CN113117068A

CN113117068A - 一种兽用牛流行热灭活疫苗及其规模化生产方法

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Publication number: CN113117068A
Application number: CN202110429954.4A
Authority: CN
Inventors: 孔彩平; 郝鹏; 刘国英; 杨波; 方建国; 朱旭; 刘建奇; 王秀明; 李雪峰
Original assignee: Spirit Jinyu Biological Pharmaceutical Co ltd
Current assignee: Spirit Jinyu Biological Pharmaceutical Co ltd
Priority date: 2021-04-21
Filing date: 2021-04-21
Publication date: 2021-07-16

Abstract

本发明公开了一种兽用牛流行热灭活疫苗及其规模化生产方法，属于疫苗生产技术领域。本发明提供的方法包括利用悬浮培养工艺培养细胞、病毒悬浮培养、病毒抗原液澄清、浓缩纯化、灭活和乳化配苗步骤，该方法能够实现牛流行热病毒大量增殖，提高病毒抗原含量和产量，且自动化程度高，各步骤协同作用可以共同提高疫苗的质量和稳定性，解决了传统转瓶或微载体工艺培养细胞生产牛流行热病毒产量低、工艺繁琐、病毒抗原批间差异大、疫苗效力低、疫苗有效期短等技术难题。

Description

一种兽用牛流行热灭活疫苗及其规模化生产方法

技术领域

本发明属于生物医药中疫苗的制备技术领域，具体是涉及一种兽用牛流行热灭活疫苗及其规模化生产方法。

背景技术

牛流行热(Bovine ephemeral fever，BEF)是由牛流行热病毒(Bovine ephemeralfever virus)引起的黄牛、奶牛、肉牛及水牛的一种急性、非接触性传染病。该病的特征为突然高热、呼吸促迫、流泪和消化器官的严重卡他性炎症和运动障碍。感染该病的大部分病牛经2-3日即可恢复正常，故又称三日热或暂时热。该病病势迅猛，但多为良性经过，但是该病能引起牛大群发病，明显降低乳牛的产乳量。

牛流行热疫苗是预防该病大规模蔓延的最主要途径之一。然而，目前国内外主要利用传统转瓶或微载体工艺培养细胞制备牛流行热病毒抗原以规模化生产疫苗，这两种方式都是利用贴壁细胞进行病毒抗原培养，即：先将细胞贴附于转瓶瓶壁或者微载体表面，待细胞长满单层后进行接毒，接毒后随着病毒增殖，细胞逐渐圆缩产生病变，当病变细胞达到80％以上时收获病毒液，得到牛流行热病毒抗原。这两种病毒抗原的制备方式都需进行贴壁细胞培养，在规模化生产疫苗时需要对细胞进行消化、分瓶，污染风险大；而且这些操作都需要人工完成，大量的人工操作使得人工成本高。另外，贴壁细胞的细胞数量较少，存在产毒效率低、疫苗效力低、达到同等的免疫效果需要的免疫剂量大、批间差异大等技术缺陷。

发明内容

针对现有技术中存在的技术缺陷，本发明的一个方面提供一种兽用牛流行热灭活疫苗的规模化生产方法，其包括以下步骤：

S1)使用反应器悬浮培养BHK21-C13细胞至细胞密度达到2×10⁶个细胞/mL以上，收获细胞悬液；

S2)向步骤S1)收获的细胞悬液中接种牛流行热病毒种毒，悬浮培养后收获病毒液；

S3)将步骤S2)收获的病毒液经澄清、浓缩纯化、灭活和乳化配苗处理后生产获得兽用牛流行热灭活疫苗。

上述方法中，步骤S1)中所述使用反应器悬浮培养BHK21-C13细胞至细胞密度达到2×10⁶个细胞/mL以上的具体操作为：

S11)利用复苏的BHK21-C13悬浮细胞株在悬浮专用培养基中传代悬浮培养至BHK21-C13悬浮细胞的细胞密度为2.0×10⁶细胞/mL以上；

S12)将传代后的BHK21-C13悬浮细胞转移至反应器中，加入悬浮专用培养基稀释至细胞密度为0.2～0.5×10⁶细胞/mL，在36.5±0.5℃，pH值7.20±0.1，DO值20％～60％(饱和度百分比)，转速60～110rpm下培养至反应器内的BHK21-C13细胞密度为2×10⁶细胞/mL以上；

步骤S11)和S12)中所述悬浮专用培养基的配方为：在BBSM培养基中加入1.0～1.5g/L的碳酸氢钠，和3％～5％(体积百分比)的新生牛血清，调节pH值至7.2±0.5。

上述方法中，视生产规模由小至大反应器容积依次为5L、50L、500、5000L；且，大规模的生产使用大容积的反应器，在该反应器中使用前一小规模反应器中培养的BHK21-C13悬浮细胞进行悬浮培养；

其中5L、50L、500L、5000L反应器中的培养方法及培养条件相同。

上述方法中，步骤S2)的具体操作方法为：

将反应器内培养合格的BHK21-C13悬浮细胞培养液中的悬浮专用培养基弃掉，加入第一病毒维持液(配方为：在BBSM培养基中加入1.0～1.5g/L的碳酸氢钠，和1％～3％(体积百分比)的马血清，调节pH值至7.4±0.2)恢复至原培养体积，再按0.2％～0.5％(体积百分比)接种牛流行热病毒种毒，在33.0～37.0℃，pH值7.20～7.60，DO值20％～60％(饱和度百分比)，转速60-110rpm下培养，待细胞病变≥75％时收获病毒液。

上述方法中，所述牛流行热病毒种毒为使用悬浮培养的BHK21-C13悬浮细胞制备的牛流行热病毒生产用悬浮种毒或使用贴壁培养的BHK21-C13贴壁细胞制备的牛流行热病毒生产用贴壁种毒。

