CN102268411A - Ibdv无血清微载体悬浮培养增殖的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种IBDV无血清微载体悬浮培养增殖的方法，包括下列步骤：1）Vero细胞的无血清培养的驯化；2）IBDV病毒增殖：将驯化的细胞接种到含0.25%的乳清蛋白水解物的无血清培养基，待细胞粘附到微载体并开始生长时接种IBDV病毒，90h收获病毒。本发明对从ATCC引进的Vero细胞进行驯化，降血清的培养，最终获得无血清微载体培养条件下的Vero细胞，同时改进IBDV病毒增殖时培养基成分，减少外源性病毒的影响，提高IBDV在无血清微载体培养条件下的病毒效价。通过优化病毒繁殖培养基增殖的IBDV病毒效价高于未优化培养基增殖的IBDV和采用鸡胚成纤维细胞增殖的IBDV病毒效价；与Vero细胞有血清培养的IBDV相当；免疫原性实验表明：该病毒的免疫原性强，适合作为疫苗生产。

Description

IBDV无血清微载体悬浮培养增殖的方法

技术领域

本发明涉及将鸡传染性法氏囊病毒在无血清培养基及微载体的悬浮培养Vero上的增殖，属于生物工程技术领域。

背景技术

鸡传染性法氏囊病（Infectious Bursal Disease,IBD），是由传染性法氏囊病毒（IBDV）引起的鸡的一种高度接触性传染病，最早发生于美国Delaware州的Gamboro地区，主要感染3~6周龄的青年鸡，病毒在法氏囊的淋巴细胞中迅速繁殖，损伤法氏囊的B淋巴细胞，引起严重的免疫抑制。1980年以后该病传入我国并大面积暴发和持续流行，严重影响了我国养鸡业的发展，当前对于该病普遍采用接种疫苗的进行预防。

目前，国内生产IBDV疫苗大部分采用鸡胚培养增殖病毒或有血清培养的鸡胚成纤维细胞。在培养基中添加一定量的新鲜血清，常用胎牛血清或小牛血清，因为血清可供给细胞营养成份，血清中的激素可刺激细胞生长，血清中的许多结合蛋白对激素、维生素和脂类等有稳定和调节作用。但是，培养基中含有血清成份，用以制造疫苗可诱发过敏反应，对提纯和收获细胞产物带来很大困难，加上每批血清的质量不同，从而影响疫苗的稳定性。

由血清使用所造成的细胞培养过程和细胞表达产物安全性的不确定因素增加的现实问题，成为动物细胞无血清培养技术研究和应用的发展动因。随着动物细胞无血清培养技术的不断进步，为包括Vero细胞在内的动物细胞大规模无血清培养技术的应用提供了必要的技术支撑，无血清培养已成为包括疫苗在内的生物技术药物生产的总趋势。2010年，美国、欧盟和日本等发达国家将全面停止在生物制药中应用血清，FDA将停止含血清细胞培养工艺生产的生物技术新药的申报受理。

当前，国内普遍使用转瓶接种IBDV的生产方式，培养体积0.5L左右，无法进行大规模制备。国外已经使用微载体在生物反应器中培养Vero细胞生产部分病毒性疫苗产品，国内个别企业通过引进技术已经使用微载体Vero细胞生产疫苗。

发明内容

本发明的目的是提供一种IBDV病毒在无血清培养基以及微载体悬浮培养的Vero细胞上增殖的方法，本发明的另一个目的是筛选出适合IBDV病毒在无血清培养基培养条件下增殖新的培养基成分，适合大批量病毒的制备，并避免了血清中携带外源性病毒的危害。

本发明的IBDV无血清微载体悬浮培养增殖的方法，包括下列步骤：

1）Vero细胞的无血清培养的驯化：逐步降低Vero细胞培养基中的血清浓度，在15代之内将血清降低到0.2%；将低血清培养的细胞转到无血清培养基中培养，待细胞适应后，扩增细胞作为种子库细胞；

