CN102586194B - H9亚型禽流感病毒Vero细胞适应株及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种H9亚型禽流感病毒Vero细胞适应株及其在制备预防H9亚型禽流感疫苗中的应用。本发明得到的适应株应用于Vero细胞其病毒增殖速度和产量上都优于目前鸡胚培养的禽流感病毒，以及未驯化的H9亚型禽流感病毒病毒株。本发明的H9亚型禽流感病毒Vero细胞适应株能够替代鸡胚快速、大量生产流感病毒，具有广泛的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种能够在Vero细胞中稳定增殖的细胞株及其应用，特别涉及一种H9亚型禽流感病毒Vero细胞适应株及其应用。属于疫苗制备领域。
背景技术
禽流行性感冒(简称禽流感，AI)是由A型流感病毒引起的禽类的感染和/或疾病综合症。引起AI的病原称为禽流感病毒。
根据世界动物卫生组织（OIE）的疾病分类标准，高致病性禽流感属A类疾病，我国也将其列为一类传染病，其传播速度快、发病率和死亡率高；而中等到低等毒力的AIV可引起亚临床症状，出现产蛋下降、呼吸系统或全身性感染等多种程度不同的各种症状。鸡群感染该病毒，严重影响鸡的生产性能。肉仔鸡增重减慢，死亡数量增加，易继发患其它细菌性疾病。H9N2亚型AIV是一种低等毒力的病毒，可引起临床或亚临床症状。目前，在全世界从各种家禽和野生禽中分离到上千株H9N2亚型AIV，90年代以来，在世界许多国家发生；自1998年，国内许多鸡群发生H9N2亚型禽流感的报道，H9N2亚型AIV在我国广泛存在，并且多呈低致病性感染，然而由于其分布广泛并且有逐渐蔓延之势，因此给养禽业造成的威胁是巨大的。
预防该病最行之有效的办法就是疫苗的接种，目前，市售的禽流感疫苗绝大多数为鸡胚组织苗，相对于细胞苗而言，其具有成本高、产品质量批间差大、且容易生产鸡源性潜在疾病的感染等缺点。近几年，随着禽流感的频繁暴发以及跨种属传播，需要一种可在流感大流行时能够替代鸡胚快速、大量生产流感病毒的细胞培养系统。
发明内容
针对现有技术中的问题，本发明所要解决的技术问题是提供一种能够在Vero细胞中稳定增殖的H9亚型禽流感病毒Vero细胞适应株。
本发明所要解决的技术问题是通过以下技术手段实现的：
2011年初，本发明人从黑龙江省双城市郊某养殖场分离得到一株禽流感病毒（H9亚型）病毒株，其具有经胰酶处理后能在细胞上增殖的特性，基于此，本研究针对组织苗的不足，HY株的特性，将其驯化为一株能够在Vero细胞上良好增殖的VERO细胞适应株，并将其命名为H9亚型禽流感病毒VERO细胞适应株HY株，其具有经胰酶处理后能在细胞上增殖的特性，可用于在Vero传代细胞中增殖进而制备禽流感病毒灭活疫苗。
所述的H9亚型禽流感病毒VERO细胞适应株HY株，分类命名为禽流感病毒（H9亚型），保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所，其菌种保藏编号为：CGMCC5409，保藏日期为2011年10月28日。
本发明的H9亚型禽流感病毒VERO细胞适应株HY株是通过以下方法制备得到的：
1病毒的分离
病料来自黑龙江省双城市郊某养殖场，采集濒死鸡气管拭子和泄殖腔拭子，用2000单位青、链霉素溶液中处理后，接种鸡胚，收集48h~78h鸡胚尿囊液。对收获的鸡胚液进行血凝试验，HA血凝价为9log2。
2病毒分离株血凝抑制（HI）试验
分别用H5、H7和H9亚型AI标准阳性血清及ND、EDS-76病毒标准阳性血清与HA为阳性的鸡胚尿囊液进行HI试验。结果表明，与H5、H7、ND和EDS-76病毒标准阳性血清反应为阴性，与H9亚型AI标准阳性血清反应为阳性。
3在Vero细胞的传代与收获
3.1将收获的组织毒，用灭菌生理盐水稀释后，接种80%长成单层后的Vero细胞，37℃培养3天，放入-20℃中冻融3次，收获病毒液。
3.2重复上述试验10次，直至病毒在Vero细胞增值良好。
本发明的H9亚型禽流感病毒VERO细胞适应株HY株可用于制备H9亚型禽流感病毒病毒液，其病毒增殖速度和产量上都优于目前鸡胚培养的禽流感病毒，以及未驯化的H9亚型禽流感病毒病毒株。
将本发明的H9亚型禽流感病毒VERO细胞适应株HY株用于制备H9亚型禽流感灭活疫苗，具有广泛的应用前景。
