CN107904215B

CN107904215B - 一种禽流感病毒的全悬浮培养方法

Info

Publication number: CN107904215B
Application number: CN201711439115.0A
Authority: CN
Inventors: 蔡仕君; 陈瑞爱; 罗顺; 李延鹏; 温良海; 张晓楠
Original assignee: Gansu Jianshun Biotechnology Co ltd; Huanong Zhaoqing Biological Industry Technology Research Institute Co ltd; Zhaoqing Dahuanong Biological Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Gansu Jianshun Biotechnology Co ltd; Huanong Zhaoqing Biological Industry Technology Research Institute Co ltd; Zhaoqing Dahuanong Biological Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2017-12-27
Filing date: 2017-12-27
Publication date: 2021-07-27
Anticipated expiration: 2037-12-27
Also published as: CN107904215A

Abstract

本发明公开了一种禽流感病毒的全悬浮培养方法，包括以下步骤：步骤1：取EB66细胞进行生长培养；步骤2：待EB66细胞的密度生长至适于接毒时，采用流加补液接毒工艺向EB66细胞中接种禽流感病毒，进行病毒的增殖培养；步骤3：在接毒24h后，每隔12h取样测定病毒的HA效价，在病毒HA效价达到最高时收获病毒并保存，得到培养后的禽流感病毒。本发明用EB66细胞进行禽流感病毒培养，避免了采用传统鸡胚培养工艺生产时易引入大量杂蛋白的缺点，有效降低鸡只免疫副反应的发生，同时提高培养的禽流感病毒滴度及纯度，进而提高禽流感疫苗的生产品质。

Description

一种禽流感病毒的全悬浮培养方法

技术领域

本发明涉及一种禽流感病毒的全悬浮培养方法，特别涉及一种通过全悬浮传代细胞系悬浮培养禽流感病毒的方法，属于兽用生物制品技术领域。

背景技术

目前，已上市的禽流感疫苗大多是通过传统的鸡胚培养制得，国内外应用鸡胚进行禽流感病毒的生产己有许多年的历史。该工艺简单且技术成熟，其制备工艺主要流程为：首先将种毒液接种至鸡胚尿囊液中，鸡胚作为一个卵细胞整体，由于组织分化程度低，不会对接种的病毒产生抗体，十分有利于病毒的复制；病毒在鸡胚中培育一定时间后，通过收集鸡胚尿囊液，得到疫苗制品的中间产品；经超滤离心和浓缩后，需采用环丙内酯或甲醛灭活，再经裂解剂(如TritonX-100等)进行病毒裂解，并纯化HA和NA蛋白，最后根据HA蛋白所占比例来标定疫苗浓度。

鸡胚作为病毒培养的基质，需要经过严格工序来保证其品质。首先，合格的鸡胚除了能正常生产禽流感病毒外，还应该是健康鸡群产下的受精卵，例如SPF海兰白鸡；其次，生产中一般要求产蛋鸡的年龄不超过1周年；再者，为确保鸡群在生长过程中没有感染任何禽流感等相关疾病，必须经过定期检测，同时要严格确保受精卵内不能带有任何病毒。受到这些因素的限制，导致无特定病原体(Spedfic PathogenFree,SPF)的鸡胚产量小、成本高，往往不能满足大批量生产禽流感疫苗的需求。除此之外，鸡胚培养还存在诸多问题，不同批次的鸡胚质量往往存在差异，难以控制品质，而不同质量的鸡胚会对病毒培养产生不同副作用，且鸡胚的来源容易受到禽流感疫情的影响；此外，鸡胚是许多细菌的天然宿主，容易受到环境中细菌的感染，己有研究者指出由母体遗传给鸡胚所带来的潜在污染比GMP车间无菌环境中人为操作所带来的污染化率大很多，而这也正是鸡胚培养过程中难以控制的地方。另外，在鸡胚的尿囊液中含有大量动物源蛋白，在提取病毒时易被带入病毒液中，导致成品疫苗中有大量动物源蛋白，从而引起过敏反应等副作用。

