CN102586194B - H9亚型禽流感病毒Vero细胞适应株及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种H9亚型禽流感病毒Vero细胞适应株及其在制备预防H9亚型禽流感疫苗中的应用。本发明得到的适应株应用于Vero细胞其病毒增殖速度和产量上都优于目前鸡胚培养的禽流感病毒,以及未驯化的H9亚型禽流感病毒病毒株。本发明的H9亚型禽流感病毒Vero细胞适应株能够替代鸡胚快速、大量生产流感病毒,具有广泛的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种能够在Vero细胞中稳定增殖的细胞株及其应用,特别涉及一种H9亚型禽流感病毒Vero细胞适应株及其应用。属于疫苗制备领域。
背景技术
禽流行性感冒(简称禽流感,AI)是由A型流感病毒引起的禽类的感染和/或疾病综合症。引起AI的病原称为禽流感病毒。
根据世界动物卫生组织(OIE)的疾病分类标准,高致病性禽流感属A类疾病,我国也将其列为一类传染病,其传播速度快、发病率和死亡率高;而中等到低等毒力的AIV可引起亚临床症状,出现产蛋下降、呼吸系统或全身性感染等多种程度不同的各种症状。鸡群感染该病毒,严重影响鸡的生产性能。肉仔鸡增重减慢,死亡数量增加,易继发患其它细菌性疾病。H9N2亚型AIV是一种低等毒力的病毒,可引起临床或亚临床症状。目前,在全世界从各种家禽和野生禽中分离到上千株H9N2亚型AIV,90年代以来,在世界许多国家发生;自1998年,国内许多鸡群发生H9N2亚型禽流感的报道,H9N2亚型AIV在我国广泛存在,并且多呈低致病性感染,然而由于其分布广泛并且有逐渐蔓延之势,因此给养禽业造成的威胁是巨大的。
预防该病最行之有效的办法就是疫苗的接种,目前,市售的禽流感疫苗绝大多数为鸡胚组织苗,相对于细胞苗而言,其具有成本高、产品质量批间差大、且容易生产鸡源性潜在疾病的感染等缺点。近几年,随着禽流感的频繁暴发以及跨种属传播,需要一种可在流感大流行时能够替代鸡胚快速、大量生产流感病毒的细胞培养系统。
发明内容
针对现有技术中的问题,本发明所要解决的技术问题是提供一种能够在Vero细胞中稳定增殖的H9亚型禽流感病毒Vero细胞适应株。
本发明所要解决的技术问题是通过以下技术手段实现的:
2011年初,本发明人从黑龙江省双城市郊某养殖场分离得到一株禽流感病毒(H9亚型)病毒株,其具有经胰酶处理后能在细胞上增殖的特性,基于此,本研究针对组织苗的不足,HY株的特性,将其驯化为一株能够在Vero细胞上良好增殖的VERO细胞适应株,并将其命名为H9亚型禽流感病毒VERO细胞适应株HY株,其具有经胰酶处理后能在细胞上增殖的特性,可用于在Vero传代细胞中增殖进而制备禽流感病毒灭活疫苗。
所述的H9亚型禽流感病毒VERO细胞适应株HY株,分类命名为禽流感病毒(H9亚型),保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,地址在北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所,其菌种保藏编号为:CGMCC5409,保藏日期为2011年10月28日。
本发明的H9亚型禽流感病毒VERO细胞适应株HY株是通过以下方法制备得到的:
1病毒的分离
病料来自黑龙江省双城市郊某养殖场,采集濒死鸡气管拭子和泄殖腔拭子,用2000单位青、链霉素溶液中处理后,接种鸡胚,收集48h~78h鸡胚尿囊液。对收获的鸡胚液进行血凝试验,HA血凝价为9log2。
2病毒分离株血凝抑制(HI)试验
分别用H5、H7和H9亚型AI标准阳性血清及ND、EDS-76病毒标准阳性血清与HA为阳性的鸡胚尿囊液进行HI试验。结果表明,与H5、H7、ND和EDS-76病毒标准阳性血清反应为阴性,与H9亚型AI标准阳性血清反应为阳性。
3在Vero细胞的传代与收获
3.1将收获的组织毒,用灭菌生理盐水稀释后,接种80%长成单层后的Vero细胞,37℃培养3天,放入-20℃中冻融3次,收获病毒液。
3.2重复上述试验10次,直至病毒在Vero细胞增值良好。
