CN1147833A - 甲型肝炎病毒培养工艺 - Google Patents

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Abstract

一种生产病毒疫苗的基于微载体的工艺，其中一项实例为甲型肝炎病毒，该工艺包含由玻璃包被的聚苯乙烯微载体和MRC-5细胞组成的聚集的微载体系统，该系统为病毒在甚至是延长的感染期的繁殖创造了稳定的环境。按照本工艺的微载体聚集体避免了在其它系统中见到的在长时间培养中细胞从珠上的脱落，从而达到在微载体培养中的高产率。当病毒的产率可通过在延长的感染期创造稳定的培养物而增加时即可应用本方法。可规模扩大的搅拌的生物反应器被用于替代多个平行固定表面生物反应器。这种聚集的微载体工艺消除了固定表面生物反应器的容积限制，它保护病毒在其上培养的细胞免受切应力破坏，它提供增强的细胞对细胞相互作用，它为病毒生长提供稳定的环境，它为营养物通过聚集体对流运输提供空腔，并且它提供一种收获病毒溶胞产物以进行下游加工的直接方法。

Description

甲型肝炎病毒培养工艺
                   发明背景
i.发明领域
本发明的领域是一种在微载体细胞培养物中生产病毒的工艺。以在玻璃包被的微载体上培养并用甲型肝炎病毒感染的灌注的MRC-5细胞作为例子说明本发明。
ii.背景
很多病毒和治疗学蛋白由依赖贴壁细胞产生，此种细胞附着于表面是细胞生长和细胞系正常功能的前提条件。当需要相对少量时，常规使用多个T-烧瓶和滚筒瓶(Roller bottle)提供所需的表面积。其它商业可获得的系统如NUNC CELL FACTORIES和COSTARCUBES大量增加了表面积并从而提高了每个生物反应单元的生产能力。然而，这些系统仍需要多个生物反应单元以用于大量生产，因而限制了商业生产的工艺过程扩大潜能。
已发展了多种填充床系统，包括空心纤维反应器，球面填充床，随机方向纤维填充床，和多孔陶瓷单成岩(porous ceramicmonolith)。这些体系已被证实由于其反应器构型和由于细胞生长限制了营养运输通道而在保持反应器中细胞的营养供应方面有困难。中空纤维反应器依靠弥散和Starling流以提供培养基流过细胞单元[见J.M.Perit(1989)，B.C.D.Thesis，Dept of Chem.Eng.，Mass.Inst.Technology，August 1989]。只有当纤维上细胞聚集深度是可控制和一致时弥散营养穿透才是足够的，而在这些反应器中不是这样的。当细胞生长时Starling流降低，因为由于细胞生长提供了增加的流动阻力。这降低了细胞生长室内的混合。珠或纤维的随机填充床依赖强迫对流，并且两者都倾向于穿过最低流体阻力的路径开辟通路，绕过表面最致密，因而可能含有细胞的区域。多孔陶瓷单成岩在这方面较好，但它们遭受第二个因素，即生物结垢的影响。当这些细胞在附着表面生长时，它们可收缩和关闭培养基流发生的路径([J.E.普曼等，Ann.Mtg.Soc.Ind.Microbiol；Orlando，弗罗里达，Aug.1，1990]对于陶瓷单成岩，细胞生长导致通道的收缩，从而增加了对流动的流体阻力。培养基于是选择流向其它平行的通道，结果是带有最大量细胞生长的通道得到最少的培养基。由于这些细胞微环境的不均一性和有限的工艺过程扩大潜能，这些反应器只获得了有限的成功，迄今还没有美国批准的人类疫苗或治疗药物是用这些系统生产的。
在细胞和病毒培养中使用固相静态混合器是公知的，见Grabner和Paul，美国专利4,296,024。使用筛网培养包含数种细胞类型的原代组织可见于美国专利4,963,489和5,160,490。从基质成纤维细胞的筛网培养得到的组织在4,963,489中提出权利要求。使用固定的混合元件作为细胞生长的表面向细胞群提供了均匀的营养输送。工艺过程扩大,清洁，和灭菌问题仍是这些生物反应系统商业应用的困难。另外，在这些系统中不能在培养过程中直接监测生物量。因而，必须使用细胞量的间接测定以确定生物反应器的运行状况。由于同样的原因，对于这些反应器构型，去除细胞相关产物也会成为问题。
微载体技术在小的球状珠(90至250微米直径)上为细胞生长提供了大量的表面积，它们悬浮在一个搅拌釜生物反应器中。可获得高的表面积/容积比，导致在一个生物容积基础上的高效生产系统。该技术在培养过程中提供一种均质细胞培养环境，并能够定量细胞量并收获细胞相关产物。由于该生物反应器是一种搅拌釜，已建立的清洁和灭菌步骤，以及釜的总体设计很易于从商业应用的发酵工业中得到。使用在1000-1500升规模的微载体的脊髓灰质炎疫苗的商业制造证明了本方法的工艺规模扩大潜力。使用微载体培养的狂犬病疫苗和口蹄疫苗的商业生产进一步证明了本发明的已证实的工艺规模扩大潜力。
虽然许多细胞系和病毒已在微载体上繁殖，但将此技术以商业规模应用仍有许多问题。在整个培养过程中获得低的切应力环境并在长期的培养期维持持续的产物生成的活培养物可能是困难的。选择适当的微载体和培养条件对产生期望的产物常常是至关重要的。甲型肝炎病毒的繁殖是这些挑战的一个好例子。Junker，B等人(《用于减毒甲型肝炎的大规模培养的微载体方法的评价》细胞技术学，9卷，1-3，1992)描述了CYTODEX 3微载体作为MRC-5细胞生长并随后被甲型肝炎病毒感染的基质的评价。微载体培养的甲型肝炎病毒低滴度的主要原因在于在感染期细胞逐渐从珠上落下。基于这些结果，微载体技术被报告为商业化规模生产甲型肝炎病毒的亚最佳选择。因为本发明内容中例举了甲型肝炎病毒的培养，简单综述了用于培养此种病毒的方法是适宜的。
1973年芬斯通等人[科学182，p1026]使用免疫电镜鉴定了感染性肝炎的病原，以后称为甲型肝炎病毒，(HAV)。甲型肝炎病毒的体外培养最初由普罗伏斯特等报告[P.S.E.B.M.160，p213，1979]，采用下述程序，即，将HAV感染的狨的肝作为肝移植培养和恒河猴胎肾(FRhK6)细胞培养的接种物[美国专利4,164,566]。在以后的发明中，直接接种HAV(在此之前未经亚人类灵长类传代)成功地被用于启动HAV的体外繁殖[普罗伏斯特等，P.S.E.B.M.167，p201(1981)；美国专利5,021,348]。
从这项工作证实通过体外培养减毒HAV。另外，还证实在体外连续传代中，HAV培养由于病毒适应于培养细胞而变得更多产且复制速度加快。进一步的发展是证实活的减毒病毒[普罗伏斯特等，J.Med.Viol.20，p165(1986)]和福尔马林灭活的HAV[美国专利4,164,566,美国专利5,021,348；等在病毒性肝炎和肝病中p-83-86，1988-ALan R.Liss，Inc]两者的保护作用。从前面的工作，已逐渐明确无论是灭活的还是减毒的，免疫原性HAV都是可能的疫苗候选者。然而，如果安全的HAV疫苗要商业化易得地用于人类，需要一种可重复生产的，商业规模工艺以生产高纯度抗原。
为疫苗生产培养HAV的多种方法已被描述。因此，普罗伏斯特等(美国专利5,021,348)描述了一种工艺，通过此工艺，在一项优选的方法中，MRC-5细胞的细胞培养物被HAV感染。根据其内容，病毒和细胞按照传统的方法以单层生长。在美国专利4,783,407中，HAV在Vero细胞中(一种灵长类肾细胞)中生长。在美国专利4,301,209中，描述了在中空纤维毛细管单元中的高滴度HAV生产。在美国专利4,412,002中描述了从持续感染细胞分离HAV的方法。在EP0302692中，描述了HAV在滚动瓶中培养。在所有这些系统中，不能得到商业工艺所需要的大规模HAV生产，或严重地受为HAV感染建立的细胞层的可得总表面积限制。
1984年，Widel等人发表了在CYTODEX 3微载体上在37℃生长的恒河猴胎肾(FRh-K)细胞系中野生型甲型肝炎的繁殖(Widell等，《用于大规模生产甲型肝炎病毒的微载体细胞培养系统》病毒学方法杂志，Vol8，63-71，1984)。其中未提及使用CYTODEX 3微载体作为FRh-K细胞生长表面的细胞消耗或微载体聚集。由于相同的微载体系统被Junke等人确定不适合在MRC-5中生产减毒病毒，这些系统显然是非常不同的。因此，比来自猴的FRh-K细胞系更优选用于生产人类疫苗的MRC-5人类二倍体细胞系，不能成功地被培养以使用Widel描述的工艺生产甲型肝炎疫苗，原因是MRC-5细胞易于形成微载体聚集体。由于Widel描述的方法学限于FRh-K细胞，在此未提及聚集和细胞消耗，因此，从此项工作不能获得当使用MRC-5细胞遇到这些问题如何克服的知识。
在微载体细胞培养中细胞聚集非常常见，并且从20世纪70年代中期已在发表的文献中被提及。然而，很少论文特别提及此问题。下面讨论几篇相关文献。
