CN102988975A - 甲型、乙型肝炎联合疫苗及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种甲型、乙型肝炎联合疫苗，包括有甲型肝炎病毒抗原和乙型肝炎病毒表面抗原蛋白，其中，所述甲型肝炎病毒抗原为甲型肝炎病毒经人胚肺二倍体细胞培养收获并纯化的甲型肝炎病毒抗原，其含量为630～660EU/ml，所述乙型肝炎病毒表面抗原蛋白含量为重组酿酒酵母发酵表达并纯化的乙型肝炎病毒表面抗原蛋白，其含量为15～30μg/ml。本发明可减少频繁的接种次数和漏种的机会，提高接种成功率，降低接种成本，为控制这两种肝炎的感染和流行提供了更为有效的途径，且具有良好的安全性、免疫原性和稳定性。

Description

甲型、乙型肝炎联合疫苗及其制备方法

技术领域

本发明涉及肝炎疫苗领域，尤其涉及一种甲型、乙型肝炎联合疫苗及其制备方法。 

背景技术

病毒性肝炎是由多种肝炎病毒引起的以肝脏损害为主的全身性急性或持续性传染病，在世界各地均有发病流行。在肝炎患者中30-50％属于甲型肝炎(简称甲肝)。甲肝是一种自限性疾病，但极易引起爆发流行，与当地社会、经济状况和卫生水平密切相关。全世界每年报道甲肝病例约140万，事实上，这个数值可能还要高出3-10倍；而乙型肝炎(简称乙肝)已有超过1/3的世界人口被感染。乙肝是乙肝病毒引起的疾病，在世界各国均有流行，我国属高流行区。WHO估计全世界约有36亿乙肝携带者，每年约有100万死于与之有关的慢性复杂性疾病和急性爆发死亡^[1]。尽管甲肝和乙肝的传播途径不一样，但大量报道，住院的肝炎患者有相当一部分同时感染甲肝和乙肝。由于甲肝和乙肝疫苗的使用，这两种肝炎的感染和流行得到了有效的控制。 

然而，随着国家扩大免疫计划，疫苗种类越来越多，免疫次数不断增多，免疫程序复杂，免疫成本也不断提高，也增加了漏种的机会。 

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：提供一种甲型、乙型肝炎联合疫苗，该疫苗可减少频繁的接种次数和漏种的机会，提高接种成功率，降低接种成本，为控制这两种肝炎的感染和流行提供了更为有效的途径，且具有良好的安全性、免疫原性和稳定性。 

本发明进一步所要解决的技术问题是：提供一种甲型、乙型肝炎联合疫苗的制备方法，该方法稳定可行，制备的联合疫苗具有良好的安全性、免疫原性和稳定性。 

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案： 

一种甲型、乙型肝炎联合疫苗，包括有甲型肝炎病毒抗原和乙型肝炎病 毒表面抗原蛋白，其中，所述甲型肝炎病毒抗原为甲型肝炎病毒经人胚肺二倍体细胞培养收获并纯化的甲型肝炎病毒抗原，其含量为630～660EU/ml，所述乙型肝炎病毒表面抗原蛋白含量为重组酿酒酵母发酵表达并纯化的乙型肝炎病毒表面抗原蛋白，其含量为15～30μg/ml。 