本发明一种疫苗组合物，其特征在于含有本发明所述的H9亚型禽流感病毒Vero细胞适应株。所述的疫苗组合物，其特征在于还可进一步包含药学上接受的载体或佐剂。
通过比较实验发现，利用本发明的VERO细胞适应株HY株生产疫苗新方法与利用鸡胚生产的老方法的比较，具有以下优点：
1、维持液中加入的胰蛋白酶是经过壳聚糖包被后，起到缓慢释放的作用；
2、细胞苗在增殖速度和产量上都优于目前鸡胚培养的禽流感疫苗；
3、降低生产成本；
4、细胞苗的免疫效力不低于利用鸡胚生产的流感灭活苗。
具体实施方式
下面通过实验并结合实施例对本发明做进一步说明，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，决不限制本发明的保护范围。
试剂和材料：
毒株：H9亚型禽流感病毒VERO细胞适应株HY株，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其菌种保藏编号为CGMCC.5409。
H9亚型禽流感病毒HY株（未驯化）由哈药集团生物疫苗有限公司保存，提供。
材料：10～11日龄SPF鸡胚为哈药集团生物疫苗有限公司SPF鸡场种蛋在本研发中心孵化、vero细胞购自中国兽药监察所、0.22μm滤器购自PALL公司。
试剂：优质白油购自美国索尼泊尔公司、司本-80、吐温-80购自新加坡禾大公司、硬脂酸铝购自沈阳东兴试剂厂、脱乙酰度为85%的壳聚糖购自Sigma公司、胰酶购自GIBICO公司、三聚磷酸钠购自天津市光复精细化工研究所。H5和H9亚型AI标准阳性血清购买自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所；H7亚型AI标准阳性血清及ND、EDS-76病毒标准阳性血清购买中国兽医药品监察所。
实施例1H9亚型禽流感病毒VERO细胞适应株HY株的获得
1原始病毒株的分离
病料来自黑龙江省双城市郊某养殖场，采集濒死鸡气管拭子和泄殖腔拭子，用2000单位青、链霉素溶液中处理后，接种鸡胚，收集48h~78h鸡胚尿囊液。对收获的鸡胚液进行血凝试验，HA血凝价为9log2。
2病毒分离株血凝抑制（HI）试验
分别用H5、H7和H9亚型AI标准阳性血清及ND、EDS-76病毒标准阳性血清与HA为阳性的鸡胚尿囊液进行HI试验。结果表明，与H5、H7、ND和EDS-76病毒标准阳性血清反应为阴性，与H9亚型AI标准阳性血清反应为阳性。
3在Vero细胞的传代与收获
3.1将收获的组织毒，用灭菌生理盐水稀释后，接种80%长成单层后的Vero细胞，37℃培养3天，放入-20℃中冻融3次，收获病毒液。
3.2重复上述试验10次，直至病毒在Vero细胞增殖良好。
获得一株能够在Vero细胞增殖良好的病毒株，命名为H9亚型禽流感病毒VERO细胞适应株HY株，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其菌种保藏编号为CGMCC5409。
实施例2利用H9亚型禽流感病毒VERO细胞适应株HY株生产流感病毒灭活疫苗
1、壳聚糖纳米粒包埋法固定化胰酶的制备
（1）称取脱乙酰度为85%的壳聚糖，用1%的乙酸溶解，制成浓度为0.5～2mg/mL的壳聚糖溶液，过0.22μm滤器。称取胰酶，用去离子水溶解，制成浓度为500μg/mL的胰酶溶液，过0.22μm滤器。称取三聚磷酸钠，用去离子水溶解，制成浓度为1.0～2.0mg/mL的三聚磷酸钠溶液，过0.22μm滤器。
（2）取5mL壳聚糖溶液，滴加2.5～7.5mL500μg/mL的胰酶溶液，磁力搅拌3min，获得溶液A；
（3）溶液A在室温、无菌条件下以900～1300r/min磁力搅拌30s，然后逐滴加入2.5mL的三聚磷酸钠溶液，继续磁力搅拌10～30min，获得溶液B；
（4）将溶液B于4℃、12000r/min离心2min，取沉淀并用等体积的PBS（pH7.4）洗三次，然后加入等体积的PBS（pH7.4）悬浮，真空冷冻干燥24h，获得包埋胰酶的壳聚糖纳米粒。
2、H9N2亚型VERO细胞适应株AIV HY株细胞病毒液的制备