本发明的H9亚型禽流感病毒VERO细胞适应株HY株可用于制备H9亚型禽流感病毒病毒液,其病毒增殖速度和产量上都优于目前鸡胚培养的禽流感病毒,以及未驯化的H9亚型禽流感病毒病毒株。
将本发明的H9亚型禽流感病毒VERO细胞适应株HY株用于制备H9亚型禽流感灭活疫苗,具有广泛的应用前景。
本发明一种疫苗组合物,其特征在于含有本发明所述的H9亚型禽流感病毒Vero细胞适应株。所述的疫苗组合物,其特征在于还可进一步包含药学上接受的载体或佐剂。
通过比较实验发现,利用本发明的VERO细胞适应株HY株生产疫苗新方法与利用鸡胚生产的老方法的比较,具有以下优点:
1、维持液中加入的胰蛋白酶是经过壳聚糖包被后,起到缓慢释放的作用;
2、细胞苗在增殖速度和产量上都优于目前鸡胚培养的禽流感疫苗;
3、降低生产成本;
4、细胞苗的免疫效力不低于利用鸡胚生产的流感灭活苗。
具体实施方式
下面通过实验并结合实施例对本发明做进一步说明,应该理解的是,这些实施例仅用于例证的目的,决不限制本发明的保护范围。
试剂和材料:
毒株:H9亚型禽流感病毒VERO细胞适应株HY株,保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,其菌种保藏编号为CGMCC.5409。
H9亚型禽流感病毒HY株(未驯化)由哈药集团生物疫苗有限公司保存,提供。
材料:10~11日龄SPF鸡胚为哈药集团生物疫苗有限公司SPF鸡场种蛋在本研发中心孵化、vero细胞购自中国兽药监察所、0.22μm滤器购自PALL公司。
试剂:优质白油购自美国索尼泊尔公司、司本-80、吐温-80购自新加坡禾大公司、硬脂酸铝购自沈阳东兴试剂厂、脱乙酰度为85%的壳聚糖购自Sigma公司、胰酶购自GIBICO公司、三聚磷酸钠购自天津市光复精细化工研究所。H5和H9亚型AI标准阳性血清购买自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所;H7亚型AI标准阳性血清及ND、EDS-76病毒标准阳性血清购买中国兽医药品监察所。
实施例1H9亚型禽流感病毒VERO细胞适应株HY株的获得
1原始病毒株的分离
病料来自黑龙江省双城市郊某养殖场,采集濒死鸡气管拭子和泄殖腔拭子,用2000单位青、链霉素溶液中处理后,接种鸡胚,收集48h~78h鸡胚尿囊液。对收获的鸡胚液进行血凝试验,HA血凝价为9log2。
2病毒分离株血凝抑制(HI)试验
分别用H5、H7和H9亚型AI标准阳性血清及ND、EDS-76病毒标准阳性血清与HA为阳性的鸡胚尿囊液进行HI试验。结果表明,与H5、H7、ND和EDS-76病毒标准阳性血清反应为阴性,与H9亚型AI标准阳性血清反应为阳性。
3在Vero细胞的传代与收获
3.1将收获的组织毒,用灭菌生理盐水稀释后,接种80%长成单层后的Vero细胞,37℃培养3天,放入-20℃中冻融3次,收获病毒液。
3.2重复上述试验10次,直至病毒在Vero细胞增殖良好。
获得一株能够在Vero细胞增殖良好的病毒株,命名为H9亚型禽流感病毒VERO细胞适应株HY株,保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,其菌种保藏编号为CGMCC5409。
实施例2利用H9亚型禽流感病毒VERO细胞适应株HY株生产流感病毒灭活疫苗
1、壳聚糖纳米粒包埋法固定化胰酶的制备
(1)称取脱乙酰度为85%的壳聚糖,用1%的乙酸溶解,制成浓度为0.5~2mg/mL的壳聚糖溶液,过0.22μm滤器。称取胰酶,用去离子水溶解,制成浓度为500μg/mL的胰酶溶液,过0.22μm滤器。称取三聚磷酸钠,用去离子水溶解,制成浓度为1.0~2.0mg/mL的三聚磷酸钠溶液,过0.22μm滤器。
(2)取5mL壳聚糖溶液,滴加2.5~7.5mL500μg/mL的胰酶溶液,磁力搅拌3min,获得溶液A;
(3)溶液A在室温、无菌条件下以900~1300r/min磁力搅拌30s,然后逐滴加入2.5mL的三聚磷酸钠溶液,继续磁力搅拌10~30min,获得溶液B;
(4)将溶液B于4℃、12000r/min离心2min,取沉淀并用等体积的PBS(pH7.4)洗三次,然后加入等体积的PBS(pH7.4)悬浮,真空冷冻干燥24h,获得包埋胰酶的壳聚糖纳米粒。