上述方法中，所述牛流行热病毒生产用悬浮种毒和牛流行热病毒生产用贴壁种毒的制备具体包括：

M1)牛流行热病毒基础种毒的制备

取长势良好且已铺满单层的BHK21-C13贴壁细胞，弃去原培养液，加入第二病毒维持液(配方为：在MEM培养基中加入1％～3％(体积百分比)的马血清，用碳酸氢钠溶液调节pH值至7.4±0.2)，再按0.1％(体积比)的比例加入牛流行热病毒毒株或牛流行热病毒培养液，于33～37℃培养，当细胞病变≥75％(数量百分比)时收获病毒液，得到牛流行热基础种毒；

M2)牛流行热病毒生产用悬浮种毒的制备

取培养合格的BHK21-C13悬浮细胞，弃去原培养液，加入第一病毒维持液恢复至原培养体积，再加入0.1％(体积百分比)步骤M1)制备的牛流行热基础种毒，在33.0～37.0℃，pH值7.20～7.60，DO值20％～60％(饱和度百分比)，转速60-110rpm下培养，待细胞病变≥75％时收获病毒液，得到牛流行热病毒生产用悬浮种毒；或

M2’)牛流行热病毒生产用贴壁种毒的制备

取长势良好且已铺满单层的BHK21-C13贴壁细胞，弃去原培养液，加入第二病毒维持液，再按0.1％(体积比)的比例加入步骤M1)制备的牛流行热基础种毒，于33～37℃培养，当细胞病变≥75％(数量百分比)时收获病毒液，得到牛流行热病毒生产用贴壁种毒，病毒含量为10^6.0TCID₅₀/mL以上。

上述方法中，步骤S3)的具体操作为：

澄清：将步骤S2)收获的病毒液用已灭菌澄清过滤器(0.45μm)预处理病毒液或用连续流离心机离心，获得病毒澄清液；

浓缩纯化：用500KD-750KD中空纤维柱将病毒澄清液进行5～10倍浓缩，再用等体积PBS进行洗滤，取浓缩并洗滤后的病毒液，加入PEG后于3～5℃振荡2～6h后静置过夜，经高速冷冻离心(4℃，6000～10000r/min离心20～40min)后，弃掉离心上清，将沉淀用PBS(pH为7.4±0.2，浓度为0.04mol/L)按浓缩后体积重悬，获得浓缩纯化后病毒液；

灭活：按照1:(3000～5000)(v/v)将灭活剂加入浓缩纯化后病毒液中，进行灭活，灭活条件为：4±1℃，24～30h，100～120r/min间歇搅拌，灭活完成后将温度调至37±1℃水解1～3h，将灭活剂水解，获得灭活后病毒抗原；

乳化配苗：将灭活后病毒抗原作为水相，加入油相中进行混合乳化操作，分装获得兽用牛流行热灭活疫苗。

上述方法中，所述灭活剂为β-丙内酯；所述油相为206佐剂，所述水相和油相的配比为：水相:油相＝46:54(v/v)；乳化操作具体为：将水相加入油相，边加边搅拌，30±1℃混匀20～40min，降温过夜。

本发明另一方面提供一种兽用牛流行热灭活疫苗，其由上述的生产方法获得，其中配苗用牛流行热病毒抗原液中病毒含量为10^7.0TCID₅₀/mL以上，所述兽用牛流行热灭活疫苗在2～8℃条件下的保存期为9个月以上。制苗中使用适于低温条件下灭活的灭活剂，例如β-丙内酯。

基于以上技术方案提供的兽用牛流行热灭活疫苗的规模化生产方法首先采用悬浮培养工艺获得病毒接种用细胞以生产病毒液，随后经澄清、浓缩纯化、灭活和乳化配苗等操作生产得到免疫效力高、质量稳定的兽用牛流行热灭活疫苗。采用悬浮培养工艺悬浮培养BHK21-C13细胞可以快速得到大量的悬浮细胞用于牛流行热病毒种毒接种以生产病毒抗原，省去了大规模生产贴壁细胞时需要进行的细胞消化、分瓶等操作，避免污染的风险，且自动化程度高(能够自动监控细胞生长最适条件)，大大降低了人工成本。将牛流行热病毒种毒接种至BHK21-C13悬浮细胞中，其产毒效率高且稳定(能够自动监控病毒繁殖的最适条件)，相对于将种毒接种至贴壁细胞中，获得的病毒液病毒含量显著提高，可达到10^7.00TCID₅₀/mL以上。利用中空纤维柱和PEG协同对病毒液进行浓缩纯化后，可以去除病毒液中绝大部分杂蛋白(去除率达到98％以上)，并且获得的病毒抗原液仍保持较高的病毒抗原含量，可达到10^7.5TCID₅₀/mL以上，满足生产高滴度的兽用牛流行热疫苗的要求，因此其达到同等的免疫效果需要的免疫剂量小。在病毒抗原灭活中选择使用适于低温条件(例如4℃±1℃)下灭活的灭活剂β-丙内酯，不仅可以有效保护对热敏感的牛流行热病毒抗原，并且相对于其他灭活剂的灭活时间相对较短，且用量相对较低，提高了疫苗的生产效率并节约了生产成本，而且在病毒抗原灭活后可以快速水解该灭活剂，得到对免疫牛无毒性的代谢产物β羟基丙酸，保证了疫苗的接种安全，减少免疫后副反应。灭活后的牛流行热病毒浓缩抗原经乳化佐剂乳化配制成疫苗，经检验获得的疫苗稳定性好，保存期较长，其在2～8℃条件下的保存期为9个月以上，远远长于市场上已有的牛流行热灭活疫苗的有效期(2～8℃保存4个月)。

