一种VERO细胞培养新布尼亚病毒纯化灭活疫苗的制备方法
1.发明领域
本发明属于生物技术领域,具体涉及一种新布尼亚病毒(SFTSbunyavirus)纯化灭活疫苗的制备方法。
2.发明背景
新布尼亚病毒(Novel Bunyavirus,SFTS Bunyavirus),是发热伴血小板减少综合症(Fever with Throbocytopenia Associated syndrome,SFTS)的病原,为布尼亚病毒科白蛉热病毒属的一种新型病毒,于2009年在中国首先发现,也是中国首例发现的新型病毒。患者出现以高热、血小板减少、白血球降低、多器官功能紊乱、出血等为特征的严重急性传染病,严重影响着人民的健康和生命安全。到目前为止,全国已有河南、江苏、湖北、山东、安徽和辽宁等16个省发现300多病例,造成40余人死亡。中国国家疾控中心、江苏省疾控中心先后成功的分离到该病病毒,并对其进行了病原学、流行病学、临床医学等研究。目前该病毒序列已经阐明,但是对SFTS尚无特效药治疗和疫苗预防。
3.发明内容
本发明的目的之一在于提供了一株新的,用于制备灭活疫苗的新布尼亚病毒JS-2007-001,该病毒分类命名为新布尼亚病毒(Severe fever withthrombocytopenia syndrome virus;Novel Bunyaviridae),其保藏号为CCTCC V201211;保藏时间为2012年3月1日;保藏单位为:中国典型
培养物保藏中心;保藏地址为:武汉大学生命科学学院武汉市武昌珞珈山。
本发明的目的之二在于提供了将上述新布尼亚病毒JS-2007-001制备成为纯化灭活疫苗的方法。
本发明的优点在于,经过适应性培养、免疫原性鉴定和免疫保护作用鉴定发现,本发明中涉及的JS-2007-001病毒毒种具有最佳的生长特性和适应特性,在较短时间内达到生长高峰,可稳定获得较高滴度病毒,免疫动物获得抗体水平较高,从而能开发成为一种稳定的可商业化应用的纯化灭活疫苗。
具体的,本发明涉及一种新布尼亚病毒纯化灭活疫苗的制备方法,其包括如下步骤:1)采用转瓶培养VERO细胞为产毒细胞;2)以保藏号为CCTCC V201211的新布尼亚病毒JS-2007-001作为毒种进行接种;3)进行细胞扩增、病毒种子驯化、接种、培养、收集病毒滤液;4)将病毒滤液进行灭活、除菌、浓缩和纯化;以及5)加入保护液,并检定合格后制备成品疫苗。
在所述的制备方法中,其中所述的VERO细胞为经VERO细胞传代适应的毒种,该毒种滴度按CCID50法不低于7.01gCCID50/mL。
上述制备方法的培养步骤具体为:
其中所述的培养步骤具体为:
1)制备VERO细胞培养液。所述VERO细胞培养液为含10%新生牛血清、0.3%水解乳蛋白、1%NaHCO3、2mM谷氨酰胺的MEM培养基;
2)采用3L、10L或15L转瓶培养VERO细胞,其按1∶2或1∶4进行细胞传代,37℃培养,待细胞成片后接种VERO细胞毒种;
3)接种病毒,具体步骤为倒去培养液,加入浓度为100~1000CCID50/mL病毒,其MOI为0.001~0.0001;将接种病毒后的细胞置于33℃~35℃下12小时,使病毒与细胞充分接触吸附;然后倒去病毒液,用0.01磷酸盐缓冲液对细胞表面进行冲洗;最后加入含0.1%人白蛋白pH7.4~7.6DMEM溶液,送入33℃~35℃恒温室进行培养;
4)将病毒培养144-168小时,当细胞病变达到“++++”后开始收获病毒;收获的病毒液按1∶4000加入β丙内酯,灭活72小时后进行浓缩纯化;
5)纯化后的病毒液加入病毒保护剂后除菌,检定合格后即为疫苗原液,再经分装,各项检验合格后制成疫苗。
本发明所述的制备方法,疫苗主要质量指标为:病毒滴度≥7.01gCCID50/mL;疫苗免疫剂量:0.5mL/剂/人;抗生素残留量:≤50ng/剂;牛血清残留量:≤50ng/剂;热原:≤20EU/剂;疫苗pH:7.4-7.8;热稳定性:符合2010年药典第三部标准,合格;疫苗效力:15μg/剂免疫动物对新布尼亚病毒感染≥90%保护作用;无菌检查:符合2010年药典第三部标准;支原体检查:符合2010年药典第三部标准;异常毒性试验:符合2010年药典第三部标准。