优选地，还包括有免疫铝佐剂，其含量为0.35～0.62mg/ml。 

优选地，所述甲型肝炎病毒抗原含量为640EU/ml。 

优选地，所述乙型肝炎病毒表面抗原蛋白含量为20μg/ml。 

优选地，所述的甲型肝炎病毒毒株为自分离的SH株。 

优选地，所述的重组酿酒酵母菌种为美国默克公司以DNA重组技术构建的表达HBsAg的重组酿酒酵母。 

相应地，本发明还公开了一种甲型、乙型肝炎联合疫苗的制备方法，该方法包括以下步骤： 

甲型肝炎病毒抗原制备步骤，将甲型肝炎病毒经人胚肺二倍体细胞培养收获并纯化，得到甲型肝炎病毒抗原； 

乙型肝炎病毒表面抗原蛋白制备步骤，将重组酿酒酵母发酵表达并纯化，乙型肝炎病毒表面抗原蛋白； 

混合步骤，将所述甲型肝炎病毒抗原和乙型肝炎病毒表面抗原蛋白混合，调节pH值至6.0～7.0之间，制成甲型、乙型肝炎联合疫苗。 

优选地，所述甲型肝炎病毒抗原制备步骤具体包括： 

甲肝病毒原液制备步骤，将甲型肝炎病毒毒株SH与人胚肺二倍体细胞混合吸附后接种至细胞工厂，于34-35℃下培养，至病毒增殖高峰期后，用胰酶消化含甲肝病毒的细胞，收获细胞病毒液，经超声破碎，氯仿抽提，超滤膜超滤，去除细胞杂蛋白，再经凝胶层析纯化，按抗原含量用磷酸盐缓冲液稀释至抗原含量不低于3200EU/ml后，过滤除菌，甲醛灭活，即得甲肝病毒原液； 

甲型肝炎病毒抗原铝吸附产物制备步骤，将灭活后的甲肝病毒原液加入硫酸钾铝溶液吸附18-24小时后，用无菌生理盐水洗涤，去上清液后，用生理盐水稀释至抗原含量不低于3200EU/ml，制成甲肝病毒抗原铝吸附产物； 

优选地，所述乙型肝炎病毒表面抗原蛋白制备步骤具体包括： 

乙肝病毒表面抗原蛋白原液制备步骤，将美国默克公司以DNA重组技术 构建的表达HBsAg的重组酿酒酵母工作种子批菌种经锥形瓶、种子罐、生产罐进行发酵培养，收获酵母菌，经高压匀浆器破碎酵母菌，滤膜过滤除去酵母菌碎片，以硅胶吸附法粗提HBsAg，疏水色谱法纯化HBsAg，用硫氰酸盐处理，按蛋白浓度用磷酸盐缓冲液稀释至抗原蛋白浓度为600-800EU/ml，除菌过滤后即为原液； 

原液中加入终浓度为100μg/ml甲醛，在34-38℃保温72-96小时灭活，灭活后蛋白质和铝剂按1μg蛋白质加入3.86mg的比例混合，置2-8℃吸附沉降18-24小时，用无菌生理盐水洗涤，去上清液后再恢复至原体积，制成HBsAg吸附产物； 

优选地，所述混合步骤具体包括： 

将甲肝病毒抗原铝吸附产物与HBsAg吸附产物等比例混合后，用0.1mol/L的HCl调节pH值至6.0～7.0之间，制成甲型、乙型肝炎联合疫苗，其中含甲肝病毒抗原640EU/ml，HBsAg为20μg/ml。 

本发明的有益效果是： 

本发明的实施例通过将以甲型肝炎病毒毒株SH株经人胚肺二倍体细胞培养得到的甲型肝炎病毒抗原和以重组酿酒酵母发酵表达的乙型肝炎病毒表面抗原蛋白混合，制成甲型、乙型肝炎联合疫苗，从而减少了频繁的接种次数和漏种的机会，提高了接种成功率，降低了接种成本，为控制这两种肝炎的感染和流行提供了更为有效的途径，且具有良好的安全性、免疫原性和稳定性。 

具体实施方式

下面详细描述本发明提供的甲型、乙型肝炎联合疫苗的实施例。 

实施例1 

本实施例主要包括有甲型肝炎病毒抗原和乙型肝炎病毒表面抗原蛋白，其中，所述甲型肝炎病毒抗原为甲型肝炎病毒经人胚肺二倍体细胞培养收获并纯化的甲型肝炎病毒抗原，其含量为630～660EU/ml，所述乙型肝炎病毒表面抗原蛋白含量为重组酿酒酵母发酵表达并纯化的乙型肝炎病毒表面抗原蛋白，其含量为15～30μg/ml。 

