CN101869702B - 以悬浮微载体细胞培养系统产制的疫苗及其方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种以悬浮微载体细胞培养系统产制的疫苗及其方法，包括如下技术步骤：(1)将制苗用细胞接种到含有培养基与微载体的培养罐内；(2)将上述细胞与微载体混合均匀，使细胞贴附在微载体上；(3)在适当温度下，提供上述细胞足够的养分及气体，使细胞在上述微载体上继续生长；(4)将制苗用病毒制成病毒悬浮液，接种于上述细胞上，继续培养；每隔1～3日收获病毒液或含有病毒的细胞，并且更换培养液；(5)将上述收获的病毒液纯化后，视需要进行灭活，灭活后的病毒液加入适当佐剂，不经灭活的病毒液则加入适当的冻干保护剂，充分混匀后定量分装，即得到所需的疫苗。该方法生产工艺简单、可显著提高疫苗产量和质量。

Description

以悬浮微载体细胞培养系统产制的疫苗及其方法

技术领域

本发明属于生物制品技术领域，更具体是涉及一种以悬浮微载体细胞培养系统生产的疫苗以及其方法。

背景技术

目前公知的全病毒疫苗生产方法，多以鸡胚胎蛋、动物组织或细胞培养方式来产制病毒；然而，以鸡胚胎蛋产制病毒有蛋源质量及来源不稳定等问题，而以动物组织产制全病毒疫苗则含有太多外来的蛋白质，容易使施打对象引起过敏反应和神经方面的并发症；因此，较佳的方式是找到对该病毒具有感受性的细胞，以细胞培养方式来大量产制病毒。

以贴附型细胞培养生产病毒以制造全病毒疫苗(包括活毒及灭活疫苗)，其中细胞的大量培养是生产疫苗的关键之一，传统上，制苗用细胞系(贴附型)的培养，先经过EDTA-胰酶细胞分散消化传代，以细胞培养液于适当温度下在培养盘或培养瓶内培养，形成良好单层时，用于继续传代或接种病毒。目前实验室或企业大多使用转瓶自动培养系统(Roller BottleSystem)，使细胞可以获得充足的气体及养分交换。

然而，这种传统式细胞培养工艺的缺点是：准备时间繁杂，无法一次大量培养细胞，而且每一个培养盘或培养瓶只能培养单层细胞。若要短时间内大量培养，所需要的空间与设备使用及维护成本非常庞大，增加企业人力、物力的成本负担。

由此可知，以上述细胞培养方式制造全病毒疫苗具有诸多缺点，亟需加以改良。

发明内容

本发明的目的在于克服现有工艺存在的不足之处，提供一种以悬浮微载体细胞培养系统产制疫苗的方法以及根据此方法制得的疫苗。该方法具有生产工艺简单且稳定、易操作，病毒含量高，批间差异小，质量易控制，可显著提高疫苗产量和质量。利用本发明生产的疫苗安全性好、免疫效力高，对病毒攻毒具有完全的免疫保护作用。

为达到上述目的，本发明采取了如下的技术方案：

以悬浮微载体细胞培养系统产制疫苗的方法，包括下列技术步骤：

1.将制苗用细胞接种到含有培养基与微载体的培养罐内；

2.将上述细胞与微载体混合均匀，使细胞贴附在微载体上；

3.在适当温度下，提供上述细胞足够的养分及气体，使细胞在上述微载体上继续生长；

4.将制苗用的病毒制成病毒悬浮液，接种于上述细胞上，继续培养；每隔数日收获病毒液，并且更换培养基；

毒种鉴定：各种疫苗须完全符合《中华人民共和国药典》及/或《中华人民共和国兽药典》规范，无细菌、霉菌、支原体及外源病毒污染。

5.将上述收获的病毒液纯化后，依照是否需要灭活而加入灭活剂或不加入灭活剂，灭活后的病毒液加入适当佐剂，不经灭活的病毒液则加入适当的冻干保护剂，充分混匀后定量分装，即得到灭活或活毒疫苗。