目前采用传代细胞系MDCK细胞作为培养基质生产禽流感病毒疫苗的技术已经越来越趋向于成熟，甚至已经达到了全悬浮大规模生产的水平，MDCK细胞虽可高密度悬浮培养，培养的禽流感病毒滴度可达到鸡胚水平，但是免疫原性与动物副反应一直是使用MDCK细胞生产禽流感病毒疫苗的技术壁垒。与鸡胚相比，同等血凝价时，采用MDCK细胞生产的禽流感病毒免疫鸡体后产生的抗体水平低，副反应严重，且MDCK细胞能在裸鼠中诱导肿瘤产生，存在致瘤的风险，导致疫苗的使用安全性较低，这对于疫苗的安全性来说是一个致命的缺点。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供用全悬浮传代细胞系EB66细胞生产禽流感H9亚型病毒的方法，该方法具有生产工艺稳定、易操作，病毒含量高、批间差异小、质量易控的优点，可显著提高疫苗产量和质量，使用该方法生产出的禽流感疫苗安全性好、免疫效力高。

本发明的目的在于提供一种禽流感病毒的全悬浮培养方法，包括以下步骤：

步骤1：取EB66细胞进行生长培养；

步骤2：至EB66细胞的密度生长至适于接毒时，采用流加补液接毒工艺向EB66细胞中接种禽流感病毒，进行病毒的增殖培养；

步骤3：在接毒24h后，每隔12h取样测定病毒的HA效价，在病毒HA效价达到最高时收获病毒并保存，得到培养后的禽流感病毒。

进一步地，所述步骤2的具体操作方式如下：

待EB66细胞的密度生长至适于接毒时，取禽流感种毒对步骤1所得细胞株采用流加补液的方法进行禽流感病毒的接种，按病毒液与细胞培养基体积比进行接种，接毒完成后，将摇瓶放回5％的CO₂培养箱中进行吸附，此时轨道摇床以固定的培养转速进行振荡；吸附完成后补加病毒生产液，并放回到5％CO₂培养箱中继续培养，轨道摇床以固定的培养转速进行振荡；

进一步地，本发明的全悬浮培养方法还包括步骤4：取步骤3所得培养后的禽流感病毒作为下一代病毒传代培养的种毒，继续采用流加补液工艺接种至EB66细胞中进行病毒的传代驯化与增殖，并按此方法连续传代2-30代，最终收获禽流感病毒在EB66传代细胞中适应毒。

进一步地，步骤1所用EB66细胞的培养方法如下：

从液氮中迅速取出EB66细胞，在37℃水浴锅中迅速融化，待EB66细胞完全融化后，将复苏细胞加入约复苏细胞30倍体积的培养基中，经离心机300g离心10min，倒掉上清液，加入培养基将细胞吹打重悬均匀，接种至三角摇瓶中，并放置于轨道摇床上进行悬浮培养，每天取样进行细胞计数并计算活率，待培养至第2-3天时，进行细胞传代，细胞经连续传代3代次以上，且细胞倍增速率稳定时，用于病毒的接种或者继续传代。

更进一步地，所述的EB66细胞培养温度为35℃-37℃，优选为37℃；培养转速为130rpm-150rpm，优选为150rpm。

更进一步地，当EB66细胞密度达到6×10⁶/mL-15×10⁶/mL时，用于禽流感病毒的接种，优选的，细胞密度达到8×10⁶/mL～10×10⁶/mL时，用于接毒。

更进一步地，禽流感病毒接毒量以体积比为主，按病毒与细胞培养基体积比为1/100/-5/100000之间接种，优选的体积比为5/10000-5/100000。

更进一步地，所述的流加补液接毒，细胞接毒后吸附时间为0.5h-2h，培养温度为33℃-35℃，优选为33℃；培养转速为110rpm-140rpm，优选为120rpm。

更进一步地，病毒接种吸附完成后，需补加新的病毒生产培养基，补加比例为原工作培养基体积的1-3倍，优选为补加原工作体积1倍的生产培养基。

更进一步地，病毒的培养需要补加TPCK胰酶，补加策略为接种病毒的第0天补加2mg/L，第1天再补加2mg/L或接种病毒的第0天一次性补加4mg/L，优选为第0天补加2mg/L,第1天再补加2mg/L。

更进一步地，所述的EB66传代细胞培养基为

CD EB66(健顺DP210)，该培养基属于无血清、化学界定培养基。

进一步地，所述的禽流感病毒为A型禽流感病毒A/chicken/Gμangdong/DA/2014(H9N2)株(简称DA株)，由肇庆大华农生物药品有限公司鉴定、保管和供应。