2、H9N2亚型VERO细胞适应株AIV HY株细胞病毒液的制备
(1)接种:取H9N2亚型VERO细胞适应株AIV HY株作为生产用种毒,用灭菌生理盐水作适当稀释(10-510-7),待细胞80%长成单层后,弃掉细胞培养液,按培养液体积的1/10接毒,37度吸附1小时,在维持液中加入经壳聚糖包被的胰蛋白酶,终浓度为6μg/ml,37度培养3天,收获病毒液。
(2)病毒液收获:收获病毒液,放入-20度冰柜中反复冻融3次,测定每个容器中病毒的HA效价,HA效价低于1:128者弃去。同时作无菌检验应无菌生长。收获的病毒液灭活前在2~8℃保存,应不超过5日。
(3)病毒液灭活
将病毒液注入灭活灌,开启灭活罐的搅拌器,准确量取10%的甲醛溶液,在不断搅拌时加入至含抗原液的灭活灌中,使其充分搅拌均匀。甲醛溶液终浓度为0.1%。
将灭活罐升温至37℃(以罐内温度达到37℃开始计时),维持灭活时间16小时,期间不停缓慢搅拌。
灭活结束后,取样10ml,用于做灭活检验和无菌检验。灭活后的病毒液在2-8℃保存不超过15天。
(4)半成品检验
无菌检验:取已经灭活的病毒胚液,按《中国兽药典》附录15页,对灭活的AIV病毒液进行检验,应无菌生长。
灭活检验:取经甲醛灭活的AIV(H9)病毒胚液,分别接种10~11日龄SPF鸡胚尿囊腔内,每种病毒液接种6枚鸡胚,每胚0.2mL,置36~37℃孵育,每日照胚2次,非特异死亡应不超过1个。培养96小时,全部取出。分别测每个鸡胚液的HA效价,HA效价均应小于2log2,收获的鸡胚液再传一代,HA效价均应小于2log2,认为AIV(H9)灭活完全。
(5)病毒含量测定
将灭活前取出的浓缩病毒胚液10倍系列稀释,取10-6、10-7、10-8、10-94个稀释度分别接种10~11日龄SPF鸡胚5个,每胚尿囊腔内接种0.1mL,24小时前死亡鸡胚弃去不记,每日照蛋2次,观察5日,无论死胚、活胚均应测定血凝价,血凝价≥1:16(微量法)者判为感染。按Reed-Muench法计算EID50,每0.1mL病毒含量≥107.0EID50,方可用于制苗。
3、油乳剂灭活疫苗的制备
油相制备:取优质白油94份(以毫升为单位),加司本-806份(以毫升为单位),混合后加热,另加硬脂酸铝2份(以克为单位),一边加一边搅拌,直至透明为止,高压灭菌,冷却后备用。
水相制备:将灭活的病毒细胞液,取4份吐温-80,加入到混合后的抗原液96份中,使吐温-80充分溶解。
配苗及乳化:取2份油相加入乳化灌内,开动电机慢速搅拌,同时徐徐加入上述1份水相,加完后继续搅拌,同时加入1%硫柳汞溶液,使其最终浓度为0.01%;然后通过均质机乳化。制成禽流感(H9亚型)灭活疫苗。乳化后,取样3~5mL,以3000r/min离心15分钟,若有分层现象,应重复乳化1次。
4、分装:将乳化好的疫苗定量分装,加盖密封和标签,于2~8℃保存,待检。
实施例3利用细胞毒和组织毒制备得到的疫苗的比较
按照实施例2的方法生产的,利用本发明驯化后的H9亚型禽流感病毒VERO细胞适应株HY株(细胞毒)生产的疫苗与按照实验例1的方法生产的,利用未驯化的H9亚型禽流感病毒病毒株(组织毒)生产的疫苗进行比较,为了验证细胞毒的特性,分别制备了10批次组织毒和细胞毒,并测定了相关技术指标,现将其中一些指标的比较结果总结如下,如表1-5所述:
表1两种种毒红细胞凝集价比较
批次 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 |
组织毒 | 1︰128 | 1︰128 | 1︰512 | 1︰256 | 1︰256 | 1︰128 | 1︰256 | 1︰128 | 1︰64 | 1︰256 |
细胞毒 | 1︰128 | 1︰128 | 1︰512 | 1︰256 | 1︰128 | 1︰512 | 1︰256 | 1︰256 | 1︰256 | 1︰256 |
表2两种种毒病毒含量的比较(lg EID50)
批次 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 |
组织毒 | 7.5 | 7.7 | 7.7 | 7.5 | 7.9 | 7.9 | 7.5 | 8.1 | 7.9 | 7.7 |