成品检验：各种疫苗皆按《中华人民共和国药典》及/或《中华人民共和国兽药典》进行检验，应符合相关规定，对该疫苗施用人体或动物安全无副作用。

上述技术方案中，(1)步骤中的微载体为玻璃圆珠、聚酯纤维圆片、聚酯纤维平板。

上述技术方案中，(3)步骤是以搅拌通气或是以培养液液面升降方式，使细胞获得气体交换。

上述技术方案中，步骤(2)、(3)、(4)中所述的细胞培养温度是36～37℃，并含有2.5～5％二氧化碳。

上述技术方案中，(1)步骤中的细胞为狗肾细胞(MDCK)，(4)步骤中的病毒为禽流感病毒(H5N1)。

上述技术方案中，(1)步骤中的细胞为仓鼠幼鼠肾细胞(BHK)、兔肾细胞(PK13)或非洲绿猴肾细胞(VERO)，(4)步骤中的病毒为猪伪狂犬病病毒(PRV)。

上述技术方案中，(1)步骤中的细胞为猪肾细胞(PK)、仓鼠肾细胞(HK)或非洲绿猴肾细胞(VERO)，(4)步骤中的病毒为日本脑炎病毒(JEV)。

上述技术方案中，(1)步骤中的细胞为仓鼠幼鼠肾细胞(BHK)，(4)步骤中的病毒为牛流行热病毒(BEFV)。

上述技术方案中，(1)步骤中的细胞为非洲绿猴肾细胞(VERO)，(4)步骤中的病毒为狂犬病病毒(rabies virus)。

本发明所提供的以悬浮微载体细胞培养系统产制疫苗的方法，与其它现有技术相互比较时，更具有下列优点：

1.本发明所提供的细胞培养方法，在一个瓶子内可以让细胞贴附的面积大增，可以减少培养瓶、培养基的使用，其效能为传统转瓶自动培养系统的数十倍，可以节省许多成本及人力，亦可减少操作人员与病毒接触的机会，减少操作人员感染人畜共通病毒(如：禽流感H5N1病毒、日本脑炎病毒、狂犬病病毒)的机会。

2.本发明提供的方法细胞接种量低，容易控制，且病毒感染效率高，生产效能高。

附图说明

请参阅以下有关本发明一较佳实施例的详细说明及其附图，将可进一步了解本发明的技术内容及其目的功效；有关该实施例的附图为：

图1为本发明的制备流程图。

具体实施方式

下面的说明部分及示意图，仅具示范说明性而非限制性。

实施例1  禽流感活毒疫苗的制作

1.1病毒与细胞株

用来制作禽流感疫苗的病毒须由政府授权的单位提供，为H5N1重配疫苗原型株(reassortant)，该病毒株是分离自高致病性禽流感病毒株(例如：A/Hong Kong/213/2003或A/VietNam/1194/2004，或NIBRG-14)。经过致病性测试，结果显示H5N1重配疫苗原型株病毒不具有致病性后，才可用来制作H5N1禽流感疫苗。并且使用对该病毒株具有良好的感受性的细胞系(本实施例选用狗肾细胞系Madin Darby Canine Kidney，MDCK)，作为制苗用细胞系，通过感染并大量繁殖H5N1禽流感病毒。

细胞系、种毒株及量产用病毒株，都是依照《中华人民共和国药典》及《中华人民共和国兽药典》所规定，来进行特性试验、病毒含量试验及外来物质试验。

1.2方法

(1)将制苗用狗肾细胞系(MDCK细胞)细胞接种到含有DMEM液体培养基(GIBCO公司)(含体积百分比为10％的犊牛血清)与微载体的培养罐内；

(2)于37℃、5％CO₂培养环境下，利用温和搅拌，或抽、放真空方式使液体培养基液面在培养罐内小幅度升降，作用约1小时，使上述细胞与微载体混合均匀，并使细胞贴附在微载体上；

(3)于37℃、5％CO₂培养环境下，同样利用搅拌或抽、放真空的方式，提供上述细胞足够的养分及气体，使细胞在上述微载体上生长约4～7天，直到细胞长满整个微载体，更换新的DMEM培养液并加入体积百分比为2％的犊牛血清，准备接种病毒；

(4)将制苗用的H5N1重配疫苗原型株病毒以DMEM液体培养基制成病毒悬浮液(接种浓度为10^-4M.O.I.(感染复数，Multiplicity of infection))，接种于上述细胞上，置于34℃、5％CO₂培养环境下继续培养，同样利用搅拌或抽、放真空的方式，提供细胞足够的养分及气体；经过2～3日收获病毒液，置于4℃保存；收获的病毒液进行毒种鉴定以确认合乎各项标准；

毒种鉴定

(a)病毒含量：以噬斑形成单位(plaque forming unit，PFU)方法计算病毒含量，每1.0mL病毒含量须≥1×10⁶PFU。

(b)纯净性：应无细菌、霉菌、支原体及外源病毒污染。

(5)经检验合格的病毒含量≥1×10⁶PFU/mL H5N1重配疫苗原型株病毒抗原原液经过离心纯化后，以甲醛(formaldehyde)或2-溴乙胺(binary ethyleneimine，BEI)将病毒灭活后，经氢氧化铝佐剂或以乳化(水包油，w/o)或双相乳化(水包油包水，w/o/w)制成油质疫苗，并定量分装，加盖密封后储存于2～8℃得到成品。将制成的3批疫苗编号为H5N1-T001、H5N1-T002、H5N1-T003。

成品检验：按《中华人民共和国兽药典》进行检验，应符合规定，对施打动物安全无副作用。疫苗病毒含量≥1×10⁶PFU/mL。无菌检验按《中国兽药典》附录15页进行检验，应无细菌生长。

1.3结果

病毒含量：H5N1重配疫苗原型株病毒接种MDCK细胞后，收获病毒液，共3批，分别测定病毒含量，每1mL病毒含量分别为10^9.02PFU、10^9.15PFU、10^9.06PFU。