Verani等(1983)比较了MRC-5二倍体细胞和两种转化细胞系在玻璃包被的微载体和带电的DEAE-右旋糖酐微载体上的生长(法瑞尼J.等《三种已建立的细胞系在玻璃微载体上的生长》生物技术与生物Biotech and Bioeng.，Vol.25，1359-1372，1983)。在玻璃包被的微载体上所有三种细胞系都发生微载体聚集，而使用右旋糖酐微载体只有一种传代细胞系聚集。扫描电镜(SEM)分析证实在两种表面上细胞附着的方式显著不同。在玻璃微载体培养中，细胞通过长丝足连接，而对于DEAE右旋糖酐微载体连接发生在整个细胞边缘。在我们报告的MRC-5/SOLOHILL玻璃包被系统对MRC-5/dextran系统的稳定性方面，这种连接机制的不同可能是一个重要的因素。
高斯勃尔和胡(1991)证实在存在直径约20微米的小带电微球体时，一些细胞系可被诱导形成细胞聚集体(微载体典型地为90-250微米；高斯勃尔S.and W.S.胡《在微球体诱导的聚集物培养中依赖贴壁细胞的培养》Appl.Microbial.Biotech.，Vol，34，735-741，1991)。以此方式生长的两种转化细胞被发现不扩展，而是以集拢的多层群存在。一种二倍体细胞系也在这些球体上作为聚集体生长，但细胞形状不规则，见美国专利5,114,855。由于胡的工作中使用的球体比常规的微载体小很多，本专利内容中描述的聚集体形成不在胡的专利包括的范围中。将大小降至胡的专利的范围似乎不能应用于甲型肝炎病毒的制备。
鲍瑞和培普萨基斯(1992)研究了使用在CYTODEX 3微载体上生长的中国仓鼠卵巢K1细胞抑制细胞聚集体形成的方法(鲍瑞，M.C.和E.T.培普萨基斯“CHO-细胞微载体培养中桥和大细胞团块之形成：振荡，去甲基亚砜和牛血清的作用”细胞技术学，Vol8，237-248，1992)。此工作的重点在于在微载体培养期间转化细胞系的过度生长，而并未提及二倍体细胞作为聚集体在微载体上的生长。发现增加搅拌可因破坏微载体间的细胞桥而减少聚集和增加细胞死亡。本文公开我们研究关于使用MRC-5和玻璃包被的微载体，我们的研究与这些结果一致。我们发现搅拌确实降低在玻璃包被的微载体系统中MRC-5细胞的聚集率，并伴随细胞死亡增加。我们也发现在培养条件下聚集是一种不可逆的现象。
为减少传代细胞系在悬浮培养中作为细胞聚集体生长已作了大量的工作。图伯特等(1980)发表了此方法的早期描述并引述了关于“细胞系对悬浮培养的适应”的专利(图伯特.W.R.等，“用于大规模生产生物分子的细胞聚集体悬浮培养”，在体外，Vol 16(6)，486-490，1980)。由于MRC-5细胞是人类二倍体，它们的生物活性需要细胞扩展，因此不适用此方法检验。
因此，虽然如上所述，有报告公布MRC-5细胞可在玻璃微载体上作为细胞微载体聚集体生长并且甲型肝炎病毒可从CYTODEX 3微载体培养生产，但MRC-5细胞/CYTODEX 3微载体系统的不稳定性导致本领域技术人员相信微载体培养不适合有效的HAV生产。本文公布了一种独特的稳定微载体系统，它克服了以前在微载体上用MRC-5细胞生产甲型肝炎病毒中的问题。本发明还确立了一种方法学，它将微载体工艺和已存在的下游HAV提纯工艺联用。
                    发明概述
本发明提供一种产生微载体聚集体培养物的工艺，它在用于制造病毒疫苗的整个延长的感染期维持细胞群。甲型肝炎病毒在MRC-5细胞中的生产一直存在着问题，原因是在感染期细胞从微载体上脱落。使用玻璃包被的微载体系统和本文描述的方法学，通过产生能维持细胞于活性状态以在微载体培养中大量生产病毒的稳定微载体聚集体而克服了这个问题。本发明可应用于生产其它病毒，使病毒产量可通过在延长感染期中产生稳定培养物而增加。我们对CYTODEX 3，一种胶原包被的微载体的经验与早期报告一致，显示在该系统中，聚集体的形成是不规律的而且细胞群在进入平稳期时是不稳定的。与以前形成鲜明对照，我们发现了一种基于玻璃包被的微载体工艺，它支持细胞的延长的稳定培养。我们还发展了一种方法用于使用一种表面活性剂缓冲系统破坏微载体聚集体并溶解细胞。在此过程中核保持完整，所以它们可在进入提纯过程前被滤出。溶胞产物随后按照已确定的病毒提纯工艺进行下游加工处理。本工艺的疫苗应用包括生产可在聚集的微载体培养物中繁殖并从生物反应器中回收的任何病毒。可形成聚集的培养物的依赖贴壁细胞包括MRC-5，WI38，Vero，和鸡胚成纤维细胞。可在这些宿主细胞中繁殖的病毒包括，但不限于，甲型肝炎、水痘、麻疹、流行性腮腺炎、风疹、脊髓灰质炎、疱疹病毒和轮状病毒。
本工艺提供了一种方法，利用微载体技术对细胞生长的已证实的商业化工艺规模扩大优势，进行病毒性疫苗，如甲型肝炎的生产，这些病毒疫苗的生产需要延长的培养时间。成功地应用微载体技术于培养延伸入平稳期的其它产物的生产，在本发明中显示是由于恰当选择了微载体/细胞系统，它可产生为延长的细胞活性和产物形成提供微环境的聚集体。聚集体的形成，如本文所述，保护细胞免受悬浮微载体产生的剪切力的作用。聚集体拥有近50-60％的空腔，可供聚集体外的营养对流传送，并降低聚集体的密度使颗粒易于悬浮。聚集体形成也提供了密切的细胞与细胞接触，增加细胞对细胞的病毒性感染传播，并为产物形成提供组织样接触。
                     附图简述图1.在MRC-5细胞和SOLOHILL玻璃微载体上生长的甲型肝炎病
毒的生长期和收获期细胞密度。图2.在MRC-5细胞和SOLOHILL玻璃微载体上生长的甲型肝炎病
毒的生长期和收获期的灌注微载体旋转器培养物的pH曲线。图3.灌注的微载体旋转器培养物，与单层细胞培养物甲型肝炎病毒分
别在C-5细胞和SOLOHILL玻璃微载体，和COSTAR CUBE
表面的生长期和收获期的累积葡萄糖消耗之比较。图4.灌注的微载体旋转器培养物，与单层细胞培养物甲型肝炎病毒分
别在MRC-5细胞和SOLOHILL玻璃微载体，和COSTAR
CUBE表面生长的生长期和收获期的累积乳酸产量之比较。图5.灌注的微载体旋转器培养物，与单层细胞培养物甲型肝炎病毒分
别在MRC-5细胞和SOLOHILL玻璃微载体，和COSTAR
CUBE表面生长的生长期和收获期的累积氨产量之比较。图6.灌注的微载体旋转器培养物，与单层细胞培养物甲型肝炎病毒分
别在MRC-5细胞和SOLOHILL玻璃微载体，和COSTAR
CUBE表面生长的生长期和收获期的葡萄糖消耗曲线之比较。图7.灌注的微载体旋转器培养物，与单层细胞培养物甲型肝炎病毒分
别在MRC-5细胞和SOLOHILL玻璃微载体，和COSTAR
CUBE表面生长的生长期和收获期的乳酸产量曲线之比较。图8.灌注的微载体旋转器培养物，与单层细胞培养物甲型肝炎病毒分
别在MRC-5细胞和SOLOHILL玻璃微载体，和COSTAR
CUBE表面生长的生长期和收获期的葡萄糖消耗和乳酸产量的比
率之比较。图9.在SOLOHILL玻璃微载体上的灌注的微载体旋转器培养物的甲
型肝炎病毒生长曲线。图10.溶剂提取的生长于SOLOHILL玻璃微载体上灌注的微载体旋转
器培养物中的甲型肝炎病毒的SDS PAGE。图11.灌注的微载体旋转器培养物滤过溶胞产物，与单层细胞培养物甲
型肝炎病毒分别在MRC-5细胞和SOLOHILL玻璃微载体，和
COSTAR CUBE表面的生长在260nm处的HPSE曲线之比较。图12.得自灌注的微载体旋转器培养物的核酸酶处理溶胞产物，与单层
细胞培养物甲型肝炎病毒分别在MRC-5细胞和SOLOHILL
玻璃微载体，和COSTAR CUBE表面的生长在260nm处的
HPSEC曲线之比较。图13.得自灌注的微载体旋转器培养物的捕获产物，与单层细胞培养物
甲型肝炎病毒分别在MRC-5细胞和SOLOHILL玻璃微载体，
和COSTAR CUBE表面的生长在260nm处的HPSEC曲线之
比较。图14.得自灌注的微载体旋转器培养物的PEG沉淀产，与单层细
胞培养物甲型肝炎病毒分别在MRC-5细胞和SOLOHILL玻璃
微载体，和COSTAR CUBE表面的生长在260nm处的HPSEC
曲线之比较。图15.得自灌注的微载体旋转器培养物的阴离子交联产物的，与单层细
胞培养物甲型肝炎病毒分别在MRC-5细胞和SOLOHILL玻璃
微载体，和COSTAR CUBE表面的生长在260nm处HPSEC曲
线之比较。图16.通过本发明的方法学使用MRC-5细胞和SOLOHILL玻璃包被
微载体生产的培养5天后的微载体聚集体。聚集体大小相近并且
不存在不带有细胞的单个微载体。图17.用荧光素二乙酸酯染色的MRC-5/SOLOHILL玻璃微载体聚集
