CN104031888B

CN104031888B - 鸡新城疫病毒弱毒株、灭活疫苗及其应用

Info

Publication number: CN104031888B
Application number: CN201410116245.0A
Authority: CN
Inventors: 邢明伟; 柴洪亮; 曾祥伟; 侯志军; 田丽红
Original assignee: Northeast Forestry University
Current assignee: Northeast Forestry University
Priority date: 2014-03-26
Filing date: 2014-03-26
Publication date: 2016-04-06
Anticipated expiration: 2034-03-26
Also published as: CN104031888A

Abstract

本发明公开了鸡新城疫病毒弱毒株、灭活疫苗及其应用，属于鸡新城疫病毒株的分离和应用领域。本发明从鸡病料中分离得到一株鸡新城疫病毒弱毒株（DL11株），其微生物保藏编号为：CGMCC？NO.7958；经过血凝和血凝抑制试验证明本发明所分离的病毒株为鸡新城疫病毒株；静脉接种致病指数测定试验证明该病毒株为鸡新城疫病毒弱毒株。本发明分离的鸡新城疫病毒弱毒株半成品红细胞凝集价、病毒含量均高于《兽用生物制品规程》的标准，制备成本较低，适合大生产要求；用本发明的弱毒株制备的灭活疫苗，其免疫效力高，能抵抗强毒株攻击，可作为疫苗株应用于鸡新城疫的预防或诊断。

Description

鸡新城疫病毒弱毒株、灭活疫苗及其应用

技术领域

本发明涉及一株病毒弱毒株，尤其涉及一株鸡新城疫病毒（Newcastlediseasevirus）弱毒株，本发明还涉及该鸡新城疫病毒弱毒株制备的灭活疫苗及其在制备预防、治疗或诊断新城疫药物或试剂中的应用，属于鸡新城疫病毒弱毒株的分离和应用领域。

背景技术

新城疫（Newcastledisease，ND）是禽类的一种急性、高度接触性传染病，其病原为新城疫病毒(Newcastlediseasevirus，NDV)。ND给世界养禽业构成严重威胁并造成巨大损失，被国际兽疫局定为I类烈性传染病,因此新城疫是禽病研究的重点。尽管中国新城疫免疫接种已经普及多年并己基本上控制了典型新城疫的流行，但非典型ND仍时有发生，严重威胁着养鸡业的健康发展。

根据新城疫病毒株致病性程度和发病后的病理变化的不同将其分为速发型毒株、中发型毒株和缓发型毒株。NDV只有一种血清型，但不同毒株的致病力、生物学特性及理化特性却不尽相同，即使毒力相同的毒株，在病毒红细胞凝集谱、病毒热稳定性等方面也存在明显差异。单克隆抗体等技术的应用从免疫学角度证实了不同毒株间的抗原决定簇存在差异，同时也证明免疫压力足以导致NDV的抗原变异。分子克隆技术的发展又进一步从分子水平证实了不同毒株的基因组间核苷酸一级结构及蛋白质二级结构上的差异，这些差异的存在给目前只使用少数几株疫苗来防制ND这种严重的禽类传染病的可行性提出了质疑。

发明内容

本发明的目的之一是提供一株鸡新城疫病毒(Newcastlediseasevirus，NDV)弱毒株；

本发明的目的之二是将所述的鸡新城疫病毒弱毒株应用于防治或诊断鸡新城疫。

本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：

一株鸡新城疫病毒(Newcastlediseasevirus)弱毒株，其微生物保藏编号为：CGMCCNO.7958；分类命名为：鸡新城疫病毒；保藏单位：中国微生物保藏管理委员会普通微生物中心；保藏时间是2013年7月16日：保藏地址：中国北京朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

