CN103347534B

CN103347534B - 牛病毒性腹泻病毒1b型疫苗组合物和方法

Info

Publication number: CN103347534B
Application number: CN201180067439.0A
Authority: CN
Inventors: D.W.维斯; J.R.哈里斯
Original assignee: Elanco US Inc
Priority date: 2010-12-27
Filing date: 2011-12-21
Publication date: 2018-09-11
Anticipated expiration: 2031-12-21
Also published as: WO2012092053A1; PL2658570T3; MX2013007584A; JP2014502619A; US20130280294A1; KR101554080B1; MX351380B; PE20140871A1; NZ611531A; JP6053036B2; RU2013128921A; CO6761399A2; CA2822825C; SG191396A1; KR20130109220A; PT2658570T; CN103347534A; CA2822825A1; AU2011352800B2; EP2658570B1

Abstract

公开了包含修饰的活牛病毒性腹泻病毒1b型(BVDV‑1b)的免疫原性组合物、和其用于配制和施用治疗和预防药剂中的方法。具体而言，本发明提供了用于预防、治疗、管理和/或改善病毒或微生物感染或其一种或多种症状(包括例如，导致船运热、牛呼吸疾病复合症、和/或牛病毒性腹泻的那些感染)的免疫原性组合物和方法，尤其是在易感或受感染的动物中。

Description

牛病毒性腹泻病毒1b型疫苗组合物和方法

发明背景

交叉引用相关申请

本申请涉及题为“Compositions and Methods for Identifying andDifferentiating Viral Components of Multivalent Shipping Fever Vaccines”的共同未决的美国临时专利申请系列号61/427,404(2010年12月27日与此同时提交，且特别地通过对其明确引用而整体并入本文)中。

关于联邦资助的研究或开发的声明

不适用。

合作研究协议的当事人姓名

不适用。

发明领域

本发明总体涉及兽药和动物疫苗的领域。更具体地，其涉及免疫原性组合物，制备这种组合物的方法，和用于预防、治疗、改善、和/或管理微生物或病毒感染或其症状(特别是哺乳动物家畜中的呼吸道感染，包括多因素疾病诸如牛呼吸道疾病复合症(BRDC))的方法。公开了抗原组合物和它们在配制和施用预防和治疗剂以用于预防、治疗和/或改善瘟病毒且特别是负责或涉及易感或感染动物中船运热、BRDC和牛病毒性腹泻的瘟病毒的感染的一种或多种症状中的使用方法。

相关领域的描述

BRDC是多因素疾病复合症，其经常折磨市场渠道和目标牧场或饲养场中的储料/饲料小牛(stocker/feeder calves)。这种疾病的主要细菌病原体是溶血性曼海姆菌(Mannheimia haemolytica)、多杀巴斯德氏菌(Pasteurella multocida)、睡眠嗜组织菌(Histophilus somni)(原睡眠嗜血杆菌(Haemophilus somnus))和牛支原体。已经与船运热相关的病毒病原体是牛疱疹病毒1型(BHV-1)、副流感病毒3(PI₃)、牛呼吸道合胞病毒(BRSV)和牛病毒性腹泻病毒(BVDV)。

牛病毒性腹泻病毒(BVDV)

BVDV目前公认为牛呼吸疾病复合症(BRDC)(通常被称为“船运热”)的重要病原体。感染所有年龄段的牛(包括哺乳小牛)的疾病的特征在于呼吸急促、咳嗽、抑郁、食欲丧失、眼和鼻分泌物和温度升高。在急性发作时，死亡可能在症状开始后24小时内发生。鉴于缺乏抗病毒治疗剂，BVDV的治疗是有问题的，且由瘟病毒感染导致的死亡率较高。此外，在许多情况下，对治疗药物的抗菌素耐药性也使得参与BRDC的细菌病原体的治疗变得复杂。

牛病毒性腹泻病毒是不同组的病毒，其可以根据表型(参见，例如，Baker, 1995)(细胞病变或非细胞病变的)和基因型(参见，例如，Ridpath等人, 1994；Vilcek等人,2001；和Flores等人, 2002)进行分类。由于许多原因，在家畜中建立针对BVDV的保护性免疫一直是有问题的。如同在一些其他病毒介导的疾病中，针对BVDV的血清抗体水平并不一定与预防疾病相关。在哺乳小牛中建立保护性免疫遇到了额外的障碍，因为针对BVDV的母体抗体可能耗竭注射的免疫原且有效地中和疫苗。

Fulton等人的研究(2006)评价了进入美国饲养场的21,743只小牛且确定88只小牛被BVDV持续感染(PI)。在88只PI小牛中，77.9％被BVDV-1b感染；只有11.6％被BVDV-1a感染，且只有10.5％被BVDV-2a感染。不幸的是，尽管这些数据清楚地表明，BVDV-1b是进入国内饲养场的PI牛的优势亚型，但是目前没有对于BVDV-1b感染特异性的USDA许可的疫苗。

因此，由于这些原因和现有技术中固有的其他原因，存在对于引发剧烈和多面的免疫应答的BVDV疫苗制剂和特别是引发针对BVDV的1b型形式的免疫应答的BVDV疫苗制剂的需要。因为在未接种的畜群中存在巨大经济损失的可能性，存在对于在哺乳动物家畜群体中诱导预防免于BVDV感染的含有修饰的活BVDV-1b疫苗的低成本(且优选地，单剂量)疫苗的需要。

同样，因为针对多因素疾病诸如BRDC和相关船运热疾病的现有多价疫苗对于预防BVDV-1b感染在很大程度上是无效的，所以还存在对于更好预防和控制BVDV-1b-易感家畜中疾病暴发的改进的接种形式的需要。

