CN1966075A - 一种人用乙型脑炎灭活疫苗及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种人用乙型脑炎灭活疫苗及其制备方法。用人二倍体细胞株KMB17培养乙型脑炎病毒DL4株，收集澄清的病毒收获液，经1∶2000比例甲醛灭活、透析浓缩、Sepharose 4FF柱层析纯化、以及氢氧化铝吸附制备得到灭活疫苗。该疫苗经免疫效力试验证明具有免疫原性，经动物临床观察证明安全有效，可用于预防乙型脑炎。本发明制备方法简便，成本低廉，具有良好的应用前景。

Description

一种人用乙型脑炎灭活疫苗及其制备方法

技术领域

本发明属于人类预防医学技术领域，具体涉及一种人用乙型脑炎灭活疫苗，以及该疫苗的制备方法。

背景技术

流行性乙型脑炎，简称乙脑，是一种由乙脑病毒引起，经蚊类媒介传播，人畜共患的中枢神经系统急性传染病。乙脑的病原体是流行性乙型脑炎病毒，属黄病毒科黄病毒属，为嗜神经、RNA病毒，呈球形，直径40nm，对低温和干燥的抵抗力强。乙脑属东南亚及西太平洋地区的区域性传染病，与当地的气候条件和媒介蚊的孽生活动有密切关系。中国乙脑的流行具有明显的季节性特点，多发于夏、秋季节，主要在7、8、9三个月。传染源是被感染的人或动物，再通过蚊虫的叮咬进而传播给其他的人或动物，猪与蚊被认为是本病毒的主要长期储存宿主和扩散宿主。

人，尤其是儿童对乙脑病毒普遍易感。乙脑的潜伏期一般在10～14天左右，在临床上，以明显的季节性、起病急、高热、头痛及不同程度的意识障碍为特点。病程一般约两周，死亡多在病后一周内发生，病死率较高，约为30％左右。在流行区域，约85％病例发生在15岁以下的儿童。10岁以下儿童易产生严重后遗症，如：失语、瘫痪、精神异常、痴呆、肢体弯曲畸形、扭转痉挛等。因此，预防乙型脑炎对于保护儿童健康显得极为重要。目前世界上还没有治疗乙脑的特效药，预防乙脑关键是接种疫苗。我国规定15岁以下未成年人可免费接种乙脑疫苗，接种乙脑疫苗后，人群的保护率可达90％以上。

目前，国际上应用较多的乙脑疫苗主要有鼠脑灭活疫苗、地鼠肾灭活疫苗、地鼠肾减毒活疫苗和Vero细胞纯化灭活疫苗。这其中鼠脑及地鼠肾细胞生产的乙脑灭活疫苗免疫原性弱，需多次接种，造成疫苗中残存的动物组织外源物质不可避免地带入人体，是多见过敏反应的重要原因。减毒活疫苗虽然可以减少多次接种引发的过敏反应，但有报道称减毒的疫苗病毒在有免疫功能障碍的动物体内可增殖，并引起死亡，提示接种免疫功能障碍者，有可能造成安全性问题。其次，活疫苗因存在诸多问题而尚未得到WHO的认可，如有较严重的潜在的病毒污染问题；动物的级别很难达到SPF级；来自不同动物的质量和敏感性有差异；动物来源越来越困难，尤其是灵长目动物。而以Vero细胞为基质的冻干精制乙脑灭活疫苗已在中国境内投入使用，虽然避免了上述疫苗的缺陷，但Vero细胞乙型脑炎灭活疫苗目前只有一家公司生产，并且由于其病毒培养采用传统转瓶技术，产量较低，根本无法满足国内外乙脑疫苗市场需求。另外，该疫苗理论上还存在致肿瘤性的危险，对Vero细胞使用代数有严格要求。

另外，作为疫苗培育介质的人二倍体细胞KMB17在疫苗生产领域中已经使用了30多年，证明是安全有效的。人二倍体细胞与原代细胞相比，具有能够充分鉴定和标准化的优点，可实现细胞种子库系统，建立的细胞库可多年用于生产，有利于质量控制。二倍体细胞与传代细胞相比，理论上不存在致肿瘤的潜在危险性。但常用的这些毒株如P3、SA 14-14-2等对人二倍体细胞不敏感，因此，乙脑疫苗的生产长期以来都无法使用人二倍体细胞。

如何进一步增强乙脑疫苗的免疫效果、提高使用的安全性，就成为现有技术中亟待解决的技术难题。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种安全有效的人用乙型脑炎灭活疫苗。同时，本发明还提供所述疫苗的制备方法。

本发明的目的通过以下技术方案予以实现。

本发明提供的乙型脑炎灭活疫苗是采用人二倍体细胞株KMB17培养的乙型脑炎病毒DL4株，经甲醛灭活、透析浓缩、柱层析纯化、以及氢氧化铝吸附制备而成的疫苗，它由下列成分组成：

