CN108517318A

CN108517318A - 一种猪流行性腹泻病毒的变异毒株及其应用

Info

Publication number: CN108517318A
Application number: CN201810316634.6A
Authority: CN
Inventors: 闫若潜; 班付国; 王华俊; 赵雪丽; 谢彩华; 马震原; 王淑娟; 刘梅芬; 陈慧娟; 赵月龙; 杨朋霞
Original assignee: Henan Center For Animal Disease Control & Prevention
Current assignee: Henan Center For Animal Disease Control & Prevention
Priority date: 2018-03-30
Filing date: 2018-04-10
Publication date: 2018-09-11
Anticipated expiration: 2038-04-10
Also published as: CN108517318B

Abstract

本发明属于微生物技术领域，具体地说，涉及猪流行性腹泻病毒的变异毒株(PEDV‑HNCADC‑2017，保藏编号为CCTCC NO：V201766)及其应用。本发明所述变异毒株在10％血清培养基的VERO细胞中传代至156代，其TCID₅₀可达10^7.7/0.1mL，毒价较高，能与猪阳性血清和Balb/c小鼠阳性血清反应，免疫荧光反应较强。由其制备的弱毒活疫苗可用于猪流行性腹泻病的预防，抗体产生快，免疫后2周能产生较高的抗体水；由其制备的灭活疫苗安全性高，免疫后不排毒，可用于母猪和1日龄仔猪猪流行性腹泻病的防控。当采用二者联合免疫，可显著提高免疫效果。

Description

一种猪流行性腹泻病毒的变异毒株及其应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体地说，涉及猪流行性腹泻病毒的变异毒株及其应用。

背景技术

猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea，PED)是由猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)引起的以腹泻、呕吐和脱水为特征的猪肠道传染病。该病多发生在冬春寒冷季节，哺乳仔猪、架子猪或育肥猪等各年龄段均可发病，但哺乳仔猪发病和死亡最为严重，病死率高达90％～100％，给养猪业带来了严重的危害和经济损失。20世纪70年代，英国首次报道PED，以后相继在比利时、德国、加拿大、日本、瑞士等多个国家报道了该病的发生与流行。20世纪80年代后，该病开始在亚洲一些养猪国家流行，中国也多次报道了猪流行性腹泻，尤其是2010年以来，猪流行性腹泻在我国重新出现，并大范围爆发流行，表现为哺乳仔猪的高发病率和高死亡率，给我国养猪业造成严重经济损失。2013年以来，PED在美国猪群中爆发疫情，并迅速波及到整个美国和一些相邻的国家，经济损失在9～18亿美元。

PEDV属于冠状病毒科冠状病毒属α冠状病毒，该病毒属于单股正义RNA病毒，基因组全长约28Kb，至少编码7个开放阅读框，编码顺序为5’UTR-ORF1a-ORF1b-S-ORF3-E-M-N-3’UTR，分别编码主要结构蛋白：复制酶多聚蛋白lab(pplab)、纤突蛋白(S)、ORF3蛋白、小膜蛋白(E)、膜糖蛋白(M)和核衣壳蛋白(N)，其中N蛋白在病毒的感染细胞过程中产量最高，是病毒诱导机体免疫的主要优势抗原。

2014年以来，我国猪流行性腹泻病流行依然严重，主要危害初生仔猪，病死率较高，给养猪业带来了巨大的损失，当前主要采用病料返饲、自家苗或商品化疫苗防控该病，但是效果不一，易造成排毒散毒。因此，开发含有流行株猪流行性腹泻病毒抗原、在细胞中稳定传代、且免疫源性好的疫苗成为当前防控该病的首要任务。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种猪流行性腹泻病毒的变异毒株及其应用。

为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：

第一方面，本发明提供一种猪流行性腹泻病毒PEDV-HNCADC-2017株，已于2017年11月22日在湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，其保藏编号为CCTCC NO：V201766。

