

Claims

1.低血清培养Vero细胞生产猪流行性腹泻CV777株病毒的方法，其特征在于，它包括以下步骤：

S1. 制备用细胞的传代与培养：

取T75瓶培养铺满单层Vero细胞，经EDTA-胰酶细胞分散液消化细胞，用细胞生长液吹打分散细胞，加入20ml细胞生长液，将Vero细胞置于温度为37±2℃的二氧化碳培养箱中培养72h，待形成良好的细胞单层时，进行放大培养, 上述细胞生长液为10%血清含量的DMEM或MEM培养液；

S2. 驯化细胞适应低血清培养基：包括以下子步骤：

S21. 第一代细胞的驯化：

将步骤S1扩大培养的Vero细胞接种到第一代低血清培养基中进行驯化，所述第一代低血清培养基为含10%血清的DMEM或MEM培养液和含5%血清的默克MD低血清培养液的混合液，DMEM或MEM培养液与默克MD低血清培养液体积比为2:1，其中血清的含量为8.3%；

S22. 第二代细胞的驯化：

将驯化的第一代Vero细胞接种到第二代低血清培养基中进行驯化，所述第二代低血清培养基为含10%血清的DMEM或MEM培养液和含5%血清的默克MD低血清培养液的混合液，DMEM或MEM培养液与默克MD低血清培养液体积比为1:1，其中血清的含量为7.5%；

S23. 第三代细胞的驯化：

将驯化的第二代Vero细胞接种到第三代低血清培养基中进行驯化，所述第三代低血清培养基为含10%血清的DMEM或MEM培养液和含5%血清的默克MD低血清培养液的混合液，DMEM或MEM培养液与默克MD低血清培养液体积比为1:2，其中血清的含量为6.7%；

S24. 第四代细胞的驯化：

将驯化的第三代Vero细胞接种到第四代低血清培养基中进行驯化，所述第四代低血清培养基为默克MD低血清培养基和血清的混合液，血清的含量为5%；

S3. 驯化细胞适应低血清培养环境：

使用T75细胞瓶，37℃静态培养驯化的第四代Vero细胞，培养液为默克MD低血清培养基和血清的混合液，血清的含量为1～5%，即为生产用种子细胞；

S4. 细胞毒种的繁殖：

用病毒培养液将猪流行性腹泻CV777株病毒毒种按1～5%（v/v）的比例接种到生产用种子细胞单层中进行培养，至细胞70%发生病变时收获毒液；将此毒液作为种毒，在生产用细胞上进行细胞适应性连续传代，直至TCID₅₀稳定，此时收获的毒液作为生产用种毒；

S5. 制备毒液的繁殖：

待生产用种子细胞形成单层，按1～5%（v/v）的比例接入生产用种毒，置于培养温度为37±2℃的二氧化碳培养箱中培养，待70%以上细胞发生病变时收获病毒液。

2.如权利要求1所述的低血清培养Vero细胞生产猪流行性腹泻CV777株病毒的方法，其特征在于，所述EDTA-胰酶细胞分散液为质量分数为0.10～0.25%的胰酶和0.02%的EDTA的Hank’s液的混合液。

3.如权利要求1所述的低血清培养Vero细胞生产猪流行性腹泻CV777株病毒的方法，其特征在于，步骤S1中所述细胞生长液为低血清培养基和血清的混合液，其中血清的含量为1～5%。

4.如权利要求1所述的低血清培养Vero细胞生产猪流行性腹泻CV777株病毒的方法，其特征在于，步骤S4和S5中所述的病毒毒种培养液为低血清培养基、血清和抗生素的混合液，其中，血清的含量为0～1%，抗菌素的含量为100～200IU/mL，且混合液的pH值为7.2～7.4。