另外，本实施例还可包括有免疫铝佐剂，免疫铝佐剂的含量为0.35～0.62mg/ml。 

实施例2 

本实施例主要包括有甲型肝炎病毒抗原和乙型肝炎病毒表面抗原蛋白，其中，所述甲型肝炎病毒抗原为甲型肝炎病毒经人胚肺二倍体细胞培养收获并纯化的甲型肝炎病毒抗原，其含量为640EU/ml，所述乙型肝炎病毒表面抗原蛋白含量为重组酿酒酵母发酵表达并纯化的乙型肝炎病毒表面抗原蛋白，其含量为20μg/ml，免疫铝佐剂的含量为0.35～0.62mg/ml。 

具体实现时，本实施例采用的甲型肝炎病毒毒株SH株，为本公司新分离的产毒量高、培养周期短、人胚肺二倍体细胞适应良好的毒株，可有效提高病毒产率，且安全性更好；采用细胞-病毒混合吸附技术以大大提高了病毒产量，缩短病毒培养周期，以及细胞工厂培养细胞技术，有效利用空间，节省厂房面积，提高疫苗生产能力。 

本实施例采用的菌种为美国默克公司以DNA重组技术构建的表达HBsAg的重组酿酒酵母。重组乙型肝炎疫苗的整套生产工艺为深圳康泰生物制品股份有限公司从国际著名制药公司默克(默沙东)公司引进，自1994年投产以来，累计销售2亿多人份，安全性和有效性得到了极高的评价，这为甲型、乙型肝炎联合疫苗的研制提供了有力的技术支持与可靠的单价疫苗保障供应。 

下面详细描述本发明提供的甲型、乙型肝炎联合疫苗的实施例。 

实施例3 

本实施例主要包括以下步骤： 

甲型肝炎病毒抗原制备步骤，将甲型肝炎病毒经人胚肺二倍体细胞培养收获并纯化，得到甲型肝炎病毒抗原； 

乙型肝炎病毒表面抗原蛋白制备步骤，将重组酿酒酵母发酵表达并纯化，乙型肝炎病毒表面抗原蛋白； 

混合步骤，将所述甲型肝炎病毒抗原和乙型肝炎病毒表面抗原蛋白混合，调节pH值至6.0～7.0之间，制成甲型、乙型肝炎联合疫苗。 

实施例4 

本实施例主要包括： 

甲型肝炎病毒抗原制备步骤，具体包括： 

甲肝病毒原液制备步骤，将甲型肝炎病毒毒株SH与人胚肺二倍体细胞混合吸附后接种至细胞工厂，于34-35℃下培养，至病毒增殖高峰期后，用胰酶消化含甲肝病毒的细胞，收获细胞病毒液，经超声破碎，氯仿抽提，超滤膜超滤，去除细胞杂蛋白，再经凝胶层析纯化，按抗原含量用磷酸盐缓冲液稀释至抗原含量不低于3200EU/ml后，过滤除菌，甲醛灭活，即得甲肝病毒原液； 

甲型肝炎病毒抗原铝吸附产物制备步骤，将灭活后的甲肝病毒原液加入硫酸钾铝溶液吸附18-24小时后，用无菌生理盐水洗涤，去上清液后，用生理盐水稀释至抗原含量不低于3200EU/ml，制成甲肝病毒抗原铝吸附产物。 

乙型肝炎病毒表面抗原蛋白制备步骤，具体包括： 

乙肝病毒表面抗原蛋白将美国默克公司以DNA重组技术构建的表达HBsAg的重组酿酒酵母工作种子批菌种经锥形瓶、种子罐、生产罐进行发酵培养，收获酵母菌，经高压匀浆器破碎酵母菌，滤膜过滤除去酵母菌碎片，以硅胶吸附法粗提HBsAg，疏水色谱法纯化HBsAg，用硫氰酸盐处理，按蛋白浓度用磷酸盐缓冲液稀释至抗原蛋白浓度为600-800EU/ml，除菌过滤后即为原液； 

HBsAg吸附产物制备步骤，在原液中加入终浓度为100μg/ml甲醛，在34-38℃保温72-96小时灭活，灭活后蛋白质和铝剂按1μg蛋白质加入3.86mg的比例混合，置2-8℃吸附沉降18-24小时，用无菌生理盐水洗涤，去上清液后再恢复至原体积，制成HBsAg吸附产物。 