所述猪流行性腹泻病毒PEDV-HNCADC-2017株作为一种猪流行性腹泻病毒的变异毒株，在10％血清培养基的VERO细胞中传代至156代，其TCID₅₀可达10^7.7/0.1mL，毒价较高，可用于制备猪流行性腹泻弱毒活疫苗或(和)灭活疫苗。

进一步地，基于所述猪流行性腹泻病毒PEDV-HNCADC-2017株的特性，本发明提供了所述猪流行性腹泻病毒PEDV-HNCADC-2017株在制备治疗/预防猪流行性腹泻的药物方面的应用。

作为一种具体的应用，所述药物可为疫苗，所述疫苗的抗原成分来自猪流行性腹泻病毒PEDV-HNCADC-2017株，包括但不限于其核衣壳蛋白。

进一步地，所述疫苗可为弱毒活疫苗或灭活疫苗。

第二方面，基于前述猪流行性腹泻病毒PEDV-HNCADC-2017株的应用，本发明提供了由猪流行性腹泻病毒PEDV-HNCADC-2017株制备的猪流行性腹泻疫苗。

进一步地，当所述疫苗为弱毒活疫苗时，制备方法如下：

1)按照常规方法制备Vero细胞(Vero细胞购自美国ATCC)，生长液为含8％新生牛血清的MEM，培养细胞长成单层时接种SD10株病毒；

2)取PEDV-HNCADC-2017株毒种(≥10^7.5TCID₅₀/0.1mL)按1％接种长势良好的Vero细胞单层，置37℃吸附1.5～2小时，加含2％新生牛血清DMEM维持液继续培养；

3)接毒后，每日观察2次，记录细胞病变情况，细胞病变达80％～80％以上时收获，反复冻融3次；

4)取冻融后的病毒液测定病毒含量，病毒含量不低于10^7.5TCID₅₀/0.1mL；

5)将检验合格的细胞毒液与保护剂按常规方法制备成疫苗。其中所述保护剂可以为本领域常规使用的任一种病毒疫苗用保护剂，例如蔗糖牛奶冻干保护剂，以及蔗糖和明胶的保护剂，所述蔗糖和明胶在疫苗中的质量百分比终浓度分别为5％和1％。

为了提高疫苗的保存时间，本发明对所述疫苗的保护剂进行优化，提供一种优选的配方，即本发明所述弱毒活疫苗中包含如下质量百分比浓度的成分：蔗糖15％、明胶1.2％、海藻糖2.6％和乳糖2％。通过添加上述组分，可以使疫苗在长期保存后，还能保持活力。在4℃条件下放置180日，其效价基本不变，放置360日，其抗体阻断率稍有下降，但仍高于规定的标准；而用普通保护剂冻干的产品，在4℃条件下放置180日，其抗体效价基本上能达到规定的标准，但放置360日后抗体效价下降很快，尤其720日后不可再使用，只能按报废品处理。

进一步地，当所述疫苗为灭活疫苗时，制备方法如下：

1)病毒培养与灭活

将收获的病毒细胞培养液反复冻融2次，6000rpm离心10min，收集上清液，即为病毒液，按照一定比例加入β-丙内酯灭活36h得到灭活的PEDV培养液；

灭活效果验证：灭活后的细胞培养液在VERO细胞上盲传3代观察细胞状态，细胞培养无病变，表明病毒灭活充分。

2)灭活病毒与白油佐剂的乳化

油相配制：将处理后的白油、span和吐温-80按照96:4比例混匀，并进行121℃高压蒸汽灭菌后备用；

水相配制：将灭活的PEDV病毒细胞培养液加入4％吐温-80混匀；

将灭活的PEDV病毒细胞培养液水相与油相佐剂按照1:3混合后乳化，并进行相关检验后制备成PEDV灭活疫苗。

第三方面，本发明进一步提供一种可提高猪获得猪流行性腹泻免疫能力的免疫方式，采用前述弱毒活疫苗和/或所述灭活疫苗进行免疫，不仅如此，当采用前述弱毒活疫苗与灭活疫苗进行联合免疫，相对使用单一疫苗，可显著提高免疫效果。