乙型脑炎病毒DL4株纯化抗原           100μg/ml

氢氧化铝                            0.8-1mg/ml

硫柳汞                              0.05-0.1mg/ml

本发明提供了一种乙型脑炎灭活疫苗的制备方法，该方法采用下列顺序的步骤：

1.挑选生长致密的单层细胞KMB17细胞，弃去培养液；

2.用PBS充分冲洗细胞，加入维持液，接种DL4株乙脑疫苗毒种，在37℃下培养12，其间第4，8天时收集上清并添加等量维持液，第12天再次收集上清并与前二次收集的上清混合，离心去除细胞沉淀；

3.收集澄清的病毒收获液，按1∶2000比例加入甲醛灭活病毒，在22℃下培养七天后，透析浓缩至原体积的1/10，上样于Sepharose 4FF柱层析纯化，收集纯化后的灭活病毒颗粒，电泳及高效液相色谱(HPLC)确定蛋白纯度高于99％，采用Lowry法检测蛋白浓度，透析浓缩蛋白浓度至1mg/ml，得到病毒原液；

4.将病毒原液过滤除菌后，加入磷酸缓冲液、终浓度为0.1％的Al(OH)₃及0.01％的硫柳汞调整蛋白含量至100μg/ml，得到所需的乙型脑炎灭活疫苗原液。

其中，人二倍体细胞株KMB17来源于正常人胎儿组织，属成纤维细胞，细胞形态为梭形，染色体为二倍体。由中国医学科学院医学生物学研究所建立，主要用于培养病毒制备疫苗。该细胞在疫苗的生产中使用了30多年，证明是安全有效的，无致肿瘤性。

乙型脑炎病毒DL4株，属黄病毒科黄病毒属，为嗜神经、RNA病毒，呈球形，直径40nm。由中国医学科学院医学生物学研究所用常规方法分离自云南大理，经滤过试验及与乙脑特异性免疫血清做中和试验、单克隆抗体的交叉HI和IFAT试验结果证实为乙脑病毒，可作为纯化灭活疫苗用毒株。

本发明与现有技术相比，具有以下有益效果：

1.人二倍体细胞KMB17在疫苗的生产中使用了30多年，证明是安全有效的。人二倍体细胞与原代细胞相比，具有能够充分鉴定和标准化的优点，可实现细胞种子库系统，建立的细胞库可多年用于生产，有利于质量控制。

2.二倍体细胞与传代细胞相比，理论上不存在致肿瘤的潜在危险性。KMB17为细胞基质培养DL4，病毒效价可达5.8～6.0logCCID50/ml，达到疫苗生产用病毒滴度。经过灭活、纯化获得纯度达90％的精制品，是具备免疫原性的安全有效的乙脑灭活疫苗。

3.本发明制备方法科学合理，产量高，能满足国内外乙脑疫苗市场的需要。

具体实施方式

下面通过具体实施例，对本发明作进一步清楚地说明，但它们并不是对本发明保护范围的限定。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出的变形或者是等同的技术手段，均属于本发明的保护范围。

实施例1——对DL4株进行病毒鉴定

经滤过试验及与乙脑特异性免疫血清做中和试验、单克隆抗体的交叉HI和IFAT试验结果证实为乙脑病毒。电镜和病理检查结果表明DL4病毒能在小白鼠脑组织内繁殖，并可致神经细胞变性坏死，符合乙脑病毒的嗜神经性。该毒株经用乙脑敏感动物试验检测其嗜神经毒力。接种于3天龄乳小白鼠，经8天潜伏期，出现规律发病和死亡，发病表现为行走不稳、后肢瘫痪。DL4感染乳小白鼠发病后，各器官组织病理检查结果如下：脑软膜下轻度充血，大脑实质灶状出血，神经细胞普遍肿胀变性，尼氏体结构不清，核仁不清，少部分核浓缩，病变以大脑实质为显，蛛网膜下腔有出血病变。未见明显的筛网状软化灶。心肌细胞颗粒变性，部分胞浆呈空泡样变，间质、心外膜充血。部分肝细胞明显肿胀增大，胞浆疏松化，少数肝细胞脂肪变性。肾近曲小管上皮细胞普遍颗粒样变性。肺组织明显出血，胃肠有出血病变。其它脏器组织未见病理改变。透射电镜观察检测DL4感染鼠脑标本超薄切片发现：神经细胞核常染色质丰富，核仁明显且多，部分神经细胞质内粗面内质网增多，部分细胞质内见电子密度高的不规则的较小的病毒包含体。粗面内质网腔内及胞质内见电子密度高的、直径约45nm的病毒颗粒和许多葡萄样聚集的、大小不等的微泡和微管结构，部分细胞高尔基体扁平膜囊内见少数病毒颗粒，在神经突起间隙内见少数病毒颗粒。接种KMB17细胞，约4天后可见细胞病变(CPE)，表现为圆缩、堆聚、脱落。DL4株毒力和灭活疫苗通用病毒株P3相当。