综上所述，本发明提供一种成本低且适于规模化生产兽用牛流行热灭活疫苗的方法，且获得的兽用牛流行热灭活疫苗安全性高、免疫效力高、批次间差异小、稳定性好且保存期长，可以用于预防牛流行热的大规模蔓延。

附图说明

图1为本发明实施例1中分离的牛流行热病毒毒株的电镜照片。

具体实施方式

本发明提供了一种兽用牛流行热灭活疫苗的规模化生产方法，包括悬浮培养制备病毒抗原的细胞，病毒液的澄清、浓缩纯化、灭活和乳化配苗等步骤。该方法主要利用生物反应器大规模悬浮培养牛流行热病毒敏感细胞(BHK21-C13细胞)并接种牛流行热病毒种毒，通过设置接种和培养参数使牛流行热病毒大量繁殖，从而获得高滴度的牛流行热病毒液，病毒液经澄清、中空纤维柱和PEG协同浓缩纯化、采用β-丙内酯进行灭活和乳化等操作得到牛流行热灭活疫苗。本发明提供的方法能够实现牛流行热病毒大量增殖，大大提高病毒滴度与配苗用病毒抗原含量，实现工艺自动化，且各步骤协同作用，共同提高了疫苗的质量(例如免疫效力高、免疫剂量低、批次间差异小)、安全性和稳定性(例如2～8℃条件下的保存期为9个月以上)，解决了传统转瓶或微载体工艺培养细胞生产牛流行热病毒产量低、工艺繁琐、疫苗效力低、免疫剂量大、批次间差异大、疫苗产品有效期短等技术难题。

以下结合具体实施例，更具体地说明本发明的内容，并对本发明作进一步阐述，但这些实施例绝非对本发明进行限制。

实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种实验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为对本发明生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提示替换使用。

实施例1、牛流行热病毒的分离与鉴定

实施例中使用的牛流行热病毒毒株是从河南南阳市某养殖场1头疑似牛流行热病牛分离而来，具体分离操作如下：

采集病牛抗凝血，利用牛流行热(牛流行热病毒)荧光定量PCR方法(参照CN109355431A中公开的针对牛流行热病毒的引物和PCR检测方法)检测该抗凝血，若牛流行热呈阳性，说明该抗凝血中含有牛流行热抗原；将该抗凝血冻融3次后接种于BHK21-C13单层细胞(保存于金宇保灵生物药品生物有限公司)，培养基为含8％-10％新生牛血清的DMEM溶液，37℃培养48-72h，待细胞出现圆缩、聚堆时(一般为48h)收集病毒培养物，利用牛流行热荧光定量PCR方法进行检测，若牛流行热含量明显增多，则将培养物继续进行传代培养(培养条件同前)，培养3代(F3)后细胞病变典型稳定；取F3进行病毒克隆纯化，获得病毒克隆株，取病毒克隆株进行连续传代至F6，经以下纯净性、特异性、免疫电镜、理化特性、生物学特性等鉴定，该病毒株纯净性符合要求，免疫电镜、理化特性、生物学特性符合牛流行热病毒特征，证明该病毒株为牛流行热毒株。

1)纯净性检测

1.1、无菌检验：按照《中国兽药典》现行三部附录方法进行检验。

1.2、支原体检验：按照《中国兽药典》现行三部附录方法进行检验。

1.3、外源病毒检测：按照《中国兽药典》现行三部附录方法进行检验。

检测结果如下表1所示，可见经分离传代后的病毒株中无菌生长、无支原体生长和无外源病毒污染，该分离病毒株纯净性良好。

表1：F6代病毒株纯净性检测结果

2)特异性检测

2.1、RT-PCR检测

用病毒RNA提取试剂盒提取RNA，反转录cDNA，进行PCR扩增(PCR引物参照CN109355431A中公开的针对牛流行热病毒的上下游引物)。PCR反应体系为：2×One stepRT-PCR Buffer III 12.5μl，Takara Ex Taq HS酶0.5μl，PrimeScript RT Enzyme Mix II酶0.5μl，上游引物(10μM)1μl，下游引物(10μM)1μl，模板1μl，加水补充至25μl。PCR循环条件为：42℃反转录30分钟，95℃预变性3分钟，变性94℃，10秒，退火54℃，30秒，延伸72℃，30秒，35个循环。PCR产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，获得预期大小的特异性目的条带。

2.2、鉴别检验

将病毒株用MEM营养液(购自宜兴市赛尔生物科技有限公司，产品代码：1605-030)稀释为100TCID₅₀/0.1ml，与等量牛流行热特异性阳性血清混合，在37℃下中和作用1小时后，将混合液(血清中和病毒液)接种已长成单层的BHK21-C13细胞4瓶(25cm²/瓶)，每瓶接种1.0ml，在37℃下吸附1小时，弃去混合液，补加含2％马血清的MEM营养液10.0ml，同时设立正常细胞对照和病毒对照各1瓶。经检验，血清中和病毒样品4/4未见CPE，病毒对照4/4出现CPE，正常细胞对照正常，说明分离的毒株为牛流行热毒株。

3)理化特性试验

3.1、电镜形态观察

取F6代病毒培养物200ml，反复冻融3次后10000r/min离心30分钟，取上清液进行500倍稀释后与等体积牛流行热阳性血清于37℃作用2-3h，10000r/min离心30分钟，沉淀物用0.5ml去离子水溶解，用2％磷钨酸钠负染30分钟，室温下自然干燥后，在透射电镜下观察。结果如图1所示，可见病毒粒子呈三角形、锥形或弹形，与已有文献描述的牛流行热病毒形态、大小一致。