发明概述

本发明涵盖新的有用的组合物，以及其使用方法，其可以有利地改进将预防和/或治疗剂递送至需要其的动物。本发明提供了疫苗组合物，所述疫苗组合物提供了相比于常规制剂的优势，且特别提供了预防或控制一种或多种瘟病毒引起的疾病和特别是由BVDV病毒引起的疾病(包括1b型亚基因型(即，BVDV-1b)的疾病)的方式。

在总体和一般的意义上，本发明涵盖组合物，制备这种组合物的方法，和它们在预防、治疗和/或管理病毒和/或微生物感染、发病机制和疾病中的使用方法。本文公开的免疫原性组合物以及其使用方法尤其可用于使用本发明的疫苗组合物和其使用方法来预防、治疗和/或改善易感哺乳动物中船运热/BRDC的一种或多种症状，所述疫苗组合物优于目前在兽医学领域可获得的常规船运热预防剂/治疗。

在特定实施方案中，本发明提供了包含修饰的活BVDV-1b病毒的免疫原性组合物，以及含有它们的药物制剂，和这种疫苗在多种预防和/或治疗方案中的制备方法。这种组合物和方法特别可用于在易于被BVDV感染的动物诸如哺乳动物家畜中预防病毒和多因素疾病。

在相关实施方案中，本发明还提供了使用公开的疫苗组合物以用于引发动物中病毒特异性免疫应答的方法。在总体和一般的意义上，这种方法通常涉及将本文公开的一种或多种免疫原性组合物提供给选择的动物，其量和时间可以有效地引发动物中的病毒特异性免疫应答和特别是BVDV特异性免疫应答。在这种实施方案中，动物优选是偶蹄类哺乳动物，且更优选是，牛科的成员。

本发明还提供了在一种或多种选择的哺乳动物群体中预防或控制病毒和/或微生物感染(和特别是由BVDV和相关物种引起的瘟病毒感染)的爆发的方法。该方法通常涉及将有效量的一种或多种公开的免疫原性或疫苗组合物提供给这种群体的易感或有风险成员，其持续的时间足以延迟、减轻、降低、抑制和/或防止在一般群体中这种感染的爆发。示例性哺乳动物群体包括但不限于，牛亚科和羊亚科的成员，和特别是美洲野牛属(Bison)、Bos属、水牛属(Bubalus)、山羊属(Capra)、雪羊属(Oreamnos)、麝牛属(Ovibos)、羊属(Ovis)、非洲水牛属(Syncerus)等的成员。在说明性实施方案中，这些方法在治疗美洲野牛属、Bos属、山羊属(Capra)和羊属(Ovis)中的商业家畜(包括但不限于，美洲野牛(Bison bison)、Bos taurus、山羊(Caprahircus)和家绵羊(Ovis aries))中是特别理想的。

在另一个方面，本发明提供了用于刺激动物的免疫系统以生产针对病毒感染和特别是牛科强毒瘟病毒感染的保护性免疫应答的方法。这种方法通常涉及至少将免疫和预防有效量的一种或多种公开的疫苗组合物施用于需要其的动物，其量和时间足以刺激动物的免疫系统。在该方法的常规实践中，在一个实施方案中，施用一种或多种公开的免疫和预防活性的疫苗组合物优选诱导动物中至少第一可检测量的抗瘟病毒抗体，且还更优选地，诱导动物中至少第一可检测量的抗BVDV-1b抗体。在优选的实施方案中，施用组合物优选免疫动物以免于BVDV-1b病毒的初次、随后、和/或复发性感染，在某些实施方案中，还优选免疫动物以免于一种或多种基因相似或表位相关的病毒(包括例如，BVDV病毒的一种或多种类型、毒株和亚型(包括但不限于，BVDV-1a、BVDV-2和其他基因相似的瘟病毒)的初次、随后、和/或复发性感染。

在又另一个实施方案中，本发明提供了用于在动物中产生针对瘟病毒的保护性免疫应答的方法。这种方法通常涉及将免疫和预防有效量的一种或多种公开的BVDV-1b免疫原性组合物提供给需要其的动物，其条件和时间足以产生这种针对一种或多种瘟病毒种、亚种或毒株和优选地针对一种或多种BVDV种、毒株、亚型或血清型的保护性免疫应答。

同样地，本发明还提供了将预防或治疗组合物提供给哺乳动物宿主中第一细胞的方法。这种方法通常涉及将预防或治疗有效量的一种或多种本文公开的BVDV特异性免疫原性组合物提供给需要其的哺乳动物，其条件和时间可以有效将组合物提供给这种哺乳动物中的至少第一细胞、组织、器官或器官系统。

本发明还提供了用于预防、治疗、和/或改善哺乳动物中的BVDV感染的一种或多种症状的方法。这种方法通常涉及将免疫和预防有效量的一种或多种公开的BVDV-1b免疫原性组合物提供给需要其的哺乳动物，其条件和时间足以预防、治疗和/或改善哺乳动物中的BVDV感染的一种或多种症状。

同样地，本发明还提供了用于预防、治疗、和/或改善哺乳动物中的多因素疾病诸如BRDC和特别是其中至少第一BVDV感染牵连作为疾病的因果或贡献性病原体的那些疾病中的一种或多种症状的方法。这种方法通常涉及将至少第一免疫或预防有效量的至少第一抗BVDV-1b疫苗组合物施用于选择的哺乳动物，其条件和时间足以预防、治疗和/或改善哺乳动物中的疾病的一种或多种症状。

在又另一个实施方案中，本发明提供了用于预防、治疗、和/或改善牛科成员中船运热的一种或多种症状的方法。这种方法通常涉及将至少第一免疫或预防有效量的包含修饰的活BVDV-1b病毒群体的第一组合物提供给牛科动物，其条件和时间足以预防、治疗和/或改善牛科动物中的船运热的一种或多种症状。