本发明主要通过以下方式分离得到所述的鸡新城疫病毒弱毒株：本发明人在黑龙江省大庆市郊某养殖场的濒死鸡中采集濒死鸡肝脏，研磨后用1500单位青、链霉素溶液于4℃处理12h，2000r/min离心，取上清接种鸡胚，收集48h-96h死亡鸡胚尿囊液。经过血凝和血凝抑制试验证明，本发明所分离的病毒株为鸡新城疫病毒株；本发明进一步将所收获的鸡胚尿囊液在鸡胚盲传5代；用PBS将长成单层的CEF清洗，接种万倍稀释的鸡胚毒，37℃吸附1小时后，加入含2%犊牛血清的DMEM，至37℃、5%CO₂环境培养，待细胞80%出现病变后，至-20℃冻融3次后，收获细胞毒，进行15次连续传代培养，传至第20代最终分离获得一株鸡新城疫病毒弱毒DL11株。

静脉接种致病指数（IVPI）的测定试验表明，本发明所分离的鸡新城疫病毒DL11株的IVPI为0，说明该DL11株为弱毒株，通过进一步实验证明，DL11株半成品的红细胞凝集价、病毒含量均高于《兽用生物制品规程》的标准，生产成本较低，适合大生产的要求；用DL11株制备的灭活疫苗的免疫效力远远高于1︰16，且能抵抗强毒株攻击，完全能作为疫苗株进行使用。

本发明的另一个目的是用所分离的鸡新城疫病毒弱毒株（DL11株）制备成鸡新城疫灭活疫苗，将其用于预防或治疗鸡新城疫。

由此，本发明提供了一种鸡新城疫灭活疫苗的制备方法，包括：

（1）培养所分离的鸡新城疫病毒弱毒株（DL11株），得到病毒液；

（2）向病毒液中加入灭活剂，将病毒液灭活；

（3）向灭活后的病毒液中加入佐剂制备得到水相；

（4）将水相加入到油相中，混合均匀，乳化，即得。

优选的，所述的水相按照以下方法制备得到：

按重量份计，取灭活抗原液96份，加入4份灭菌吐温-80，充分搅拌，直到吐温-80完全溶解，即得。

其中，所述的油相由白油、司本-80和硬脂酸铝组成；更优选的，所述的油相通过以下方法制备得到：按重量份计，将白油94份和司本-806份混合后加热，另加硬脂酸铝2份，边加边搅拌，直至透明为止，高压灭菌，冷却后备用，即得。

本发明所涉及到术语及定义

术语“灭活疫苗”是指包含不能再复制或生长的感染性生物或病原体的疫苗组合物。病原体可以是细菌、病毒或原生动物来源的。灭活可以通过多种方法来完成，包括冻融、化学处理、超声处理、辐射、热或足以阻止感染性生物或病原体复制或生长同时保留其免疫原性的任何其他常规方法。

术语“佐剂”是指加入疫苗中以增加疫苗的免疫原性的物质。

术语“药学上可接受的载体”指用于包含疫苗抗原的可以注射入宿主而无不良效应的流体媒介物。本领域已知的合适的药学上可接受的载体包括但不限于无菌水、盐水、葡萄糖、右旋糖或缓冲溶液。载体可以包含辅助试剂，包括但不限于稀释剂、稳定剂、防腐剂、湿润剂、乳化剂、pH缓冲剂、黏度增强添加剂或着色剂等。

术语“疫苗组合物”包括在药学上可接受的载体中用于在宿主中诱导免疫应答的至少一种抗原或免疫原。疫苗组合物可以以剂量或通过兽医学领域技术人员所熟知的技术或剂量进行施用，在施用剂量时可以综合考虑动物的年龄、性别、体重和得病状况等因素；施用途径可以是经皮例如皮肉、肌肉、皮下等；疫苗组合物可以单独施用，或可以与其它处理或治疗共同施用。疫苗组合物中还可以包含辅助物质，例如：湿润或乳化剂、pH缓冲剂、佐剂、黏度增强添加剂或着色剂等。