混合步骤，具体包括： 

将甲肝病毒抗原铝吸附产物与HBsAg吸附产物等比例混合后，用0.1mol/L的HCl调节pH值至6.0～7.0之间，制成甲型、乙型肝炎联合疫苗，其中含甲肝病毒抗原640EU/ml，HBsAg为20μg/ml。 

具体实现时，本实施例采用的甲型肝炎病毒毒株SH株，为本公司新分离的产毒量高、培养周期短、人胚肺二倍体细胞适应良好的毒株，可有效提高病毒产率，且安全性更好；采用细胞-病毒混合吸附技术以大大提高了病毒产量，缩短病毒培养周期，以及细胞工厂培养细胞技术，有效利用空间，节省厂房面积，提高疫苗生产能力。 

本实施例采用的菌种为美国默克公司以DNA重组技术构建的表达HBsAg的重组酿酒酵母。重组乙型肝炎疫苗的整套生产工艺为深圳康泰生物制品股份有限公司从国际著名制药公司默克(默沙东)公司引进，自1994年投产以来，累计销售2亿多人份，安全性和有效性得到了极高的评价，这为甲型、乙型肝炎联合疫苗的研制提供了有力的技术支持与可靠的单价疫苗保障供应。 

实施例5 

本实施例主要包括以下步骤： 

按常规方法培养人胚肺二倍体细胞，长成单层后用0.125％胰酶消化分散，加入含10％小牛血清的MEM培养液得细胞悬液，按0.05-0.1MOL加入甲肝病毒，在20-30℃混合吸附30-90分钟后，将混合吸附的细胞病毒混合液用含10％小牛血清的MEM培养液稀释10倍后按0.5MOI接种于2-40层细胞工厂，34-35℃培养21-24天。至病毒增殖高峰期，用0.125％胰酶消化含甲肝病毒的细胞，收获细胞病毒液，超声破碎得混合液，取上清加入氯仿抽提，离心后取上清水相得到粗制的甲肝病毒液。超滤膜超滤浓缩，去除细胞杂蛋白。再经凝胶层析纯化，得病毒层析液。按抗原含量用磷酸盐缓冲液稀释至抗原含量不低于3200EU/ml后，经0.2μm滤膜过滤除菌，加入终浓度为80μg/ml的甲醛37℃灭活12天灭活，即得甲肝病毒原液。将灭活后的原液加入硫酸钾铝溶液吸附18-24小时，用无菌生理盐水洗涤，去上清液后再用生理盐水稀释至终抗原含量为1280EU/ml，制成甲肝病毒抗原铝吸附产物。 

取美国默克公司以DNA重组技术构建的表达HBsAg的重组酿酒酵母工作种子批菌种经0.25L锥形瓶27-29℃药瓶培养17-19小时、2L锥形瓶27-29℃药瓶培养17-19小时、70L种子罐27-29℃发酵培养16-22小时、800L生产罐27-29℃发酵培养44-48小时，收获酵母菌。经高压匀浆器破碎酵母菌后，加入加入等体积含Triton X-100的磷酸盐缓冲液，在加入的过程中边用滤膜过滤除去酵母菌碎片，抽提HBsAg。按每克蛋白质加入1.43g硅胶比例加入硅胶吸附，离心弃去上清，硅胶沉淀用磷酸盐缓冲液悬浮，粗提得HBsAg，疏水色谱法纯化HBsAg，用硫氰酸盐处理，用磷酸盐缓冲液稀释，除菌过滤后即为原液。原液中按一定比例加入终浓度为100μg/ml甲醛，34-38℃保温72-96小时灭活。灭活后蛋白质液中加入硫酸钾铝溶液吸附18-24小时，用无 菌生理盐水洗涤，去上清液后再恢复至原体积，制成HBsAg吸附产物。 

将甲肝病毒抗原铝吸附产物与HBsAg吸附产物等比例混合后，用0.1mol/L的HCl调节pH值至6.0～7.0之间，制成甲型、乙型肝炎联合疫苗，其中含甲肝病毒抗原640EU/ml，HBsAg为20μg/ml。 