（1）接种：取H9N2亚型VERO细胞适应株AIV HY株作为生产用种毒，用灭菌生理盐水作适当稀释（10-510-7），待细胞80%长成单层后，弃掉细胞培养液，按培养液体积的1/10接毒，37度吸附1小时，在维持液中加入经壳聚糖包被的胰蛋白酶，终浓度为6μg/ml，37度培养3天，收获病毒液。
（2）病毒液收获：收获病毒液，放入-20度冰柜中反复冻融3次，测定每个容器中病毒的HA效价，HA效价低于1:128者弃去。同时作无菌检验应无菌生长。收获的病毒液灭活前在2～8℃保存，应不超过5日。
（3）病毒液灭活
将病毒液注入灭活灌，开启灭活罐的搅拌器，准确量取10%的甲醛溶液，在不断搅拌时加入至含抗原液的灭活灌中，使其充分搅拌均匀。甲醛溶液终浓度为0.1%。
将灭活罐升温至37℃（以罐内温度达到37℃开始计时），维持灭活时间16小时，期间不停缓慢搅拌。
灭活结束后，取样10ml，用于做灭活检验和无菌检验。灭活后的病毒液在2-8℃保存不超过15天。
（4）半成品检验
无菌检验：取已经灭活的病毒胚液，按《中国兽药典》附录15页,对灭活的AIV病毒液进行检验，应无菌生长。
灭活检验：取经甲醛灭活的AIV(H9)病毒胚液，分别接种10～11日龄SPF鸡胚尿囊腔内，每种病毒液接种6枚鸡胚，每胚0.2mL，置36~37℃孵育，每日照胚2次，非特异死亡应不超过1个。培养96小时，全部取出。分别测每个鸡胚液的HA效价，HA效价均应小于2log2，收获的鸡胚液再传一代，HA效价均应小于2log2，认为AIV(H9)灭活完全。
（5）病毒含量测定
将灭活前取出的浓缩病毒胚液10倍系列稀释，取10-6、10-7、10-8、10-94个稀释度分别接种10～11日龄SPF鸡胚5个，每胚尿囊腔内接种0.1mL，24小时前死亡鸡胚弃去不记，每日照蛋2次，观察5日，无论死胚、活胚均应测定血凝价，血凝价≥1:16（微量法）者判为感染。按Reed-Muench法计算EID50，每0.1mL病毒含量≥107.0EID50，方可用于制苗。
3、油乳剂灭活疫苗的制备
油相制备：取优质白油94份（以毫升为单位），加司本-806份（以毫升为单位），混合后加热，另加硬脂酸铝2份（以克为单位），一边加一边搅拌，直至透明为止，高压灭菌，冷却后备用。
水相制备：将灭活的病毒细胞液，取4份吐温-80，加入到混合后的抗原液96份中，使吐温-80充分溶解。
配苗及乳化：取2份油相加入乳化灌内，开动电机慢速搅拌，同时徐徐加入上述1份水相，加完后继续搅拌，同时加入1%硫柳汞溶液，使其最终浓度为0.01%；然后通过均质机乳化。制成禽流感（H9亚型）灭活疫苗。乳化后，取样3～5mL，以3000r/min离心15分钟，若有分层现象，应重复乳化1次。
4、分装：将乳化好的疫苗定量分装，加盖密封和标签，于2~8℃保存，待检。
实施例3利用细胞毒和组织毒制备得到的疫苗的比较
按照实施例2的方法生产的，利用本发明驯化后的H9亚型禽流感病毒VERO细胞适应株HY株（细胞毒）生产的疫苗与按照实验例1的方法生产的，利用未驯化的H9亚型禽流感病毒病毒株（组织毒）生产的疫苗进行比较，为了验证细胞毒的特性，分别制备了10批次组织毒和细胞毒，并测定了相关技术指标，现将其中一些指标的比较结果总结如下，如表1-5所述：
表1两种种毒红细胞凝集价比较
| 批次 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 |
| 组织毒 | 1︰128 | 1︰128 | 1︰512 | 1︰256 | 1︰256 | 1︰128 | 1︰256 | 1︰128 | 1︰64 | 1︰256 |
| 细胞毒 | 1︰128 | 1︰128 | 1︰512 | 1︰256 | 1︰128 | 1︰512 | 1︰256 | 1︰256 | 1︰256 | 1︰256 |
表2两种种毒病毒含量的比较（lg EID50）
| 批次 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 |
| 组织毒 | 7.5 | 7.7 | 7.7 | 7.5 | 7.9 | 7.9 | 7.5 | 8.1 | 7.9 | 7.7 |
| 细胞毒 | 7.7 | 7.9 | 7.9 | 7.5 | 7.5 | 7.9 | 7.9 | 8.1 | 7.7 | 7.9 |
表3两种种毒鸡静脉接种致病指数的比较