术语“免疫应答”指在动物引发的应答。免疫应答可以指细胞免疫、体液免疫或同时包含二者。

具体实施方式

通过下列实施例将更具体说明本发明的实施方式，但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。

通用的试验方法

一、微量红细胞凝集（HA）试验

1向微量血凝板每孔中加入PBS25μl，共做4行平行重复。

2吸取抗原加入到第1列各孔，每孔25μl，然后自左向右进行2倍系列稀释至第11列孔，从第11列各孔吸取25μl混合液，弃去。第12列各孔不加抗原，作为对照孔。

3向每孔中加入1%红细胞悬液25μl。

4将微量血凝板置微型震荡器上震荡1分钟。

5将微量血凝板置室温作用30分钟，判定结果。以使红细胞完全凝集的最高稀释度作为该抗原的HA效价。

二、微量血凝抑制（HI）试验

1在96孔微量板上，第1孔至第12孔，每孔加入25μlPBS。

2向第1孔中加入被检血清25μl，依次2倍系列稀释至第12孔，最后从第12孔弃去25μl混合液。

3向每孔中加入25μl4HA单位工作抗原液，置微型震荡器上震荡1分钟。

4置室温下作用30分钟。

5向每孔加入1%红细胞悬液25μl，置微型震荡器上震荡1分钟。

6置室温作用30分钟，判定结果。

7每次测定时应设阴性血清对照和已知HI抗体效价的阳性血清对照。

8结果判定当阴性血清HI效价不高于1∶8（微量法）、阳性血清HI效价与规定效价相比误差不超过1个滴度时，方可成立。红细胞沉淀呈泪珠状流淌，判为HI阳性；红细胞在孔底均匀分布或呈锯齿状凝集，判为HI阴性。以完全抑制4HA单位抗原的血清最高稀释度作为待检血清的HI抗体效价。

三、病毒含量的测定试验

将毒种用灭菌生理盐水作10倍系列稀释，取10^-7、10^-8、10^-93个稀释度，各尿囊腔内接种10～11日龄SPF鸡胚5枚，每胚0.1ml，置36～37℃继续孵育，48小时以前死亡的鸡胚弃去不计，在48～120小时死亡的鸡胚随时取出，至120小时，取出所有活胚，逐枚收获鸡胚液，分别测定红细胞凝集价，凝集价不低于1:160（微量法1:128）者判为感染，计算EID₅₀。每0.1ml病毒含量应不低于10^8.0EID₅₀。

实施例1鸡新城疫病毒弱毒株（DL11株）的分离、培养和鉴定

1、病料采集

鸡病料来自黑龙江省大庆市郊某养殖场，采集濒死鸡肝脏，研磨后用1500单位青、链霉素溶液于4℃处理12h，2000r/min离心，取上清接种鸡胚，收集48h～96h死亡鸡胚尿囊液。

2、病毒分离株血凝（HA）和血凝抑制（HI）试验

对收获的鸡胚液进行血凝试验，HA血凝价为8log₂。

分别用禽流感H5、H7和H9亚型标准阳性血清及ND、EDS标准阳性血清与鸡胚尿囊液进行HI试验。

结果表明，与禽流感H5、H9、H7亚型和EDS病毒标准阳性血清反应为阴性，与ND标准阳性血清反应为阳性。

3、分离培养

3.1病毒在鸡胚上的传代

将收获的病毒液在鸡胚盲传5代。

3.2病毒在细胞上的传代

3.2.1细胞的制备

取9～11日龄SPF鸡胚，去除头、四肢和内脏，剪成1mm³左右的组织块。PBS洗3遍，用0.25%胰酶消化5～15min，弃去胰酶，加入含10%犊牛血清的DMEM，用吸管将CEF细胞（请给出CEF细胞的商业购买途径）轻轻吹打均匀至培养瓶中，37℃、5%CO₂环境培养，待细胞长成单层后使用。

3.2.2接种与收获

用PBS将长成单层的CEF清洗3遍，接种万倍稀释的鸡胚毒，37℃吸附1小时后，加入含2%犊牛血清的DMEM，至37℃、5%CO₂环境培养，待细胞80%出现病变后，至-20℃冻融3次后，收获细胞毒。重复此步骤15次。部分代次种毒红细胞凝集价、种毒病毒含量、疫苗血清HI抗体以及疫苗攻毒保护率的测定数据结果分别见表1-4；收获细胞毒，进行15次连续传代培养，传至第20代，本发明最终筛选获得一株弱毒疫苗株（DL11株），将该DL11毒株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，微生物保藏编号为：CGMCCNo.7958。