无菌检验：三批产品均无菌生长。

比较以本发明“悬浮微载体细胞培养系统”与现有转瓶培养系统，培养MDCK细胞系，以增殖禽流感病毒H5N1，两系统细胞培养的病毒产量如表1-1所示。

表1-1  不同培养系统增殖禽流感病毒H5N1的产量比较

上述对比试验结果可知，以本发明悬浮微载体细胞培养系统生产的禽流感疫苗与现有方法生产的疫苗对鸡只均具有良好的安全性及免疫效果，且以本发明悬浮微载体细胞培养系统生产禽流感疫苗的产量，远大于现有转瓶培养系统生产的产量。

实施例2

2.1猪伪狂犬病活毒疫苗的制作

2.1.1病毒与细胞株

用来制作猪伪狂犬病活毒疫苗的病毒，是将伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PRV)强毒株(LC)上的gI醣蛋白及胸腺核苷激酶(TK)双基因以遗传工程方式去除而成的基因缺损弱毒株。经过致病性测试，结果显示gI醣蛋白及胸腺核苷激酶(TK)双基因缺损弱毒株(LCM株)病毒不具有致病性后，才可用来制作猪伪狂犬病活毒疫苗。并且使用对该病毒株具有良好的感受性的细胞系(本实施例选用仓鼠幼鼠肾细胞BHK细胞；其它细胞如：兔肾细胞(PK13)或非洲绿猴肾细胞(VERO)也对猪伪狂犬病毒有良好的感受性)，作为制苗用细胞系，通过感染并大量繁殖猪伪狂犬病病毒。

2.1.2方法

(1)将制苗用BHK细胞接种到含有体积百分比为10％的犊牛血清DMEM液体培养基(GIBCO公司)与微载体的培养罐内；

(2)于36～37℃、5％CO₂培养环境下，利用温和搅拌，或抽、放真空方式使液体培养基液面在培养罐内小幅度升降，作用约1～3小时，使上述细胞与微载体混合均匀，并使细胞贴附在微载体上；

(3)于36～37℃、5％CO₂培养环境下，同样利用搅拌或抽、放真空的方式，提供上述细胞足够的养分及气体，使细胞在上述微载体上生长约2～5天，直到细胞长满整个微载体，更换新的DMEM培养液并加入体积百分比为2％的犊牛血清，准备接种病毒；

(4)将猪伪狂犬病gI^-/TK^-双基因缺损株(LCM株)病毒以DMEM液体培养基(含体积百分比为2％的犊牛血清)制成病毒悬浮液(接种浓度为1 TCID₅₀/细胞)，接种于上述细胞上，置于36～37℃、5％CO₂培养环境下继续培养，同样利用搅拌或抽、放真空的方式，提供细胞足够的养分及气体；每隔18～24小时(当细胞病变(CPE)达90％以上)收获病毒液，置于4℃保存；收获的病毒液进行毒种鉴定以确认合乎各项标准；

毒种鉴定

(a)病毒含量：将收获的病毒液用DMEM液体培养基做10倍系列稀释，取10^-6、10^-7、10^-83个稀释度，每个稀释度分别接种BHK细胞4瓶，在36～37℃、5％CO₂培养箱中培养16～120小时，每日观察并纪录细胞病变(CPE)，按Reed-Muench计算TCID₅₀，每1.0mL病毒含量须≥1×10⁵TCID₅₀。

(b)纯净性：按《中华人民共和国兽药典》进行，应无细菌、霉菌、支原体及外源病毒污染。

(c)特异性：将收获的病毒液用DMEM液体培养基稀释为10³TCID₅₀/mL，与等量抗PRV家兔免疫血清等量混合，经37℃感作一小时后分别接种于猪肾(PK)、兔肾(RK)等株化细胞经培养5日，须无细胞变性效应，并经次代同源细胞继代培养7日，也须无细胞变性效应，并分别以天竺鼠、鹅及鸡的1％红血球进行吸附试验，均须呈阴性反应。

(5)经检验合格的病毒含量≥1×10⁵TCID₅₀/mL猪伪狂犬病gI^-/TK^-双基因缺损株(LCM株)病毒抗原原液经过离心纯化后，以50％(体积比)乳糖作为冻干保护剂，充分摇匀后冻结真空干燥，并定量分装，加盖密封后储存于2～8℃得到成品。将制成的3批疫苗编号为PR-T1、PR-T2、PR-T3。

成品检验：按《中华人民共和国兽药典》进行检验，应符合规定，对施打动物安全无副作用。疫苗病毒含量≥1×10⁵TCID₅₀/mL。无菌检验：按《中国兽药典》附录15页进行检验，应无细菌生长。

2.1.3结果

病毒含量：猪伪狂犬病gI^-/TK^-双基因缺损株(LCM株)病毒接种BHK细胞后，收获病毒液，共3批，分别测定病毒含量，每1mL病毒含量分别为10^7.15TCID₅₀、10^7.20TCID₅₀、10^7.35TCID₅₀。