3.2、乙醚敏感试验

取F6代病毒培养物1.5ml，3管，其中2管加入1.5ml乙醚，充分振荡，在室温分别作用10分钟和30分钟，3000r/min离心10分钟，抽取下层病毒液，然后在通风橱内吹10分钟去除残存乙醚，另1管不加乙醚作为病毒对照，将3管病毒液进行病毒含量测定并计算TCID₅₀。测定结果如下表2所示，可见将F6代病毒培养物经乙醚处理10min后，其病毒含量由10^7.00TCID₅₀/0.1ml降低为10^0.75、10^1.00、10^0.75TCID₅₀/0.1ml，经乙醚处理30min后，对细胞失去感染性，与不加乙醚处理的结果明显不同，表明该病毒株有囊膜，对乙醚敏感。

表2：乙醚处理实验结果(TCID₅₀/0.1ml)

3.3、耐酸、碱性试验

取F6代病毒培养物10.0ml，用1N NaOH或1N HCl将pH值调至2.0、5.6、7.0、9.0、12.0，pH 2.0和pH 12.0组室温作用10min，pH 5.6和pH 9.0组室温作用60min，pH 7.0组室温作用90min，将作用后病毒液及作用前病毒液进行病毒含量测定并计算TCID₅₀。测定结果如下表3所示，可见将F6代病毒培养物pH调节至2.5和12.0后作用10min，病毒失去对细胞的感染性，说明该病毒株不能耐受强酸强碱，将pH调至5.6后作用60min，病毒含量从10^7.0TCID₅₀/0.1ml迅速下降至10^2.0TCID₅₀/0.1ml，说明该病毒株不耐酸。将pH调至8.0和9.0，作用60min后，病毒含量分别降低了10^0.5和10^1.0TCID₅₀/0.1ml，说明该病毒株对碱有一定的耐受性。

表3：耐酸、耐碱性试验结果

3.4、抗胰蛋白酶试验

取F6代病毒培养物1.0ml，3管，其中2管分别加入1.0ml 1％胰酶和1ml 0.5％胰酶，另外1管作为病毒对照，在室温作用10分钟，立即加入1ml冰箱预冷的新生牛血清，充分混匀终止胰蛋白酶作用，将3管病毒液进行病毒含量测定并计算TCID₅₀。测定结果如下表4所示，可见将F6代病毒培养物分别加0.5％和1％胰酶处理后，其病毒含量下降明显，说明该病毒对胰蛋白酶较敏感。

表4：胰蛋白酶处理实验结果(TCID₅₀/0.1ml)

3.5、温度敏感性试验

取F6代病毒培养物5管，置56℃分别水浴10分钟、30分钟和60分钟，置37℃水浴作用8h、18h，将作用后病毒液连同作用前病毒液进行病毒含量测定并计算TCID₅₀。测定结果如下表5所示，可见将F6代病毒培养物置56℃水浴处理后，其病毒含量下降明显，60min后可以使病毒株完全灭活，37℃水浴条件下病毒含量变化不大。

表5：温度敏感性试验

4)生物学特性(乳鼠毒力实验)

从-70℃超低温冰箱取1支F6代牛流行热病毒培养物约1ml，选取1～3日龄乳鼠2窝，各10只，其中1窝作为不攻毒的阴性对照，另一窝10只乳鼠采用1ml一次性注射器通过脑内注射方式注射0.03ml牛流行热病毒培养物，每日观察，记录乳鼠存活情况。

结果表明，接种牛流行热细胞毒F6代的10只乳鼠在接种后第5天开始出现精神沉郁、消瘦、后肢麻痹等症状，第6天时便有1只乳鼠出现死亡，第7天时4只死亡，第8天时攻毒组剩余乳鼠全部死亡，对照组乳鼠均正常。

综上经纯净性检测、特异性检测、免疫电镜、理化特性、生物学特性等鉴定，该实施例分离获得的病毒株纯净性符合要求，免疫电镜、理化特性、生物学特性均符合牛流行热病毒特征，证明该病毒株为牛流行热病毒毒株。

实施例2、牛流行热病毒接种和培养条件的优化

2.1、病毒抗原最佳收获时间的确定：

将实施例1中F6代种毒继续传10代，获得F16代种毒，按照0.2％(体积百分含量)接种于BHK21-C13悬浮细胞(以下实施例3中详述BHK21-C13悬浮细胞培养方法)，细胞初始接种密度为2×10⁶个/ml，置于37℃培养，培养基为悬浮专用培养基(在BBSM培养基(购自北京清大天一科技有限公司，产品代码：MD910)中加入1.15g/L的碳酸氢钠，和3％～5％(体积百分比)的新生牛血清，调节pH值至7.2±0.5)，分别于培养24、48、72、96、120h时取样观察牛流行热病毒感染BHK21-C13悬浮细胞的活力和密度，并分别检测抗原TCID₅₀，检测结果见表6。

表6：牛流行热病毒感染BHK21-C13悬浮细胞

由上表6可知，当牛流行热病毒培养48-72h时，病毒抗原含量达到最高，为10^6.75TCID₅₀/100μL，即48-72h为病毒抗原最佳收获时间。

2.2、最佳接毒量的确定：

将实施例1中F6代种毒继续传10代，取F16代种毒分别按照体积百分含量0.1％、0.2％、2％、5％的接毒量同时接种于BHK21-C13悬浮细胞，细胞初始密度为2×10⁶个/ml，置于37℃培养，培养基为悬浮专用培养基，培养48h后分别收获病毒抗原，并且再按照相同接毒量传代3次，分别检测TCID₅₀，检测结果见下表7。

表7：不同接毒量病毒检验结果

由上表7可以看出接毒量为0.2％和0.5％时，病毒含量更高，由此可以推断病毒最佳接毒量为0.2％-0.5％，即0.2％-0.5％(体积百分含量)为该病毒种毒的最佳接毒量。

2.3、最佳培养温度的确定：

将实施例1中F6代种毒继续传10代，取F16代种毒按照体积百分含量0.5％接种于BHK21-C13悬浮细胞，细胞初始密度为2×10⁶个/ml，分别置于32℃、34℃、35℃、37℃含5％二氧化碳气氛的培养箱中培养，培养基为悬浮专用培养基，培养48h后分别收获病毒抗原并检测TCID₅₀，结果见表8。