表1部分代次种毒红细胞凝集价（HA）的测定

代次

F2

F5

F6

F8

F10

F12

F14

F16

F18

F20

HA

1︰128

1︰512

1︰64

1︰128

1︰256

1︰512

1︰256

表2部分代次种毒病毒含量的测定（单位：EID₅₀/0.1ml）

表3部分代次疫苗血清HI抗体的测定

代次	F1	F5	F10	F15	F20
						HI	1︰49.6	1︰59.2	1︰54.4	1︰67.2	1︰73.6

表4部分代次疫苗攻毒保护率的测定

代次	F1	F5	F10	F15	F20
						保护率	100%	100%	100%	100%	100%

4、静脉接种致病指数（IVPI）的测定

取6周龄SPF鸡10只，静脉接种10^-1稀释的F1代含毒尿囊液0.1ml，另取2只接种生理盐水做对照。每日在接种的相应时间观察，记录接种鸡情况，分正常、发病、麻痹和死亡。

观察10日后，累计正常、发病、麻痹和死亡动物数，根据不同权值累计总分数。结果表明，该DL11毒株的IVPI为0，证明DL11株为弱毒株。5、DL11株与LaSota株生产性能的比较

用北京株强毒（CVCCAV1611株）分别攻击用DL11株和LaSota株灭活疫苗免疫过的鸡，两者的保护率均为100%。但采用细胞培养生产DL11株的原液成本约为用鸡胚生产的32%，实验结果见表5：

表5两种生产方法的比较

项目	胚源	细胞源
			攻毒保护率	100%	100%
生产原料	鸡胚	鸡胚成纤维细胞
			抗原成本	0.78元/ml	0.25元/ml

实施例2鸡新城疫病毒DL11株种毒的制备

1、基础种子批建立

用筛选的第20代种毒（CGMCCNO.7958）接种长成单层的CEF，37℃吸附1小时后，加入含2%犊牛血清的DMEM，至37℃、5%CO₂环境培养，待细胞80%出现病变后，至-20℃冻融3次后，收获细胞毒，经2次冻融后，收获。连续传代不超过3代。

2、生产种子批建立

取基础种子，用灭菌生理盐水万倍稀释后，按病毒培养液量的1%接入形成单层的细胞培养物中，37℃吸附1小时后，加入含2%犊牛血清的DMEM，至37℃、5%CO₂环境培养，待细胞80%出现病变后，至-20℃冻融3次后，收获含毒细胞培养液。连续传代不超过5代。

实施例3鸡新城疫灭活疫苗的制备

为了验证细胞毒的特性，用筛选的第20代种毒（CGMCCNO.7958），用相同的方法，分别制备了10批次灭活疫苗，并测定了相关技术指标，具体说明如下。

1、病毒液的制备

1.1细胞的制备

取9～11日龄SPF鸡胚，去除头、四肢和内脏，剪成1mm³左右的组织块。PBS洗3遍，用0.25%胰酶消化5～15min，弃去胰酶，加入含10%犊牛血清的DMEM，用吸管将细胞轻轻吹打均匀，至培养瓶中，37℃环境培养，待细胞长成单层后使用。

1.2接种与收获

用PBS将长成单层的CEF清洗3遍，接种万倍稀释的第20代种毒（CGMCCNO.7958），37℃吸附1小时后，加入含2%犊牛血清的DMEM，至37℃环境培养，待细胞80%出现病变后，至-20℃冻融3次后，收获细胞毒。每瓶抽样测定血凝效价，HA效价低于1∶128者应弃去。同时无菌检验应为阴性。