本发明与现有技术相比，具有如下有益效果：

1、本发明通过采用全悬浮传代细胞系EB66细胞进行禽流感病毒培养，避免了采用传统鸡胚培养工艺生产时易引入大量杂蛋白的缺点，有效降低鸡只免疫副反应的发生；同时还避免了生产基质和培养过程引入外源病毒的风险；此外EB66细胞无致瘤性，使用安全，使得通过EB66细胞所培养的病毒抗原具有更高的安全性；

2、采用本发明培养的禽流感病毒各批间质量差异小，疫苗质量高，有效克服了疫苗大量生产受制于鸡胚供应的缺点，节省了生产成本；同时还具有生产工艺简便易操作、培养环境可控、可大规模生产等特点，具有很好的经济效益和应用前景；

3、本发明采用了先进的悬浮培养技术，达到效果如下：

(1)单位体积内细胞密度大大提高，使得单位体积培养液中的病毒含量增高，病毒滴度增加，并提高了病毒培养产量和生产效率；(2)本发明采用无血清全悬浮培养，无需载体和血清，大大减少产品杂质的引入，简化了产品的分离纯化过程，降低了生产难度，同时有效降低免疫后副反应的发生概率；

4、本发明采用流加补液接毒工艺的方法，当EB66细胞密度生长至适合接毒时，进行病毒的接种，病毒吸附完成后，补加新的病毒生产培养基，补加体积为原工作体积的1-3倍(也可在补液之后接毒)，利用该生产工艺简单、不需要换液的特点，大大提高了培养基的利用率，节省了生产成本，通过按照一定的比例补加新鲜的病毒生产培养基，即可使EB66细胞实现二次生长，增加细胞总数，从而有利于促进病毒的增殖，并提高最终的病毒产量；应当注意的，其中所述的生产培养基和生长培养基可以为不同的培养基，也可为相同的培养基。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。

实施例1-4所得禽流感病毒的HA效价检测方法如下：

在96孔微量反应板上，自左至右向各孔分别加50μL生理盐水。并向左侧第1孔加50μL病毒液，待混合均匀后，吸50μL至第2孔，依次进行倍比稀释至第11孔，吸取并弃去50μL，第12孔为红细胞对照；从右至左依次向各孔加入1％鸡红细胞悬液50μL，在振荡器上进行振荡，室温下静置25-30分钟后观察结果。红细胞全部凝集，沉于孔底，平铺呈网状，即为100％凝集(++++)，红细胞沉于孔底呈点状则为不凝集者(-)。

实施例1

本发明实施例1所用材料来源如下：

1.病毒：A型禽流感病毒A/chicken/Gμangdong/DA/2014(H9N2)株(简称DA株)，由肇庆大华农生物药品有限公司鉴定、保管和供应。

2.细胞：全悬浮传代细胞系EB66细胞，由甘肃健顺生物科技有限公司提供。

3.无血清、化学界定培养基：CD EB66(DP210)培养基，由甘肃健顺生物科技有限公司提供。

本发明实施例H9亚型禽流感病毒的培养方法如下：

1.从液氮罐中取出冻存的EB66细胞株，置于37℃水浴融化后加入到约30mL的CDEB66210(健顺生物货号DP210)培养基中，经离心机300g离心10min，去掉上清液，使用125mL三角摇瓶将细胞重悬于15mL的CD EB66210培养基中，将培养基置于37℃，5％CO₂培养箱中，轨道摇床转速设置为150rpm，进行悬浮培养，第一天补充培养基10mL，第二天再次补充培养基10mL，第三天进行传代；

2.对步骤1所得的EB66细胞株进行细胞密度计数，并接种至三角瓶中，接种密度为0.35×10⁶cells/mL-0.75×10⁶cells/mL，将三角瓶置于37℃，5％CO₂的培养箱中进行培养，设定轨道摇床转速为150rpm，继续培养2-3天后，重复此方法进行继续传代，对连续传代三代次后的细胞进行扩增，用于病毒接种实验；

