CN1223377C - 甲型肝炎灭活疫苗吕8快株的选育和制备方法 - Google Patents

甲型肝炎灭活疫苗吕8快株的选育和制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN1223377C
CN1223377C CNB021339260A CN02133926A CN1223377C CN 1223377 C CN1223377 C CN 1223377C CN B021339260 A CNB021339260 A CN B021339260A CN 02133926 A CN02133926 A CN 02133926A CN 1223377 C CN1223377 C CN 1223377C
Authority
CN
China
Prior art keywords
strain
generation
days
hepatitis
liquid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
CNB021339260A
Other languages
English (en)
Other versions
CN1490053A (zh
Inventor
陈统球
褚嘉祐
张华远
万宗举
侯宗柳
阳选祥
谭顺革
曹逸云
金炜翔
龙润乡
李华
杨净思
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Aimei Convac Bio Pharmacy Jiangsu Co ltd
Original Assignee
Institute of Medical Biology of CAMS and PUMC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institute of Medical Biology of CAMS and PUMC filed Critical Institute of Medical Biology of CAMS and PUMC
Priority to CNB021339260A priority Critical patent/CN1223377C/zh
Publication of CN1490053A publication Critical patent/CN1490053A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN1223377C publication Critical patent/CN1223377C/zh
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

本发明提供一种甲型肝炎灭活疫苗吕8快株的选育和制备方法，它将吕8株病毒液按1∶5-50的体积比接种在致密细胞单层上，置37℃吸附2小时，补充pH7.4-7.8的维持液，35-36℃培养传代，1-2代次每代培养35天，3-6代次每代培养28天，7-26代次每代培养12-16天，收获毒株。该毒株的抗原滴度和感染性滴度较高，经狨猴毒力实验证明已由强毒株变异为弱毒株，用它生产甲肝灭活疫苗不仅对人体安全，有良好的免疫原性和保护效果，而且由于病毒繁殖的高峰期由35天缩短为12-16天，因此，有利于进行大规模的产业化生产，因此，是一种生产甲肝灭活疫苗的理想毒株。