所述联合免疫方法具体为：

方案1：母猪产前45～50天，后海穴注射上述制备弱毒活疫苗1头份；分娩前23～25天，后海穴注射上述制备灭活油乳疫苗1头份；再次配种前7天，后海穴注射上述制备灭活油乳1头份；

方案2：母猪产前45～50天，后海穴注射上述制备灭活油乳1头份；分娩前23～25天，后海穴注射上述制备弱毒活疫苗1头份；再次配种前7天，后海穴注射上述制备弱毒活疫苗1头份。

为了使所述免疫方式体现在免疫产品中，本发明提供了一种可提高猪获得猪流行性腹泻免疫能力的系统，所述系统包括前述弱毒活疫苗和前述灭活疫苗。

本发明涉及到的原料或试剂均为普通市售产品，涉及到的操作如无特殊说明均为本领域常规操作。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可以相互组合，得到具体实施方式。

本发明的有益效果在于：

本发明提供了一种猪流行性腹泻病毒的变异毒株PEDV-HNCADC-2017，其具有在10％血清DMEM培养基的VERO细胞中传代至156代，其TCID50可达10^7.7/0.1mL，能与猪阳性血清和Balb/c小鼠阳性血清反应，免疫荧光反应较强。由其制备的弱毒活疫苗可用于猪流行性腹泻病的预防，抗体产生快，免疫后2周能产生较高的抗体水平；由其制备的灭活疫苗安全性高，免疫后不排毒，可用于母猪和1日龄仔猪猪流行性腹泻病的防控。当采用二者联合免疫，可显著提高免疫效果。

附图说明

图1为本发明所述PEDV-HNCADC-2017分离变异株S基因的进化分析图。

图2为灭活细胞培养液在VERO细胞上传代的显微镜观察图(10*10)。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的解释说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1

本实施例用于说明PEDV-HNCADC-2017株的分离与鉴定。

1.主要试剂

非洲绿猴肾细胞(vero)购于武汉大学中国典型培养物保藏中心；细胞培养基DMEM购于博士德生物公司；胎牛血清购于Sera公司；病毒基因组DNA/RNA快速抽提试剂盒购于Axygen生物科技有限公司；感受态菌种购于大连宝生物公司；青霉素、链霉素均购于索莱宝公司。

2.样品的处理

取PEDV荧光定量PCR检测为阳性的腹泻仔猪的粪便样品或肠内容物，用DMEM配制成1:5的悬液，震荡混匀，使用匀浆仪匀浆5min，在4℃条件下10000r/min离心10min，取上清用0.22μm的滤器过滤获得样品处理液，即可接种于vero细胞。

3.病毒的分离

取长满单层的、生长状态良好的vero细胞接种上述样品处理液。接种前用无血清D-Hanks液清洗vero细胞2次，将1mL经过滤的PEDV阳性悬液加到T 25细胞培养瓶中，在5％CO₂、37℃细胞培养箱中培养1h，每20min摇动细胞培养瓶一次，使处理液中病毒与细胞充分接触并吸附细胞，同时设置阴性对照孔(采用DMEM培养基为阴性对照)，弃去细胞瓶中液体，加入含有7.5μg/mL胰酶、2％血清的DMEM完全培养基6mL，放入5％CO₂、37℃细胞培养箱培养24h～72h，6～9h观察一次细胞病变(CPE)，若无CPE产生，则在接种72h后冻融细胞2次后，收集细胞和培养液进行下一代的接种培养，盲传至第8代观察到CPE出现，将细胞冻融2次后收集细胞和培养液并继续传代培养，收集的每代细胞培养物进行荧光定量PCR扩增鉴定。

4.PEDV分离毒株RT-PCR鉴定

4.1引物的设计与合成

根据GenBank中登录的PEDV CV777S1(AF353511)基因序列，利用Oligo 6.0软件设计引物S1-1(p1)/S1-1(p2)，理论扩增产物大小为1 066bp。