疫苗性状试验结果见表2-1。

表2-1  三批疫苗性状试验结果

无菌试验为阴性，结果见表2-2。

表2-2  三批疫苗无菌试验结果

每批疫苗抽10只样品溶解后进行试验。

BHI：脑心抽出液培养基(Brain Heart Infusion Broth)接种检体后，经37℃培养1周。

PPLO Agar：支原体固体培养基。

检体先接种于Friis液体培养基内，经1周取培养液移至PPLO Agar，于5％CO₂条件下继续培养1周，然后以显微镜检查是否有支原体菌落生成。

特异性试验：无其它病毒污染，结果见表2-3。

表2-3  三批疫苗特异性试验结果

PK：猪肾细胞系

RK：兔肾细胞系

CPE：细胞病变

2.2本发明制得的猪伪狂犬病活毒疫苗与同类产品的比较试验

2.2.1材料

(1)疫苗：猪伪狂犬病活毒疫苗(以悬浮微载体细胞培养系统制得)3批，批号：PR-T1、PR-T2、PR-T3。猪伪狂犬病活毒疫苗(以转瓶自动培养系统制得)1批，批号：PR-RB1。

(2)实验动物：1月龄断奶仔猪、易感后备母猪，PR疾病抗体均为阴性(血清中和价≤1∶2)。

(3)病毒：猪伪狂犬病毒(PRV)TNL强毒株。

2.2.2方法

(1)安全性试验

a.对仔猪的安全性试验：取1月龄PR病毒抗体阴性(血清中和抗体≤1∶2)断奶仔猪16头，随机分为4组，各组分别注射PR-T1、PR-T2、PR-T3批和PR-RB1疫苗，每头均肌肉注射疫苗4ml，连续观察21日，同时测温、观察采食、呼吸等情况。

b.后备母猪的安全性试验：取后备母猪8头，配种前4周分别肌肉接种PRV(LCM)-gI^-/TK^-疫苗(批号：PR-T1)和PR-RB1疫苗各4头，8ml/头。免疫后测温，每日作常规临床观察。配种怀孕后观察是否发生早产、流产、死胎、木乃伊胎及弱仔等繁殖障碍，连续观察至分娩。

(2)抗体检测与攻毒保护试验：取1月龄PR病毒抗体阴性(血清中和抗体≤1∶2)易感仔猪20头，随机分为5组，每组4头，1、2、3组分别各肌肉注射PR-T1、PR-T2、PR-T3三批PRV(LCM)-gI^-/TK^-疫苗2ml/头，4组肌肉注射PR-RB1疫苗2ml/头，5组作为负对照，21日后采血分离血清测定中和抗体效价，同时每头猪滴鼻10^5.0TCID₅₀2ml的PRV(TNL强毒)病毒，连续观察14日，测量并观察仔猪临床表现。

2.2.3结果

(1)安全性试验

1月龄断奶仔猪分别注射免疫4ml的疫苗(PR-T1、PR-T2、PR-T3)、PR-RB1疫苗后，仔猪无体温升高，采食、精神状况及生长发育情况均正常，试验仔猪均存活。后备母猪免疫8ml的疫苗(PR-T1)和PR-RB1疫苗后，均无体温变化，食欲正常。正常配种后，未发生目标病征。结果表明，三批实验疫苗和PR-RB疫苗对靶动物超剂量接种是安全的。结果见表2-4。

表2-4  疫苗安全性试验结果

(2)抗体检测与攻毒保护试验

以中和试验方法检测疫苗免疫后的血清中和抗体，结果表明无论是PR-T1、PR-T2、PR-T3疫苗还是PR-RB1疫苗免疫后抗体均在1∶16以上，攻毒后均4/4保护，对照4/4发病，结果见表2-5。

表2-5  疫苗免疫效力试验结果

比较以本发明“悬浮微载体细胞培养系统”与现有转瓶培养系统，培养BHK细胞系，以增殖猪伪狂犬病病毒，两系统细胞培养的病毒产量如表2-6所示。

表2-6  不同培养系统增殖猪伪狂犬病病毒的产量比较

上述对比试验结果可知，以本发明悬浮微载体细胞培养系统生产的猪伪狂犬病疫苗与现有方法生产的疫苗对易感仔猪和后备母猪均具有良好的安全性及免疫效果，且以本发明悬浮微载体细胞培养系统生产猪伪狂犬病疫苗的产量，远大于现有转瓶培养系统生产疫苗的产量。

实施例3

3.1日本脑炎活毒疫苗的制作

3.1.1病毒与细胞株

用来制作日本脑炎活毒疫苗的病毒是“at”株，该病毒株是采自受日本脑炎感染的猪只，以仓鼠肾细胞(hamster kidney cell，HK cell)经过传代220代，成为弱毒株。经过致病性测试，结果显示该弱毒株病毒不具有致病性后，才可用来制作日本脑炎活毒疫苗。并且使用对该病毒株具有良好的感受性的细胞系(本实施例选用仓鼠肾细胞(HK)；其它细胞如：猪肾细胞(PK)与非洲绿猴肾细胞(VERO)也对日本脑炎病毒有良好的感受性)，作为制苗用细胞系，通过感染并大量繁殖日本脑炎病毒。