Description

甲型肝炎灭活疫苗吕8快株的选育和制备方法
本发明涉及一种含有病毒抗原的医用生物制品，尤其是一种用于预防人类甲型肝炎的灭活疫苗毒株及其制备方法。
甲型肝炎是由甲型肝炎病毒(HAV)引起的一种自限性病毒性传染病，世界各地均有此病的发生。在不发达或发展中国家卫生条件差的地区最容易传播成为高度地方性的流行病，而在高流行区易感染者主要是儿童。我国是HAV感染的高流行区，平均每年有24万人患甲型肝炎，为此，许多研究者致力于甲型肝炎疫苗的研究。如美国专利4.164.566公开了一种在人类灵长目动物(如狨猴)细胞培养中选育出HAV制备甲型肝炎疫苗。美国专利4.506.016公开了一种将甲肝病毒首先适宜于人肾细胞，然后再适应于人胚肺细胞的减毒HAV株制备甲肝减毒活疫苗。中国专利891065806公开了甲型肝炎减毒疫苗毒种(H2减毒株)及其制备方法。中国专利921149980公开了甲型肝炎疫苗的生产方法，提供了制备甲型肝炎疫苗的毒种LA-1减毒株及规模化生产疫苗的方法。因此，加大研制甲型肝炎疫苗的进度和力度已成为刻不容缓的任务。
本发明的目的在于提供一种安全、有效，繁殖周期短，适于大规模生产甲肝灭活疫苗的毒株。
本发明通过下列技术方案实现：所采用的甲型肝炎灭活疫苗毒株是从甲肝患者粪便中直接用人胚肺二倍体细胞(KMB17株)培养、分离而获得的吕8株病毒毒种，经过将人胚肺二倍体细胞37℃培养4-5天形成致密细胞单层，用PBS洗涤细胞，其特征在于：将吕8株病毒液按1∶5-50的体积比接种在致密细胞单层上，置37℃吸附2小时，补充pH7.4-7.8的维持液，35-36℃培养传代，1-2代次每代培养35天，3-6代次每代培养28天，7-26代次每代培养12-16天，收获病毒液。
本发明所用毒种-吕8株是在1988年我国上海地区流行甲肝时，从典型甲肝急性期患者粪便中分离的甲型肝炎病毒，经KMB17人胚肺二倍体细胞培养、分离、适应得到的毒种。
本发明所述毒株培养过程中，1-6代次每周更换维持液一次，维持液中含5-10％的小牛血清和卡那霉素80-100u/ml，7-26代次则不需要更换维持液。
用本发明方法制备的甲肝灭活疫苗毒株-吕8快株，其抗原滴度和感染性滴度较高，经狨猴毒力实验证明已由强毒株变异为弱毒株，用它生产甲肝灭活疫苗不仅对人体安全，有良好的免疫原性和保护效果，而且由于病毒繁殖的高峰期由35天缩短为12-16天，因此，有利于进行大规模的产业化生产，因此，是一种生产甲肝灭活疫苗的理想毒株。
本发明提供的甲型肝炎灭活疫苗毒株25代和26代经中国药品生物制品检定所进行检定，其结果见下表：
检定项目 25代吕8株          26代吕8株
无菌实验 合格               合格
感染性滴度Log TCID50/ml 8.33               7.77
 HAV抗原滴度 1∶256             1∶512
中和试验 均能被特异抗体中和
鉴别试验 HAV抗原阳性        HAV抗原阳性
结论 具有甲型肝炎病毒特征
本发明提供的甲型肝炎灭活疫苗毒株-吕8快株的性质如下：
形状：球形，27-30mm；
氯化铯浮密度：1.34g/cm2；
耐热性：60℃30分钟对感染性无明显影响，100℃5分钟可完全灭活；
抗原滴度：1∶512～1∶1024；
感染性滴度：107.5～108.5CCID50/ml；
繁殖高峰时间：12-16天；
最适繁殖温度：35-36℃；
繁殖部位：细胞胞浆内；
致细胞病变：未见CPE；
毒力：未见血清酶的异常升高，肝脏组织未见病理变化；
免疫原性：可使小白鼠、恒河猴、狨猴产生较强的免疫反应。
实施例1
按常规方法先将人胚肺二倍体细胞(KMB17株)置于37℃培养4-5天，使之长成致密细胞单层，弃旧液，用PBS洗涤细胞一次，按1∶5的体积比接种吕8株病毒，置37℃吸附2小时，补充pH7.4维持液，其中维持液中含5-10％小牛血清和80-100u/ml卡那霉素，置35℃继续培养，1-2代次每代培养35天，3-6代次每代培养28天，每周更换维持液一次，7-26代次每代培养12天，收获，收毒时用PBS洗涤细胞一次，加消化液，让消化液过细胞面三次，当细胞从瓶壁脱落后，按20μl/cm2的量加入无酚红PBS或MEM制成悬浮液，收集悬浮液于PP瓶中，用大容量低速离心机在4℃2000～2500rpm离心15-20分钟，用PBS或生理盐水(0.85％NaCL)悬浮细胞沉淀，收集细胞悬液装瓶，置-30℃冷藏，得吕8快株病毒液。
实施例2
除接种吕8株病毒比例为1∶50，7-26代次每代培养16天，收获毒株外，其余制备工艺过程均与实施例1相同。
实施例3
除接种吕8株病毒比例为1∶25，7-26代次每代培养14天，收获毒株外，其余制备工艺过程均与实施例1相同。
动物接种试验：
试验组：将本发明之主种子批(25代)静脉接种普通狨猴2只，接种剂量为7.44CCID50/ml，观察12周。接种后两周抗体阳转，血清酶无异常升高，肝脏组织未见病理变化。
对照组：将吕8粪便悬液接种2只狨猴，接种剂量为1.23CCID50/ml，接种后ALT有1-2周次升高，AST有3-4周次升高，肝脏出现+++的病理变化。
说明吕8株经组织培养，快速传代后，根据血清肝酶变化以及肝脏病理检查结果，其毒力基本属于弱毒性质，且抗原性仍然保持良好。

