CN102058882B - 一种制备甲型肝炎灭活疫苗的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种制备甲型肝炎灭活疫苗的方法，其是将甲肝病毒株SH与人胚肺二倍体细胞MRC-5混合吸附后接种到细胞工厂增殖甲肝病毒，至病毒增殖高峰期，用胰酶消化细胞，收获细胞病毒液，经超声破碎，氯仿抽提，超滤膜超滤，去除细胞杂蛋白，再经凝胶过滤层析纯化，除菌过滤，氢氧化铝佐剂吸附，制成甲型肝炎灭活疫苗。采用本发明方法制备的甲型肝炎灭活疫苗经小鼠体内效力试验结果表明，ED₅₀高于参比苗，其免疫原性优于参比苗。本发明方法可以提高疫苗安全性，简化工艺，缩短生产周期，降低生产成本，实现甲型肝炎灭活疫苗的规模化生产。

Description

一种制备甲型肝炎灭活疫苗的方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地说，涉及一种制备甲型肝炎灭活疫苗的新方法。

背景技术

甲型肝炎，简称甲肝，是由甲型肝炎病毒引起的一种严重危害人类健康的急性传染病。甲肝主要通过“粪-口”途径传播，或个人间的传播，或因污染了甲肝病毒的水或者食物从而引起甲肝爆发。大龄儿童和成人感染甲肝后，70％以上为临床型感染，病死率为0.3％～0.6％；50岁以上患者的病死率为1.8％；慢性肝病者感染甲肝后，发生急性肝衰竭的危险性升高。随着生活条件的改善，成年人感染甲肝人数有增多趋势，临床型甲肝比例上升，从而甲肝成为较严重的公共卫生问题。

我国是甲型肝炎高发区，每年至少有24万人患甲型肝炎，造成巨大的经济损失和社会危害，接种甲型肝炎疫苗是预防甲型肝炎流行的最有效措施。

目前世界上有两种预防控制甲肝的疫苗，一种是甲肝减毒活疫苗，甲肝减毒活疫苗如L-A-1株已用于规模生产近20年，在预防控制甲肝的爆发和流行、降低发病率方面起到了巨大作用，但减毒活疫苗存在毒力返祖，对一些免疫缺陷个体可能诱发严重疾病等缺点；另一种是甲肝灭活疫苗，甲肝灭活疫苗具有安全性好、免疫后抗体水平高、效期长、稳定性好的优点。

目前国内生产的甲型肝炎灭活疫苗，由于各生产厂家使用的毒株、细胞基质和生产工艺不同，产品质量参差不齐。我国人口众多，甲肝疫苗远不能满足国内市场需求。

发明内容

本发明的目的是提供一种制备甲型肝炎灭活疫苗的新方法。

为了实现本发明目的，本发明的一种制备甲型肝炎灭活疫苗的方法，其是将甲肝病毒与人胚肺二倍体细胞MRC-5混合吸附后接种到细胞工厂增殖甲肝病毒，至病毒增殖高峰期，用胰酶消化细胞，收获细胞病毒液，经超声破碎，氯仿抽提，超滤膜超滤，去除细胞杂蛋白，然后经过凝胶过滤层析纯化，除菌过滤，氢氧化铝佐剂吸附，制成甲型肝炎灭活疫苗。

本发明的目的还可以采用以下的技术措施来进一步实现。

本发明的一种制备甲型肝炎灭活疫苗的方法，包括如下步骤：

1)按常规方法培养人胚肺二倍体细胞MRC-5，长成单层后将细胞基质用胰酶消化分散为单个细胞，加入含10％小牛血清的MEM细胞培养液使细胞浓度为每毫升含100-150万个细胞，细胞液按0.05-0.1MOI加入甲肝病毒，在20-30℃温度下进行混合吸附30-90分钟；

其中，所述MEM为0.03％Glu、0.08％NaHCO₃、0.01％青霉素和0.01％链霉素。

2)将混合吸附的细胞-病毒混合液用含10v/v％小牛血清的MEM细胞培养液稀释10倍后按0.5MOI接种于2-40层细胞工厂增殖甲肝病毒；培养温度为34-35℃，培养时间为21-24天。