KMB17培养DL4效价为5.8～6.0logCCID50/ml，达到疫苗生产用病毒滴度。利用层析纯化获得纯度达90％的精制品，并经免疫效力试验证明具有免疫原性，经动物临床观察证明安全有效。可以作为纯化灭活疫苗用毒株。

建立了DL4株乙脑疫苗生产用毒种库并自检合格，对种子库的遗传稳定性、生化特性、抗原性、毒性、毒力等进行分析，明确该种子库可以传代的次数。工作病毒库直接从种子病毒库病毒接种细胞传代制备。

实施例2——对疫苗的分段检测及动物试验

病毒收获液，病毒原液和疫苗原液均为无异物、无沉淀的澄明液体，经鉴定无细菌污染、无支原体污染、无异常毒素，pH7.2～8.0。

将病毒收获液进行10倍系列稀释，取6个稀释度，每个稀释度脑内接种体重为7～9g小鼠4只，每只0.03ml，逐日观察，3日内死亡的小鼠不计，观察14天，滴度不低于5.5lg LD₅₀/ml。

取少量病毒原液进行SDS-PAGE电泳后，考马斯亮兰染色及乙脑病毒E蛋白抗体进行Western检测，均呈现表观分子量为53kDa的单一条带。

病毒原液接种KMB17细胞，无细胞病变，无病毒蚀斑形成。

取病毒原液脑内接种体重为12～14g小鼠8只，每只0.03ml，同时腹腔接种0.5ml，为第1代；7天后将第一代小鼠处死3只，取脑制成10％悬液，脑内接种6只小鼠，为第2代；7天后将第2代小鼠处死3只，同时接种6只小鼠，为第3代。从接种之日起逐日观察14天，每代小鼠除处死外，全部健存。

实施例3——安全性检测的动物试验

将疫苗原液腹腔免疫体重为12～14g小鼠10只，每只0.5ml，免疫两次，间隔7天。第2次免疫后第7天采血，分离血清，同组血清等量混合，于56度灭活30分钟。稀释血清，与稀释病毒(约200PFU/0.4ml)等量混合，同时将稀释后的病毒与正常小鼠血清等量混合，作为病毒对照，置37度水域90分钟，接种6孔板BHK21细胞，每孔0.4ml，置37度培养90分钟，加入含甲基纤维素的培养基覆盖物，于37度5％二氧化碳孵箱中培养5天，染色，噬斑计数显示疫苗溶液C所诱导产生的抗血清能够完全中和病毒，无蚀斑形成。

实施例4——动物试验

将疫苗原液皮下注射免疫10只乳鼠，每只0.2ml，免疫两次，间隔14天，第28天每只小鼠腹腔注射1000LD₅₀的P3或DL4乙脑病毒，从病毒攻击之日起逐日观察14天，全部小鼠健存。

实施例5——动物试验

疫苗原液甲醛含量不高于0.50mg/剂，牛血清蛋白残留量不高于50ng/剂，细菌内毒素不高于100EU/剂；腹腔注射体重为18～20g小鼠5只，每只0.5ml，观察7天，全部健存。

Claims (2)

1.一种人用乙型脑炎灭活疫苗，其特征在于它由下列成分组成：

DL4株乙型脑炎病毒纯化抗原         100μg/ml

氢氧化铝                          0.8～1mg/ml

硫柳汞                            0.05～0.1mg/ml

2.一种权利要求1所述乙型脑炎灭活疫苗的制备方法，其特征在于采用下列顺序的步骤：

(1)挑选生长致密的单层细胞KMB17细胞，弃去培养液；

(2)用PBS充分冲洗细胞，加入维持液，接种DL4株乙脑疫苗毒种，在37℃下培养12天，其间第4，8天时收集上清并添加等量维持液，第12天再次收集上清并与前二次收集的上清混合，离心去除细胞沉淀；

(3)收集澄清的病毒收获液，按1∶2000比例加入甲醛灭活病毒，在22℃下培养七天后，透析浓缩至原体积的1/10，上样于Sepharose 4FF柱层析纯化，收集纯化后的灭活病毒颗粒，电泳及高效液相色谱(HPLC)确定蛋白纯度高于99％，采用Lowry法检测蛋白浓度，透析浓缩蛋白浓度至1mg/ml，得到病毒原液；

(4)将病毒原液过滤除菌后，加入磷酸缓冲液、终浓度为0.1％的Al(OH)₃及0.01％的硫柳汞调整蛋白含量100μg/ml，得到所需的乙型脑炎灭活疫苗原液。