Claims (2)

1、一种甲型肝炎灭活疫苗吕8快株的选育和制备方法，它包括从甲肝患者粪便中直接用人胚肺二倍体细胞(KMB17株)培养、分离而获得的吕8株病毒毒种，以及将人胚肺二倍体细胞置于37℃培养4-5天形成致密细胞单层，用PBS洗涤细胞，其特征在于：将吕8株病毒液按1∶5-50的体积比接种在致密细胞单层上，置37℃吸附2小时，补充pH7.4-7.8的维持液，35-36℃培养传代，1-2代次每代培养35天，3-6代次每代培养28天，7-26代次每代培养12-16天，收获病毒液。
2、根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述毒株培养过程中，1-6代次每周更换维持液一次，维持液中含5-10％的小牛血清和80-100u/ml的卡那霉素。
CNB021339260A 2002-10-17 2002-10-17 甲型肝炎灭活疫苗吕8快株的选育和制备方法 Expired - Lifetime CN1223377C (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CNB021339260A CN1223377C (zh) 2002-10-17 2002-10-17 甲型肝炎灭活疫苗吕8快株的选育和制备方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CNB021339260A CN1223377C (zh) 2002-10-17 2002-10-17 甲型肝炎灭活疫苗吕8快株的选育和制备方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN1490053A CN1490053A (zh) 2004-04-21
CN1223377C true CN1223377C (zh) 2005-10-19

Family

ID=34145716

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CNB021339260A Expired - Lifetime CN1223377C (zh) 2002-10-17 2002-10-17 甲型肝炎灭活疫苗吕8快株的选育和制备方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN1223377C (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103525770B (zh) * 2013-10-08 2015-08-19 云南沃森生物技术股份有限公司 人胚肺成纤维细胞株在制备甲肝疫苗中的应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN1490053A (zh) 2004-04-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN101402944B (zh) 一种ev-71病毒毒种、人用灭活疫苗及其制备方法
CN104099301B (zh) 柯萨奇病毒a16型病毒株、用途、疫苗及其制备方法
CN101695570A (zh) 一种手足口病单、双价灭活疫苗及其制备方法
CN102911910A (zh) 人胚肺成纤维细胞株及利用其生产手足口病毒疫苗的方法
CN102618505B (zh) 人轮状病毒毒种ztr-68毒株及其分离，培养与鉴定
CN101524536B (zh) 人胚肺成纤维细胞乙型脑炎疫苗及其制备方法
CN100513559C (zh) 新的水痘病毒毒株、水痘减毒活疫苗及其制备方法
CN101161286B (zh) 水痘减毒活疫苗
CN102805862B (zh) 一种vero细胞培养新布尼亚病毒纯化灭活疫苗的制备方法
CN1223377C (zh) 甲型肝炎灭活疫苗吕8快株的选育和制备方法
CN1966075A (zh) 一种人用乙型脑炎灭活疫苗及其制备方法
CN103160475B (zh) 一种肠道病毒71型病毒株及其用途、疫苗和制备方法
CN1029239C (zh) 甲型肝炎疫苗的生产方法
CN102757941B (zh) 甲型肝炎病毒株hav-zl2012，由其制备得到的疫苗及应用
CN102174477B (zh) 甲型肝炎病毒株sh及其二倍体细胞适应方法
CN103160474B (zh) 肠道病毒71型病毒株、疫苗、动物模型建立方法
CN1216985C (zh) 甲型肝炎病毒毒株,制备甲肝灭活疫苗的方法及所得疫苗
CN102805863B (zh) 一种人二倍体细胞培养新布尼亚病毒纯化灭活疫苗的制备方法
CN105713855A (zh) 菌株及其应用，以及疫苗及其制备方法
CN101525597B (zh) 新的甲型肝炎灭活疫苗病毒毒株及其培养方法
CN115429876A (zh) 一种预防手足口病的联合疫苗及其制备方法和应用
CN1128218C (zh) 可致成人腹泻的新轮状病毒(Rotavirus)及其培养方法
CN112791179B (zh) 一种预防手足口病的联合疫苗及其制备方法和应用
CN118272316A (zh) 手足口病疫苗及其制备方法和应用
CN104694486B (zh) 一种二联手足口病灭活疫苗及其制备方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
ASS Succession or assignment of patent right

Owner name: KUNMING SHANGCHENG BIOTECHNOLOGY CO., LTD.