体。绿色荧光代表活细胞。图18.在培养第一天MRC-5/SOLOHILL玻璃微载体系统的初步聚
集。使用荧光素二乙酸酯；活细胞荧光绿色。图19.MRC-5/玻璃包被微载体珠的空腔百分比接近50％，与聚集体
直径无关。图20.细胞生长中的聚集体形成。聚集体大小随每个聚集体的细胞数量
增加而成比例地增加。
                本发明详述
本发明是一项在微载体细胞培养中繁殖和培养病毒的工艺。本工艺的疫苗应用包括可在聚集的微载体培养中繁殖并从生物反应器回收的任何病毒的生产。可形成聚集的培养物的依赖贴壁细胞包括但不限于MRC-5，WI38，Vero，和鸡胚成纤维细胞。可在这些宿主细胞中繁殖的病毒包括但不限于甲型肝炎、水痘、麻疹、流行性腮腺炎、风疹、脊髓灰质炎病毒、疱疹病毒和轮状病毒。按照本工艺，细胞在玻璃包被的微载体上生长至最理想的密度并用病毒感染。按照本发明的一项实施方案，在细胞生产和病毒感染阶段用培养基灌注培养物。在感染的末期，收获微载体。产物病毒从上清培养液或溶胞的细胞收集。在不释入培养基的细胞相关联病毒或需要额外步骤以被大量稀释病毒的情况下(如冰冻/解冻或液体剪切力)，可采用本发明描述的用于从聚集的微载体培养物释放病毒的收获方法。收获可涉及流体切应力或流体切应力加表面活性剂以使细胞透性化。
灌注的MRC-5细胞在玻璃包被的微载体上培养并用甲型肝炎病毒感染举例说明了本发明的工艺。在灌注的微载体培养中病毒生产中的一个重要因素是细胞群在感染过程中的稳定性。这一观察结果对于缓慢生长病毒如甲型肝炎病毒(HAV)特别重要。在HAV的生产中，优选细胞为MRC-5，虽然也可使用可用于人类疫苗生产的类似细胞，如WI38或VERO。在HAV和MRC-5培养的情况下，细胞群必须在21天的感染过程中保持稳定。在这段时间内，细胞处于平稳期。
在涉及得自多种制造商包括Pharmacia(CYTODEX1，2&3)，SOLOHILL Laberatories(玻璃和胶原包被的)，Mat Tek(Plastek)，和Mitsubishi Kasei(Diacarrier)的微载体的微载体筛选研究中，我们发现只有SOLOHILL玻璃包被的聚苯乙烯珠在平稳期建立了稳定的培养物。在此系统中，MRC-5细胞在随培养进展而尺寸增加的微载体聚集体中生长。在筛选供商业应用的各种微载体系统时，经常筛选出引起所用的细胞系显著聚集的微载体类型。增加搅拌，降低钙浓度，和降低血清浓度是用以减少或消除聚集的常用方法。在MRC-5系统中，我们已发现通过适当的培养技术，玻璃包被的微载体系统可与MRC-5细胞形成一种聚集结构，它是用于疫苗生产的病毒的理想繁殖环境。该聚集体通过经细胞与细胞接触的细胞桥形成。当微载体的数量增加时，细胞在提供一种组织样生长形态的空腔中生长。此空腔已知为聚集体体积的50或60％，如图19中所示，而细胞团只占此空腔的1-2％。因此，与导致细胞团之间弥散限制的生物反应器系统或固定化方法不同，这些细胞分布于聚集体并带有足够的空腔供通过此珠对流传送营养和产物。该聚集体对超过细胞培养范围中所见到的pH变化和高至1mM浓度的EDTA抗性表明不需要受体键来维持聚集体结构，此受体键在聚集体的最初形成中很可能被涉及。由于聚集体可通过胰蛋白酶消化完全解离，因此聚集体结构最可能由细胞分泌的细胞外基质蛋白维持。其它MRC-5细胞/微载体系统形成的聚集体不如我们在本文所描述的用玻璃包被的微载体系统产生的稳定。因此，根据我们的经验，选择玻璃包被的微载体用于细胞培养导致形成稳定的聚集体结构，可供用于疫苗生产的病毒繁殖。
一旦我们基于在感染期的稳定性选择了玻璃包被的微载体用于细胞生长，必须采用合适的培养条件以形成一致大小的聚集体。图16-18显示用本发明描述的方法学的聚集体形成。对于考虑这样一种系统用于病毒性疫苗的商业生产，一致的，可预测的聚集体形成是重要的。首先，通过微载体群的细胞连接必须一致，因为聚集通过细胞与细胞的相互作用而不是细胞与微载体的相互作用发生。这一点可从这样的事实得知：不附着有细胞的珠在整个培养过程中将保持原状，而附着有细胞的微载体发生聚集。在适当的附着条件下，所有微载体都附着有细胞并因而都在培养中参预形成聚集体，如图20所示。这可通过接种每个珠大于5个细胞达到，这一点在微载体工作中是已确立的经验。在一致附着中，胰蛋白酶消化过程，搅拌，pH，温度和血清浓度也起重要作用。聚集体大小的增长作为聚集体内细胞生长的函数显示于图20。由采用的搅拌方式确定的流体力学环境对聚集体在培养中的生长是重要的。每分钟转数RPM应维持在或刚刚高于“临界离底悬浮搅拌速度(criticaloff bottom suspension stiring rate)，它对应于没有微载体在底部停留大于1秒钟的搅拌速度。叶轮应为釜直径的约一半或更大，以减少所需RPM而最大量地混合。较小的叶轮在接近叶轮处产生高切应力区，它可破坏细胞桥，从而降低聚集和细胞活力。不健康的培养物将增加聚集体大小。认为这是由于在细胞溶解中DNA释放，介导聚集增加。采用一种维持细胞活力的给养策略(培养基replishment)可减低在平稳期的进一步聚集。
聚集体在临界离底悬浮低于单个微载体，这一点是出乎意料的，因为聚集体尺寸更大。其原因是因为聚集体体积的50-60％是空腔(充满培养基)而降低了聚集体密度，还可能因为通过在异质的表面消耗能量悬浮聚集体的流体动力学。然而，这些聚集体确实比单个微载体沉降得更快。这些特性对于以制造规模进行加工是有利的。因此，我们发现，细胞聚集为平稳期细胞和为病毒感染和生长提供了稳定环境，而不是象以前所想的那样是不希望的。
SOLOHILL玻璃微载体包括一个具有预定大小和密度的聚苯乙烯珠，包被有一薄层玻璃，按照SOLOHILL Labs，Inc(美国专利4,029045,4,448,884和4,564,532)准许的专利生产工艺。由于玻璃的密度是2.4g/ml，有必要包被低密度的微载体以提供低密度的玻璃表面(密度为1.02至1.04g/ml)。微载体密度刚刚高于液体培养基的密度，对于降低在搅拌釜中悬浮微载体时切应力对细胞的损伤是至关重要的。因此，具有这种特性的任何玻璃包被的微载体在本工艺中均可使用，而SOLOHILL玻璃微载体只是一种可商购的实例。SOLOHILL玻璃微载体已被用于培养一些依赖贴壁细胞系，包括，Vero(猴肾)，CEF(鸡胚成纤维细胞)，BHK(仓鼠肾)，MRC-5(人类胚胎肺二倍体成纤维细胞)，HFF(人类包皮成纤维细胞)，和MDBK(Mardin-Darby牛肾)。按照本文公开的方法，现在所有这些细胞类型可用于延长的，聚集的细胞培养以产生能感染这些细胞并在其中繁殖的病毒。已报告，玻璃基质导致与得自Pharmacia LKB Biotechnology的CYTODEX 3微载体上见到的不同的附着形态(Varani，J.等，生长于微载体培养的成纤维或上皮细胞的基于基质的生长及生物学特性的差异J.Biol.Stand.Vol.13，pp67-76，1985)。这些不同与本文公开的适当培养条件一起被用于诱引稳定的聚集体形成以生产病毒疫苗。
在本发明的一项实施方案中，仅为举例说明目的，株系CR326F的甲型肝炎病毒(HAV)变异株第28代(P28)被用于感染在微载体上生长的MRC-5细胞，并将产生的材料在第29代(P29)培养。P28CR326F是一种减毒HAV株。HAV的其它株和/或血清型包括在本发明中，其中包括可用本领域常规技术减毒的HAV株。适合HAV繁殖的其它细胞系包括Vero，FL，WI-38和FRhK6细胞。HAV在细胞培养中繁殖的这些和其它系统的讨论见盖瑞蒂，R.J.“针对甲型肝炎的活性免疫”，盖瑞蒂，R.J.(ed) Hepatitis A Academic Press1984，pp.263-276；和Tice胡rst，J.R.，Seminars in Liver Disease6，46-55(1986)。一般来说，任何细胞系如任何人类二倍体成纤维细胞系，可用作HAV的宿主细胞，只要它对HAV感染敏感。优选的细胞系是MRC-5。本领域技术人员应知道，本发明的范围包括，除HAV的CR326F株的第18，P18或P28代外，任何其它HAV变异体或株，不管它是减毒的还是强致病性的，以及可在依赖贴壁细胞上培养其它病毒。可通过在细胞或动物中连续传代，或通过其它方法分离减毒的变异株或株。参见，普罗伏斯特，P.J.等，Proc.Soc.Exp.Biol.Med.170，8(1982)；普罗伏斯特，P.J.等，医学病毒学杂志，20，165(1986)；美国专利4,164,566和5,021,348以知关于减毒的详情。本发明的培养方法对于减毒或有强致病性的HAV株易于和容易被接受。