2）IBDV病毒增殖：将驯化的细胞接种到含0.25%的乳清蛋白水解物的无血清培养基，待细胞粘附到微载体并开始生长时接种IBDV病毒，90h收获病毒。

优选地，

所说的步骤2）中IBDV病毒增殖具体包括以下步骤：

1）将无血清培养的Vero细胞消化后离心，按照3~4×10⁵cell/mL的初始密度重悬到病毒维持液中；病毒维持液成分为含0.25%的乳清蛋白水解物的无血清培养基IVT；细胞初始培养条件为pH值7.1、悬浮培养搅拌速度35rpm、溶氧30%、温度37℃；

2）待细胞在微载体上贴附后，接种IBDV病毒，接种病毒时的微载体的粘球率达到40~50%；病毒接种量：病毒以0.01~0.2的感染复数接种；IBDV病毒增殖期间，维持条件：pH值7.2、悬浮培养搅拌速度35rpm、溶氧30%、温度37℃，接种90h收获病毒。

本发明对从ATCC引进的Vero细胞进行驯化，降血清的培养，最终获得无血清微载体培养条件下的Vero细胞，同时改进IBDV病毒增殖时培养基成分，减少外源性病毒的影响，提高IBDV在无血清微载体培养条件下的病毒效价。通过优化病毒繁殖培养基增殖的IBDV病毒效价高于未优化培养基增殖的IBDV和采用鸡胚成纤维细胞增殖的IBDV病毒效价；与Vero细胞有血清培养的IBDV相当；免疫原性实验表明：该病毒的免疫原性强，适合作为疫苗生产。

附图说明

图1是经驯化的Vero细胞在无血清培养时细胞形态；

图2是经驯化的Vero细胞在无血清微载体悬浮培养时细胞形态；

图3是经驯化的Vero细胞在无血清微载体悬浮培养时的具体生长曲线；

图4是无血清培养Vero细胞微载体悬浮培养增殖IBDV 的细胞形态（接毒后24h、48h、72h、90h）；

图5不同培养方式增殖的IBDV效价比较。

具体实施方式

以下叙述本发明的具体实施例，应该说明的是实施例只对本发明有说明作用，而没有限制作用。

本发明使用的无血清培养的Vero细胞由江苏省农科院国家兽用生物制品研究中心驯化并保存；无血清培养IVT购于Cell Culture Technologies公司；降血清培养过程中使用的培养基--199购于北京清大天一公司；微载体Cytodex 1购于GE healthcare，将干燥的微载体放入无Ca²⁺、Mg²⁺的PBS中浸泡3h，之后再用PBS洗涤2次，经121℃高压蒸汽灭菌30min，冷却后置4℃待用，使用前用细胞培养液清洗2次后即可使用；5L细胞培养反应器购于上海国强生物技术有限公司，乳清蛋白水解物购于Sigma公司。

实施例1  驯化Vero细胞在无血清微载体悬浮培养

驯化Vero细胞在无血清微载体悬浮培养包括下列步骤：

1、驯化Vero细胞

复苏Vero细胞，采用序贯适应法适应方法驯化细胞。在细胞适应过程中，以1×10⁵cell/mL细胞浓度传代。

序贯适应法详细步骤：Vero细胞在10% FCS的DMEM中复苏培养，再依次在5%、2% 、1%、0.5%FCS的199培养基中传代，逐步降低血清浓度，最后在15代内将细胞转到无血清IVT培养，观察细胞形态，如图1所示。

驯化后的细胞较10%血清培养的Vero细胞形态细长；细胞1分3传代后，4h后细胞贴壁开始生长；在培养24h后达到生长高峰，72h长满细胞瓶。

稳定培养5代后，将细胞扩大培养，冻存细胞，建立初始细胞库F0-IVT。

、Vero细胞的复苏与扩大培养

从初始细胞库中复苏F0-IVT 的Vero细胞，将细胞在方瓶中扩增到一定数量。

、Vero细胞在无血清微载体悬浮培养

将无血清培养的Vero细胞用0.25%的胰酶消化后，重悬于新鲜的IVT培养基中，1500rpm离心10min后，弃上清。将细胞再次重悬在新鲜的IVT培养基中，细胞进行计数，按照按照3~4×10⁵cell/mL的初始密度接种到含2g/L的微载体悬液中，进入反应器培养。