3.1.2方法

(1)将制苗用HK细胞接种到MEM液体培养基(GIBCO公司，内含体积百分比为10％的犊牛血清、0.01M NaHCO₃、0.1mg/ml硫酸卡那霉素(kanamycin sulfate)、100,000IU青霉素G钠盐(Penicillin G Sodium))与微载体的培养罐内；

(2)于37℃、5％CO₂培养环境下，利用温和搅拌，或抽、放真空方式使液体培养基液面在培养罐内小幅度升降，作用约2小时，使上述细胞与微载体混合均匀，并使细胞贴附在微载体上；

(3)于37℃、5％CO₂培养环境下，同样利用搅拌或抽、放真空的方式，提供上述细胞足够的养分及气体，使细胞在上述微载体上生长约2～5天，直到细胞长满整个微载体，更换新的MEM培养液并加入体积百分比为10％的犊牛血清，准备接种病毒；

(4)将日本脑炎弱毒株(JEV-“at”strain)病毒以MEM液体培养基(含体积百分比为10％的犊牛血清)制成病毒悬浮液(接种浓度为0.005M.O.I.)，接种于上述细胞上，置于37℃、5％CO₂培养环境下继续培养，同样利用搅拌或抽、放真空的方式，提供细胞足够的养分及气体；每隔3～5天收获病毒液，置于4℃保存；收获的病毒液进行毒种鉴定以确认合乎各项标准；

毒种鉴定

(a)病毒含量：将收获的病毒液用MEM液体培养基做10倍系列稀释，取10^-6、10^-7、10^-83个稀释度，每个稀释度分别接种HK细胞4瓶，在36～37℃、5％CO₂培养箱中培养16～120小时，每日观察并纪录细胞病变(CPE)，按Reed-Muench计算TCID₅₀，每1.0mL病毒含量须≥1×10⁵TCID₅₀。

(b)纯净性：应无细菌、霉菌、支原体及外源病毒污染。

(c)特异性：将收获的病毒液用MEM液体培养基稀释为200pfu/mL，加入等量中和抗体价为10⁴以上(以噬斑法测定)的抗猪瘟病毒家兔免疫血清，经37℃感作1.5小时后接种于仓鼠肾细胞(HK)经培养5日，须无细胞变性效应，并经次代同源细胞继代培养7日，也须无细胞变性效应，并分别以天竺鼠、鹅及鸡的1％红血球进行吸附试验，均须呈阴性反应。

(5)经检验合格的病毒含量≥1×10⁵TCID₅₀/mL日本脑炎弱毒株病毒抗原原液经过离心纯化后，以50％(体积比)乳糖作为冻干保护剂，并加入5μg/ml卡那霉素(kanamycin)、5IU/mL青霉素(Penicillin)，充分摇匀后冻结真空干燥，并定量分装，加盖密封后储存于2～8℃得到成品。将制成的3批疫苗编号为JE-T01、JE-T02、JE-T03。

成品检验：按《中华人民共和国药典》及《中华人民共和国兽药典》进行检验，应符合规定，对施打动物安全无副作用。疫苗病毒含量≥1×10⁵TCID₅₀/mL。无菌检验：按《中国兽药典》附录15页进行检验，应无细菌生长。

3.1.3结果

病毒含量：日本脑炎弱毒株病毒接种HK细胞后，收获病毒液，共3批，分别测定病毒含量及疫苗性状，试验结果见表3-1。

表3-1  三批疫苗性状试验结果

无菌试验为阴性，结果见表3-2。

表3-2  三批疫苗无菌试验结果

每批疫苗抽10只样品溶解后进行试验。

BHI：脑心抽出液培养基(Brain Heart Infusion Broth)接种检体后，经37℃培养1周。

PPLO Agar：支原体固体培养基。

检体先接种于Friis液体培养基内，经1周取培养液移至PPLO Agar，于5％CO₂条件下继续培养1周，然后以显微镜检查是否有支原体菌落生成。

特异性试验：无其它病毒污染，结果见表3-3。

表3-3  三批疫苗特异性试验结果

HK：仓鼠肾细胞

CPE：细胞病变

3.2本发明制得的日本脑炎活毒疫苗与同类产品的比较试验

3.2.1材料

(1)疫苗：日本脑炎活毒疫苗(以悬浮微载体细胞培养系统制得)3批，批号：JE-T01、JE-T02、JE-T03。猪温活毒疫苗(以转瓶自动培养系统制得)1批，批号：JE-RB01。