与现有技术相比，本发明具有以下优点： 

联合疫苗以及用于制备此疫苗的甲肝病毒抗原铝吸附产物和HBsAg吸附产物，理化性质稳定，且两种吸附产物几乎完全吸附，它们之间未发生干扰，体外效力与单价疫苗相当。结果见表1，2，3，4。 

表1甲肝病毒抗原铝吸附产物检定结果 

表2HBsAg吸附产物检定结果 

表3甲型、乙型肝炎联合疫苗检定结果 

(2)联合疫苗的安全性良好。取20120302A批联合疫苗分别做豚鼠全身过敏性试验和家兔刺激性试验。过敏性试验结果表明，联合疫苗低剂量组动物、高剂量组动物以及对照组动物均未出现与给药相关的异常症状。初次致敏、末次致敏和激发当日雌雄动物体重与阴性对照组比较均无统计学差异，见表4。而且联合疫苗低剂量组、高剂量组动物在激发后即刻至观察结束未见过敏反应症状，即肌肉注射联合疫苗不会引起豚鼠发生全身主动过敏反应。刺激 性试验结果则显示，6只受试动物在给药及恢复期期间饮水、摄食正常，体重增长，健康状况良好。肉眼观察，实验动物的左侧给药侧和右侧对照侧肌肉组织均未见任何刺激反应症状，刺激反应评分为0分。病理检查结果表明，家兔肌肉注射给予联合疫苗，对注射部位肌肉组织有轻微刺激性。同时按照生物制品规程，取6批联合疫苗接种小鼠和豚鼠做异常毒性试验，在7天的观察期内，小鼠和豚鼠全部健存，体重增加，无任何异常反应，符合规程要求，结果见表5，6。 

表4豚鼠注射联合疫苗全身主动过敏试验豚鼠体重(g，((X±s，n＝3) 

表5甲型、乙型肝炎联合疫苗异常毒性试验小鼠试验结果 

表6甲型、乙型肝炎联合疫苗异常毒性试验小鼠试验结果 

(3)联合疫苗的免疫原性良好。采用小鼠ED50测定法，将联合疫苗做4倍递增稀释，分别以原倍、4倍、16倍和64倍稀释样免疫15～20gICR品系SPF级小鼠，每组注射10只小鼠，每只小鼠腹腔注射注射1ml，于免疫后28天尾动脉采血，分离血清检测抗-HAV和抗-HBs。在实验期间，未见小鼠有异常反应，28天时测定ED50，结果见表7。 

表7甲型、乙型肝炎联合疫苗体内免疫原性测定结果 

联合疫苗的稳定性良好。联合疫苗在3个月的2～8℃长期稳定性试验中，各批次疫苗甲肝和乙肝体外效力分别在初始值的87～97％和82～107％之间波动，略有下降，但均符合要求，结果见表8。37℃4周热加速稳定性试验中，在3周时甲肝体外相对效力测定值在0.80～0.87之间，乙肝体外相对效力测定值在0.52～0.55之间，均高于合格标准，甲肝体外相对效力(RP)平均失活速率为-0.1369周-1，乙肝体外相对效力(RP)平均失活速率为-0.2048周-1，根据37℃1天相当于1.7个月的原则，可初步推算出疫苗的效期在36 个月以上，具有很好的稳定性，结果见表9。 

表8甲型、乙型肝炎联合疫苗2～8℃3个月长期稳定性试验结果 

表9甲型、乙型肝炎联合疫苗37℃热加速稳定性试验结果 

以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。 

Claims (10)

1.一种甲型、乙型肝炎联合疫苗，其特征在于：包括有甲型肝炎病毒抗原和乙型肝炎病毒表面抗原蛋白，其中，所述甲型肝炎病毒抗原为甲型肝炎病毒经人胚肺二倍体细胞培养收获并纯化的甲型肝炎病毒抗原，其含量为630～660EU/ml，所述乙型肝炎病毒表面抗原蛋白含量为重组酿酒酵母发酵表达并纯化的乙型肝炎病毒表面抗原蛋白，其含量为15～30μg/ml。