3.取用第3代扩增至第4代的种子细胞200mL，重复步骤2的操作，使细胞密度达到8.38×10⁶/mL；

4.取H9亚型禽流感种毒对步骤3所得细胞株采用流加补液的方法进行禽流感病毒的接种，接毒量以体积比为主，按病毒液与细胞培养基体积比为：2/100、5/1000、1/1000、5/10000、1/10000、5/100000分别接种至步骤3中的EB66细胞；接毒完成后，将摇瓶放回至37℃、5％的CO₂培养箱中进行吸附培养1小时，此时轨道摇床转速为120rpm；吸附完成后补加1倍体积的病毒生产液，并放回到33℃、5％CO₂培养箱中继续培养，轨道摇床转速为120rpm，同时，按照接毒后第0天补加2mg/L，第1天再补加2mg/L的添加策略加入TPCK胰酶；其中H9亚型禽流感种毒来源为肇庆大华农生物药品有限公司，毒价为10^8.2EID₅₀/0.1mL；

5.在接毒24h之后每隔12小时取样，进行HA效价的检测。

对实施例1取样检测HA效价，结果(表1)如下：

表1：不同接毒量对禽流感病毒在EB66细胞中增殖的影响

接毒量(体积比)	HA效价(平均值)
		2/100	2<sup>5.33</sup>
5/1000	2<sup>5.33</sup>
		1/1000	2<sup>6.5</sup>
5/10000	2<sup>6.17</sup>
		1/10000	2<sup>7.33</sup>
5/100000	2<sup>7.17</sup>

从表中可以看出，禽流感病毒在EB66细胞中的培养受到接毒量的影响，在接毒量过低或者过高都不能达到最佳的培养效果，当按体积比为1/10000接毒时，所得到禽流感病毒的HA效价最高(2^7.33)，因此后续的禽流感病毒传代驯化按此比例进行病毒的接种。

实施例2：不同TPCK补加策略对禽流感病毒增殖的影响

本发明实施例2所用材料来源如下：

1.病毒：由实施案例1中收获的HA效价最高时的禽流感病毒。

本发明实施例H9亚型禽流感病毒的培养方法如下：

1.对EB66细胞进行传代及培养，本次实施案例中使用的细胞依然为实施案例1中继续传代的细胞，传代方法与细胞培养条件同实施例1；其中，EB66接毒细胞代次限制为细胞工作库复苏后的3-30代之内；

2.当步骤1中细胞生长至密度为8×10⁶/mL～10×10⁶/mL时，采用流加补液工艺，按接毒量与细胞培养基体积比为1/10000进行禽流感病毒的接种，接种的病毒来源为实施案例1中收获的HA效价最高时的禽流感病毒，将接种后的培养基分为两组，病毒培养条件除TPCK胰酶补加策略不同，其余与实施例1相同；其中，第1组的TPCK胰酶补加策略为在接毒后的第0天、第1天分别补加2mg/L的TPCK胰酶；第二组的TPCK胰酶补加策略为接毒后的第0天一次性补加4mg/L的TPCK胰酶；

3.在接毒24h后，每隔12h取样进行HA效价的检测，从而比较不同TPCK胰酶补加策略对禽流感病毒在EB66细胞中增殖的影响。

对实施例2取样检测HA效价，结果(表2)如下：

表2：不同TPCK补加策略对禽流感病毒在EB66细胞中增殖的影响

如上表中可以看出，禽流感病毒在EB66细胞中的增殖因TPCK胰酶补加策略不同而且有不同的结构，通过两种比较不同TPCK胰酶补加策略，结果显示，采用第一组的胰酶的策略(HA效价为2⁹)收获的病毒具有更高的HA效价。因此后续的禽流感病毒传代驯化按接毒后按照本实施例第1组的TPCK胰酶补加策略进行补加。

实施例3

本发明实施例3所用材料来源如下：

1.病毒：由实施案例2中收获的HA效价最高时的禽流感病毒。

本发明实施例H9亚型禽流感病毒的培养方法如下：

2.当步骤1中细胞生长至密度为8×10⁶/mL～10×10⁶/mL时，采用流加补液工艺，按接毒量与细胞培养基体积比为1/10000进行禽流感病毒的接种，接种的病毒来源为实施案例2中收获的HA效价最高时的禽流感病毒，将接种后的培养基分为三组，各组的病毒培养条件除病毒生产液补加体积不一同，其余与实施例1相同；其中，第1组在吸附完成后按原工作培养基体积与生产液补加体积为1:1的比例进行生产液补加，第2组按体积1:2的比例进行生产液补加，第3组按体积比1:3的比例进行生产液补加；