(2)实验动物：4周龄断奶仔猪，体重为2～3kg，日本脑炎抗体均为阴性(血清中和价≤0.9)。

3.2.2方法

(1)安全性试验

取4周龄日本脑炎病毒抗体阴性(血清中和抗体≤0.9)断奶仔猪8头，随机分为4组，各组分别注射JE-T01、JE-T02、JE-T03批和JE-RB01疫苗，每头均肌肉注射建议剂量疫苗(2mL)，连续观察14日，同时测体重、观察采食、神经学上的症状等情况。

(2)抗体检测试验

取4周龄日本脑炎病毒抗体阴性(血清中和抗体≤1∶10)易感仔猪10头，随机分为5组，每组2头，第1、2、3组分别各肌肉注射1倍剂量的JE-T01、JE-T02、JE-T03疫苗，第4组肌肉注射1倍剂量的JE-RB01疫苗，第5组不注射任何疫苗，以作为负对照；免疫14日后采血分离血清，以测定中和(NT)抗体力价与血凝抑制(HI)抗体力价。

3.2.3结果

(1)安全性试验

4周龄断奶仔猪分别注射免疫建议剂量的疫苗(JE-T01、JE-T02、JE-T03)、JE-RB01疫苗后，仔猪无体温升高，采食、精神状况及生长发育情况均正常，试验仔猪均存活。结果表明，三批实验疫苗和JE-RB01疫苗对靶动物超剂量接种是安全的。结果见表3-4。

表3-4  疫苗安全性试验结果

(2)抗体检测试验

以中和试验方法检测疫苗免疫后的血清中和抗体，结果表明无论是JE-T01、JE-T02、JE-T03疫苗还是JE-RB01疫苗免疫后抗体力价均在1∶20以上，结果见表3-5。

表3-5  疫苗免疫效力试验结果

比较以本发明“悬浮微载体细胞培养系统”与现有转瓶培养系统，培养HK细胞系，以增殖日本脑炎病毒，两系统细胞培养的病毒产量如表3-6所示。

表3-6  不同培养系统增殖日本脑炎病毒的产量比较

上述对比试验结果可知，以本发明悬浮微载体细胞培养系统生产的日本脑炎疫苗与现有方法生产的疫苗对易感仔猪均具有良好的安全性及免疫效果，且以本发明悬浮微载体细胞培养系统生产日本脑炎疫苗的产量，远大于现有转瓶培养系统生产疫苗的产量。

实施例4

4.1牛流行热灭活疫苗的制作

4.1.1病毒与细胞株

以牛流行热病毒强毒株(bovine ephemeral fever virus，BEFV，例如：Tn73或Tn88128株)制作牛流行热灭活疫苗，并且使用对该病毒株具有良好的感受性的细胞系(本实施例选用仓鼠幼鼠肾细胞BHK)，作为制苗用细胞系，通过感染并大量繁殖牛流行热病毒。

4.1.2方法

(1)将制苗用BHK细胞接种到MEM液体培养基(GIBCO公司，内含体积百分比为7％的犊牛血清、0.01M NaHCO₃、0.1mg/ml硫酸卡那霉素(kanamycin sulfate)、100,000IU青霉素G钠盐(Penicillin G Sodium))与微载体的培养罐内；

(2)于37℃、5％CO₂培养环境下，利用温和搅拌，或抽、放真空方式使液体培养基液面在培养罐内小幅度升降，作用约2小时，使上述细胞与微载体混合均匀，并使细胞贴附在微载体上；

(3)于37℃、5％CO₂培养环境下，同样利用搅拌或抽、放真空的方式，提供上述细胞足够的养分及气体，使细胞在上述微载体上生长约2～5天，直到细胞长满整个微载体，更换新的MEM培养液并加入体积百分比为2％的犊牛血清，准备接种病毒；

(4)将牛流行热病毒强毒株(Tn88128株)以MEM液体培养基(含2％犊牛血清)制成病毒悬浮液(接种浓度为0.05M.O.I.)，接种于上述细胞上，置于37℃、5％CO₂培养环境下继续培养，同样利用搅拌或抽、放真空的方式，提供细胞足够的养分及气体；每隔3～5天收获病毒液，置于4℃保存；收获的病毒液进行毒种鉴定以确认合乎各项标准；

毒种鉴定

(a)病毒含量：将收获的病毒液用MEM液体培养基做10倍系列稀释，取10^-6、10^-7、10^-83个稀释度，每个稀释度分别接种BHK细胞4瓶，在37℃、5％CO₂培养箱中培养16～120小时，每日观察并纪录细胞病变(CPE)，按Reed-Muench计算TCID₅₀，每1.0mL病毒含量须≥1×10⁶TCID₅₀。

(b)纯净性：按《中华人民共和国兽药典》进行，应无细菌、霉菌、支原体及外源病毒污染。

(5)经检验合格的病毒含量≥1×10⁶TCID₅₀/mL牛流行热病毒抗原原液经过离心纯化后，以2-溴乙胺(binary ethyleneimine，BEI)将病毒灭活后，经双相乳化(水包油包水)制成油质疫苗，并定量分装，加盖密封后储存于2～8℃得到成品。将制成的3批疫苗编号为BEF-T01、BEF-T02、BEF-T03。