S1-1基因的引物序列为：

S1-1(p1)：5'-TTTTTGGACCATAGCATCGACT-3'，

S1-1(p2)：5'-AATACTCATACTAAAGTTGGTGGGA-3'。

4.2PEDV核酸的提取和反转录

取PEDV分离株细胞培养物200μL，采用天隆DNA/RNA快速抽提试剂盒法提取RNA；按照如下试剂和程序对提取样品及阴、阳性对照的RNA分别进行反转录(cDNA)。体系总体积为20μL，各成分如下：

试剂	体积
		M-MLV 5×Reactin Buffer	4.0μL
dNTP(2.5mmol/L)	4.0μL
		S1-1(p2)(20mmol/L)	1.0μL
Rnasin(40U/μL)	0.5μL
		M-MLV RT(5U/μL)	0.5μL
RNA	10.0μL

混匀后置37℃水浴锅，反应1h，得到的cDNA用于PCR扩增或-20℃冻存备用。

4.3RT-PCR扩增

分别以样品及阴、阳性对照的cDNA为模版，反应体积为25μL，加入以下成分，对其S1-1基因进行PCR扩增：

扩增反应程序为：95℃预变性5min后，94℃45sec，51℃45sec，72℃90sec共35个循环，72℃延伸10min。反应结束后，取10μL PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测；检测为PCR阳性的病料，分别进行猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪圆环病毒2型(PCV2)和猪瘟病毒(CSFV)四种外源病毒的检测，检测结果为阴性的病料进行下一步的病毒分离；

5.PEDV病毒蚀斑纯化

1)在6孔细胞培养板中接种1×10⁵的Vero细胞(2mL)，放入37℃、5％CO₂饱和湿度培养箱中过夜培养。

2)接毒：

以不含血清的DMEM将病毒作连续的10倍稀释，选择适当稀释度的病毒悬液接种6孔细胞培养板内的单层细胞。置于37℃作用1h，使病毒充分吸附。吸附完毕后，吸出病毒液，同时设置阴性对照。

3)加琼脂培养基：

取配好的营养琼脂糖，融化后降温至50～55℃时与2×DMEM4％血清完全培养基1：1混合，沿壁注入铺有细胞的培养板中，并缓慢翻转，使营养琼脂糖覆盖在细胞表面，厚度约2mm，以不超过3mm为宜。平放30min，待琼脂糖凝固，随后倒置37℃、5％CO₂饱和湿度培养箱中继续培养。逐日观察一次细胞形态以及出斑情况，约48h后，出现肉眼可见的病灶。

4)挑单克隆病毒斑，获得PEDV-HNCADC-2017株(或称为分离株/分离变异株)，加入50μL无血清DMEM培养基冻融2次后接种于培养瓶中培养。

6.PEDV病毒TCID₅₀测定

将Vero细胞消化后调整细胞数目至2～3×10⁵个/mL，加至96孔细胞培养板，100μL/孔；待细胞铺满孔底后，弃培养液，D-Hank液洗涤2次；将细胞培养液连续10倍稀释，共稀释10个梯度；将10个梯度的病毒液加入96孔板，每个梯度8孔；培养5～7天，详细记录每孔病变；结果显示，按Reed-muench氏法算出PEDV-HNCADC-2017分离株的第10、25、50、126、136、142、156代(冻融1次)、156代(冻融2次)病毒液的TCID₅₀分别为10^3.38/0.1mL、10^5.81/0.1mL、10^6.11/0.1mL、10^6.7/0.1m、10^7.73/0.1mL、10^7.71/0.1mL、10^7.7/0.1mL、10^8.3/0.1mL，病毒的滴度随着病毒培养代次的增加而逐渐提高且趋于稳定。

7.PEDV-HNCADC-2017分离变异株S基因序列分析

将PEDV-HNCADC-2017分离变异株S基因序列分析与GenBank数据库中中其他PEDV参考毒株S基因序列比对分析，发现该序列与2013～2017年国内地方流行株的相似性在97.4％～98.3％之间，与韩国DR13毒株的相似性为86.4％，与比利时CV777毒株的相似性为86.6％，与美国MN毒株、IA1毒株的相似性为98.2％，系统进化树分析表明，分离变异株与20160421/HENZK株亲缘关系较近。