| 批次 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 |
| 组织毒 | 0.18 | 0.19 | 0.18 | 0.18 | 0.19 | 0.17 | 0.18 | 0.19 | 0.18 | 0.18 |
| 细胞毒 | 0.19 | 0.19 | 0.18 | 0.18 | 0.18 | 0.18 | 0.19 | 0.17 | 0.18 | 0.19 |
表4两种种毒在鸡只分离率的比较
| 批次 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 |
| 组织毒 | 100% | 100% | 100% | 100% | 100% | 100% | 100% | 100% | 100% | 100% |
| 细胞毒 | 100% | 100% | 100% | 100% | 100% | 100% | 100% | 100% | 100% | 100% |
21～28日龄SPF鸡30只，由购自哈药集团生物疫苗有限公司SPF鸡场的SPF鸡胚自行孵化后使用。疫苗免疫组为2组，每组10只鸡，分别免疫细胞毒灭活苗和组织毒灭活苗，各皮下注射疫苗0.3ml，另10只作对照组。接种后21～28日，所有鸡只各静脉注射H9亚型禽流感病毒HY株0.2ml（≥107.0EID50），攻毒后第5日，采集每只鸡的泄殖腔拭子进行病毒分离。将每只鸡的样品经尿囊腔内接种9～11日龄SPF鸡胚5枚。孵育观察5日，无论死胚、活胚均应测定鸡胚液血凝价，以5枚鸡胚中至少有1枚鸡胚的鸡胚液血凝价不低于1∶16（微量法）判为病毒分离阳性。对病毒分离为阴性的样品，应盲传1次，再次测定HA价。两种种毒灭活苗免疫保护率的比较如表5所示。
表5两种种毒灭活苗免疫保护率的比较
| 批次 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 |
| 组织苗保护率 | 100% | 90% | 100% | 90% | 100% | 100% | 90% | 100% | 100% | 100% |
| 细胞苗保护率 | 90% | 90% | 100% | 100% | 100% | 90% | 100% | 100% | 100% | 100% |
如上所述，两种病毒的半成品红细胞凝集价、鸡静脉接种致病指数和分离率没有明显的差异；而病毒含量、免疫原性细胞毒较组织毒略有提高，而且在生产过程中，由于适应株能够快速且稳定的在Vero细胞中增殖，病毒产量大，滴度高，因此，细胞毒在生产中有着重要的应用价值。
实验例1利用为驯化的H9亚型禽流感病毒生产流感病毒灭活疫苗
为方便比较，本实验例所采用的病毒毒株为实施例1中所分离得到的原始病毒株（组织毒，未驯化），其他H9亚型禽流感病毒株同样适用于本实验例。
1、壳聚糖纳米粒包埋法固定化胰酶的制备
（1）称取脱乙酰度为85%的壳聚糖，用1%的乙酸溶解，制成浓度为0.5～2mg/mL的壳聚糖溶液，过0.22μm滤器。称取胰酶，用去离子水溶解，制成浓度为500μg/mL的胰酶溶液，过0.22μm滤器。称取三聚磷酸钠，用去离子水溶解，制成浓度为1.0～2.0mg/mL的三聚磷酸钠溶液，过0.22μm滤器。
（2）取5mL壳聚糖溶液，滴加2.5～7.5mL500μg/mL的胰酶溶液，磁力搅拌3min，获得溶液A；
（3）溶液A在室温、无菌条件下以900～1300r/min磁力搅拌30s，然后逐滴加入2.5mL的三聚磷酸钠溶液，继续磁力搅拌10～30min，获得溶液B；
（4）将溶液B于4℃、12000r/min离心2min，取沉淀并用等体积的PBS（pH7.4）洗三次，然后加入等体积的PBS（pH7.4）悬浮，真空冷冻干燥24h，获得包埋胰酶的壳聚糖纳米粒。
2、H9N2亚型病毒株细胞病毒液的制备
（1）接种：取H9N2亚型病毒株作为病毒种毒，用灭菌生理盐水作适当稀释（10-510-7），待细胞80%长成单层后，弃掉细胞培养液，按培养液体积的1/10接毒，37度吸附1小时，在维持液中加入经壳聚糖包被的胰蛋白酶，终浓度为6μg/ml，37度培养3天，收获病毒液。