成品检验：按《中华人民共和国兽药典》进行检验，应符合规定，对施打动物安全无副作用。疫苗病毒含量≥1×10⁶TCID₅₀/mL。无菌检验按《中国兽药典》附录15页进行检验，应无细菌生长。

4.1.3结果

病毒含量：牛流行热病毒病毒接种BHK细胞后，收获病毒液，共3批，分别测定病毒含量，每1mL病毒含量分别为1×10^8.2TCID₅₀、1×10^8.5TCID₅₀、1×10^8.35TCID₅₀。

无菌检验：按2000年兽用生物制品规程附录445页进行，三批产品均无菌生长。

4.2本发明制得的牛流行热灭活疫苗与同类产品的比较试验

4.2.1材料

(1)疫苗：牛流行热灭活疫苗(以悬浮微载体细胞培养系统制得)3批，批号：BEF-T01、BEF-T02、BEF-T03。猪温活毒疫苗(以转瓶自动培养系统制得)1批，批号：BEF-RB01。

(2)实验动物：6月龄仔牛，牛流行热病毒抗体均为阴性(血清中和价≤1∶10)。

4.2.2方法

抗体检测与攻毒保护试验：取6月龄仔牛10头，牛流行热病毒抗体呈阴性(血清中和抗体≤1∶10)，随机分为5组，每组2头，第1、2、3组分别各肌肉注射1倍剂量的BEF-T01、BEF-T02、BEF-T03疫苗，第4组肌肉注射1倍剂量的BEF-RB01疫苗，第5组不注射任何疫苗，以作为负对照；免疫8周后采血分离血清，以测定中和抗体力价。

4.2.3结果

以中和试验方法检测疫苗免疫后的血清中和抗体，结果表明无论是BEF-T01、BEF-T02、BEF-T03疫苗还是BEF-RB01疫苗免疫后抗体力价均在1∶32以上，结果见表4-1。

表4-1  疫苗免疫效力试验结果

比较以本发明“悬浮微载体细胞培养系统”与现有转瓶培养系统，培养BHK细胞系，以增殖牛流行热病毒，两系统细胞培养的病毒产量如表4-2所示。

表4-2  不同培养系统增殖牛流行热病毒的产量比较

上述对比试验结果可知，以本发明悬浮微载体细胞培养系统生产的牛流行热疫苗与现有方法生产的疫苗对易感仔牛均具有良好的安全性及免疫效果，且以本发明悬浮微载体细胞培养系统生产牛流行热疫苗的产量，远大于现有转瓶培养系统生产疫苗的产量。

实施例5狂犬病灭活疫苗的制作

5.1病毒与细胞株

以狂犬病病毒强毒株(Rabies virus，RV，例如：CTN-1或aGV株)制作狂犬病灭活疫苗，并且使用对该病毒株具有良好的感受性的细胞系(本实施例选用非洲绿猴肾细胞VERO)，作为制苗用细胞系，通过感染并大量繁殖狂犬病病毒。

5.2方法

(1)将制苗用VERO细胞接种到MEM液体培养基(GIBCO公司，内含体积百分比为7％的犊牛血清、0.01M NaHCO₃、0.1mg/ml硫酸卡那霉素(kanamycin sulfate)、100,000IU青霉素G钠盐(Penicillin G Sodium))与微载体的培养罐内；

(2)于36℃、5％CO₂培养环境下，利用温和搅拌，或抽、放真空方式使液体培养基液面在培养罐内小幅度升降，作用约2小时，使上述细胞与微载体混合均匀，并使细胞贴附在微载体上；

(3)于36℃、5％CO₂培养环境下，同样利用搅拌或抽、放真空的方式，提供上述细胞足够的养分及气体，使细胞在上述微载体上生长约7天，直到细胞长满整个微载体，更换新的MEM培养液并加入体积百分比为2％的犊牛血清，准备接种病毒；

(4)将狂犬病病毒强毒株(aGV株)以MEM液体培养基(含体积百分比为2％的犊牛血清)制成病毒悬浮液(接种浓度为0.05M.O.I.)，接种于上述细胞上，置于36℃、5％CO₂培养环境下继续培养，同样利用搅拌或抽、放真空的方式，提供细胞足够的养分及气体；于接种第4天收获第1次病毒液，并加入新的MEM培养液(含体积百分比为2％的犊牛血清)，继续培养，每隔2天连续收获病毒液；收获的病毒液置于4℃保存，并进行毒种鉴定以确认合乎各项标准，应无细菌、霉菌、支原体及外源病毒污染，并测定病毒液滴度，每1.0mL病毒含量须≥5.5lg LD₅₀/ml；

(5)经检验合格的病毒含量≥5.5lg LD₅₀/ml的狂犬病病毒抗原原液经过离心纯化后，以甲醛或2-溴乙胺(BEI)将病毒灭活后，经氢氧化铝佐剂或以乳化(水包油，w/o)或双相乳化(水包油包水，w/o/w)制成油质疫苗，并定量分装，加盖密封后储存于2～8℃得到成品。