5L细胞培养反应器中细胞悬浮培养条件：pH值7.1、搅拌速度35rpm、溶氧30%、温度37℃。

如图2所示，细胞在6h后贴附微载体，并开始生长。每天取样观察细胞状态，并进行细胞计数。细胞在4天后达到最大细胞密度：1.2×10⁶cell/mL，具体生长曲线见图3。

 

实施例2   IBDV（鸡传染性法氏囊病毒）在无血清微载体悬浮培养的Vero细胞上增殖

1、初始Vero细胞在无血清微载体悬浮培养

将无血清培养的Vero细胞用0.25%的胰酶消化后，重悬于新鲜的IVT培养基中，1500rpm离心10min后，弃上清。将细胞按照3~4×10⁵cell/mL的初始密度重悬在病毒维持液中：含0.25%的乳清蛋白水解物的无血清培养基IVT，进入反应器培养。

细胞初始培养条件：pH值7.1、悬浮培养搅拌速度35rpm、溶氧30%、温度37℃；

2、IBDV病毒的增殖

待细胞在微载体上贴附后，接种IBDV病毒，接种病毒时的微载体的粘球率达到40~50%；

病毒接种量：病毒以0.01~0.2的感染复数接种；

IBDV病毒增殖期间，维持条件：pH值7.2、悬浮培养搅拌速度35rpm、溶氧30%、温度37℃。

接毒后24h取样观察，接毒后24h细胞仍处于生长阶段，细胞密度可以达到5~8×10⁵cell/mL，48h细胞有部分开始从微载体上脱落，72h有50%左右细胞脱落，最终90h细胞大部分从微载体上，收获病毒。

、IBDV病毒效价的测定

病毒收获后反复冻融3次，释放病毒，在制备好的CEF上测定病毒效价，同时测定CEF增殖的IBDV、10%血清培养的Vero细胞增殖IBDV病毒效价，进行比较。

结果显示：无血清微载体悬浮培养的Vero细胞增殖的IBDV病毒效价TCID₅₀从24h 10^4.5/mL到最终培养90h收获病毒时的10^7.5/mL；病毒增殖1000倍。高于未优化培养基增殖的IBDV的10⁶/mL；比CEF增殖的IBDV的10⁷/mL高；等同于10%血清培养的Vero细胞增殖IBDV病毒效价（图5）。

、IBDV病毒免疫原性检测

将病毒制成疫苗后，免疫21日龄鸡，免疫疫苗后7、14、21、28天，采血分离血清。采用固定病毒稀释血清法进行血清中和试验，检测血清中抗体效价，当血清稀释2500倍后仍能中和100 TCID₅₀的病毒，不产生病变，认为合格，判为阳性血清。

检测结果表明：自制油苗，在免疫后14天产生20％的阳性率，21、28天阳性率升高到83.3％、90.7％，可以肯定由无血清微载体悬浮增殖的IBDV免疫原性较好。

Claims (2)

1.IBDV无血清微载体悬浮培养增殖的方法，其特征在于，包括下列步骤：

1）Vero细胞的无血清培养的驯化：逐步降低Vero细胞培养基中的血清浓度，在15代之内将血清降低到0.2%；将低血清培养的细胞转到无血清培养基中培养，待细胞适应后，扩增细胞作为种子库细胞；

2）IBDV病毒增殖：将驯化的细胞接种到含0.25%的乳清蛋白水解物的无血清培养基，待细胞粘附到微载体并开始生长时接种IBDV病毒，90h收获病毒。

2.根据权利要求1所述的IBDV无血清微载体悬浮培养增殖的方法，其特征在于，所说的步骤2）中IBDV病毒增殖具体包括以下步骤：

1）将无血清培养的Vero细胞消化后离心，按照3~4×10⁵cell/mL的初始密度重悬到病毒维持液中；病毒维持液成分为含0.25%的乳清蛋白水解物的无血清培养基IVT；细胞初始培养条件为pH值7.1、悬浮培养搅拌速度35rpm、溶氧30%、温度37℃；

2）待细胞在微载体上贴附后，接种IBDV病毒，接种病毒时的微载体的粘球率达到40~50%；病毒接种量：病毒以0.01~0.2的感染复数接种；IBDV病毒增殖期间，维持条件：pH值7.2、悬浮培养搅拌速度35rpm、溶氧30%、温度37℃，接种90h收获病毒。

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