在本发明的一项优选实施方案中，MRC-5细胞被足以获得足够细胞培养感染的HAV多重感染(MOI)。0.05-1的多重感染是可接受的。通过使用得自受HAV感染并培养约28天的平稳期培养物上清液部分的HAV，可方便地产生贮存种。HAV可在平稳期培养物中繁殖达到病毒产量高峰。其它方法如微载体培养或COSTAR CUBE可被用于贮存种的产生。细胞培养的培养液可为任何支持MRC-5细胞活跃生长和HAV繁殖的培养液。
本发明的工艺通过下列步骤或期可得到更好的理解。步骤1：微载体制备
在适合搅拌悬浮培养哺乳类细胞的生物反应器中装入干燥，玻璃包被的微载体珠。这些珠被悬浮在WF1质量水中并原位灭菌。灭菌后，将水排出并向生物反应器中加入适合培养为特定病毒生长选定的细胞的灭菌培养液。为保证完全将水置换和对珠进行平衡，优选培养液作至多3次置换。对HAV培养，我们发现在此阶段使用Williams Media E(无血清)是可接受的。向培养液中加入约20克/升至75克/升微载体，优选地约40克/升至60克/升是理想的。步骤2：细胞接种
微载体一经平衡于选定的培养液和温度(37℃)，细胞，优选处于晚对数期者，被接种入培养器皿。对于小规模工作，小多层细胞培养单元NUNC CELL FACTORIES(NCFs)是适合此目的的，按照制造商的指示在其中细胞可以单层生长。接种细胞浓度为5-10细胞/载体珠，对应于在使用的珠装填量，约100000(1×105)细胞/mL。对于约600mL的小微载体培养，约需要6×107个细胞。对于一个铺满的10层NCF，使用胰蛋白酶可收获约5×108个细胞。对更大规模微载体培养接种，通过使用附加的NCF或，如果必要的话使用种子微载体培养，这些比率易于扩大规模。一旦细胞被用胰蛋白酶收获并用含培养液血清中和，它们通过低速离心被沉淀并再悬浮于含约10％补充铁的牛血清的培养液中，或将它们用含约10％补充铁的牛血清的培养液简单稀释。通过使用一份细胞接种物对9份微载体/无血清培养液，得到1％补充铁的牛血清终浓度。这个比率可通过改变加入再悬浮细胞接种物的血清浓度或通过改变接种物对生物反应器容量的比率而改变。发现在pH7.6-7.9的1％血清浓度可提供一致的细胞附着。
接种后，允许细胞在微载体上附着约3小时(虽然更长或更短的时间是可接受的并且为附着提供的精确时间不是至关重要的)，使用足够获得临界离底悬浮的搅拌速度，即，达到没有微载体在被搅拌生物反应器底部停留1秒钟以上的状态所需要的最小搅拌速度(叶轮每分种转数，rpm)。这一点可通过检查和适当改变叶轮的速度获得，这是本领域技术人员熟知的一种简单过程。步骤3：灌注培养细胞至晚对数期
在细胞得到足够时间附着于微载体上后，向培养液补充附加的血清供细胞生长。对于用于HAV生产的MRC-5细胞，优选补充足够的补充铁的牛血清以得到10％的血清浓度。正如本领域技术人员可知的，对于其它培养液配方血清浓度可不同。
在细胞附着和用任何调整的血清条件平衡后约24小时，建立起一个灌注入口/出口系统，通过此系统培养液以约0.7至约2，优选约1.3，容积培养液/天的速度去除和补充。监测葡萄糖、乳酸和氨提供了一种保证不发生营养缺乏和pH波动的方法。本领域中技术人员熟知监测这些参数的技术和保持它们稳定性的方法。例如，如果发现葡萄糖供应受限，则灌注速度可增加。如果发现由于乳酸产生和积累而pH过酸，则添加弱碱或增加灌注速度可控制这种不希望的趋势。无菌滤过的空气在生物反应器的顶部空间提供，并且在小规模时，可使用表面叶轮通过破坏气-液交界面的表面张力而有利地增加气体运送。
一旦建立了灌注，细胞即可生长进入晚指数(对数)，或早平稳期。典型地，对于用10％含铁牛血清补充的Williams培养液E中的MRC-5细胞，这需要约6天时间。虽然为细胞生长提供的时间长度不是至关重要的，但最好提供足够的时间以利于细胞良好生长和获得聚集。步骤4：感染
典型地，感染性病毒的贮存种被方便地冰冻保存。不管如何建立，贮存的感染性病毒被用于以约0.05至约1，优选约0.1的多重感染(MOI)去感染细胞。在此感染阶段停止灌注2小时以使病毒附着于细胞上。一旦已提供足够的时间使病毒充分附着于细胞上，即可重新开始灌注。可每周从培养物取样，并根据不同的病毒经过足够的时间后可收获整个生物反应器。对于在我们描述的系统中的MRC-5细胞上生长的HAV，通常在感染后约14-28天得到峰HAV产量。步骤5：病毒收获
作为病毒收获的第一步，停止搅拌并让连接在微载体上的病毒感染的细胞通过重力下沉。在生产规模时，优选使用洗涤聚集体的方法，如使用一种滤过装置。将培养上清液去除。对于HAV，发现大量病毒是在细胞内，因而必须通过细胞溶胞而被释放。这一点通过在收获溶液中破坏细胞聚集体而获得。优选地，收获溶液中含有一种有效地使细胞对HAV可通透的成分。这样的成分在本领域中是公知的。优选地，以可能的最低有效浓度应用表面活性剂如Triton X-100，NP-40，或类似物，去易化后者的去除。已发现一种可用于此目的的表面活性剂为TRITON X-100，它可在适当的缓冲液如10mM Tris-HCl，0.1mM MgCl2中以约0.1％的浓度应用。
在我们的系统中破坏聚集体的一种有效方法包括，让微载体通过一个包括一系列直径逐渐减小的孔板的再循环圈使1/16″，然3/6″然1/32″的直径，并将生物反应器的内容物以约500-1000mL/分再循环，直至所有聚集体被破坏(通过显微镜观察样本)。在此步的规模扩大中，通过为在收获时获得同样的线速度增加流速而适当选择孔板的直径以获得破坏聚集体所需的流体切应力。由于线速度＝流速/孔板的面积，破坏聚集体的条件可通过获得1010cm/分-2020cm/分范围内的线速度而得到，不管规模的大小。最小直径(1/32″，约0.8mm)约为单个微载体直径(约150μm)的5倍。对于较大规模的生产，使用较大的孔板以避免淤塞，但为了补偿，简单地增加流速以提供上述范围的线速度。这样的孔径足够小可获得有效的聚集体破坏，但又足够大，使淤塞，特别是在经过较大的孔后，很少发生。其它技术，包括但不限于利用声波，也可被使用。产生的微载体浆静置沉淀，含病毒的细胞碎片被倾析和贮存。将生物反应器再装入含缓冲液的表面活性剂并将生物反应器的内容物再次通过外环和孔板再循环以回收被捕获的病毒。再一次让浆沉淀并将上清液与贮存的上清液合并。在此阶段，用血细胞计数板计数上清液中的细胞核提供了估计收获细胞数量的一个好方法。将上清液过滤，优选通过5μm的滤膜以去除细胞核，并将上清液按需要进行下游加工。下面提供经得起HAV纯化检验的工艺。步骤6：HAV的提纯
按照本发明的培养物中生产的HAV可用本领域公知的方法提纯，或者它也可在减毒后直接用作疫苗。它也可按照本领域中公知的方法被灭活，其中首先是福尔马林灭活。本领域中公知的这些步骤的详情参见，如，美国专利4,164,566；5,021,348；EP0302692；和USSN07/926873，92年10月8日提交。步骤7：疫苗灭活和配方
需要或可能需要常规和公知特性的附加加工步骤以制备纯化的HAV衣壳供疫苗应用。例如，用福尔马林处理，灭菌滤过和对载体或佐剂吸附是制备福尔马林灭活疫苗的典型基本步骤。见，如Provost，P.J.等，Proc.Soc.Exp.Biol.Med.160，213(1979)；Provost，P.J.等，J.Med.Virol.19，23(1986)。HAV的灭活可通过加热，pH改变，辐射，用有机溶剂如福尔马林或多聚甲醛处理。典型地，HAV灭活以1/4000比率的福尔马林进行。被灭活的HAV随后用氢氧化铝吸收或其沉淀以提供佐剂和载体效应。被灭活的HAV疫苗已显示有效[NewEnglandJ.of Med.327：453-457，(1992)]。
为了比较本发明的工艺与单层细胞培养-病毒生产工艺，将MRC-5细胞接种入2个大规模COSTAR CUBE生物反应器和3个微载体培养物。微载体培养的灌注率为0.7和1.5生物反应器容量/天，它包括了COSTAR CUBE中使用的1.3生物反应器容积/天。选择微载体装载量以取得与生产COSTAR CUBE生物反应器相似的细胞密度，以便在两种反应器间进行直接比较。微载体培养在整个感染期是稳定的，并且就葡萄糖和乳酸而言与COSTAR CUBE生物反应器具有相似的代谢率。微载体溶胞物与1′升COSTAR CUBE溶胞产物提纯效率相近并且易于使用一种适合HAV纯化的下游工艺处理。基于每个细胞的甲型肝炎产量约为COSTAR CUBE工艺的一半，表明在微载体培养中有必要使感染过程最优化。每升生物反应器容积的单位容积产量也约为COSTAR CUBE产量的一半；但是，使用本方法，有增加细胞密度1倍以上的潜力，从而通过增加微载体装载量使单位容积产量增加。MRC-5细胞群被维持在稳定微载体聚集体中，在21天感染过程中没有细胞丢失。其它被检测的微载体类型导致在生长期后MRC-5细胞群从微载体上消耗，因而不适合病毒生产。我们在微载体培养中达到了最终细胞密度2.2～2.4×106细胞/ml，这与COSTAR CUBES中产生的估计的2.6×106细胞/ml相似。