成品检验：应符合规定，对施打动物安全无副作用。疫苗病毒含量≥5.5lg LD₅₀/ml，且应无细菌生长。

5.3结果

病毒含量：狂犬病病毒接种VERO细胞后，连续收获病毒液，共重复2次试验，分别测定病毒含量，每1mL病毒含量分别如表5-1所示。

表5-1  病毒收获量

无菌检验：三批产品均无菌生长。

比较以本发明“悬浮微载体细胞培养系统”与现有转瓶培养系统，培养VERO细胞系，以增殖狂犬病病毒，两系统细胞培养的病毒产量如表5-2所示。

表5-2  不同培养系统增殖狂犬病病毒的产量比较

上述对比试验结果可知，以本发明悬浮微载体细胞培养系统生产狂犬病疫苗的产量，远大于现有转瓶培养系统生产疫苗的产量。

虽然已经就特别具体实例及应用说明过本发明，不过谙于此技者，从本揭示可以产生附加的具体实例，及修改而不违离所主张的本发明旨意或超过本发明所主张的范围。因此，要了解本文的图式及说明部份是仅提出作为例子以帮助本发明的理解且不应该视为要限制其范围。

上列详细说明是针对本发明的可行实施例的具体说明，该实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明的等效实施或变更，均应包含于本案的专利范围中。

Claims (5)

1.以悬浮微载体细胞培养系统产制疫苗的方法，其特征在于：包括如下技术步骤：

(1)将制苗用细胞接种到含有培养基与微载体的培养罐内；

(2)将上述细胞与微载体混合均匀，使细胞贴附在微载体上；

(3)在适当温度下，以培养液液面升降方式，提供上述细胞足够的养分及气体，使细胞在上述微载体上继续生长；

(4)将制苗用的病毒制成病毒悬浮液，接种于上述细胞上，继续培养；于一定时间或一段时间连续收获病毒液，并且更换培养基；

(5)将上述收获的病毒液纯化后，加入适当的冻干保护剂，充分混匀后定量分装，即得到所需的活毒疫苗；

所述步骤(1)中的细胞为狗肾细胞，所述步骤(4)中的病毒为禽流感病毒；

或所述步骤(1)中的细胞为仓鼠幼鼠肾细胞、兔肾细胞或非洲绿猴肾细胞，所述步骤(4)中的病毒为猪伪狂犬病病毒；

或所述步骤(1)中的细胞为猪肾细胞、仓鼠肾细胞或非洲绿猴肾细胞，所述步骤(4)中的病毒为日本脑炎病毒；

或所述步骤(1)中的细胞为仓鼠幼鼠肾细胞，所述步骤(4)中的病毒为牛流行热病毒；

或所述步骤(1)中的细胞为非洲绿猴肾细胞，所述步骤(4)中的病毒为狂犬病病毒。

2.以悬浮微载体细胞培养系统产制疫苗的方法，其特征在于：包括如下技术步骤：

(1)将制苗用细胞接种到含有培养基与微载体的培养罐内；

(2)将上述细胞与微载体混合均匀，使细胞贴附在微载体上；

(3)在适当温度下，以培养液液面升降方式，提供上述细胞足够的养分及气体，使细胞在上述微载体上继续生长；

(4)将制苗用的病毒制成病毒悬浮液，接种于上述细胞上，继续培养；于一定时间或一段时间连续收获病毒液，并且更换培养基；

(5)将上述收获的病毒液纯化后，以灭活剂进行灭活，并加入适当的佐剂，充分混匀后定量分装，即得到所需的灭活疫苗；

所述步骤(1)中的细胞为狗肾细胞，所述步骤(4)中的病毒为禽流感病毒；

或所述步骤(1)中的细胞为仓鼠幼鼠肾细胞、兔肾细胞或非洲绿猴肾细胞，所述步骤(4)中的病毒为猪伪狂犬病病毒；

或所述步骤(1)中的细胞为猪肾细胞、仓鼠肾细胞或非洲绿猴肾细胞，所述步骤(4)中的病毒为日本脑炎病毒；

或所述步骤(1)中的细胞为仓鼠幼鼠肾细胞，所述步骤(4)中的病毒为牛流行热病毒；

或所述步骤(1)中的细胞为非洲绿猴肾细胞，所述步骤(4)中的病毒为狂犬病病毒。

3.根据权利要求1或2所述的以悬浮微载体细胞培养系统产制疫苗的方法，其特征在于：(1)步骤中的微载体为玻璃圆珠、聚酯纤维圆片、或聚酯纤维平板。

4.根据权利要求1或2所述的以悬浮微载体细胞培养系统产制疫苗的方法，其特征在于：(4)步骤是以1至5天为时间单位收获1次病毒液，并连续收获病毒液。

5.一种根据权利要求1或2所述方法制备的疫苗。

Images