免疫原性组合物

为了提供针对一种或多种瘟病毒和特别是牵涉于牛科成员中BRDC和船运热中的一种或多种病毒病原体的更广泛的保护，本发明人已经开发出包括一种或多种BVDV-1b特异性抗原的安全且有效的疫苗制剂。已经描述了单价和多价疫苗制剂，包括，在单价疫苗的情况下含有一种或多种引发仅对于BVDV特异性的免疫应答的抗原、表位或修饰的活病毒的那些，或在多价疫苗的情况下含有一种或多种引发不仅对于BVDV而且对于一种或多种额外病原体特异性的免疫应答的抗原、表位或修饰的活病毒的那些。

在说明性实施方案中，已经开发出包含修饰的活BVDV-1b的单价免疫原性组合物，以保护家畜免于BVDV-1b感染。此外，本发明还已经提供了对于BRDC和相关船运热特异性的多价免疫原性组合物，包括示例性的六重(即，“六价”)修饰的活牛病毒制剂，其包括用于特异性诱导动物中针对BHV-1、PI₃、BRSV、BVDV 1型的两种亚基因型(1a和1b)、和BVDV 2型中的一种或多种、优选两种或更多种、更优选三种或更多种的免疫应答的抗原组分。在更优选的实施方案中，该制剂诱导针对上述中每一种的免疫应答，通常至不同的水平。

在进一步的实施方案中，本发明提供了含有上述免疫原的疫苗制剂，和其用于预防、治疗、和/或改善动物中的瘟病毒感染和特别是哺乳动物家畜中BVDV-1b感染的一种或多种症状的方法。本发明进一步涵盖疫苗制剂和它们在预防、治疗和/或改善牛科动物和其他相关哺乳动物物种中的船运热诸如BRDC的一种或多种症状中的使用方法。

疫苗制剂

本发明提供了免疫原性组合物和其疫苗制剂，其用于预防一种或多种病毒感染，以及组合物，其用于预防或治疗选择的哺乳动物中的一种或多种多因素疾病复合症。具体而言，本发明提供了一种或多种公开的免疫原性组合物在制备用于预防、防止或治疗哺乳动物中一种或多种疾病、或这种疾病的一种或多种症状、诸如家畜中的BVDV感染的疫苗药物中的用途，且特别提供了在制备用于防止、管理、改善和/或治疗哺乳动物中一种或多种疾病、或这种疾病的一种或多种症状、诸如家畜中的BVDV感染的兽医学可接受的药物中的用途。

可以通过本领域普通技术人员可获得的对于选择的哺乳动物的任何合适的施用途径，优选通过肌内或皮下注射或经由鼻内、口服、皮肤、经皮或皮内施用而施用本发明的疫苗。优选地，对于针对BVDV-1b的疫苗，皮下、或通过肌内或鼻内途径施用接种，其中最优选皮下递送。通常在断奶之前、断奶时或在进入牧场或饲养场的时候施用疫苗。作为进行中的成体牛操作的部分，也可以常规采用一个或多个“增强”剂量的这种疫苗，包括例如作为每年再接种/维持时间表的部分。

尽管本发明的药物制剂和疫苗可以制备在任何合适的兽医学可接受的制剂中，但是，在特定的实施方案中，如在兽医学领域中普通技术人员已知的，本发明提供了即用施用(ready-to-administer)的溶液或悬浮液的形式的、在适合用于在施用前稀释的浓缩储存溶液中的、或可重构形式诸如冻干、冷冻干燥或冷冻制剂的疫苗。

修饰的活瘟病毒组合物的制备和本发明的组合物和疫苗与其他免疫原(有或没有一种或多种佐剂)的配制根据本文的指导是常规的，且包括活的减毒瘟病毒与药学可接受的载体或稀释剂，任选地与其他免疫原且任选与佐剂相混合。

药物制剂和疫苗的载体、稀释剂或其他惰性或非活性组分可以包含一种或多种稳定剂、防腐剂和/或缓冲剂，正如在兽医学领域中可以采用的。示例性稳定剂包括但不限于，SPGA和下列中的一种或多种：碳水化合物(包括但不限于山梨糖醇、甘露糖醇、淀粉、蔗糖、葡聚糖、谷氨酸或葡萄糖)，蛋白(包括但不限于奶粉、血清白蛋白、酪蛋白、或来自其他来源诸如来自植物或微生物的蛋白)等。合适的缓冲剂包括但不限于，一种或多种碱金属磷酸盐。可用于配制公开的药物组合物和疫苗的示例性防腐剂包括但不限于，硫汞撒(thimerosal)、硫柳汞、庆大霉素、新霉素、制霉菌素、两性霉素B、四环素、青霉素、链霉素、多粘菌素B、和其任何组合。示例性稀释剂包括但不限于无菌水、一种或多种水性缓冲液(诸如缓冲盐水等)、一种或多种醇(包括多元醇，例如，甘油等)、和其任何组合。

在需要时，本发明的疫苗组合物也可以进一步任选包括一种或多种佐剂。具有佐剂活性的合适的化合物和组合物的非限制性实例包括氢氧化铝，磷酸铝，或氧化铝，水包油型，油包水型，水包油包水型(water-in-oil-in-water)乳剂，其基于，例如，矿物油，诸如但不限于，Drakeol®、Bayol®、或Marcol®；植物油，诸如但不限于，棉籽油、花生油、或玉米油；维生素E醋酸酯；皂苷；鱼油，诸如但不限于，鲨烯或角鲨烷；或其任何组合。