细胞毒 | 7.7 | 7.9 | 7.9 | 7.5 | 7.5 | 7.9 | 7.9 | 8.1 | 7.7 | 7.9 |
表3两种种毒鸡静脉接种致病指数的比较
批次 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 |
组织毒 | 0.18 | 0.19 | 0.18 | 0.18 | 0.19 | 0.17 | 0.18 | 0.19 | 0.18 | 0.18 |
细胞毒 | 0.19 | 0.19 | 0.18 | 0.18 | 0.18 | 0.18 | 0.19 | 0.17 | 0.18 | 0.19 |
表4两种种毒在鸡只分离率的比较
批次 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 |
组织毒 | 100% | 100% | 100% | 100% | 100% | 100% | 100% | 100% | 100% | 100% |
细胞毒 | 100% | 100% | 100% | 100% | 100% | 100% | 100% | 100% | 100% | 100% |
21~28日龄SPF鸡30只,由购自哈药集团生物疫苗有限公司SPF鸡场的SPF鸡胚自行孵化后使用。疫苗免疫组为2组,每组10只鸡,分别免疫细胞毒灭活苗和组织毒灭活苗,各皮下注射疫苗0.3ml,另10只作对照组。接种后21~28日,所有鸡只各静脉注射H9亚型禽流感病毒HY株0.2ml(≥107.0EID50),攻毒后第5日,采集每只鸡的泄殖腔拭子进行病毒分离。将每只鸡的样品经尿囊腔内接种9~11日龄SPF鸡胚5枚。孵育观察5日,无论死胚、活胚均应测定鸡胚液血凝价,以5枚鸡胚中至少有1枚鸡胚的鸡胚液血凝价不低于1∶16(微量法)判为病毒分离阳性。对病毒分离为阴性的样品,应盲传1次,再次测定HA价。两种种毒灭活苗免疫保护率的比较如表5所示。
表5两种种毒灭活苗免疫保护率的比较
批次 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 |
组织苗保护率 | 100% | 90% | 100% | 90% | 100% | 100% | 90% | 100% | 100% | 100% |
细胞苗保护率 | 90% | 90% | 100% | 100% | 100% | 90% | 100% | 100% | 100% | 100% |
如上所述,两种病毒的半成品红细胞凝集价、鸡静脉接种致病指数和分离率没有明显的差异;而病毒含量、免疫原性细胞毒较组织毒略有提高,而且在生产过程中,由于适应株能够快速且稳定的在Vero细胞中增殖,病毒产量大,滴度高,因此,细胞毒在生产中有着重要的应用价值。
实验例1利用为驯化的H9亚型禽流感病毒生产流感病毒灭活疫苗
为方便比较,本实验例所采用的病毒毒株为实施例1中所分离得到的原始病毒株(组织毒,未驯化),其他H9亚型禽流感病毒株同样适用于本实验例。
1、壳聚糖纳米粒包埋法固定化胰酶的制备
(1)称取脱乙酰度为85%的壳聚糖,用1%的乙酸溶解,制成浓度为0.5~2mg/mL的壳聚糖溶液,过0.22μm滤器。称取胰酶,用去离子水溶解,制成浓度为500μg/mL的胰酶溶液,过0.22μm滤器。称取三聚磷酸钠,用去离子水溶解,制成浓度为1.0~2.0mg/mL的三聚磷酸钠溶液,过0.22μm滤器。
(2)取5mL壳聚糖溶液,滴加2.5~7.5mL500μg/mL的胰酶溶液,磁力搅拌3min,获得溶液A;
(3)溶液A在室温、无菌条件下以900~1300r/min磁力搅拌30s,然后逐滴加入2.5mL的三聚磷酸钠溶液,继续磁力搅拌10~30min,获得溶液B;
(4)将溶液B于4℃、12000r/min离心2min,取沉淀并用等体积的PBS(pH7.4)洗三次,然后加入等体积的PBS(pH7.4)悬浮,真空冷冻干燥24h,获得包埋胰酶的壳聚糖纳米粒。
2、H9N2亚型病毒株细胞病毒液的制备