表8：不同病毒收获时间的病毒检验结果

温度(℃)	TCID<sub>50</sub>/0.1ml
		32	10<sup>5.5</sup>TCID<sub>50</sub>/0.1ml
34	10<sup>6.5</sup>TCID<sub>50</sub>/0.1ml
		35	10<sup>6.5</sup>TCID<sub>50</sub>/0.1ml
37	10<sup>6.0</sup>TCID<sub>50</sub>/0.1ml

由表8可以看出培养温度为32℃和37℃时，抗原TCID₅₀低于34-35℃培养时的抗原TCID₅₀，因此优选34℃-35℃为该病毒的最佳培养温度。

2.4、最佳接种密度的确定：

将实施例1中F6代种毒继续传10代，取F16代种毒按照体积百分含量0.2％的接毒量接种于三组不同细胞密度的BHK21-C13悬浮细胞中，细胞密度分别为1.0×10⁶个/ml、2.0×10⁶个/ml、4.0×10⁶个/ml、6.0×10⁶个/ml，置于34℃含5％二氧化碳气氛的恒温振荡培养箱中培养，培养基为悬浮专用培养基，培养48小时收获病毒液进行病毒TCID₅₀含量检测，结果见表9。

表9：不同接种密度的病毒检验结果

由表9可以看出，当细胞密度不低于2.0×10⁶个/ml，接种牛流行热病毒种毒后，毒价均可达10^6.0TCID₅₀/0.1ml以上，因此对于该毒株，不低于2.0×10⁶个/ml为最佳接种密度。

实施例3、牛流行热灭活疫苗的生产

该实施例利用上述实施例1分离的牛流行热病毒毒株作为种毒为例，按照上述实施例2确定的病毒接种和培养条件用悬浮培养的BHK21-C13细胞培养牛流行热病毒种毒，从而制备用于生产牛流行热灭活疫苗的病毒抗原。其中还可以使用已有的牛流行热病毒毒株作为种毒，同样可以实现本发明所声称的技术效果。牛流行热灭活疫苗的生产具体包括以下操作。

3.1、BHK21-C13悬浮细胞的生物反应器大规模培养

3.1.1、悬浮培养的BHK21-C13种细胞的复苏

从液氮中取出一支冻存的BHK21-C13悬浮细胞株(保存于金宇保灵生物药品有限公司)，37℃快速融化，1000rpm离心5分钟，弃上清液，加入悬浮专用培养基(BBSM培养基中按1.15g/L加入碳酸氢钠，再添加3％-5％(体积百分比)新生牛血清，调节pH值至7.2±0.5)，重悬，调节接种密度为0.2-0.5×10⁶细胞/mL，转至125mL细胞培养瓶中培养，培养体积：30-50mL，37℃、100rpm培养。

3.1.2、细胞传代

细胞培养48h后取样计数，若细胞密度≥2.0×10⁶细胞/mL时进行细胞传代，否则继续培养，取需要传代的细胞，加入悬浮专用培养基，将细胞液稀释至0.2-0.5×10⁶细胞/mL，将稀释好的细胞液分装培养瓶中悬浮培养1-3代，扩增至反应器所需体积和密度(细胞密度≥2.0×10⁶细胞/mL，存活率大于90％)。

3.1.3、BHK21-C13细胞5L反应器悬浮培养

将步骤3.1.2培养得到的符合要求的悬浮细胞250-1000mL混合在专用接种瓶内。将接种瓶内的细胞转移至5L反应器中，补加悬浮专用培养基至5000mL，细胞密度稀释至0.2-0.5×10⁶细胞/mL，设定细胞培养温度：36.5±0.5℃，pH值：7.20±0.1，DO值：20％-60％(饱和度百分比)，转速随着细胞密度、培养体积、搅拌方式的不同而不同，一般在60-110rpm。细胞培养48h后取样计数，当细胞密度≥2.0×10⁶细胞/mL时将细胞液转至50L反应器内培养，或作为培养病毒使用，否则继续培养至所需细胞密度。经测，细胞密度达2-4×10⁶细胞/mL。

3.1.4、BHK21-C13细胞50L反应器悬浮培养

取步骤3.1.3培养的符合要求(细胞密度≥2.0×10⁶细胞/mL，存活率大于90％)的悬浮细胞，加入50L反应器中，补加悬浮专用培养基至50L，使细胞密度稀释至0.2-0.5×10⁶细胞/mL，设定细胞培养温度：36.5±0.5℃，pH值：7.20±0.1，DO值：20％-60％，转速随着细胞密度、培养体积、搅拌方式的不同而不同，一般在60-110rpm。细胞培养48h后取样计数，当细胞密度≥2.0×10⁶细胞/mL时，可将细胞转至500L反应器内继续培养或培养病毒使用，否则继续培养至所需细胞密度(细胞密度≥2.0×10⁶细胞/mL)。

3.1.5、BHK21-C13细胞500L反应器悬浮培养

取步骤3.1.4培养的符合要求的悬浮细胞，加入500L反应器中，补加悬浮专用培养基至500L，使细胞密度稀释至0.2-0.5×10⁶细胞/mL，设定细胞培养温度：36.5±0.5℃，pH值：7.20±0.1，DO值：20％-60％，转速随着细胞密度、培养体积、搅拌方式的不同而不同，一般在60-110rpm。细胞培养48h后取样计数，当细胞密度≥2.0×10⁶细胞/mL时，可将细胞转至5000L反应器继续培养或病毒培养使用，否则继续培养至所需细胞密度(细胞密度≥2.0×10⁶细胞/mL)。