本发明的BVDV特异性疫苗制剂也可以进一步任选含有对一种或多种额外病毒和/或微生物特异性的一种或多种其他免疫原，所述额外病毒和/或微生物也可能对被免疫的动物致病。例如在牛和相关牛科动物中，可以存在于组合物中的额外免疫原可以源自牛致病性病毒的一种或多种，包括但不限于，轮状病毒、牛呼吸道合胞病毒、牛疱疹病毒(包括1型)、牛冠状病毒、副流感病毒(包括3型)、牛副粘病毒等等，或可替代地，源自一种或多种牛致病性微生物种类的那些，诸如不限于，多杀巴斯德氏菌、溶血性曼海姆菌(原溶血性巴斯德氏菌)、睡眠嗜组织菌(原睡眠嗜血杆菌)、牛支原体等，或任何前述的组合。

在一些实施方案中，当相关时，如本领域普通技术人员理解的，本发明的免疫原性组合物和疫苗可以包括将单剂量施用于动物，或可替代地，可以包括经一段时间将多个和/或连续剂量施用于动物。可替代地，本发明的免疫原性组合物也可以与一种或多种抗病毒或抗微生物化合物共同施用，单独或进一步组合施用一种或多种不同的微生物特异性免疫原或疫苗制剂。

本发明的另一个重要方面涉及使用公开的免疫原性组合物以递送一种或多种治疗剂而用于治疗或改善哺乳动物中感染或疾病的一种或多种症状的方法。这种方法通常涉及将一种或多种公开的免疫原性组合物施用于需要其的哺乳动物，其量和时间足以治疗、改善或减轻这种哺乳动物中这种疾病或感染的严重度、持续时间或程度。

本发明的方法和组合物也可以用于在疾病的一种或多种临床症状诊断或开始或其一种或多种症状出现之前、期间或之后防止、预防和/或接种动物，所述动物被怀疑具有一种或多种感染和/或疾病、处于发展一种或多种感染和/或疾病的风险中、或已经诊断具有一种或多种感染和/或疾病。

诱导免疫应答的方法

本发明进一步包括用于诱导易感动物中针对一种或多种病毒病原体的可检测免疫应答的方法。一种优选方法包括将足以诱导动物中可检测的免疫应答的本文公开的疫苗组合物的量施用于动物，所述动物需要其或基于例如对于给定疾病或感染的已知风险因素可能需要其。

在一些实施方案中，本发明涵盖接种受试者以免于瘟病毒感染诸如BVDV、或免于其中瘟病毒感染具有牵连或因果关系的多因素疾病诸如BRDC的方法。这种方法通常涉及将预防和/或治疗有效量的瘟病毒特异性疫苗组合物和一种或多种药学或兽医学可接受的载体、缓冲剂、稀释剂、媒介物等施用于需要其的哺乳动物，以提供动物中的可检测免疫应答以免于瘟病毒感染或这种瘟病毒感染引起或加剧的疾病。

为此，本发明提供了使用公开的免疫原性组合物和疫苗制剂而用于预防、治疗、改善或管理动物中的一种或多种病毒或微生物疾病或感染、或其一种或多种症状的方法。

本发明还提供了一种或多种公开的免疫原性组合物在制备用于预防或防止疾病的兽医药物或疫苗，包括在制备适用于预防性施用以防止或改善动物中瘟病毒感染(包括例如BVDV)的一种或多种症状的一种或多种疫苗中的用途。

本发明还提供了用于将治疗或预防性免疫原性化合物提供给哺乳动物中的第一细胞的方法，所述方法总体包括将有效量的本文公开的BVDV免疫原性组合物提供给需要其的哺乳动物，其时间有效提供免疫或治疗哺乳动物中的所需的治疗和/或预防效果，所述BVDV免疫原性组合物包括作为活性成分的多种修饰的活病毒颗粒。

治疗和预防药剂盒

包括一种或多种公开的免疫原性组合物或包括其的药物制剂；和在一个或多个预防或治疗方案中使用药剂盒的说明书的药剂盒也代表本公开的说明性方面。这种药剂盒优选包括一种或多种公开的免疫原性组合物或疫苗，或单独或与一种或多种额外的治疗化合物、药物等组合，和使用该组分预防或治疗动物中的疾病的说明书。本发明的药剂盒可以包装用于商业流通，且还可以进一步任选地包括用于将一种或多种组合物施用于选择的动物的一个或多个递送装置(例如注射器、小瓶、注射物等)。

这种药剂盒的一个或多个容器通常可以包括至少一个小瓶、试管、烧瓶、瓶、注射器或其他容器，其中可以放置一种或多种免疫原性组合物或一种或多种疫苗制剂，且优选地合适地分配成一个或多个等分试样而用于施用于动物。当还期望第二免疫原性组合物或第一抗病毒或抗微生物化合物时，药剂盒还可以在第二个不同容器或单一容器中含有第二免疫原性组合物或第一抗病毒或抗微生物化合物，所述单一容器具有易破或不易破的屏障以分离两种组分，直到准备用于施用。可替代地，多种不同的免疫原性组合物和/或不同的抗病毒或抗微生物化合物可以制备在单一制剂中，且可以包装在单一容器、小瓶、烧瓶、注射器、导管、插管、瓶、试管、安瓿、或其他合适容器中。药剂盒还可以包括较大容器，诸如箱，所述箱包括上面提到的容器连同其他设备等。多剂量可以包含在具有容器的合适器皿内，如果需要，优选连同任何合适的重量或体积测量装置以根据需要计量预先选择的剂量。

用于药物制备中使用的组合物

本发明的另一个重要方面涉及公开的免疫原性组合物(以及包括它们的制剂)在制备用于预防、治疗或改善动物诸如脊椎哺乳动物中的疾病或其症状的药物中的使用方法。在微生物或病毒来源的一种或多种疾病的治疗和/或预防中也考虑使用公开的免疫原性组合物。