（2）病毒液收获：收获病毒液，放入-20度冰柜中反复冻融3次，测定每个容器中病毒的HA效价，HA效价低于1:128者弃去。同时作无菌检验应无菌生长。收获的病毒液灭活前在2～8℃保存，应不超过5日。
（3）病毒液灭活
将病毒液注入灭活灌，开启灭活罐的搅拌器，准确量取10%的甲醛溶液，在不断搅拌时加入至含抗原液的灭活灌中，使其充分搅拌均匀。甲醛溶液终浓度为0.1%。
将灭活罐升温至37℃（以罐内温度达到37℃开始计时），维持灭活时间16小时，期间不停缓慢搅拌。
灭活结束后，取样10ml，用于做灭活检验和无菌检验。灭活后的病毒液在2-8℃保存不超过15天。
（4）半成品检验
无菌检验：取已经灭活的病毒胚液，按《中国兽药典》附录15页,对灭活的AIV病毒液进行检验，应无菌生长。
灭活检验：取经甲醛灭活的AIV(H9)病毒胚液，分别接种10～11日龄SPF鸡胚尿囊腔内，每种病毒液接种6枚鸡胚，每胚0.2mL，置36~37℃孵育，每日照胚2次，非特异死亡应不超过1个。培养96小时，全部取出。分别测每个鸡胚液的HA效价，HA效价均应小于2log2，收获的鸡胚液再传一代，HA效价均应小于2log2，认为AIV(H9)灭活完全。
（5）病毒含量测定
将灭活前取出的浓缩病毒胚液10倍系列稀释，取10-6、10-7、10-8、10-94个稀释度分别接种10～11日龄SPF鸡胚5个，每胚尿囊腔内接种0.1mL，24小时前死亡鸡胚弃去不记，每日照蛋2次，观察5日，无论死胚、活胚均应测定血凝价，血凝价≥1:16（微量法）者判为感染。按Reed-Muench法计算EID50，每0.1mL病毒含量≥107.0EID50，方可用于制苗。
3、油乳剂灭活疫苗的制备
油相制备：取优质白油94份（以毫升为单位），加司本-806份（以毫升为单位），混合后加热，另加硬脂酸铝2份（以克为单位），一边加一边搅拌，直至透明为止，高压灭菌，冷却后备用。
水相制备：将灭活的病毒细胞液，取4份吐温-80，加入到混合后的抗原液96份中，使吐温-80充分溶解。
配苗及乳化：取2份油相加入乳化灌内，开动电机慢速搅拌，同时徐徐加入上述1份水相，加完后继续搅拌，同时加入1%硫柳汞溶液，使其最终浓度为0.01%；然后通过均质机乳化。制成禽流感（H9亚型）灭活疫苗。乳化后，取样3～5mL，以3000r/min离心15分钟，若有分层现象，应重复乳化1次。
4、分装：将乳化好的疫苗定量分装，加盖密封和标签，于2~8℃保存，待检。
以上所述仅为本发明的优选实施例，对本发明而言仅是说明性的，而非限制性的；本领域普通技术人员理解，在本发明权利要求所限定的精神和范围内可对其进行许多改变，修改，甚至等效变更，但都将落入本发明的保护范围内。
Claims (4)
1.一种H9亚型禽流感病毒Vero细胞适应株，其特征在于所述的Vero细胞适应株为H9亚型禽流感病毒Vero细胞适应株HY株，分类命名为禽流感病毒H9亚型，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为：CGMCC5409。
2.权利要求1所述的Vero细胞适应株在生产H9亚型禽流感病毒中的应用。
3.权利要求1所述的Vero细胞适应株在制备预防H9亚型禽流感疫苗中的应用。
4.一种疫苗组合物，其特征在于含有权利要求1所述的H9亚型禽流感病毒Vero细胞适应株。
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| 封闭连续细胞培养生产流感病毒工艺过程关键技术的研究;罗凤山;《中国博士学位论文全文数据库 工程科技Ⅰ辑》;20091215(第12期);摘要，正文第33，42页 * |
| 罗凤山.封闭连续细胞培养生产流感病毒工艺过程关键技术的研究.《中国博士学位论文全文数据库 工程科技Ⅰ辑》.2009,(第12期),B016-19. |
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| Publication number | Publication date |
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| CN102586194A (zh) | 2012-07-18 |
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