PEDV-HNCADC-2017株的S基因(如SEQ ID NO.3所示)与比利时CV777毒株、韩国DR13毒株等国外经典毒株的S基因比较分析，PEDV-HNCADC-2017株在第163～164bp之间有TTG 3个核苷酸的插入，在173～174bp之间有GGGTGTTAA 9个核苷酸插入，在405～406bp之间有AAT 3个核苷酸插入，在466～473bp之间有TGGAAA 6个核苷酸缺失；核苷酸的插入和缺失导致了氨基酸第53～57位变异依次为S→I、M→G、N→E、S→N、S→Q；第57～58位之间有3个氨基酸G、V、N插入；第63～67位变异依次为G→A、T→G、G→Q、I→H、E→P；第135位插入N；第155～157位氨基酸变异依次为K→E、D→H、I→S。

实施例2

本实施例用于说明所述PEDV-HNCADC-2017株的应用，具体体现为利用所述PEDV-HNCADC-2017株制备猪流行性腹泻弱毒活疫苗。

1.弱毒活疫苗的制备

1.1按照常规方法制备Vero细胞(Vero细胞购自美国ATCC)，生长液为含8％新生牛血清的MEM，培养细胞长成单层时接种SD10株病毒；

1.2取PEDV-HNCADC-2017株毒种(≥10^7.5TCID₅₀/0.1mL)按1％接种长势良好的Vero细胞单层，置37℃吸附1.5～2小时，加含2％新生牛血清DMEM维持液继续培养；

1.3接毒后，每日观察2次，记录细胞病变情况，细胞病变达80％～90％以上时收获，反复冻融3次；

1.4取冻融后的病毒液测定病毒含量，病毒含量不低于10^7.5TCID₅₀/0.1mL；

1.5将检验合格的细胞毒液与保护剂按常规方法制备成疫苗。其中的保护剂可以为目前使用的任一种病毒疫苗用保护剂，例如蔗糖牛奶冻干保护剂，以及蔗糖和明胶的保护剂(其在疫苗中的质量百分比终浓度分别为5％和1％)。为了提高疫苗的保存时间，本发明对疫苗的保护剂进行优化，最终制成的疫苗中包含有质量百分比浓度为蔗糖15％、明胶1.2％、海藻糖2.6％和乳糖2％。通过添加上述的组分，可以使疫苗在长期保存后，还能保持活力。在4℃条件下放置180日，其效价基本不变，放置360日，其抗体阻断率稍有下降，但仍高于规定的标准；而用普通保护剂冻干的产品，在4℃条件下放置180日，其抗体效价基本上能达到规定的标准，但放置360日后抗体效价下降很快，尤其720日后不可再使用，只能按报废品处理。

2.疫苗检验方法及结果

2.1性状检验3批活疫苗外观呈淡黄色海绵状疏松团块，加入稀释液后迅速溶解，易与瓶壁脱离。

2.2无菌检验3批活疫苗按照现行《中华人民共和国兽药典》附录进行检验，均无菌生长。

2.3支原体检验3批活疫苗按照现行《中华人民共和国兽药典》附录进行检验，均无支原体生长。

2.4安全检验取猪流行性腹泻中和抗体、抗原均为阴性的3日龄仔猪20头，随机分成4组，每组5头，口服10头份疫苗，临床观察14日，均5/5健活，未见不良反应发生。

2.5效力检验用DMEM高糖液将疫苗稀释为每mL含1头份，再作10倍系列稀释，取10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7、10^-8、10^-9、10^-10 10个稀释度，分别接种长势良好的96孔细胞培养板中Vero细胞，每个稀释度接种8孔，每孔0.1mL，同时设细胞阴性对照2列。接种后，置37℃、含5％CO2培养72～96小时，观察细胞病变，出现CPE者判为感染，计算PEDV TCID₅₀。3批活疫苗每头份病毒含量分别为10^7.27/0.1mL、10^7.45/0.1mL、10^7.48/0.1mL。