在灌注的微载体培养中的葡萄糖消耗率和乳酸产生率与在灌注的COSTAR CUBES中产生率非常相近。在两种系统中均见到葡萄糖向乳酸的化学计量学转化。主要为谷氨酰胺代谢副产物的氨产量在微载体系统中只有一半，因而在该系统中使用2mM谷氨酰胺供给而在COSTAR CUBES中使用4mM谷氨酰胺供给。在感染后21天，微载体培养产生平均112单位/百万细胞和258单位/升生物反应器容积。这些产率分别为COSTAR CUBES中获得的产率的40-50％和38％。病毒生长曲线表明在14天时已产生大于50％的病毒，在14至21天病毒生长率大大下降。还不清楚细胞产量的下降是因为不是所有细胞参予感染，还是每个被感染细胞产量减少，还是在收获前病毒泄漏进入培养液。聚集体经2次盐水洗涤，甚至加入0.1％Triton后仍然稳定。聚集体的破坏是通过穿过一系列孔板的可控切应力，这些孔板被安装在生物反应器的再循环圈中。细胞核被释放(因而易于定量)并通过5μmDurapore滤纸滤过去除，使溶胞产物可用已确定的提纯工艺加工。溶剂提纯物质的SDS PAGE显示3个甲型肝炎病毒的特征带和一个在66000分子量的第4条带，此带可能对应于在收获盐水洗涤过程中未被完全去除的血清衍生BSA。
本发明的一个最重要的方面在于我们证实了MRC-5细胞在甲型肝炎感染的整个三周可在微载体上维持稳定状态，以供生产和定量提纯甲型肝炎。此系统的稳定性归因于MRC-5细胞在玻璃包被的聚苯乙烯微载体上生长期间形成的聚集体的独特性质。
在此给出的数据提供了灌注的微载体工艺和单层细胞培养制造工艺在类似细胞密度和灌注率的情况下的比较。代谢指标如葡萄糖利用，乳酸累积，和这些比率的摩尔比在两种工艺间显示MRC-5代谢的相似性。两种工艺得到的甲型肝炎病毒的提纯极其相似，表明如果病毒在微载体培养中生产，不需要在下游加工中有大的改变。
特定每细胞病毒产量在低灌注速度微载体培养中(0.7体积/天)只比高灌注速度(1.5升/天)培养低7％，表明使用的灌注速度对病毒产量不是限制性的。基于我们对细胞密度的最佳估计，在微载体培养中特定每细胞病毒产量为从单层生长病毒获得的约一半。由于灌注速度数据不提示营养物限制，我们可以得出结论即，或者不是所有细胞参加了感染，或者病毒已产生了但脱落于培养液中。在前一种情况，基于在最后一轮中的台盼蓝测定相信在整个感染阶段生活力是高的，在感染后21天成批再进料(较差的情况)为92％。微载体培养现在的特定每细胞病毒产量给定后，可通过提高珠装载量增加生物反应器中的细胞密度，从而增加总产量。总之，作为生产甲型肝炎和其它病毒疫苗的可规模扩大工艺，聚集的微载体系统具有巨大的潜力。
下列实施例意在举例说明本发明的特定实施方案，但这些实施例不应被误解为实施本发明的唯一模式。
                    实施例1甲型肝炎病毒贮存种生产
细胞和病毒种制造的大规模工艺涉及将MRC-5细胞单层种植于6000cm2 NUNC CELL FACTORIES(NCFs)中。MRC-5细胞在NCFs中生长至汇合。这些细胞可被收获并用于接种在微载体上。替代地，NCFs中的汇合细胞以约0.1的MOI被病毒感染。在感染后细胞被培养约28天，每周更换含10％v/v胎牛血清的培养液。发现高浓度的血清，2至10％v/v，比低水平的0.5至2％v/v引致更高的病毒产量。在本循环末，上清液中含大量病毒，在此实施例中为107.3TCID50/ml，可直接从NCF中收获，不需要细胞溶解，并用作病毒贮存种的来源。以此方式可通过更多产和容易的方法获得制造所需的大量感染性病毒，优于使摇瓶，或使用机械方法收获者。
                     实施例2在聚集的微载体系统中的甲型肝炎病毒生产
本项和下列实施例说明在小型微载体培养中定量生产甲型肝炎病毒并通过已建立的HAV提纯方法纯化溶胞物。经过适当的改变，也可生产其它病毒和细胞类型。微载体旋转器(spinner)系统(步骤1)
旋转器系统被设计为一个装于车上(cart)的自身封闭系统(selfcontained unit)操作，其中加样，培养液改变和感染在封密系统中进行，使用SCD II灭菌管焊接装置。此旋转器装置通常由Bellco制造，工作容积565ml，带有一个供温度控制的套。搅拌系统包括一个直径改为6.6cm的Bellco搅棒。该直径是基于涉及测定临界离底悬浮搅拌速度(COBSR)和计算在此速度基础上的流体动力学条件的研究而选择的。一个4cm长的表面叶轮被置于培养物交界面以在高细胞密度时提供更多的氧气运送并帮助去除CO2。微载体自由流出物的去除使用置于希望的生物反应器容积处的覆有10μm筛网1/2英寸ID金属管，使用比灌注入口流速高50％的流动速度。微载体制备
得自SOLOHILL Laboratories，Inc.的玻璃包被的聚苯乙烯微载体被用于研究。选择从SOLOHILL可得到的最低微载体比重1.02以使悬浮微载体的能量输入最少。尺寸范围是150-210μm。SOLOHILL进行的一项颗粒大小测定中，确定表面积和珠的数量分别为514cm2/g和6.6×105珠/克。实验选择的微载体装载量为35.4g/升。
微载体被置于硅化的500ml加套旋转器中，悬于WFI水中并在122℃压热灭菌30分钟。然后将微载体洗涤3遍，使用含2mM谷氨酰胺，不含血清的改良William’s培养液E。
                       实施例3细胞扩展/旋转器接种(步骤2)
用MRC-5细胞接种14个NCFs。收获12个NUNC CELLFACTORIES(NCFs)并用于接种2个COSTAR CUBE生物反应器。剩下的2个NCFs收获后用于接种微载体旋转器。将细胞在300xg离心10分钟并再悬浮于10％铁补充的牛血清(FeCS)，90％含2mM谷氨酰胺的改良Willians培养基E。在实验中不使用抗生素。细胞在37℃，pH7.7，1％FeCS中以约8细胞/珠附着。3小时后所有细胞均已附着并将培养液加至10％FeCS以开始生长期。
按照Poisson分布，只需每珠5个细胞就可保证在细胞和珠的随机相遇中至少1个细胞附着于每个珠上。我们发现在上述附着条件下，每珠5个细胞常导致一些微载体不带细胞。这些微载体在培养全过程中保持为单独的微载体，这进一步证实聚集现象通过细胞与细胞接触而不是细胞与微载体接触发生。在这项实施例中，每珠细胞的比率为8.2，并观察到在3小时后所有微载体至少附着1个细胞(细胞仍为圆形因而在不发光的微载体上可见)。最小细胞/珠比率的不同可能是由于在种植阶段一些细胞聚集，导致预测的细胞对珠比率下降。尽管如此，常规实验允许此系统的附着条件最优化。
在本实验中，种植时细胞密度为1.56×105细胞/ml，它对应于8600细胞/cm2微载体。在第2天，形成2-5MCs的小聚集体，在第5天时生长为10-30MCs。随后，一些10-30MC聚集体结合形成约50MC的聚集体。很清楚，在聚集过程中发生了细胞生长。在培养中没有单独微载体存在，并显示细胞在微载体间的空腔内生长。图1中显示的细胞生长曲线表明在第5天培养物达到2-3MM细胞/mL的细胞密度。第6天的核计数较低，因为较大的聚集体开始在样本管线颈缩阻塞，由于颗粒浓度因聚集而下降约50倍，培养物从单个MCs时的相当不透明变为半透明。因此有可能使用浊度探头进行联机培养进展监测。在28天运行中在流出液样本中未观察到由于细胞脱落而产生的漂浮细胞。在运行结束时生物反应器收获的核计数也表明在整个感染阶段培养稳定。我们发现聚集体一旦形成就非常稳定，即使是在极端的pH值下，在存在EDTA，和高搅拌速度时。由于聚集体在存在胰蛋白酶时快速破坏，聚集体最可能是通过细胞分泌的含胶原蛋白的细胞外基质的产生而稳定化的。
                     实施例4灌注(步骤3)
培养物最初使用瓶装培养基和紫外线照射过的血清以分批模式生长2天。在第二天，灌注开始，使用得自JRH的袋装的培养基，改良的William’s培养基E和FeCS。袋的份额包含10和20升Stedim包；改良的Williams培养基E和非辐照的FeCS血清份额为Merck接受供生产使用。比较使用血清补充的袋装培养基和瓶装的含有经辐照的血清对照培养液两者在T型烧瓶中MRC-5细胞在运行前后的生长。葡萄糖，乳酸和氨是一致的，证明FeCS/基础培养液自血清和培养基混合之日起6个月是稳定的。在实验中，培养液中加入碳酸氢钠至终浓度为3.7g/升以维持pH在7.3以上。