这种使用通常涉及将一种或多种公开的免疫原性组合物施用于需要其的动物，其量和时间足以预防、治疗或管理受影响的动物中的一种或多种疾病或其症状。包括一种或多种公开的免疫原性制剂的组合物也形成本发明的部分，特别是进一步包括至少一种第一药学可接受的赋形剂的那些组合物，其用于治疗或预防病毒和/或微生物来源的一种或多种疾病。

本发明的免疫原性组合物可以制备为一价(即，单价)疫苗，或可替代地，二价、三价或甚至多价(即，多价)疫苗。例如，单价疫苗将优选包括本发明的单一免疫原性组合物(例如修饰的活BVDV-1b病毒的群体)，当引入选择的受体哺乳动物和特别是易受BVDV感染的哺乳动物体内时其能够引发特异性抗BVDV免疫应答。

类似地，二价疫苗组合物将优选包括至少一种第一BVDV-1b特异性组合物和至少一种第二病毒或微生物特异性免疫原，其中每种能够在哺乳动物中引发特异性免疫应答。多价(三价或多价)疫苗组合物优选将分别包括三种或更多种病毒或微生物特异性免疫原。在本文说明的实施方案中，发明人开发出令人惊讶且出乎意料的有利的六价(六重)修饰的活疫苗制剂，其包含对于BVDV-1b、BVDV 1a型(BVDV-1a)、BVDV 2型(BVDV-2)、PI₃、牛呼吸道合胞病毒(BRSV)、和BHV-1(感染性牛鼻气管炎(IBR)的病原体)特异性的免疫原以控制哺乳动物群体和特别是家畜中的BRDC感染。

说明性实施方案的描述

下面描述了本发明的说明性实施方案。为了清楚起见，本说明书中没有描述实际实施的所有特征。当然，应当理解，在任何这种实际实施方案的开发中，必须作出许多实施特定的决定来实现开发者的特定目标，诸如符合系统相关和商业相关的约束条件，这将随着一种实施到另一种实施而变化。此外，应当理解，这种开发努力可能是复杂且耗时的，但是对于受益于本公开内容的本领域普通技术人员而言是常规措施。

“船运热”

“船运热”是对于牛和羊中的急性、高度感染性、败血病综合症给定的术语，其临床特征在于发热、气管急性炎症、流鼻涕、厌食、抑郁、纤维素性肺炎、和感染组织的坏死。在船运后饲养场中最常遇到的船运热是幼牛中的主要死因，且导致行业估计每年损失超过五亿美元。仅在1991年，主要由于治疗成本、生产损失和死亡，船运热估计花费了美国养牛业几乎6.24亿美元。

船运热的发病机制通常被认为涉及使动物倾向于受初始病毒性呼吸道感染的不利外部影响，这进而产生对一种或多种二次细菌感染的增殖有利的条件。

牛呼吸疾病(BRD)复合症(BRDC)

船运热的主要病原体是被称为牛呼吸疾病(BRD)或牛呼吸疾病复合症(BRDC)的多因素状况。BRDC是肉牛产业经济损失的主要原因，其特征在于病毒和细菌病原体的伴随相继或同时感染。BRDC牵连的病毒病原体包括牛疱疹病毒1(BHV-1)、牛PI₃、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、和牛呼吸道合胞病毒(BRSV)。

病毒感染后，受影响的动物然后发生一种或多种后续的细菌感染(例如，溶血性曼海姆菌[原溶血性巴斯德氏菌]、多杀巴斯德氏菌、睡眠嗜组织菌[原睡眠嗜血杆菌]、化脓性放线菌、和各种支原体菌种)，其常常表现为急性肺炎。

肺炎的最常见和最早的可识别的临床体征是抑郁。表现出抑郁的小牛将耳朵下垂、头部伸长、背部弯曲和/或经常从其他牛分离得到它们。由于小牛的健康进行性恶化，它们停止进食，表现出呼吸率增加，且发展出明显发热(通常在104°-108°F范围内)。

瘟病毒

瘟病毒在世界各地的动物中引起经济上重要的疾病。黄病毒科内的瘟病毒属包含三种单链正义RNA病毒：牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、典型猪瘟病毒(CSFV)、边界病病毒(BDV)。最近，已经鉴定了在基因上与BVDV相关的瘟病毒的第四个不同的组，且在文献中被称为牛病毒性腹泻病毒2型(BVDV-2) (参见例如，Thiel等人，1996；和Becher等人，1995；其各自特别地通过对其明确引用而整体并入本文)。因此，当代文本目前将BVDV的初始种称为“BVDV-1”以便在两种之间区分。

牛病毒性腹泻病毒(BVDV)

瘟病毒的模式种是BVDV 1型(BDVD-1)，其基因组长度为约12.5 kb且含有一个大开放阅读框(ORF)(Collett等人，1988，其特别地通过对其明确引用而整体并入本文)。ORF编码约450 kDa的大的多蛋白，所述大的多蛋白由宿主或病毒蛋白酶翻译时和翻译后进行加工。标准BVDV多蛋白的N-末端产生非结构蛋白p20 (Npro)、衣壳蛋白p14 (C)；包膜糖蛋白gp48 (E0)、gp25 (E1)、gp53 (E2)；非结构蛋白p125 (NS23)、p10 (NS4A)、p32 (NS4B)、p58 (NS5A)和p75 (NS5B) (参见，例如，Tautz等人，1997；Xu等人，1997； Elbers等人，1996；和Wiskerchen 等人，1991，其各自特别地通过对其明确引用而整体并入本文)。BVDV-1存在两种生物型，细胞病变(指定为“cp”)或非细胞病变(“ncp”)，其不同在于细胞病变变体中单一80-kDa多肽(非结构蛋白p80，NS3)的产生(参见，例如，Gillespie等人，1960，其特别地通过对其明确引用而整体并入本文)。