Free format text: FORMER OWNER: MEDICAL BIOLOGY INST., CHINESE ACADEMY OF MEDICAL SCIENCES

Effective date: 20100723

C41 Transfer of patent application or patent right or utility model
COR Change of bibliographic data

Free format text: CORRECT: ADDRESS; FROM: 650118 NO.379, JIAOLING ROAD, KUNMING CITY, YUNNAN PROVINCE TO: 650118 ROOM 503, BUILDING A2, ERQI, STATE COLLEGE SCIENCE PARK, KUNMING CITY HIGH-TECH ZONE

TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20100723

Address after: 650118 A2 building 503, National University Science Park, Kunming hi tech Zone, 2

Patentee after: Kunming Cheng Cheng Biotechnology Co.,Ltd.

Address before: Jiao Ling Road 650118 Yunnan city of Kunming Province, No. 379

Patentee before: INSTITUTE OF MEDICAL BIOLOGY CHINESE ACADEMY OF MEDICAL SCIENCES

ASS Succession or assignment of patent right

Owner name: KUNMING SHENGFEI BIO-PHARMACEUTICAL TECHNOLOGY CO.

Free format text: FORMER OWNER: KUNMING SHANGCHENG BIOTECHNOLOGY CO., LTD.

Effective date: 20100826

C41 Transfer of patent application or patent right or utility model
COR Change of bibliographic data

Free format text: CORRECT: ADDRESS; FROM: 650118 ROOM 503, BUILDING A2, PHASE 2, NATIONAL UNIVERSITY SCIENCE AND TECHNOLOGY PARK, KUNMING HIGH-TECH. ZONE TO: 650118 ROOM 501, BUILDING A2, PHASE 2, NATIONAL UNIVERSITY SCIENCE AND TECHNOLOGY PARK, KUNMING HIGH-TECH. ZONE

TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20100826

Address after: 650118 A2 building 501, National University Science Park, Kunming hi tech Zone, 2

Patentee after: Kunming Sheng Fei biological medicine technology Co.,Ltd.

Address before: 650118 A2 building 503, National University Science Park, Kunming hi tech Zone, 2

Patentee before: Kunming Cheng Cheng Biotechnology Co.,Ltd.

ASS Succession or assignment of patent right

Owner name: JIANGSU CONVAC BIOTECHNOLOGY CO., LTD.

Free format text: FORMER OWNER: KUNMING SHENGFEI BIOMEDICAL TECHNOLOGY CO., LTD.

Effective date: 20130516

C41 Transfer of patent application or patent right or utility model
COR Change of bibliographic data

Free format text: CORRECT: ADDRESS; FROM: KUNMING, YUNNAN PROVINCE TO: 225300 TAIZHOU, JIANGSU PROVINCE

TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20130516

Address after: 225300 drug city, Taizhou hi tech Zone, Jiangsu Province

Patentee after: JIANGSU CONVAC BIO-TECHNOLOGY Co.,Ltd.

Address before: Room 501, building A2, 2, National University Science Park, Kunming hi tech Zone

Patentee before: Kunming Sheng Fei biological medicine technology Co.,Ltd.

TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20180517

Address after: No. 819, drug City Avenue, Taizhou, Jiangsu Province, Jiangsu

Patentee after: AIMEI CONVAC BIO-PHARMACY (JIANGSU) Co.,Ltd.

Address before: 225300 drug city road, Jiangsu medical and Technological Development Zone, Taizhou

Patentee before: JIANGSU CONVAC BIO-TECHNOLOGY Co.,Ltd.

TR01 Transfer of patent right
CX01 Expiry of patent term
CX01 Expiry of patent term

Granted publication date: 20051019