3)病毒增殖高峰期，用0.125w/v％胰酶常规消化细胞，以每平方厘米面积加入20μl 0.01M pH值7.2的PBS收集细胞病毒混合液。

4)超声破碎细胞病毒混合液，超声破碎的输出功率为1500W，每次在冰浴中超声5分钟破碎细胞，共超声4～6次，使破碎率达98％以上。

5)离心步骤4)得到的混合液，取上清加入氯仿抽提，离心后取上层水相，得到粗制甲肝病毒液。其中，抽提为按三氯甲烷与病毒液1∶2的体积比混合，振摇20分钟，以每分钟4500转的速度离心20分钟，吸取上层水相。蛋白相再用抽提缓冲液(0.01M PBS，pH7.4)抽提4次，抽提4次即能将大部分病毒回收，合并上层水相。

6)将步骤5)制得的粗制甲肝病毒液经超滤膜超滤浓缩，所用超滤膜的分子量为50-100KD。

7)浓缩的病毒液经凝胶层析纯化后，经0.2μm滤膜除菌过滤，滤液用甲醛灭活。其中，凝胶层析所用层析柱为Phenyl Sepharose 6FF。

8)灭活后的病毒液经氢氧化铝佐剂吸附，制成甲型肝炎灭活疫苗。

前述的方法，其中所用甲肝病毒毒种为甲肝病毒株SH，该毒株分离自甲型肝炎急性期患者粪便，经MRC-5细胞适应，命名为SH毒株，现已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区大屯路中科院微生物研究所，保藏编号CGMCCNO.4501，保藏日期2010年12月21日。

优选地，步骤1)所述的混合吸附为将长成单层的二倍体细胞弃去细胞生长液，用0.01mol/L PBS(pH6.8)洗细胞面3次，加入0.125w/v％胰酶-EDTA消化细胞，加入MEM细胞培养液使细胞浓度为每毫升含100-150万个细胞，细胞液按0.05-0.1MOI加入甲肝病毒在20-30℃温度下进行混合吸附30-90分钟。

优选地，步骤2)所述的培养为多层细胞工厂培养，培养温度为34-35℃，培养时间为21-24天，期间每7天更换细胞维持液一次，细胞维持液为MEM细胞培养液加2v/v％的小牛血清。

细胞工厂是丹麦NUNC公司出品的CELL FACTORIES或美国CORNING公司出品的Cell STACK，译成中文为细胞工厂或细胞培养室，其培养原理相同，外观尺寸略有不同。细胞工厂可有效节省空间和培养液，保证操作的无菌性。

采用本发明方法制得的甲型肝炎灭活疫苗，其灭活甲型肝炎病毒抗原浓度为640～800EU/ml。经小鼠体内效力试验结果表明，EID50高于参比苗，其免疫原性优于参比苗。

本发明采用的新分离的产毒量高、培养周期短、人胚肺二倍体细胞适应良好的甲型肝炎病毒毒株SH，可有效提高病毒产率，且安全性更好；采用细胞-病毒混合吸附技术，提高了病毒产量，缩短了病毒增殖周期；使用细胞工厂培养细胞，有效利用了空间，节省了厂房面积，提高了疫苗生产能力；经氯仿抽提、超滤膜超滤浓缩，可有效去除杂蛋白，再经凝胶过滤层析纯化，可得到高纯度甲型肝炎病毒灭活疫苗。

本发明的方法可以提高疫苗安全性，提高疫苗产量，简化工艺，缩短生产周期，降低生产成本，实现甲型肝炎灭活疫苗的规模化生产。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

以下实施例中采用的细胞工厂是美国CORNING公司出品的CellSTACK。

实施例1

取长满单层的细胞工厂培养的人胚肺二倍体细胞(MRC-5)，经0.125w/v％胰蛋白酶-EDTA消化细胞，加入含10％小牛血清的MEM细胞培养液。其中，所述MEM为0.03％Glu、0.08％NaHCO₃、0.01％青霉素和0.01％链霉素。MEM购自北京清大天一生物技术有限公司，生产批号：080302。