基于一些BVDV分离株的系统发生分析，BVDV-1已经显示出包含至少13种不同的亚基因型(将BVDV-1a指定为BVDV-11)，而对于BVDV-2已经鉴定出两种亚基因型(BVDV-2a和BVDV-2b)(参见，例如，Pellerin等人，1994；Ridpath等人，1994，和Xue等人, 2010；其各自特别地通过对其明确引用而整体并入本文)。

BVDV-1和BVDV-2都在牛中引起急性感染(腹泻、发热、出血性综合症)，且如果感染发生在怀孕期间，则引起流产、胎儿畸形和小牛的持续性感染。持续感染动物代表病毒的主要储库，且这种动物可能染上致命的粘膜疾病(MD)。

BVDV与引起绵羊中的边界疾病和猪中的典型猪瘟(swine fever)的病毒紧密相关。感染的牛一般显示广泛性“粘膜疾病，”其特征在于升高的温度、腹泻、咳嗽和消化道粘膜溃疡(参见例如，Olafson等人1946；和Ramsey等人，1953, 其各自特别地通过对其明确引用而整体并入本文)。

BVD病毒能够穿过孕牛的胎盘，并且可以导致持续感染(PI)小牛的出生，其对该病毒免疫耐受并且在其余生持续病毒血症。这些PI牛，其高度易受引起肺炎或肠疾病的微生物的感染，提供了在牛中爆发MD疾病必要的病毒储库(参见例如，Liess等人，1974；Barber等人，1985；Malmquist, 1968；和Ross等人，1986，其各自特别地通过对其明确引用而整体并入本文)。

BVDV以粪口方式通过畜群传播，控制病毒的策略的范围为从更严格的管理措施以简单地减少经济损失，到详细的测试程序以鉴定受感染的动物(这尽管有效，但是通常需要不可接受水平的成本)。

在过去30年中，养牛业中已经销售的近150种BVDV疫苗(修饰的活病毒(MLV)和灭活减毒病毒或病毒颗粒)将取得不同程度的成功；尽管广泛利用和使用商业疫苗制剂，但是每年仍然报道了BVDV的爆发。目前的疾病管理方法涉及用疫苗每年重复接种牛，且通常采取额外步骤以尝试确保出生的小牛不是PI携带者。已经开发出数种不同试验方法来检测BVDV，和/或检测感染BVDV的动物，所述试验方法包括逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、酶联免疫测定法(ELISA)、标准病毒分离技术、和各种免疫组织化学测定法。

示例性定义

如本文所使用的，术语“约”和“接近”是可互换的，且通常应当被理解为指给定数附近的数字范围，以及所述数值范围中的所有数(例如，“约5至15”是指“约5至约15”，除非另有说明)。此外，本文中所有数值范围应当理解为包括范围内的每个完整整数。如本文所使用的，术语“抗原”或“免疫原”是指在宿主动物中诱导特异性免疫应答的物质。抗原可以包含整个生物体，杀死的、减毒的或活的；生物体的亚单位或部分；含有具有免疫原性特性的插入片段的重组载体；在呈递至宿主动物后能够诱导免疫应答的DNA块或片段；蛋白、多肽、肽、表位、半抗原、或其任何组合。可替代地，免疫原或抗原可以包含毒素或抗毒素。抗原一般涵盖任何免疫原性物质，即，当引入易感动物的组织中时引起免疫应答(例如，产生特异性抗体分子)且能够特异性结合响应于引入抗原而产生的抗体的任何物质。抗原能被免疫系统识别，诱导体液免疫应答，和/或诱导细胞免疫应答，引起B和/或T淋巴细胞的活化。抗原可以包括单一表位，或两个或更多个表位。

如本文所使用的，术语“抗体”是指分别经由重链和轻链可变结构域V_H和V_L与其他分子(抗原)结合的蛋白。术语“抗体”是指任何免疫球蛋白分子，包括，例如但不限于，IgM、IgG、IgA、IgE、IgD、和其任何子类或其组合。术语“抗体”也意味着免疫球蛋白分子的功能性片段，包括例如但不限于，Fab、Fab'、(Fab')₂、Fv、Fd、scFv 和sdFv片段，除非另有明确说明。

如本文所使用的，“抗原性多肽”或“免疫原性多肽”是下列多肽，当引入脊椎动物时，其与脊椎动物的免疫系统分子反应(即是抗原性的)，和/或在脊椎动物中诱导免疫应答(即，具有免疫原性)。除本发明的多核苷酸编码的那些以外，分离的本发明的抗原性和免疫原性多肽可以作为重组蛋白、纯化的亚单位、表达蛋白的病毒载体提供，或者可以以灭活病毒疫苗，例如，活减毒病毒疫苗、热灭活病毒疫苗等的形式提供。

如本文所使用的，“修饰的活疫苗”是下列疫苗，其包含已经改变，典型地通过在组织培养细胞中传代以减弱其引起疾病的能力而改变，但保留其当随后施用于动物时保护免于疾病或感染的能力的病毒。

如本文所使用的，“佐剂”意味着由一种或多种物质构成的组合物，所述一种或多种物质当存在于含有这种病毒的群体或多种这种抗原的疫苗组合物中时，增强修饰的活病毒或抗原的免疫原性和效力。