3.1.6、BHK21-C13细胞5000L反应器悬浮培养

取步骤3.1.5培养的符合要求的悬浮细胞，加入5000L反应器中，补加悬浮专用培养基约4500L，使细胞密度稀释至0.2-0.5×10⁶细胞/mL，设定细胞培养温度：36.5±0.5℃，pH值：7.20±0.1，DO值：20％-60％，转速随着细胞密度、培养体积、搅拌方式的不同而不同，一般在60-110rpm。细胞培养48h后取样计数，当细胞密度≥2.0×10⁶细胞/mL时用于病毒培养，否则继续培养至所需细胞密度(细胞密度≥2.0×10⁶细胞/mL)。

3.2、牛流行热病毒种毒的制备

3.2.1、牛流行热病毒基础种毒的制备

取长势良好且已铺满单层的BHK21-C13贴壁细胞，弃去原培养液(常规培养BHK21-C13贴壁细胞的培养液)，加入病毒维持液(维持液配方：MEM培养基，用7.5％(质量体积百分比W/V)碳酸氢钠溶液调节pH值至7.4±0.2，添加1％-3％(体积百分比)的马血清)，再按0.1％(体积比)的比例加入实施例1分离获得的牛流行热病毒毒株或其传代病毒液，于33-37℃培养，当细胞病变≥75％(数量百分比)时，收获病毒液并冻融3次，得到牛流行热基础种毒，也可以以此牛流行热基础种毒作为种毒按照以上方法进行连续传代后作为牛流行热基础种毒，代次范围为F7～F16代，-20℃以下冷冻保存，取样检测TCID₅₀，每0.1mL病毒含量应≥10^5.0TCID₅₀。

3.2.2、牛流行热病毒生产用悬浮种毒的制备

取上述步骤3.1中反应器内培养合格的BHK21-C13悬浮细胞，密度达到2×10⁶个细胞/mL以上，弃掉原培养液(即悬浮专用培养基)，加入病毒维持液(维持液配方：BBSM培养基按1.15g/L加入的碳酸氢钠，添加1％-3％(体积百分比)马血清，调节pH值至7.4±0.2)恢复至原培养体积，再加入0.1％(体积百分比)牛流行热病毒基础种毒(上述步骤3.2.1得到)，设定病毒培养的pH值为7.20-7.60，DO：20％-60％(饱和度百分比)，转速：60-110rpm，温度：33.0-37.0℃，累计悬浮培养48-72h，待细胞病变≥75％(数量百分比)时收获病毒液作为牛流行热病毒生产用悬浮种毒，-20℃以下冷冻保存。也可以用收获的牛流行热病毒生产用悬浮种毒液，继续经反应器连续传代不超过5代，作为牛流行热病毒生产用悬浮种毒，-20℃以下冷冻保存。

3.2.3、牛流行热病毒生产用贴壁种毒的制备

取长势良好且已铺满单层的BHK21贴壁细胞，弃去原培养液(常规培养)，加入病毒维持液(维持液配方：MEM培养基，用7.5％(质量体积百分比W/V)碳酸氢钠溶液调节pH值至7.4±0.2，添加1％-3％(体积百分比)的马血清)，再按0.1％(体积比)的比例加入上述步骤3.2.1制备的牛流行热病毒基础种毒，于33-37℃培养，当细胞病变≥75％(数量百分比)时，收获病毒液作为牛流行热病毒生产用贴壁种毒，-20℃以下冷冻保存，取样检测TCID₅₀，每0.1mL病毒含量应≥10^5.0TCID₅₀。也可以用收获的牛流行热病毒生产用贴壁种毒，连续传代不超过5代，作为牛流行热病毒生产用贴壁种毒，-20℃以下冷冻保存。

3.3、疫苗生产用牛流行热病毒液的制备

取步骤3.1中反应器内培养合格的BHK21-C13细胞悬浮，密度达到2×10⁶个细胞/mL以上，弃掉悬浮专用培养基，加入病毒维持液(维持液配方：BBSM培养基按1.15g/L加入碳酸氢钠，添加1％-3％(体积百分比)马血清，调节pH值至7.4±0.2)恢复至原培养体积，再加入0.2％-0.5％(体积百分比)牛流行热病毒生产用悬浮种毒(步骤3.2.2制备)或牛流行热病毒生产用贴壁种毒(步骤3.2.3制备)，设定病毒培养的pH值为7.20-7.60，DO值：20％-60％，转速：60-110rpm，温度：33.0-37.0℃。悬浮培养，培养48～72小时细胞活力为80％左右时收获病毒液，-20℃以下冷冻保存。取样检测TCID₅₀，每0.1mL中病毒含量应≥10^5.0TCID₅₀。将符合要求的病毒液用于配制疫苗。

TCID₅₀测定方法为：将牛流行热病毒液从超低温冰箱中取出，化冻后用MEM溶液作10倍系列稀释，取10^-4～10^-7 4个稀释度，每个稀释度接种96孔板细胞培养板各4孔，每孔100μL，再添加BHK21-C13细胞悬液，细胞密度为0.1～0.3×10⁶个细胞/mL，每孔100μL，同时设置不接毒的细胞对照，置37℃、5％二氧化碳培养箱培养3～5日，记录各稀释度细胞病变孔数，按Reed-Muench法计算TCID₅₀。检测结果如下表10所示。

表10：反应器培养牛流行热病毒生产用抗原结果(悬浮种毒)

表11：反应器培养牛流行热病毒生产用抗原结果(贴壁种毒)

由上表10和表11可见，无论是以牛流行热病毒生产用悬浮种毒作为牛流行热病毒种毒，还是以牛流行热病毒生产用贴壁种毒作为牛流行热病毒种毒，在48h左右收获牛流行热病毒液时，各批次每1mL抗原TCID₅₀均在10^7.25及以上，病毒抗原含量符合要求，且各批次收获的病毒抗原含量以及病毒抗原量均稳定，均可以用于制备牛流行热灭活疫苗。