2.如权利要求1所述的甲型、乙型肝炎联合疫苗，其特征在于：还包括有免疫铝佐剂，其含量为0.35～0.62mg/ml。

3.如权利要求1所述的甲型、乙型肝炎联合疫苗，其特征在于：所述甲型肝炎病毒抗原含量为640EU/ml。

4.如权利要求1所述的甲型、乙型肝炎联合疫苗，其特征在于：所述乙型肝炎病毒表面抗原蛋白含量为20μg/ml。

5.如权利要求1-4中任一项所述的甲型、乙型肝炎联合疫苗，其特征在于：所述的甲型肝炎病毒毒株为自分离的SH株。

6.如权利要求5所述的甲型、乙型肝炎联合疫苗，其特征在于：所述的重组酿酒酵母菌种为美国默克公司以DNA重组技术构建的表达HBsAg的重组酿酒酵母。

7.一种甲型、乙型肝炎联合疫苗的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

甲型肝炎病毒抗原制备步骤，将甲型肝炎病毒经人胚肺二倍体细胞培养收获并纯化，得到甲型肝炎病毒抗原；

乙型肝炎病毒表面抗原蛋白制备步骤，将重组酿酒酵母发酵表达并纯化，乙型肝炎病毒表面抗原蛋白；

混合步骤，将所述甲型肝炎病毒抗原和乙型肝炎病毒表面抗原蛋白混合，调节pH值至6.0～7.0之间，制成甲型、乙型肝炎联合疫苗。

8.如权利要求7所述的甲型、乙型肝炎联合疫苗的制备方法，其特征在于，所述甲型肝炎病毒抗原制备步骤具体包括：

甲肝病毒原液制备步骤，将甲型肝炎病毒毒株SH与人胚肺二倍体细胞混合吸附后接种至细胞工厂，于34-35℃下培养，至病毒增殖高峰期后，用胰酶消化含甲肝病毒的细胞，收获细胞病毒液，经超声破碎，氯仿抽提，超滤膜超滤，去除细胞杂蛋白，再经凝胶层析纯化，按抗原含量用磷酸盐缓冲液稀释至抗原含量不低于3200EU/ml后，过滤除菌，甲醛灭活，即得甲肝病毒原液；

甲型肝炎病毒抗原铝吸附产物制备步骤，将灭活后的甲肝病毒原液加入硫酸钾铝溶液吸附18-24小时后，用无菌生理盐水洗涤，去上清液后，用生理盐水稀释至抗原含量不低于3200EU/ml，制成甲肝病毒抗原铝吸附产物。

9.如权利要求8所述的甲型、乙型肝炎联合疫苗的制备方法，其特征在于，所述乙型肝炎病毒表面抗原蛋白制备步骤具体包括：

乙肝病毒表面抗原蛋白原液制备步骤，将美国默克公司以DNA重组技术构建的表达HBsAg的重组酿酒酵母工作种子批菌种经锥形瓶、种子罐、生产罐进行发酵培养，收获酵母菌，经高压匀浆器破碎酵母菌，滤膜过滤除去酵母菌碎片，以硅胶吸附法粗提HBsAg，疏水色谱法纯化HBsAg，用硫氰酸盐处理，按蛋白浓度用磷酸盐缓冲液稀释至抗原蛋白浓度为600-800EU/ml，除菌过滤后即为原液；

HBsAg吸附产物制备步骤，在原液中加入终浓度为100μg/ml甲醛，在34-38℃保温72-96小时灭活，灭活后蛋白质和铝剂按1μg蛋白质加入3.86mg的比例混合，置2-8℃吸附沉降18-24小时，用无菌生理盐水洗涤，去上清液后再恢复至原体积，制成HBsAg吸附产物。

10.如权利要求9所述的甲型、乙型肝炎联合疫苗的制备方法，其特征在于，所述混合步骤具体包括：

将甲肝病毒抗原铝吸附产物与HBsAg吸附产物等比例混合后，用0.1m0l/L的HCl调节pH值至6.0～7.0之间，制成甲型、乙型肝炎联合疫苗，其中含甲肝病毒抗原640EU/ml，HBsAg为20μg/ml。