如本文所使用的，病毒的“感染性单位”被定义为TCID₅₀，或感染或杀死易感细胞的组织培养物的50％所需的量。如本文所使用的，术语“载体”意在包括对于施用于相关动物药学可接受的任何一种或多种溶剂、分散介质、一种或多种包衣、一种或多种稀释剂、一种或多种缓冲剂、一种或多种等渗剂、一种或多种溶液、一种或多种悬浮液、一种或多种胶体、一种或多种惰性物质等、或者其组合。通常用于化学化合物和特别是免疫原的一种或多种递送媒介物的使用是药学领域的普通技术人员众所周知的。除任何常规介质或试剂与活性成分不相容的范围以外，考虑其在诊断、预防和治疗组合物中的用途。也可以将一种或多种补充活性成分并入一种或多种公开的免疫原性组合物和其疫苗制剂中，或与一种或多种公开的免疫原性组合物和其疫苗制剂组合施用。

如本文所使用的，术语“免疫(immunize)”或“免疫(immunization)”或类似术语是指赋予达到针对特异性抗原性表位或免疫原的可检测的或优选大量的免疫应答的能力。这些术语并不一定推断出完全的免疫力，而是产生基本上高于基线的免疫应答，例如，在基线处，没有施用本发明的免疫原性组合物，或施用常规的疫苗。例如，如果在施用本文公开的疫苗组合物后发生针对一种或多种目标免疫原的细胞和/或体液免疫应答(且优选大量免疫应答)，那么考虑哺乳动物是针对一种或多种目标免疫原进行免疫的。

如本文所使用的，术语针对组合物或疫苗的“免疫应答”是指在宿主动物中发生细胞和/或抗体介导的免疫应答。通常，免疫应答包括(但不限于)一种或多种下列效果：(a)产生抗体；(b)产生B细胞；(c)产生辅助性T细胞；和/或(d)产生特异性针对给定抗原或半抗原的细胞毒性T细胞。

如本文所使用的，如本文所使用的术语“免疫原性”也是指在宿主动物中引发免疫应答的物质，诸如氨基酸序列、蛋白内的氨基酸序列部分、多肽、或肽、或修饰的或减毒的杀死的或活病毒。如本文所使用的，术语“免疫原性蛋白”、“免疫原性肽”或“免疫原性多肽”是指在下列意义上具有免疫原性活性的蛋白、肽和多肽：一旦施用于宿主，其能够激发针对蛋白的体液和/或细胞类型的免疫应答。术语表位是指能够诱导体液类型(B细胞) 和/或细胞类型(T细胞)的免疫反应的蛋白位点。

术语“病原体”在本文中定义为任何种类的感染性病原体，包括，例如，病毒、朊病毒、原生动物、寄生虫，以及微生物诸如细菌、酵母、霉菌、真菌等。

如本文所使用的，术语“个体”(也可互换地称为“宿主”、“受试者”、“受体”、“患者”等)是指任何下列动物，其可以接受一种或多种本文公开的药物组合物或疫苗制剂。优选地，受试者是脊椎动物，其意在表示任何动物物种(且优选地，哺乳动物物种)。在某些实施方案中，个体优选地是任何哺乳动物宿主，包括但不限于，非人灵长类、牛科动物、犬、山羊、cavines、乌鸦(corvines)、epines、马科动物、猫科动物、公羊、兔(lapines)、野兔(leporines)、狼、绵羊(ovines)、猪、Racines、狐狸(vulpines)等，包括家畜、动物样本、外来物种、以及伴侣动物、宠物、和在兽医从业者护理下的任何动物。

短语“兽医学可接受的”和“药学可接受的”是指当施用于哺乳动物时不产生过敏或类似不良反应的分子实体和组合物。如本文所使用的，“药学可接受的盐 ”指保留母体化合物的所需生物活性且不赋予任何不需要的毒理学效应的盐。此类盐的实例包括但不限于：与无机酸(例如盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、硝酸等)形成的酸加成盐；和与例如以下有机酸形成的盐：诸如，例如乙酸、草酸、酒石酸、琥珀酸、马来酸、富马酸、葡萄糖酸、柠檬酸、苹果酸、抗坏血酸、苯甲酸、丹宁酸、双羟萘(双羟萘)酸(pamoic (embonic) acid)、藻酸、萘甲酸、多聚谷氨酸、萘磺酸、萘二磺酸、多聚半乳糖醛酸；具有多价金属阳离子(诸如锌、钙、铋、钡、镁、铝、铜、钴、镍、镉等)的盐；与N,N'-二苄基乙二胺或乙二胺形成的有机阳离子形成的盐：及其组合。

如本文所使用的，“保护性免疫应答”或“治疗性免疫应答”是指针对抗原的CTL和/或HTL应答，其以一些方式防止或至少部分地阻止疾病或其症状、副作用或进展。免疫应答也可以包括已经由辅助性T细胞的刺激促进的抗体应答。

如本文所使用的，术语“疫苗”是指含有本发明的免疫原性组合物的组合物或制剂，其形式能够施用于脊椎动物，优选施用于动物诸如哺乳动物。通常，本发明的疫苗将包括一种或多种本文公开的免疫原性组合物(包括一种或多种修饰的活病毒颗粒或其多数)，其配制用于施用于需要其的动物。这种组合物可以是任何合适的制剂，包括但不限于，制备在水性媒介物中的那些，以及作为冷冻、冷冻干燥、冻干或脱水的形式且然后随后在施用前再水化或悬浮于常规的药学可接受的媒介物(例如，无菌盐水或类似的缓冲水溶液)中的那些。以这种形式，本发明的疫苗组合物可以以方便的单一或多剂量的等分试样进行制备，其可以容易地用于本文公开的一种或多种方法或接种方案中，以预防、管理或以其他方式治疗易感动物中病毒和/或微生物感染的一种或多种状况或一种或多种症状。