3.4、病毒液澄清、浓缩纯化、灭活、乳化配苗

3.4.1、病毒液澄清

将步骤3.3收获的病毒液从冷库中提出，室温解冻，用0.45μm的已灭菌澄清过滤器预处理病毒液或者用连续流离心机离心至带降温系统的中转储存罐内，获得澄清后病毒液。

3.4.2、浓缩纯化

采用500KD-750KD中空纤维柱将澄清后病毒液进行5-10倍浓缩，再用等体积PBS进行洗滤。取浓缩并洗滤后的病毒抗原液，按照一定浓度添加PEG6000，于4℃振荡4h后静置过夜，瓶底有白色沉淀析出，将PEG6000纯化处理后的抗原用高速冷冻离心机4℃8000r/min离心30min，弃掉离心上清，将沉淀用pH为7.40，浓度为0.04mol/L的PBS液重悬，如无特殊要求，按照浓缩后的原体积进行重悬。病毒液浓缩纯化之前和浓缩纯化后的病毒含量以及蛋白含量检测结果分别如下表12和表13所示。

表12：病毒浓缩纯化前后病毒含量、无菌检测结果

表13：3批牛流行热病毒抗原浓缩纯化前后杂蛋白含量检测结果(μg/ml)

由上表12可见，经澄清后的牛流行热病毒抗原液经中空纤维柱浓缩5-10倍后，抗原TCID₅₀均提高了10^0.5以上，且经PEG纯化后恢复至浓缩后体积，抗原TCID₅₀未见明显下降，保持在10^7.75TCID₅₀/1mL以上，病毒抗原经无菌检验均合格，表明本发明建立的浓缩纯化工艺未对牛流行热病毒感染性造成影响。由上表13可见，经过澄清处理之后的病毒抗原液经中空纤维柱浓缩后，病毒抗原液中的杂蛋白去除率可达86％以上，随后再次经过PEG纯化处理后，可以进一步有效去除经浓缩后的病毒抗原液中残余的杂蛋白，去除率达到86％以上；因此，采用中空纤维柱和PEG纯化去除病毒抗原液中的杂蛋白的综合去除率达到98％以上，可见两者协同作用，可以有效去除牛流行热病毒抗原液中的杂蛋白，且保持病毒抗原TCID₅₀在较高水平，是本发明优化的适宜牛流行热病毒抗原液的浓缩纯化工艺。

3.4.3、灭活

按照1:4000(v/v)将β-丙内酯加入浓缩纯化后的牛流行热病毒抗原中，进行灭活，灭活条件为：4℃，24-30h，110r/min间歇搅拌。灭活完成后将灭活缸温度调至37℃水解2h，将β-丙内酯水解。

灭活检验：取灭活水解后病毒液，按10％(V/V)的比例接种于BHK21-C13单层细胞2瓶(25cm²/瓶)，加入MEM维持液，添加2％马血清，同时设正常细胞对照1瓶(25cm²/瓶)。37℃培养2～4日，应不出现细胞病变。收获培养物冻融后再取样按照上述方法接种BHK21-C13单层细胞盲传两代，均不应出现细胞病变。灭活检验结果入下表14所示。

表14：抗原灭活检验结果

由上表14可见，牛流行热病毒抗原经β-丙内酯灭活后将灭活液接种BHK21-C13细胞并盲传3代，均未引起牛流行热典型病变，表明建立的灭活方法可以将牛流行热抗原液完全灭活。另一方面，本发明采用β-丙内酯作为灭活剂，其按照1:4000的比例在病毒抗原液浓缩纯化后添加，在约4℃低温条件下24-30h即可完成病毒抗原的灭活处理，其中在病毒抗原液浓缩纯化后添加β-丙内酯，可以有效降低β-丙内酯的添加量，并且β-丙内酯的添加比例为1:4000左右，相对于其他灭活剂的添加比例显著降低；低温灭活环境(约4℃)可以有效保护对热敏感的牛流行热病毒抗原不被高温破坏，并且相对于使用甲醛灭活需要7～12天，BEI灭活需要48小时，本发明使用β-丙内酯灭活仅需24-30h，灭活处理时间较短，可以提高疫苗生产效率。另外，灭活完成后只需要在37℃条件下水解2h左右即可将β-丙内酯水解为对免疫牛没有毒性的人体脂肪代谢产物β羟基丙酸，因此可以保证生产的疫苗的安全性，避免接种后的副反应。

3.4.4、乳化配苗

将灭活后病毒抗原按照水相:油相(206佐剂)＝46:54(v/v)，将水相的抗原和油相进行混合乳化，具体为：将水相加入油相，边加边搅拌，30℃混匀30min，降温过夜后分装，加塞加盖并贴签，2～8℃保存备用。

将步骤3.4.3经灭活后的病毒抗原和206佐剂乳化分装后，将17001批病毒抗原配制的成品苗记为Y17001批，将17002批病毒抗原制备的成品苗记为Y17002批，将17003批病毒抗原制备的成品苗记为Y17003批，规格均为50mL/瓶，每批分装量5000mL，按操作规程分装后加盖密封并贴上产品标签，置2～8℃冷库保存备用。

3.5、疫苗成品检验

3.5.1、性状检测

(1)外观：应为乳白色或淡粉红色略带黏滞性均匀乳状液。

(2)剂型：水包油包水型(W/O/W)。取一清洁吸管，吸取少量疫苗滴于清洁冷水表面，应呈云雾状扩散。

(3)稳定性：吸取疫苗10.0mL加入离心管中，以3000r/min离心15分钟，管底析出的水相应不超过0.5mL。

(4)黏度：按现行《中国兽药典》附录进行，应符合规定。

3.5.2、装量检查：按现行《中国兽药典》附录进行，应符合规定。

3.5.3、无菌检验：按现行《中国兽药典》附录进行，应无菌生长。

3.5.4、安全检验：将制备的牛流行热灭活疫苗分别免疫犊牛、小鼠、豚鼠，连续观察14日，监测是否有异常反应。

3.5.5、效力检验：将制备的牛流行热灭活疫苗间隔21日，按照2ml/头剂量免疫3～6月龄犊牛，共免疫2次，第二次免疫后21日采血分离血清检测牛流行热病毒中和抗体。