4.接毒24h后，每隔12h取样进行HA效价的检测，从而比较生产液不同补加体积对禽流感病毒在EB66细胞中增殖的影响。

对实施例3取样检测HA效价，结果(表3)如下：

表3：生产液不同补加体积对禽流感病毒在EB66细胞中增殖的影响

组别	原工作体积：生产液体积	HA效价(平均值)
			1	1:1	2<sup>10</sup>
2	1:2	2<sup>9.5</sup>
			3	1:3	2<sup>9.25</sup>

从上表中可以看出，禽流感病毒在EB66细胞中的增殖受到生产液补加体积不同的影响，导致得到的禽流感病毒HA效价不同。结果显示，按原工作培养基与补加生产液的体积比为1:1补加生产液所得到的病毒具有更高的HA效价(2¹⁰)，因此后续的禽流感病毒传代驯化按按原工作体积比生产液补加体积1:1的比例补加生产液的方法进行病毒的接种。

实施例4

本发明实施例4所用材料来源如下：

1.病毒：由上一代次收获的HA效价最高时的禽流感病毒作为种毒。

本发明实施例H9亚型禽流感病毒的培养方法如下：

2.当步骤1中细胞生长至密度为8×10⁶/mL～10×10⁶/mL时，采用流加补液工艺，按接毒量与细胞培养基体积比为1/10000进行禽流感病毒的接种，接种的病毒来源为实施案例2中收获的HA效价最高时的禽流感病毒，接毒方法和病毒培养条件采用的为经实施例1、2、3优化的最佳条件，按此方法连续传代3代次，即第P4、P5、P6代病毒。每次接毒24h后，每隔12h取样进行HA效价的检测，在HA效价最高时进行禽流感病毒收集；

3.对收获的禽流感病毒进行HA效价的检测。

对实施例4取样检测HA效价，结果(表4)如下：

表4：禽流感病毒在EB66细胞中的连续传代驯化

代次	HA效价(平均值)
		P4	2<sup>10.6</sup>
P5	2<sup>11.25</sup>
		P6	2<sup>11</sup>

从表中可以看出，随着在EB66细胞中的连续传代驯化，禽流感病毒能够很好的适应EB66细胞，经检测，HA效价最高可达2¹¹以上，且病毒的滴度稳定。因此选择全悬浮传代细胞系EB66细胞作为禽流感病毒培养的靶细胞具有非常广阔的前景。

实施例5

将实施例1-4收获的病毒反复进行冻融离心3次，取离心后的上清液，使用灭菌生理盐水对病毒悬液进行10倍系列稀释，取10^-6、10^-7、10^-8、10^-9四个稀释度的病毒悬液分为四组，每组分别向5个10日龄SPF鸡胚尿囊腔中按照每胚0.1ml病毒液的接种量来接种病毒，接种后的鸡胚置于36～37℃的温度下继续孵育120h。观察记录鸡胚死亡情况，计算各稀释度鸡胚死亡的百分率。按Reed-Muench法计算计算EID₅₀。病毒含量应该不低于10^7.0EID₅₀。

实施例5EID₅₀检测结果(表5)如下：

表5：禽流感病毒EID₅₀检测结果

代次	EID<sub>50</sub>/0.1mL(最高值)
		P1	10<sup>7.0</sup>
P2	10<sup>7.3</sup>
		P3	10<sup>7.5</sup>
P4	10<sup>8.0</sup>
		P5	10<sup>8.3</sup>
P6	10<sup>8.2</sup>

从表中可以看出，随着在EB66细胞中的连续传代驯化，禽流感病毒EID50随着传达的次数逐渐提升，并在第4代开始趋于稳定，达到10^8.0EID₅₀/0.1mL以上(远大于10^7.0EID₅₀/0.1mL)，且病毒的滴度稳定。因此选择全悬浮传代细胞系EB66细胞作为禽流感病毒培养的靶细胞是非常可行，具有广阔的应用前景。

综上所述，本发明选用EB66细胞作为禽流感病毒培养的基质，具有如下优势：

(1)相比于目前禽流感疫苗制备常用的存在致瘤风险性的MDCK细胞，EB66细胞具有无内源性逆转录酶病毒表达、无致瘤性的优点，应用该细胞制备的疫苗具有使用安全性的优点；

(2)EB66细胞为鸭胚胎干细胞，属于禽源细胞，相对于MDCK细胞、vero细胞及marc-145细胞等异源性传代细胞系，EB66细胞对于禽流感等禽类病毒具有更好的病毒敏感性及适应性，利用该细胞培养的禽流感病毒具有滴度高、免疫源性好、副反应小的特点，对于禽类使用安全；