目标灌注速度为0.7容积/日(旋转器1)和1.5容积/日(旋转器2和3)，使用565ml生物反应器容积。但是，我们使用的微型盒式WatsonMarlow泵未将流速精确控制在固定的RPM。特别是在导管被移去后。间歇地测定速度并将下列测定的流速用于所有的计算。对于3个旋转器，在感染期的平均灌注速度分别为0.76，1.51和1.51。机内的旋转流量计和宽内径导管(低RPMs)有助于此系统的有效性。还应注意在由于未能及时换袋所致的灌注中断时将速度校正，见表I：
                                  表I
                   测定的灌注速度：生物反应器容积/日
  培养天数  旋转器#1容积/日  旋转器#2容积/日  旋转器#3容积/日
    2      0.5      1.2      1.2
    3      0.5      0.6      0.6
    4      0.5      1.2      1.2
    5      0.5      1.2      1.2
    6      0.5      1.2      1.2
    7      0.64      1.84      1.84
    8      0.7      2.1      2.1
    9      0.7      2.1      2.1
    10      0.7      1.67      1.67
    11      0.7      1.6      1.6
    12      0.7      1.27      1.27
    13      0.7      1.3      1.3
    14      0.7      1.3      1.3
    15      0.8      1.4      1.4
    16      0.8      1.4      1.4
    17      0.8      1.4      1.4
    18      0.8      1.4      1.4
    19      0.8      1.4      1.4
    20      0.8      1.4      1.4
    21      0.8      1.4      1.4
    22      0.8      1.4      1.4
    23      0.8      1.4      1.4
    24     0.8     1.4          1.4
    25     0.9     1.86          1.86
    26     0.8     1.4          1.4
    27     0.8     1.4          1.4
    28     0.8     1.4          1.4
        灌注速度：1.5容积/日＝565ml/24小时＝23.5ml/hr
文献中报告MRC-5细胞的最适pH为pH7.7，在pH7.2时显示生长完全停止(福斯泰尔等，生物技术，生物工程，39：305-313，1992)。生产性的COSTAR CUBES在整个培养期间被控制在pH7.3的调定点。由于在旋转器烧瓶中没有pH控制，维持pH在7.3以上依赖于灌注以去除乳酸和表面叶轮以增加CO2从液相的去除。图2中提供的pH曲线显示在前150小时中pH下降。在那时加入碳酸氢钠至随后的培养基袋中以增加浓度从2.2g/升去3.7g/升，用以增加缓冲能力。
本发明的一项目标是产生一种微载体培养物，使之具有与估计的用于生产规模单层细胞培养系统中生长的相似密度。一种这样的系统使用COSTAR CUBE生物反应器。在下面，我们比较基于COSTAR CUBE工艺的和在我们的微载体工艺中葡萄糖，乳酸和氨的代谢曲线。在非感染性生产COSTAR CUBES中细胞量测定为，在感染第1天1.6×106/细胞/ml，在28天后为3.0×106。由于在刚开始感染后葡萄糖摄取速度就不断上升，可能细胞密度增加(1倍)主要发生在那时，并且在COSTAR CUBE中在感染的其余时间细胞密度维持不变。在感染的COSTAR CUBE中的细胞密度估计为介于这两种细胞密度之间并最可能大于2×106细胞/ml。基于这些估计，我们得出结论，微载体培养和COSTAR CUBE生物反应器在同样的细胞密度范围内。微载体培养的灌注速度范围为从0.7至1.5生物反应器容积/日。它包括了基于COSTAR CUBE的培养工艺中使用的1.3体积/日的速度。如果细胞代谢也相似，则在相似的细胞密度和灌注速度下，可预期代谢曲线是类似的。
在两个系统中在感染过程中葡萄糖利用，乳酸产生和氨产生的累积量分别显示于图3、4和5。累积量通过质量平衡计算，给出灌注速度和随时间的浓度曲线。在图3中给出了3个微载体培养，一个代表性COSTAR CUBE反应器的累积葡萄糖，和18个COSTAR CUBE生产批量的平均累积葡萄糖。此图显示如果代谢是类似的，如同所预期的，生产性COSTAR CUBE数据处于较高和较低灌注速度的微载体数据之间。此图还显示代表性COSTAR CUBE与平均COSTAR CUBE数据表现相似，只是在约450小时时有一个改变，它可能是由于灌注操作中断所致。累积乳酸曲线再次显示类似趋势，在COSTAR CUBE工艺中的乳酸积累处于在较高和较低灌注速度的微载体工艺之间。对应于累积葡萄糖对时间作图的斜率的特定葡萄糖速度(mMo1es葡萄糖消耗量/升/小时)，在运行的前400小时随灌注速度的增加而增加。这可能说明葡萄糖浓度的不同影响葡萄糖代谢的速度。在图6和图7中在0.7体积/日和1.5体积/日微载体培养间生物反应器中葡萄糖和乳酸浓度的不同是明显的。这种不同的另一个原因可能在于生物反应器中细胞密度的微小差别。图8中显示的葡萄糖和乳酸比率表明两种工艺通过糖解途径从葡萄糖向乳酸的化学计量学转变。
图5中所示的氨累积产量显示当使用低谷氨酰胺浓度时谷氨酰胺代谢的巨大差异。由于失误，在一项COSTAR CUBE实验中，由于疏忽将谷氨酰胺加到含谷氨酰胺的培养液中使谷氨酰胺的浓度加倍。基于此资料，可能谷氨酰胺限制在2mM浓度培养。典型地谷氨酰胺失去一个氨基(并且第二个氨基发生转氨基作用)通过α-酮戊二酸进入三羧基循环(TCA)。假定所有加至生物反应器中的谷氨酰胺以1∶1转变为氨，氨累积速度将对于1.5体积/日为0.071mM/升/小时，和对于0.7体积/日为0.033mM/升/小时。这些速度接近在这些培养中所见的平均速度。还可见到在同样的进料浓度但在更高的灌注速度下，基于氨产量的利用率增加。这种效果也可见于葡萄糖代谢并表明一种浓度依赖的利用率，在其它细胞系已报告了这种情况。
                     实施例5感染，(步骤4)
在第7天，用如按照上面实施例1中所述制备的HAV贮存种感染培养物，目标MOI为0.1(即：经核计数定量，在生物反应器中每10个细胞/1病毒粒子)。随后，发现由于实际MOI为0.062，所以贮存种的滴度为7.19logs，而不是7.4logs。在感染前5小时将温度降至32℃。在感染后2小时重新开始灌注模式。
培养物pH值用Corning-Ciba血气分析仪测定。注意保证避免在取样过程中排出CO2而改变pH值。葡萄糖，乳酸和氨使用KodakBiolyzer分析。在需要时用WFI稀释样本；在测定氨时，浓度校正为在WFI中的氨浓度。细胞密度用Sanford等(J.Nat.Cancer Inst.，11：773-795，1951)的方法定量，在此方法中核被释放并用0.1％(w/v)龙胆紫和0.1mM柠檬酸染色。在第6天停用从培养物取样计数，因为聚集体挂在样本管线颈缩处。每日进行培养液流出物取样。
图9中提供感染后9至21天的病毒生长曲线。通过校正在收获过程中样本稀释的滴度取得Havag(用ELISA测定的HAV抗原)单位/ml。病毒滴度显示在感染第3周明显下降。另一可能是培养在21天前达到高峰，病毒在21天时进入培养液。从NCF实验我们得知，可在感染后21天从细胞收获病毒，和在28天时从培养液收获。后一步骤在NCFs中仍被用于产生贮存种(见实施例1)。
在表IIa和IIb中提供了COSTAR CUBE工艺和微载体工艺间病毒产量的比较：
                                           表IIa
                         在21天后每升生物反应器容积的Havag产量
灌注的生产性Cube     灌注的微载体培养物