3.5.6、保存期检验：将制备的疫苗在2～8℃保存1-12个月后免疫3～6月龄犊牛，连续观察14日，监测是否有异常反应并检测疫苗效力，以确定该疫苗的有效期。

对步骤3.4生产的3批次疫苗(Y17001、Y17002、Y17003)按照上述方法进行性状、装量、无菌性、安全性、效力、保存期等进行检测，结果如下表15、表16和表17所示，可见3批次疫苗产品的外观均为乳白色略带黏滞性乳状液，剂型均为W/O/W型，黏度均在23cp左右，且均无水相析出，均无菌生长，疫苗分别接种犊牛、小鼠、豚鼠后均无异常反应，且二免后21天中和抗体均为1:32以上，各指标均符合疫苗成品要求。

表15：3批次疫苗产品性状及无菌检验结果

表16：3批次疫苗产品安全及效力检验结果

表17：3批次疫苗在2～8℃保存1-12个月后免疫3～6月龄犊牛的效力和有效期

由上表17数据可知，将该疫苗置于2～8℃条件下保存4个月后，可以完全保护免疫动物，二免后21天中和抗体水平均≥1:32；保存9个月后，可以完全保护免疫动物，二免后21天中和抗体水平均≥1:32；保存12个月后，可以完全保护免疫动物，二免后21天中和抗体水平均≥1:32，且3批次疫苗从保存4个月至保存12个月后免疫犊牛的效力未发生明显变化。表明本发明方法生产的疫苗产品具有较长的有效期，其在2～8℃条件下可保存9个月以上，甚至达到12个月也未见效力的明显下降(显著长于目前市售的牛流行热灭活疫苗产品的有效期，2～8℃保存4个月)。

综上所述，本发明采用悬浮培养工艺悬浮培养BHK21-C13细胞可以快速得到大量的悬浮细胞，进而利用该大量培养的悬浮培养的BHK21-C13细胞悬浮培养牛流行热病毒种毒，可以获得牛流行热病毒抗原含量高且产量高的制苗用病毒抗原液，为保证配苗用病毒抗原液中高的病毒抗原含量奠定了基础；利用中空纤维柱和PEG协同对牛流行热病毒抗原液进行浓缩纯化，可以有效去除病毒液中绝大部分杂蛋白，并且获得的病毒抗原液仍保持较高的病毒抗原含量，可以有效保证配苗用病毒抗原液中抗原的高纯度和滴度，进而保证疫苗的质量稳定性并避免杂蛋白对整个配苗体系和疫苗成品的影响；在病毒抗原灭活中选择使用适于低温条件下灭活的灭活剂β-丙内酯，可以有效保护对热敏感的牛流行热病毒抗原，避免配苗用牛流行热病毒抗原被降解，进一步保证配苗用病毒抗原液中高的病毒抗原含量；以上各步骤共同作用，实现了配苗用病毒抗原液中病毒抗原的含量不低于10^7.0TCID₅₀/mL，并且配制的疫苗成品在2～8℃条件下可保存9个月以上，仍能够完全保护免疫动物，且二免后21天中和抗体水平≥1:32。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的内容。

Claims

1.一种兽用牛流行热灭活疫苗的规模化生产方法，其包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的生产方法，其特征在于，步骤S1)中所述使用反应器悬浮培养BHK21-C13细胞至细胞密度达到2×10⁶个细胞/mL以上的具体操作为：

3.根据权利要求1或2所述的生产方法，其特征在于，视生产规模由小至大反应器容积依次为5L、50L、500、5000L；且，大规模的生产使用大容积的反应器，在该反应器中使用前一小规模反应器中培养的BHK21-C13悬浮细胞进行悬浮培养；

4.根据权利要求1-3中任一项所述的生产方法，其特征在于，步骤S2)的具体操作方法为：

5.根据权利要求1-4中任一项所述的生产方法，其特征在于，所述牛流行热病毒种毒为使用悬浮培养的BHK21-C13悬浮细胞制备的牛流行热病毒生产用悬浮种毒或使用贴壁培养的BHK21-C13贴壁细胞制备的牛流行热病毒生产用贴壁种毒。

6.根据权利要求5所述的生产方法，其特征在于，所述牛流行热病毒生产用悬浮种毒和牛流行热病毒生产用贴壁种毒的制备具体包括：

M1)牛流行热病毒基础种毒的制备

M2)牛流行热病毒生产用悬浮种毒的制备

M2’)牛流行热病毒生产用贴壁种毒的制备

7.根据权利要求1-6中任一项所述的生产方法，其特征在于，步骤S3)的具体操作为：

8.根据权利要求7所述的生产方法，其特征在于，所述灭活剂为β-丙内酯；

所述油相为206佐剂，所述水相和油相的配比为：水相:油相＝46:54(v/v)；乳化操作具体为：将水相加入油相，边加边搅拌，30±1℃混匀20～40min，降温过夜。

9.一种兽用牛流行热灭活疫苗，其由权利要求1-8中任一项所述的生产方法获得，配苗用牛流行热病毒抗原液中病毒含量为10^7.0TCID₅₀/mL以上，所述兽用牛流行热灭活疫苗在2～8℃条件下的保存期为9个月以上。

10.根据权利要求9所述的兽用牛流行热灭活疫苗，制苗中使用适于低温条件下灭活的灭活剂，例如β-丙内酯。