4.附图说明
图1为VERO细胞制备新布尼亚病毒灭活疫苗工艺流程图。
5.具体实施方式
以下结合具体实施例,对本发明做进一步说明。本实施例仅仅用于对本发明的说明,不构成对本发明的限制。
实施例1:细胞复苏和传代培养
VERO细胞来自无锡罗益生物制药有限公司,冷冻细胞37℃解冻,加入37℃预热的MEM培养基(Invitrogen)。1000RPM离心10分钟,收集细胞,用1mL完全培养基(MEM培养基加上10%胎牛血清、0.3%水解乳蛋白、1%NaHCO3、2mM谷氨酰胺溶液)悬浮,进行细胞计数,接种1.5×106mL细胞到含10mL完全培养基的细胞培养瓶,置于37℃,5%CO2相对湿度90%细胞培养箱培养。当细胞形成完全单层时,倒掉培养基,加入0.25%胰蛋白酶(Invitrogen)(PH7.4-7.6)。消化到细胞单层表面出现针孔样时加入10mLMEM培养基吹打到形成单细胞悬液,进行细胞计数,每个含10mL完全培养基的25cm2细胞培养瓶接种1.5×106/mL细胞,标明时间和代次,置于37℃,5%CO2相对湿度90%细胞培养箱培养。
实施例2:VERO细胞扩增培养
采用3L、10L或15L转瓶培养VERO细胞。分别接种105/mL细胞400mL、1000mL、1500mL到装有完全培养基的3L、10L或15L细胞转瓶中,置于37℃细胞培养箱培养。经历5~6天,细胞形成完全单层时,常规消化制备单细胞悬液,按1∶2或1∶4进行细胞传代,37℃培养。
细胞培养亦可采用细胞工厂。其接种细胞数量可通过与上面培养容器面积换算得出。
实施例3:VERO细胞适应新布尼亚病毒株的建立
7株新布尼亚病毒株分别分离自江苏和安徽疫区,6株直接分离于病人血清,1株来源于可疑病犬。分离时所有细胞为VERO细胞(表1)。
表1:7株新布尼亚病毒株的分离时间与来源
|
分离时间 |
分离省份 |
分离标本 |
分离时用细胞 |
JS-2007-001 |
2011-04-01 |
江苏 |
病人血清 |
Vero |
JS-2010-004 |
2010-06-13 |
江苏 |
病人血清 |
Vero |
JS-2010-014 |
2010-10-11 |
江苏 |
病人血清 |
Vero |
JS-2010-018 |
2010-11-26 |
安徽 |
病人血清 |
Vero |
JS-2010-026 |
2010-11-22 |
江苏 |
病人血清 |
Vero |
JS-2010-DOG |
2011-01-14 |
江苏 |
可疑病犬脾脏 |
Vero |
JS-2011-013 |
2011-06-15 |
江苏 |
病人血清 |
Vero |
当细胞形成完全单层时,先倒去营养液,加入浓度为100~1000CCID50/mL(新布尼亚病毒JS-2007-001病毒毒株)毒种。其MOI为0.001~0.0001。接种病毒后的细胞置33℃~35℃培养,病毒培养144~168小时后根据细胞病变(CPE)的发展进行收获,CPE达到“++++”时,病毒滴度可达到高峰。收获病毒培养液,并测定病毒滴度。所产病毒作为毒种再接种新的VERO细胞。通过反复多次传代,病变出现时间逐渐提前至3~4天,而病毒滴度亦随着传代次数增加逐渐升高,滴度已达到7.0-8.01gCCID50/mL,说明新布尼亚病毒已适应到这些细胞上,获得了VERO细胞适应新布尼亚病毒(JS-2007-001)毒种。
收获的病毒从5代以后,每5代进行免疫原性检查和DNA序列分析。选择稳定代次作为主代毒种和工作种子。
免疫原性检查:
JS-2007-001病毒毒种在VERO细胞培养后产生的病毒收获后,经1∶4000加入β丙内酯灭活制成疫苗,用腹腔法免疫小鼠2次,间隔7天,于第一次免疫后4周采集小鼠血分离血清。试验时采用血清定量病毒变量法检测其免疫原性(抵抗病毒的能力),即将病毒进行10倍系列稀由10-1至10-9,抗血清与等量的10-2-10-6的病毒混合,对照组阴性血清与等量的10- 5-10-9的病毒混合,于37℃水浴中和90分钟后接种VERO细胞,观察两组细胞出现“++”病变终点,计算两组滴度之差,即是该抗血清抵抗病毒的能力其能力不低于500。