使细胞浓度为每毫升含100-150万个细胞，细胞液按0.05-0.1MOI加入甲肝病毒在20-30℃温度下进行混合吸附30-90分钟。将混合吸附的细胞-病毒混合液用含10％小牛血清的MEM细胞培养液稀释10倍后按0.5MOI接种于2-40层细胞工厂增值甲肝病毒，置35℃±0.5℃静置培养21-24天，期间每隔7天换1次细胞维持液(细胞维持液为MEM细胞培养液加2％的小牛血清)。待病毒增殖高峰期，用0.125w/v％的胰酶常规消化细胞，以每平方厘米面积加入20μl 0.01M pH值7.2的PBS收集细胞病毒混合液。超声破碎细胞病毒混合液，超声破碎为输出功率1500W，每次在冰浴中超声5分钟破碎细胞，共超声5次。破碎后2000rpm离心10分钟取上清病毒液，病毒液加入氯仿抽提，按三氯甲烷与病毒液1∶2的体积比混合，振摇20分钟，以每分钟4500转的速度离心20分钟，吸取上层水相；蛋白相再用抽提缓冲液(0.01M PBS，pH7.4)抽提4次，抽提4次即能将大部分病毒回收，合并上层水相。抽提液经截留分子量为50-100KD的超滤膜超滤浓缩10-40倍后用Phenyl Sepharose 6FF疏水凝胶层析柱纯化，用0.9mol/L PB(pH6.8)作为上样缓冲液，用0.01mol/L PBS(pH6.8)作为梯度洗脱液，收集病毒洗脱峰，为纯化的甲肝病毒液，再经0.2μm滤膜除菌过滤，在无菌条件下加入终浓度为80μg/ml的甲醛37℃灭活12天。灭活的甲肝病毒液经进一步检验合格后，根据病毒抗原性滴度水平稀释至1280EU/ml，经氢氧化铝佐剂吸附制成半成品，将半成品分装于无菌的西林瓶中，制成成品疫苗。

本发明制备的甲型肝炎灭活疫苗经无菌试验、异常毒性试验、pH值等检验后，各项指标均达到合格标准，氢氧化铝吸附后甲肝病毒无解离，体外相对效力达到1.12，检验结果如表1所示。

表1  实施例1制备的甲型肝炎灭活疫苗检验结果

实施例2

取长满单层的细胞工厂培养的人胚肺二倍体细胞(MRC-5)，经0.125w/v％胰蛋白酶-EDTA消化细胞，加入含10％小牛血清的MEM细胞培养液。其中，所述MEM为0.03％Glu、0.08％NaHCO₃、0.01％青霉素和0.01％链霉素。MEM购自北京清大天一生物技术有限公司，生产批号：080302。

使细胞浓度为每毫升含100-150万个细胞，细胞液按0.05-0.1MOI加入甲肝病毒在20-30℃温度下进行混合吸附30-90分钟。将混合吸附的细胞-病毒混合液用含10％小牛血清的MEM细胞培养液稀释10倍后按0.5MOI接种于2-40层细胞工厂增值甲肝病毒，置35℃±0.5℃静置培养21-24天，期间每隔7天换1次细胞维持液(细胞维持液为MEM细胞培养液加2v/v％的小牛血清)。待病毒增殖高峰期，用0.125w/v％的胰酶常规消化细胞，以每平方厘米面积加入20μl 0.01M pH值7.2的PBS收集细胞病毒混合液。超声破碎细胞病毒混合液，超声破碎为输出功率1500W，每次在冰浴中超声5分钟破碎细胞，共超声5次。破碎后2000rpm离心10分钟取上清病毒液，病毒液加入氯仿抽提，按三氯甲烷与病毒液1∶2的体积比混合，振摇20分钟，以每分钟4500转的速度离心20分钟，吸取上层水相；蛋白相再用抽提缓冲液(0.01M PBS，pH7.4)抽提4次，抽提4次即能将大部分病毒回收，合并上层水相。抽提液经截留分子量为50-100KD的超滤膜超滤浓缩10-40倍后用Phenyl Sepharose 6FF疏水凝胶层析柱纯化，用0.9mol/L PB(pH6.8)作为上样缓冲液，用0.01mol/L PBS(pH6.8)作为梯度洗脱液，收集病毒洗脱峰，为纯化的甲肝病毒液，再经0.2μm滤膜除菌过滤，在无菌条件下加入终浓度为80μg/ml的甲醛37℃灭活12天。灭活的甲肝病毒液经进一步检验合格后，根据病毒抗原性滴度水平稀释至640EU/ml，经氢氧化铝佐剂吸附制成半成品，将半成品分装于无菌的西林瓶中，制成成品疫苗。