(3)EB66细胞的倍增时间短(约12h-14h)、生长密度高(>3,000万个细胞/mL)，与其他细胞源及鸡胚源相比，大大缩短了疫苗的生产时间，提高病毒疫苗的生产效率，同时因为单位细胞密度高，因此病毒增殖量大、滴度高，生产出的病毒疫苗无需经过浓缩等下游的繁琐程序即可进行使用，大大节约了成本；能在大流行流感爆发的情况下迅速投入生产，提供疫苗产品，为养禽业保驾护航，减少损失，最大限度的保护养殖户的经济利益；

(4)EB66细胞的代谢特性：即使是在高细胞密度的条件下，细胞生长所消耗的谷氨酰胺量很低，进而保持铵和乳酸的积累在一个较低的水平，这对于细胞及病毒培养条件的稳定起到重要作用，有利于细胞及病毒的增殖，避免了培养过程更换培养基，极大的提高了培养基的利用率，节省了成本；

(5)EB66细胞已经完全实现了全悬浮无血清培养，对于传统的微载体悬浮培养和培养基需要添加血清的培养方式，EB66细胞在进行病毒疫苗制备时无需微载体，突破了细胞生长需要基质表面贴附的限制，有效节约设备空间，提高设备利用率，实现真正意义上的大规模培养；此外，由于本发明实施例无需添加血清和消化液，从而大大减少了杂质的引入，简化后期的产品分离纯化过程，有效的降低了生产成本；

(6)EB66细胞使用的培养基为专利权人自制研发的无血清、化学界定的个性化培养基，相比于国外昂贵的进口培养基，具有突出的价格优势，大大节约了成本。

综上：EB66细胞作为鸭胚胎干细胞衍生细胞株，具有胚胎干细胞源性，无致瘤性，在生产过程中可实现全悬浮无血清的高密度培养，具有倍增时间短的优点，适用于疫苗的规模化生产。具有病毒敏感性强，安全性高，生产成本低的优点。

最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其限制，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细的说明，所属领域的普通技术人员应当理解，技术人员阅读本申请说明书后依然可以对本发明的具体实施方式进行修改或者等同替换，但这些修改或变更均未脱离本发明申请待批权利要求保护范围之内。

Claims

1.一种禽流感病毒的全悬浮培养方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1：取EB66细胞进行生长培养；

步骤2：待EB66细胞的密度生长至适于接毒时，取禽流感种毒对步骤1所得细胞株采用流加补液的方法进行禽流感病毒的接种，按病毒液与细胞培养基按1/10000的体积比进行接种，接毒完成后，将摇瓶放回5％的CO2培养箱中进行吸附，此时轨道摇床以固定的培养转速进行振荡；吸附完成后补加病毒生产液，并放回到5％CO2培养箱中继续培养，轨道摇床以固定的培养转速进行振荡；接种病毒的第0天补加2mg/L TPCK胰酶，第1天再补加2mg/LTPCK胰酶；

2.根据权利要求1所述的全悬浮培养方法，其特征在于，还包括步骤4：取步骤3所得培养后的禽流感病毒作为下一代病毒传代培养的种毒，继续采用流加补液工艺接种至EB66细胞中进行病毒的传代驯化与增殖，并按此方法连续传代2-30代，最终收获禽流感病毒在EB66传代细胞中适应毒。

3.根据权利要求1所述的全悬浮培养方法，其特征在于，步骤1所用EB66细胞的培养方法如下：

4.根据权利要求1所述的全悬浮培养方法，其特征在于，所述的EB66细胞培养箱温度为35℃-37℃；轨道摇床的培养转速为130rpm-150rpm。

5.根据权利要求1所述的全悬浮培养方法，其特征在于，当EB66细胞密度达到6×10⁶/mL-15×10⁶/mL时，用于禽流感病毒的接种。

6.根据权利要求1所述的全悬浮培养方法，其特征在于，所述细胞接毒后吸附时间为0.5h-2h，培养箱培养温度为33℃-35℃；轨道摇床的培养转速为110rpm-140rpm。

7.根据权利要求1所述的全悬浮培养方法，其特征在于，病毒接种吸附完成后，还需补加新的病毒生产培养基，补加比例为原工作培养基体积的1-3倍。