生物反应器1.3容积/日      旋转器#10.7容积/日      旋转器#21.5容积/日     旋转器#31.5容积/日
产生的总Havag单位      1.9×107        1.34×105        1.51×105      1.52×105
生物反应器容积      28 liters        565ml        565ml      565nml
Havag单位/ml生物反应器      695        237        268      269
                                             表IIb
                                     感染后21天每细胞Havag产量
灌注的生产性Cube                    灌注的微载体培养物
生物反应器1.3容积/日      旋转器#10.7容积/日     旋转器#21.5容积/日    旋转器#31.5容积/日
Havag单位/ml生物反应器          695        237       268       269
细胞/m1生物反应器         估计值*2.4-3.0×106     2.21×106    2.34×106     2.36×106
Havag单位/106细胞         229-286        107       115       114
    *细胞测定基于在COSTAR CUBE中21天后测定非感染细胞密度2.5×105细胞/cm2，对应于3MM细胞/ml和在2.0×105细胞/cm2上的较低测定。
进行两种比较：一种容积产量，(Havag/升生物反应器)和一种细胞特定产量，(Havag/细胞)。每升生物反应器Havag产量提供了生物反应器生产能力的直接产量计算。由于细胞密度在各种微载体反应器间相似并类似于COSTAR CUBE生产性生物反应器的估计细胞密度，使用这种产量可直接比较生产能力。生产性COSTAR CUBE反应器产量是数个COSTAR CUBE培养收获的总Havag被28升生物反应器容积除的平均值。3个微载体旋转器的生产能力非常接近，低灌注速度培养(旋转器#1)显示产量只下降12％。微载体培养的产量是得自COSTAR CUBE工艺的产量的38％。通过增加珠装载量以提高微载体培养中的细胞密度至在此使用的细胞密度的2倍以上，可得到类似的生产能力。
COSTAR CUBE的每细胞Havag单位数据的测定是基于前面讨论的COSTAR CUBE中细胞密度的测定。旋转器的细胞密度是在21天时每个生物反应器收获期间释放的核的直接测定。由于在低灌注速度生物反应器中测定的细胞稍少些，所以每细胞产量只比其它旋转器低7％(而基于容积的产量低12％)。这表明低灌注速度仅轻微限制病毒生产。微载体细胞产量为COSTAR CUBE测定每细胞产量的约40-50％，这与容积产量基本一致，因为在生物反应器中细胞密度基本相似。
                     实施例6收获，(步骤5)
在下列测定中，我们使用两种收获步骤：一种是在感染后9和14天小的5ml收获。另一种是在感染后21天全生物反应器收获。
对于小规模取样，将5ml聚集MCs等分试样用PBS洗2次，并悬浮于0.1％三硝基甲苯细胞溶胞缓冲液。使用移液管装置(pipetman)通过流体剪切力打碎聚集体，并取样进行核计数。通过将200μg样本用0.1％龙胆紫/0.1mM柠檬酸溶液1∶1稀释使核可见。将溶胞产物在300xg离心以去除核并取等分试样供EIA测定。
对于生物反应器收获，通过吸液将培养液去除并用1倍生物反应器容积的PBS洗涤聚集体2次。然后向聚集体加1倍生物反应器容积的0.1％三硝基甲苯细胞溶解缓冲液并以流速约700ml/min依次通过一套1/16″，1/32″，和1/64″的孔板进行再循环。在再循环15-30分钟后，MCs(和小的1-3MC聚集体)可沉降并去除无MC溶胞产物。再加入生物反应器容积的0.1％三硝基甲基至MCs，通过各孔板再循环15-30分钟，并与第一次溶胞产物合并。将合并物取样进行核定量(见上面的步骤)，EIA，和HPSEC。在显微镜下观察微载体以确定细胞团的去除。
在两次用PBS以3倍于操作搅拌速度(75对25RPM)洗涤期间聚集体非常稳定。从小规模收获，我们确定聚集体即使在三硝基甲苯细胞溶胞缓冲液存在下聚集体也很难破碎。因此使用一系列孔板以模仿在小规模情况下移液管装置(pipetman)产生的流体剪切力。以流速约700ml/min每次洗涤约15分钟的再循环时间似乎足以产生足够的破碎。肉眼观察溶胞产物显示单MCs和核。本文报告的再循环时间可能不是最适的，但最适再循环易于通过常规实验基于本发明确立。此步骤的优越性在于它可使核释放用于在收获时进行细胞密度定量。单层培养溶胞产物和微载体溶胞产物间的主要不同在于需要滤出微载体和核，随后才能滤出小碎片用于通过0.2μm滤器。
                     实施例7提纯，(步骤6)
用于提纯按照上述过程生产的HAV的一些已知程序的任何一个可用于制备纯化的HAV。下面，我们提出一种可重复性提供高纯HAV的程序。
1.溶胞产物过滤/BENZONASE
约800ml溶胞产物通过Durapore 5μm滤纸过滤以去除核和MCs，随后通过0.2μm的滤器以去除小碎片。COSTAR CUBE溶胞产物只通过0.2μm滤器过滤；随后COSTAR CUBE和微载体溶胞产物进行同样处理。0.1％三硝基甲苯缓冲液用2M MgCl2补充至终浓度为2mM。BENZONASE，一种由Nycomed Pharma A/S(丹麦)作为重组蛋白生产的可商购核酸酶，(58μl/升溶胞产物)被加至每种溶胞产物并在室温搅拌下温育过夜。
2.捕获柱
约800ml BENZONASE处理的溶胞产物通过0.2μm的滤器过滤并通过重力(2米高度差)装载至含54ml Toyopearl 650M树脂的2.6cm直径捕获柱上。该柱用20柱体积的0.03M NaCl洗涤3次并将产物在～6ml/min梯度洗脱，使用分步变化至0.35M NaCl。
3.PEG沉淀和溶剂提取
在4℃保存过夜后，将洗脱的捕获柱产物(约30ml)与4.5％PEG和0.42M盐溶液在4-8℃温育以沉淀甲肝病毒并在1000xg离心。将沉淀物再悬浮于含有EDTA，(PNE)，磷酸缓冲盐溶液，和2份氯仿∶异戊醇24∶1混合物，手工振动3分钟，并在3000xg离心。将液相(～7ml)去除并用3.45ml PNE缓中液提取溶剂。将液相合并作为溶剂提取产物。
4.EIA HPSEC和SDS PAGE分析
在提纯过程中每一步的样本均进行EIA分析和HPSEC分析(Rainin HPLC系统，带有TSK-凝胶G4000PW排阻层析柱)。滤过的溶胞产物和核酸酶处理的溶胞产物在260nm处完成，而其它的则在214nm处完成。溶剂提取的产物的SDS PAGE分析是在12％凝胶上电泳。
                                表3
                           提纯EIA步骤产量
     步骤     全规模工艺   Cube#8溶胞产物     微载体溶胞产物#1                   #2                    #3
滤过的溶胞产物      88     99     84     78     80
核酸酶处理     100     89    100     88     91
捕获柱      62     60     55     73     72
PEG     108     82     88     84     88
溶剂提取      54     46*     64     72     77
总的Thru提取的      32     20     26     30     35
    *此产量的EIA数据得自1个月的样本
                                 表4
               提纯：通过HPSEC的相对甲型肝炎病毒面积％
  输入材料     PEG沉淀214nm，  面积％     AQX产物214nm，面积％   AQX产物BSA峰校正的214nm，面积％
Cube#8溶胞产物       35％       90％       98％
微载体#1       33％       55％       93％
微载体#2       41％       71％       98％
微载体#3       44％       73％       97％