3.弱毒活疫苗的安全性试验

3.1材料与方法

3.1.1对妊娠母猪试验

取产前45d～50d猪流行性腹泻中和抗体、抗原均为阴性的妊娠母猪15头，随机分成3组，每组5头，第1组后海穴注射猪流行性腹泻活疫苗1头份/头，第2组后海穴注射猪流行性腹泻活疫苗5头份/头，第3组后海穴注射DMEM液2mL作为对照组，测定接种前和接种后连续7日的体温，同时于接种后观察接种部位的变化和临床表现，观察至母猪产仔。

3.1.2对仔猪试验

取1日龄仔猪15头，随机分成3组，每组5头，第1组口服猪流行性腹泻活疫苗1头份/头，第2组口服猪流行性腹泻活疫苗5头份/头，第3组口服DMEM液1mL作为对照组，连续14日观察仔猪的临床反应和接种部位的变化。

3.2结果

3.2.1对妊娠母猪试验

免疫组1组和2组10头妊娠母猪与对照组比较，精神状态、采食、饮水、妊娠产仔均未见异常，注射部位均未见不良反应、无肿块形成。结果表明本发明的弱毒株对妊娠母猪时安全的。

3.2.2对仔猪试验

免疫组1组和2组10头仔猪与对照组比较，吃乳、诱饲、粪便均未见异常，注射部位均未见不良反应、无肿块形成。表明本发明的弱毒株对仔猪是安全的。

4.猪流行性腹泻弱毒活疫苗的效力试验

4.1材料和方法

取产前45d～50d妊娠母猪10头，随机分成2组，每组5头，第1组后海穴注射猪流行性腹泻弱毒活疫苗，第2组后海穴注射DMEM液2mL作为对照组，母猪产仔后，1日龄、7日龄、14日龄各取14头，随机分成2组，每组10头，均口服猪流行性腹泻强毒5倍TCID₅₀，观察攻毒后仔猪的临床表现。

4.1结果

免疫母猪所产的仔猪，1日龄攻毒后，10头免疫仔猪哺乳、精神、粪便未见异常，均健活；对照组仔猪攻毒后，10头均表现典型的猪流行性腹泻症状，死亡9/10头。7日龄攻毒后，免疫仔猪哺乳、精神、粪便未见异常，均健活；对照组仔猪攻毒后，10头均表现典型的猪流行性腹泻症状，死亡8/10头。14日龄攻毒后，10头免疫仔猪采食、精神、粪便未见异常，均健活；对照仔猪攻毒后，10头均表现典型的猪流行性腹泻症状，死亡8/10头。

实施例3

本实施例用于说明所述PEDV-HNCADC-2017株的应用，具体体现为利用所述PEDV-HNCADC-2017株制备猪流行性腹泻灭活疫苗。

1.PEDV灭活疫苗的制备

1.1病毒培养与灭活

1.2灭活病毒与白油佐剂的乳化

佐剂配制：将处理后的白油、span和吐温-80按照79：15：6比例混匀，并进行121℃高压蒸汽灭菌后备用。

将灭活的PEDV病毒细胞培养液与白油佐剂按照1:(1.5～3)混合后乳化，并进行相关检验后制备成PEDV灭活疫苗。

1.3β-丙内酯(BPL)与甲醛灭活剂比较

(1)β-丙内酯(BPL)：直接作用于病毒核酸，保持免疫原性，强灭活效果；极易水解，无残留，并且水解产物无毒无害；灭活时间短，缩短了疫苗的生产周期；

(2)甲醛：使微生物的蛋白质、核酸变性，导致死亡；对蛋白质产生一定的变性作用，能够保留大部分抗原性；灭活后产生两种免疫原：一类是天然的抗原，即未被甲醛破坏的抗原；另一类是被甲醛破坏后形成的新抗原。

2.PEDV灭活疫苗的安全性试验

2.1材料与方法

2.1.1对妊娠母猪试验

取产前45d～50d猪流行性腹泻中和抗体、抗原均为阴性的妊娠母猪15头，随机分成3组，每组5头，第1组后海穴注射猪流行性腹泻灭活疫苗1头份/头，第2组后海穴注射猪流行性腹泻灭活疫苗5头份/头，第3组后海穴注射DMEM液2mL作为对照组，测定接种前和接种后连续7日的体温，同时于接种后观察接种部位的变化和临床表现，观察至母猪产仔。