本发明制备的甲型肝炎灭活疫苗经无菌试验、异常毒性试验、pH值等检验后，各项指标均达到合格标准。检验结果如表2所示。

表2  实施例2制备的甲型肝炎灭活疫苗检验结果

实验例3

将本发明实施例1、实施例2制得的甲型肝炎疫苗进行小鼠体内效力试验，计算终点稀释度，观察其免疫原性。

km小鼠(购自中国军事医学科学院病原微生物所)，雌雄各半，体重16-18g，随机分组。试验分为12组，每组10只，试验苗8组：分别注射实施例1和实施例2制备的疫苗；参比苗组：国外甲型肝炎灭活疫苗(购自北京军区疾病预防控制中心，爱巴苏：产品批号：3001424.02)。用疫苗稀释剂将试验苗和参比苗进行4倍系列稀释，共4个稀释度原倍、1∶4、1∶16、1∶64。每只小鼠腹腔注射1.0ml，免疫4周后，眼内眦采血，离心分离血清，-20℃保存备用。采用ELISA竞争抑制法检测抗HAV抗体，按照Reed-Muench法计算终点稀释度。结果如表3所示。

表3  本发明的甲肝灭活疫苗小鼠效力试验结果

从表3可以看出，采用本发明方法制得的甲型肝炎灭活疫苗，其免疫原性优于对照疫苗，且该疫苗具有安全性好、免疫后抗体水平高、效期长、稳定性好的优点。可进行大规模生产，以满足国内市场对甲肝疫苗的需求。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (6)

1.一种制备甲型肝炎灭活疫苗的方法，其特征在于，将甲肝病毒与人胚肺二倍体细胞MRC-5混合吸附后接种到细胞工厂增殖甲肝病毒，至病毒增殖高峰期，用胰酶消化细胞，收获细胞病毒液，经超声破碎，氯仿抽提，超滤膜超滤，去除细胞杂蛋白，然后经过凝胶过滤层析纯化，除菌过滤，氢氧化铝佐剂吸附，制成甲型肝炎灭活疫苗；

所用甲肝病毒毒种为甲肝病毒株SH，保藏号为CGMCC NO.4501。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)按常规方法培养人胚肺二倍体细胞MRC-5，长成单层后将细胞基质用胰酶消化分散为单个细胞，加入含10％小牛血清的MEM细胞培养液使细胞浓度为每毫升含100-150万个细胞，细胞液按0.05-0.1MOI加入甲肝病毒，在20-30℃温度下进行混合吸附30-90分钟；

其中，所述MEM含有0.03％Glu、0.08％NaHCO₃、0.01％青霉素和0.01％链霉素；

2)将混合吸附的细胞-病毒混合液用含10v/v％小牛血清的MEM细胞培养液稀释10倍后按0.5MOI接种于2-40层细胞工厂增殖甲肝病毒；

3)病毒增殖高峰期，用0.125w/v％胰酶常规消化细胞，以每平方厘米面积加入20μl 0.01M pH值7.2的PBS收集细胞病毒混合液；

4)超声破碎细胞病毒混合液；

5)离心步骤4)得到的混合液，取上清加入氯仿抽提，离心后取上层水相，得到粗制甲肝病毒液；

6)将步骤5)制得的粗制甲肝病毒液经超滤膜超滤浓缩；

7)浓缩的病毒液经凝胶层析纯化后，经0.2μm滤膜除菌过滤，滤液用甲醛灭活；

其中，凝胶层析所用层析柱为Phenyl Sepharose 6FF；

8)灭活后的病毒液经氢氧化铝佐剂吸附，制成甲型肝炎灭活疫苗。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤2)培养温度为34-35℃，培养时间为21-24天。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤4)的超声破碎，其输出功率为1500W，每次在冰浴中超声5分钟破碎细胞，共超声4～6次。

5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤5)的氯仿抽提为按三氯甲烷与病毒液1∶2的体积比混合，振摇20分钟，以每分钟4500转的速度离心20分钟，吸取上层水相。

6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤6)采用的超滤膜，其截留的分子量为50-100KD。