产量平均批18-26 27.9％   SD3.5％ 68.3％     SD6.9％
提纯工作的目的是确定得自微载体的溶胞产物和得自单层细胞培养的溶胞产物之间的区别，以供进一步提纯。为了比较的目的，将1升得自COSTAR CUBE的溶胞产物与800ml微载体溶胞产物一起提纯。提纯通过溶剂提取进行，因为相当多的提纯都是通过这一点达到的并提供提纯效果的良好比较。而且在此规模下，通过其余过程的材料量是有限的。如图3所示，小规模工艺的EIA产量与全规模工艺的基本一致。另外，微载体来源的溶胞产物产量与生产性溶胞产物对照组非常一致。图10中提供的，用溶剂提取的产物进行的SDS PAGE银染清楚显示小规模COSTAR CUBE溶胞产物和3种微载体培养物的3条甲型肝炎病毒带。在约66000分子量处的另一条带在微载体的泳道中不显现。这对应于BSA(分子量66200)，并很可能是因为在收获期间为在添加至三硝基甲苯细胞溶胞缓冲液上前去除血清蛋白进行PBS洗涤不充分所致。COSTAR CUBE溶胞产物有2倍于通常在生产中所见的EIA测定的甲型肝炎病毒量，很可能是因为在取样前混合不充分所致。COSTARCUBE溶胞产物的高HAV含量在工艺中继续下去，因而带密度的不同部分是由于此，部分是由于MC培养物约50％的产量。
滤过的溶胞产物，核酸处理的溶胞产物，捕获产物，PEG沉淀，和溶剂提取物的HPSEC曲线显示于图11-15。注意在微载体和COSTAR CUBE溶胞产物间曲线非常相似，表明每种物质具有类似的提纯效果。在溶剂提取的曲线中，在HAV和溶剂峰间的额外的峰被认为是来自SDS PAGE凝胶的BSA带。PEG沉淀和溶剂提取产物(AQX)的相对％HAV面积在表4中提供。注意百分比按照与代表溶剂峰前所有峰的产量的同样方法计算。比较COSTAR CUBE#8溶胞产物与微载体溶胞产物，显示PEG产物相对一致而溶剂提取的产物具有较低的面积％。在微载体培养中的额外峰猜测为BSA。考虑到这一点。用肝病毒面积％的计算是通过减去猜测的BSA峰，以供比较。微载体和COSTAR CUBE#8溶胞产物的相对面积％极其相符，并在此点显示极纯的产物。比较COSTAR CUBE#8溶胞产物和生产性COSTAR CUBE平均值的相对面积显示PEG步骤稍低的全规模产量和溶剂提取步骤的更大下降。这提示全规模和小规模提纯具有不同之处。
                        实施例8在聚集的微载体系统中繁殖水痘病毒
下面描述用水痘病毒OKa株感染作为聚集体培养物生产的MRC-5细胞。按照实施例2中描述的在微载体旋转器系统中制备40g/升，60g/升或80g/升的solohill玻璃包被的微载体，并以实施例3中描述的类似方法用NUNC CELL FACTORIES中扩增的MRC-5细胞种植。以目标速度1，1.5，和2容积/日灌注细胞，增加的速度对应于较高的珠装载量。灌注操作与实施例4相似。细胞生长4至5天，然后用工作种(Working Seed)以感染比率为1个收获的工作种细胞对微载体培养物中15个靶细胞感染细胞。在感染时的细胞密度从2至4百万细胞/ml不等。工作种的制备是通过用贮存种以1∶125的MOI感染10层NUNCCELL FACTORY并在感染后48小时用胰蛋白酶消化。在30小时后开始每6小时收获1次感染的微载体样本，方法是倾析培养液，用磷酸缓冲盐溶液洗涤4次，然后再悬浮于稳定剂配方中。聚集体通过使用注射器针头产生的剪切力被打碎。在感染后约48小时，使用实施例6中描述的流体切应力方法学收获3个旋转器的全部容积。没有实施例6中描述的表面活性剂存在，聚集体更难以被打碎。因此，更需要增加通过孔板的线速度而增加流体切应力。
                       实施例9在聚集的微载体培养中繁殖流行性腮腺炎病毒
将原代或在单层培养物数次传代的冰冻保存的鸡胚成纤维细胞，在本实施例中传代两次，以约每株5-10个细胞加至不同材料上-在本实施例中为玻璃包被的塑料-(直径150-212μm，比重1.02)，在250mL玻璃旋转spinner器皿中40g/L。使用改良的培养液199或DMEM，补充以10％FBS培养细胞至最终密度高达4×106细胞/mL，每日更换培养液。在本系统中生长特征为当细胞密度增加时，微载体聚集得越来越大(2-50)，在此系统中证实可通过向此微载体培养物中加入流行性腮腺炎病毒种(Jeryl Lynn株)使流行性腮腺炎病毒感染和复制，以供疫苗生产。

Claims (15)

1.一种在聚体的微载体--细胞培养物中生产大量病毒的方法，它包含，维持细胞群于聚集的和附着的状态，使细胞不从微载体上脱落，甚至直至延长的感染期，以生产商业量的病毒疫苗抗原，它包括下列步骤：
a)通过水化，灭菌和平衡生物反应器中培养液中玻璃包被的微载体制备玻璃包被的微载体，适于培养对将被用作疫苗抗原的病毒的感染易感的细胞；
b)以足以获得细胞对微载体的一致附着以保证基本每个微载体至少附着一个细胞的浓度将细胞种植于适当的培养液中，使用等于临界离底悬浮速度(COBSR)的搅拌速度和允许有结构的聚集体形成的pH和温度；
c)培养此种植和附着的细胞至晚对数和早平台期，进行pH控制并充分补充培养液以提供足够的细胞营养，并控制聚集体大小和控制搅拌速度，使之慢至可允许有效的微载体--细胞聚集体形成，但快至可维持所有微载体的悬浮(即，COBSR)；
d)用病毒感染晚对数或早平台期的微载体--细胞聚集体，并使病毒生长足够长时间以在收获时获得最大病毒产量；
e)从聚集的微载体细胞培养物收获和回收病毒。
2.权利要求1，步骤(b)的方法，其中细胞以约5至10细胞/微载体种植。
3.权利要求1，步骤(a)的方法，其中微载体为SOLOHILL玻璃微载体。
4.权利要求1，步骤(b)的方法，其中细胞为人类二倍体肺成纤维细胞，Vero细胞，或鸡胚成纤维细胞。
5.权利要求4的方法，其中细胞为MRC-5细胞或WI38细胞。
6.权利要求1，步骤(d)的方法，其中病毒为甲型肝炎病毒，水痘病毒，麻疹病毒，流行性腮腺炎病毒，风疹病毒，脊髓灰质炎病毒，疱疹病毒，或轮状病毒。
7.权利要求6的方法，其中病毒为甲型肝炎病毒。
8.权利要求6的方法，其中细胞为MRC-5细胞且病毒为甲型肝炎病毒。
9.权利要求1的方法，其中步骤(e)的收获包含迫使聚集的微载体细胞培养物通过一系列直径减小的孔板，使最小的孔板仅为单个微载体尺寸的约2倍。
10.权利要求1的方法，其中步骤(e)的收获包含迫使聚集的微载体细胞培养物通过一系列直径减小的孔板，以获得约1010m/分至约2020m/分的线速度。
11.权利要求1的方法，其中用磷酸缓冲盐溶液对附着在微载体上的聚集的被感染细胞的洗涤不引起聚集体从微载体上脱落或破碎。
12.一种在聚集的微载体--细胞培养物中生产大量病毒的方法，它包括维持细胞群于聚集的和附着的状态，使细胞不从微载体上脱落，甚至直至延长的感染期，以生产商业量的病毒疫苗抗原。它包括下列步骤：
a)通过水化、灭菌和平衡生物反应器中培养液中玻璃包被的微载体，制备SOLOHILL玻璃包被的微载体，该生物反应器适于培养对将被用作疫苗抗原的甲型肝炎病毒的感染敏感的细胞；
b)以约5至10个细胞/微载体的种植浓度种植MRC-5细胞于适当的培养液中，获得细胞对微载体的一致附着，以保证基本每个微载体至少有一个细胞附着，使用等于临界离底悬浮速度(COBSR)的搅拌速度和允许有结构的聚集体形成的pH和温度；
c)培养此种植的和附着的细胞至晚对数和早平台期，进行pH控制和以约0.7至约2容积/日的速度进行培养基补充以提供足够的细胞营养和控制聚集体大小和控制搅拌速度，使之慢至允许足够的微载体--细胞聚集体形成，但快至足以维持所有的微载体的悬浮(即，COBSR)；
d)用甲型肝炎病毒感染晚对数或早平台期中的微载体细胞聚集体，并使病毒生长足够长的时间，以在收获时获得最大病毒产量；
e)从聚集的微载体细胞培养物收获病毒，该步骤是通过去除培养液并用含约0.1％TRITON X-100的收获缓冲液置换之，迫使聚集的微载体细胞培养物通过一系列直径逐渐减小的孔板，使最小的孔板约仅为单个微载体尺寸的5倍，或足以获得在约1010m/分和约2020m/分之间的线速度，并回收释放的甲型肝炎病毒。
13.SOLOHILL玻璃微载体在甲型肝炎病毒，水痘病毒，麻疹病毒，流行性腮腺炎病毒，风疹病毒，脊髓灰质炎病毒，疱疹病毒或轮状病毒的培养中之应用。
14.SOLOHILL玻璃微载体在甲型肝炎病毒的培养中之应用。
15.一种聚集的微载体细胞培养物，其中聚集体具有约50-60％的空腔。
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