2.1.2对仔猪试验

取1日龄仔猪15头，随机分成3组，每组5头，第1组后海穴注射猪流行性腹泻灭疫苗1头份/头，第2组后海穴注射猪流行性腹泻活疫苗5头份/头，第3组后海穴注射DMEM液1mL作为对照组，连续14日观察仔猪的临床反应和接种部位的变化。

2.2结果

2.2.1对妊娠母猪试验

免疫组1组和2组10头妊娠母猪与对照组比较，精神状态、采食、饮水、妊娠产仔均未见异常，注射部位均未见不良反应、无肿块形成。结果表明本发明的PEDV灭活疫苗对妊娠母猪是安全的。

2.2.2对仔猪试验

免疫组1组和2组10头仔猪与对照组比较，吃乳、诱饲、粪便均未见异常，注射部位均未见不良反应、无肿块形成。表明本发明的PEDV灭活疫苗对仔猪是安全的。

3.猪流行性腹泻活疫苗的效力试验

3.1材料和方法

取产前45d～50d妊娠母猪10头，随机分成2组，每组5头，第1组后海穴注射猪流行性腹泻活疫苗，第2组后海穴注射DMEM液2mL作为对照组，母猪产仔后，1日龄、7日龄、14日龄各取14头，随机分成2组，每组10头，均口服猪流行性腹泻强毒5倍TCID₅₀，观察攻毒后仔猪的临床表现。

3.2结果

免疫母猪所产的仔猪，1日龄攻毒后，10头免疫仔猪哺乳、精神、粪便未见异常，均健活；对照组仔猪攻毒后，10头均表现典型的猪流行性腹泻症状，死亡9/10头。7日龄攻毒后，免疫仔猪哺乳、精神、粪便未见异常，均健活；对照组仔猪攻毒后，10头均表现典型的猪流行性腹泻症状，死亡9/10头。14日龄攻毒后，10头免疫仔猪采食、精神、粪便未见异常，均健活；对照仔猪攻毒后，10头均表现典型的猪流行性腹泻症状，死亡7/10头。

实施例4

本实施例用于说明所述PEDV-HNCADC-2017株的应用，具体体现为利用所述PEDV-HNCADC-2017株制备猪流行性腹泻弱毒活疫苗与制备的猪流行性腹泻灭活疫苗联合应用实行跟胎免疫母猪方案，将为母猪和所产仔猪提供更好保护。

基础健康母猪免疫方案：母猪于产前45天母猪后海穴注射弱毒活疫苗1头份；分娩前23～25天，后海穴注射灭活疫苗1头份；配种前7天，后海穴注射灭活疫苗1头份。

应当理解的是，对上述实施例所用试剂或原料的用量进行等比例扩大或者缩小后的技术方案，与上述实施例的实质相同。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 河南省动物疫病预防控制中心

<120> 一种猪流行性腹泻病毒的变异毒株及其应用

<141> 2018-01-29

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工引物(Artificial Sequence)

<400> 1

tttttggacc atagcatcga ct 22

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工引物(Artificial Sequence)

<400> 2

aatactcata ctaaagttgg tggga 25

<210> 3

<211> 1555

<212> DNA

<213> 猪流行性腹泻病毒(PEDV)