2、灭活及灭活检验

2.1灭活

加入称量准确的10%甲醛溶液，充分混匀。甲醛溶液终浓度为0.1%。至37℃，维持灭活时间为16小时，期间不停摇匀。

2.2灭活检验

灭活结束后，取灭活病毒液，各尿囊腔内接种10～11日龄SPF鸡胚5枚，每胚0.2ml。置36～37℃孵育，培养96小时，每日照胚2次，非特异死亡均应不超过1枚。分别测每枚鸡胚液的HA效价，并盲传一代，HA效价均应不高于1︰4。

3、乳化、分装

3.1油相制备

取优质白油94份，加司本-806份，混合后加热，另加硬脂酸铝2份，边加边搅拌，直至透明为止，高压灭菌，冷却后备用。

3.2水相制备

取灭活抗原液96份，加入4份灭菌吐温-80，充分搅拌，直到吐温-80完全溶解。

3.3乳化

取2份油相加入乳化灌内，开动电机低速搅拌，同时徐徐加入1份水相，继续搅拌使油相与水相充分混匀乳化。

3.4分装

定量分装，加盖密封，并粘贴标签，置2～8℃保存。

4、半成品质量检验

半成品质量检验结果见表6、表7。

表6半成品红细胞凝集价

批次

01批

02批

03批

04批

05批

06批

07批

08批

09批

10批

HA效价

1:256

1︰256

1︰512

1︰128

1︰512

1︰128

1︰512

1︰256

1︰128

1:512

表7半成品病毒含量（单位：EID₅₀/0.1ml）

批次

01批

02批

03批

04批

05批

06批

07批

08批

09批

10批

病毒含量

10^8.5

10^8.83

10^8.68

10^8.5

10^8.68

10^8.5

10^8.63

10^8.38

10^8.63

试验例4灭活疫苗的免疫攻毒试验

一、试验疫苗

供试灭活疫苗：实施例3所制备的10批灭活疫苗，

二、试验方法

用30～60日龄SPF鸡15只，其中10只各皮下注射疫苗20μl（1/25羽份）；另5只作对照，不免疫。

接种后21～28日，每只鸡采血，分离血清，测定血清中的HI抗体。然后每只鸡各肌肉注射鸡新城疫病毒北京株强毒（CVCCAV1611株）10^5.0个ELD₅₀，观察14日。

HI抗体水平见表8，攻毒保护率见表9。

表8灭活疫苗效力检验血清HI抗体

表9灭活疫苗攻毒保护率试验

批次	01批	02批	03批	04批	05批	06批	07批	08批	09批	10批
											保护率	100%	100%	100%	100%	100%	100%	100%	100%	100%	100%

根据上述试验结果可见，本发明所分离的DL11株半成品的红细胞凝集价、病毒含量均高于《兽用生物制品规程》的标准，制备成本较低，适合大生产的要求；用其制备的灭活疫苗其免疫效力远远高于1︰16，且能抵抗强毒株攻击，完全可以作为疫苗株进行使用。

Claims

1.一株鸡新城疫病毒(Newcastlediseasevirus)弱毒株，其特征在于：其微生物保藏编号为：CGMCCNO.7958。

2.权利要求1所述的鸡新城疫病毒弱毒株在制备预防或诊断鸡新城疫药物或试剂中的用途。

3.一种预防或治疗鸡新城疫的疫苗组合物，其特征在于：含有预防或治疗上有效量的灭活的权利要求1所述的鸡新城疫病毒弱毒株以及药学上可接受的载体。

4.一种制备鸡新城疫灭活疫苗的方法，其特征在于：包括以下步骤：

(1)培养权利要求1所述的鸡新城疫病毒弱毒株，得到病毒液；

(2)向病毒液中加入灭活剂，将病毒液灭活；

(3)向灭活后的病毒液中加入佐剂制备得到水相；

(4)将水相加入到油相中，混合均匀，乳化，即得。

5.按照权利要求4所述的方法，其特征在于：所述的油相由白油、司本-80和硬脂酸铝组成。

6.按照权利要求5所述的方法，其特征在于：所述的油相通过以下方法制备得到：按重量份计，将白油94份和司本-806份混合后加热，另加硬脂酸铝2份，边加边搅拌直至透明为止，灭菌冷却，即得。