抗原性检查:
JS-2007-001病毒毒种在VERO细胞培养后产生的病毒收获后,经1∶4000加入β丙内酯灭活制成疫苗,用腹腔法免疫小鼠2次,间隔7天,于第一次免疫后4周采集小鼠血分离血清。试验时采用血清变量病毒定量法,来检测疫苗免疫小鼠后产生的免疫应答能力(血清中和效价),
用100个CCD50/mL的病毒量,与10、20、40、80、160、320倍稀释的小鼠抗血清与等量的病毒混合,置37℃中和90分钟后接种细胞,以细胞出现“++”病变为终点,即该血清的中和效价,亦即疫苗免疫小数后产生的免疫应答能力。其效价一般在1∶1601∶320之间。
7株新布尼亚病毒株在VERO细胞做适应性培养、免疫原性鉴定和免疫保护作用鉴定发现,JS-2007-001病毒毒种具有最佳的生长特性和适应特性,在较短时间内达到生长高峰,可稳定获得较高滴度病毒,免疫动物获得抗体水平较高,免疫血清中和试验发现对所有7株病毒均有良好的保护作用。所以选JS-2007-001病毒毒种作疫苗制备毒种。来源于犬类的毒种(JS-2010-DOG)因为考虑到种属差异可能的潜在不确定性,尽管检测指标较好,依然没有选用(表2)。
表2:7株新布尼亚病毒株的培养特性和免疫特性鉴定
按2010版《中国药典》对毒种要求的各项检验合格后,收获的病毒作为种子扩增后用于转瓶培养生产疫苗。
实施例4:病毒接种、培养与收获
病毒接种方法为:待细胞成片后接种VERO细胞适应的新布尼亚病毒(JS-2007-001病毒毒株)毒种。先倒去营养液,加入浓度为100~1000CCID50/mL病毒液。其MOI为0.001~0.0001。接种病毒后的细胞置33℃~35培养12小时,使病毒与细胞充分接触吸附。然后倒去病毒液,用PBS对细胞表面进行冲洗,最后加入0.1%人白蛋白(V/V)、pH 7.4~7.6DMEM维持液,置于33℃~35℃恒温室进行培养。
病毒培养144~168小时后根据CPE的发展进行收获,CPE达到“++++”时,病毒滴度可达到高峰。每次收获后,可根据VERO细胞CPE情况再补加新的病毒维持液。
实施例5:病毒灭活。
采用1∶4000的β-丙内酯灭活,2~8℃72小时可以灭活病毒。检验灭活效果,将灭活的病毒液接种VERO细胞上培养,并盲传3代,用荧光免疫方法检测无病毒感染细胞,说明病毒已完全被灭活。
实施例6:病毒液的浓缩:
用截留分子量30万以上分子的超滤器(Minipore,USA)对病毒液透析浓缩。把疫苗浓缩到一定体积,然后加入PBS稀释至原体积,再按前浓缩倍数浓缩,再加入PBS至原体积。如此反复4~6次除去绝大部分残留的牛血清蛋白。用BSA ELISA检测试剂盒(博生公司,无锡)检查牛血清残留量,应低于中华人民共和国药典有关规程的要求。
实施例7:病毒液的纯化:
VERO细胞DNA去除:先将1%的鱼精蛋白硫酸盐加到病毒浓缩液中,经搅拌均匀,再以3000RPM离心,取其上清,可去除绝大部分的细胞碎片及DNA;然后用36%和55%(W/W)的蔗糖密度梯度,25000RMP超速离心4小时,最后通过Sepharose 4ff胶层析进一步去除残留DNA,采用280nm紫外吸收峰收集病毒抗原。病毒液DNA的含量应<100pg/剂。病毒液加入1%人白蛋白后经0.2μm除菌,即为疫苗原液。取样做无菌试验、DNA含量、总蛋白含量、宿主蛋白等检测。
实施例8:疫苗的制备与分装
检测合格后的疫苗原液按病毒总蛋白量分装15μg/剂分装。
分装后,进行检定,各项指标合格后即为成品疫苗。
本发明所述制备方法,疫苗主要质量指标为:病毒滴度≥7.01gCCID50/mL;疫苗免疫剂量:0.5mL/剂/人;抗生素残留量:≤50ng/剂;牛血清残留量:≤50ng/剂;热原:≤20EU/剂;VERO细胞DNA含量≤100pg/剂;VERO细胞宿主蛋白含量:酶联免疫法≤4μg/剂;疫苗pH:7.4~7.8;热稳定性:符合2010年药典第三部标准,合格;疫苗效力:15μg/剂免疫动物对新布尼亚病毒感染≥90%保护作用;无菌检查:符合2010年药典第三部标准;支原体检查:符合2010年药典第三部标准;异常毒性试验:符合2010年药典第三部标准疫苗各项指标符合2010版《中国药典》标准。