<400> 3

atgttgggcg attgggccga cgtcgcatgc tcccggccgc catggcggcc gcgggaattc 60

gattatgaag tctttaacct acttctggtt gttcttacca gtactttcaa cacttagcct 120

accacaagat gtcaccaggt gctcagctaa cactaatttt aggcggtttt tttcaaaatt 180

taatgttcag gcgcctgcag ttgttgtact gggcggctat ctacctattg gtgaaaacca 240

gggtgttaat tcaacttggt actgtgctgg ccaacatcca actgctagtg gcgttcatgg 300

tatttttgtt agccatatta gaggtggtca tggctttgag attggcattt cgcaagagcc 360

ttttgactct agtggttacc agctttattt acataaggct actaacggta acactaatgc 420

tactgcgcga ctgcgcattt gccagtttcc tagcattaaa acattgggcc ccactgctaa 480

taatgatgtt acaacaggtc gtaattgcct atttaacaaa gacatcccag ctcatatgag 540

tgaacatagt gttgtcggca taacatggga taatgatcgt gtcactgtct tttctgacaa 600

gatctattat ttttatttta aaaatgattg gtcccgtgtt gcgacaaagt gttacaacag 660

tggaggttgt gctatgcaat atgtttacga acccacctat tacatgctta atgttactag 720

tgctggtgag gatggtattt cttatcaact ctgtacagct aattgcattg gttatgctgc 780

caatgtattt gctactgagc ccaatggcca cataccagaa ggttttagtt ttaataattg 840

gtttcttttg tccaatgatt ccactttggt gcatggtaag gtggtttcca accaaccatt 900

gttggtcaat tgtcttttgg ccattcctaa gatttatgga ctaggccaat ttttctcctt 960

taatcaaacg atcgatggcg tttgtaatgg agctgctttg cagcgcgcac cagaggctct 1020

gaggtttaat attaatgaca cctctgtcat tcttgctgaa ggctcaattg tacttcatac 1080

tgctttagga acaaatcttt cttttgtctg cagtaattct tcagatcctc atttagctac 1140

cttcgccatg ccactgggtg ctacccaagt accctattat tgttttctta aagtggatac 1200

ttacaactcc actgtttata aattcttggc tgttttacct cctactgtca gggaaattgt 1260

tatcaccaag tatggtgatt tttatgtcaa tgggtttgga tacttgcatc tcggtttgtt 1320

ggatgctgtc acaattaatt tcactggtca tggcactgac gatgatgttt ctggtttttg 1380

gaccatagca tcgactaatt ttgttgatgc actcatcgaa gttcaaggaa ctgccattca 1440

gcgtttcttt attgtgatga tccaatcact agtgaattcg cggccgcctg caggtcgacc 1500

atatgggaga gctcccaacg cgttggatgc atagcttgag attctatagt acctt 1555

Claims

1.一种猪流行性腹泻病毒PEDV-HNCADC-2017株，其特征在于，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，其保藏编号为CCTCC NO：V201766。

2.根据权利要求1所述的猪流行性腹泻病毒PEDV-HNCADC-2017株，其特征在于，在10％血清DMEM培养基的VERO细胞中传代至156代，其TCID₅₀可达10^7.7/0.1mL。

3.根据权利要求1所述的猪流行性腹泻病毒PEDV-HNCADC-2017株，其特征在于，其S基因与经典疫苗株CV777的S基因相比，PEDV-HNCADC-2017株在第163～164bp之间有TTG 3个核苷酸的插入，在173～174bp之间有GGGTGTTAA 9个核苷酸插入，在405～406bp之间有AAT3个核苷酸插入，在466～473bp之间有TGGAAA 6个核苷酸缺失。

4.权利要求1～3任一项所述的猪流行性腹泻病毒PEDV-HNCADC-2017株在制备治疗/预防猪流行性腹泻的药物方面的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述药物为疫苗。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述疫苗为弱毒活疫苗或灭活疫苗。

7.由权利要求1～3任一项所述的猪流行性腹泻病毒PEDV-HNCADC-2017株制备的猪流行性腹泻疫苗。

8.根据权利要求7所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗为弱毒活疫苗，所述弱毒活疫苗中包含如下质量百分比浓度的成分：蔗糖15％、明胶1.2％、海藻糖2.6％和乳糖2％。

9.根据权利要求7所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗为灭活疫苗，所述灭活疫苗在灭活过程中采用β-丙内酯作为灭活剂。

10.一种可提高猪获得猪流行性腹泻免疫能力的系统，其特征在于，所述系统包括权利要求8所述的疫苗和权利要求9所述的疫苗。