(1)接种:取H9N2亚型病毒株作为病毒种毒,用灭菌生理盐水作适当稀释(10-510-7),待细胞80%长成单层后,弃掉细胞培养液,按培养液体积的1/10接毒,37度吸附1小时,在维持液中加入经壳聚糖包被的胰蛋白酶,终浓度为6μg/ml,37度培养3天,收获病毒液。
(2)病毒液收获:收获病毒液,放入-20度冰柜中反复冻融3次,测定每个容器中病毒的HA效价,HA效价低于1:128者弃去。同时作无菌检验应无菌生长。收获的病毒液灭活前在2~8℃保存,应不超过5日。
(3)病毒液灭活
将病毒液注入灭活灌,开启灭活罐的搅拌器,准确量取10%的甲醛溶液,在不断搅拌时加入至含抗原液的灭活灌中,使其充分搅拌均匀。甲醛溶液终浓度为0.1%。
将灭活罐升温至37℃(以罐内温度达到37℃开始计时),维持灭活时间16小时,期间不停缓慢搅拌。
灭活结束后,取样10ml,用于做灭活检验和无菌检验。灭活后的病毒液在2-8℃保存不超过15天。
(4)半成品检验
无菌检验:取已经灭活的病毒胚液,按《中国兽药典》附录15页,对灭活的AIV病毒液进行检验,应无菌生长。
灭活检验:取经甲醛灭活的AIV(H9)病毒胚液,分别接种10~11日龄SPF鸡胚尿囊腔内,每种病毒液接种6枚鸡胚,每胚0.2mL,置36~37℃孵育,每日照胚2次,非特异死亡应不超过1个。培养96小时,全部取出。分别测每个鸡胚液的HA效价,HA效价均应小于2log2,收获的鸡胚液再传一代,HA效价均应小于2log2,认为AIV(H9)灭活完全。
(5)病毒含量测定
将灭活前取出的浓缩病毒胚液10倍系列稀释,取10-6、10-7、10-8、10-94个稀释度分别接种10~11日龄SPF鸡胚5个,每胚尿囊腔内接种0.1mL,24小时前死亡鸡胚弃去不记,每日照蛋2次,观察5日,无论死胚、活胚均应测定血凝价,血凝价≥1:16(微量法)者判为感染。按Reed-Muench法计算EID50,每0.1mL病毒含量≥107.0EID50,方可用于制苗。
3、油乳剂灭活疫苗的制备
油相制备:取优质白油94份(以毫升为单位),加司本-806份(以毫升为单位),混合后加热,另加硬脂酸铝2份(以克为单位),一边加一边搅拌,直至透明为止,高压灭菌,冷却后备用。
水相制备:将灭活的病毒细胞液,取4份吐温-80,加入到混合后的抗原液96份中,使吐温-80充分溶解。
配苗及乳化:取2份油相加入乳化灌内,开动电机慢速搅拌,同时徐徐加入上述1份水相,加完后继续搅拌,同时加入1%硫柳汞溶液,使其最终浓度为0.01%;然后通过均质机乳化。制成禽流感(H9亚型)灭活疫苗。乳化后,取样3~5mL,以3000r/min离心15分钟,若有分层现象,应重复乳化1次。
4、分装:将乳化好的疫苗定量分装,加盖密封和标签,于2~8℃保存,待检。
以上所述仅为本发明的优选实施例,对本发明而言仅是说明性的,而非限制性的;本领域普通技术人员理解,在本发明权利要求所限定的精神和范围内可对其进行许多改变,修改,甚至等效变更,但都将落入本发明的保护范围内。
Claims (4)
1.一种H9亚型禽流感病毒Vero细胞适应株,其特征在于所述的Vero细胞适应株为H9亚型禽流感病毒Vero细胞适应株HY株,分类命名为禽流感病毒H9亚型,保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,其保藏编号为:CGMCC5409。
2.权利要求1所述的Vero细胞适应株在生产H9亚型禽流感病毒中的应用。
3.权利要求1所述的Vero细胞适应株在制备预防H9亚型禽流感疫苗中的应用。
4.一种疫苗组合物,其特征在于含有权利要求1所述的H9亚型禽流感病毒Vero细胞适应株。
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封闭连续细胞培养生产流感病毒工艺过程关键技术的研究;罗凤山;《中国博士学位论文全文数据库 工程科技Ⅰ辑》;20091215(第12期);摘要,正文第33,42页 * |
罗凤山.封闭连续细胞培养生产流感病毒工艺过程关键技术的研究.《中国博士学位论文全文数据库 工程科技Ⅰ辑》.2009,(第12期),B016-19. |
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