在引入动物宿主后，免疫原性组合物和包含其的疫苗能够激发免疫应答，且优选对引入的一种或多种抗原特异性的免疫应答，使得产生的免疫应答使用免疫学领域普通技术人员已知的常规测定法是容易检测的，所述测定法包括但不限于，检测接种的动物的细胞和组织内特异性抗体产生、细胞因子和/或细胞毒性T细胞活化、抗原呈递细胞、辅助性T细胞、树突状细胞和/或其他细胞应答的测定法。本发明的疫苗组合物可以包括单独的一种或多种佐剂或组合一种或多种其他抗原等，或在其中或与其伴随施用。

本发明的疫苗和免疫原性组合物在免疫后为动物赋予免疫应答。如本文所使用的，术语“免疫应答”是指体液免疫应答和/或细胞免疫应答，其导致B-和/或T-淋巴细胞的活化或增殖。然而，在一些情况下，免疫应答可能是强度较低的，且仅当使用本发明的至少一种物质时变得可检测，而其他可能需要重复施用佐剂、第二种或进一步的活性剂或其一种或多种组合。术语“佐剂”是指用于刺激活生物体的免疫系统的试剂，使得免疫系统的一种或多种功能增强且针对免疫原性试剂。

如本文所使用的，术语“治疗(treatment)”、“治疗(treat)”、“治疗(treated)”或“治疗(treating)”是指治疗或改善一种或多种疾病的症状，或降低疾病或其症状的程度或严重度，无论是在其发展折磨易感动物之前或之后。当关于例如感染性疾病使用时，该术语是指下列治疗或治疗方案，其降低感染的严重度，或减少或减轻或延迟由感染引起的疾病的一种或多种症状，以及增加感染的动物对抗感染的能力，包括例如，降低和/或消除来自治疗个体的机体的感染，或减轻或防止疾病变得更糟，或减轻或防止传播至与受影响的动物接触的其他动物。

术语“免疫原性有效量”具有其在本领域中通常的含义，即，能够诱导免疫应答的免疫原的量，所述免疫应答显著地占用(engages)与免疫原共享免疫学特征的病原体。该术语也涵盖治疗或预防有效量，或治疗和预防有效量。

如本文所使用的，术语“预防(prevention)”、“预防(prevent)”、“预防(prevented)”、“预防(preventing)”、“接种(vaccinating)”和“接种(vaccination)”是指预防或部分或完全抑制动物中的感染，或降低或延迟动物中一种或多种疾病或其一种或多种症状的发生，所述动物可能易感其，但尚未暴露于其或尚未被诊断患有其。当关于例如感染性疾病使用时，术语是指预防性施用一种或多种本发明的免疫原性组合物，其倾向于增加动物对一种或多种病毒或微生物病原体感染的抗性，或者，换言之，降低受试者将感染一种或多种病原体的可能性，或如果感染，在受感染的动物中将延迟症状、降低感染的严重度、或降低由于感染导致的疾病的症状、或其任何组合。

“预防”和“治疗”中的每一个包括管理动物中的特定感染、疾病、状况或其症状，以及候选状态或疾病或状况的进程或其任何症状的任何有益的改变。所述管理可以解决其症状中的一些或全部，实际影响或不影响潜在的感染或由其导致的任何疾病或状况。

如本文所使用的，术语“例如”仅仅通过实例但非意在限制的方式使用，且不应该被解释为仅指本说明书中明确列举的那些项目。

根据长期存在的专利法惯例，当在本申请包括权利要求中使用时，词语“一个(种)(a)”和“一个(种)(an)”表示“一个(种)或多个(种)”。

实施例

包括下面实施例以展示本发明的示例性实施方案。本领域普通技术人员应该理解，下面的实施例中公开的技术代表了在本发明的实践中发现效果较好的技术，且因此可以被认为构成了其优选的实施方式。然而，鉴于本公开内容，本领域普通技术人员应当理解，公开的特定实施方案中可以作出许多变化，且在不背离本发明的精神和范围的情况下仍然可以获得相像或类似的结果。

实施例1 - BVDV修饰的活病毒的产生

本实施例提供了用于大规模化产生BVDV-1b修饰的活病毒(MLV)的说明性方法。

材料与方法

病毒和微生物

从美国农业部(The United States Department of Agriculture，USDA)、动物和植物健康检验局(Animal and Plant Health Inspection Service，APHIS)、兽医生物制剂实验室中心(Center for Veterinary Biologics Laboratory，CVB-L) (Ames, IA, USA)获得BVDV-1b的TGAC毒株。随后主种子(MS)表示为“TVL-BVDV1b MS 04/27/2007 DW3-095”，且如与此一起提交的申请人的未决美国临时专利申请号61/427,404中所注明的，已经在一定条件下进行保藏，所述条件保证根据37 C.F.R. § 1.14和35 U.S.C. § 122授权的由专利商标局局长确定的人员在本专利申请未决期间将可以获得该培养物。在本申请的对应申请或其后续申请申请的国家中，如外国专利法所要求的，可以获得该保藏物。然而，应该理解的是，保藏物的可用性不构成对于在减损政府行为授予的专利权中实施本发明的许可。根据微生物保藏的布达佩斯条约的规定，本培养保藏物将进行储存且对于公众是可获得的，即，其将采取一切必要注意进行储存，使得在新近要求完成保藏物的样品后持续至少五年的期间，且在任何情况下，在保藏日后持续至少30(三十)年的期间或持续可能发布公开保藏的培养物的任何专利的可实施期间，使之保持活力且未受污染。保藏者承认，如果保藏中心由于保藏的条件导致的应请求时无法提供样品，保藏者具有替换保藏物的责任。在公开它的专利授权后，对于公众获得该培养保藏物的可获得性的所有限制将被不可撤回地撤销。根据布达佩斯条约的条款，TVL BVDV1b MS 04/27/2007 DW3-095病毒保藏物在2010年12月21日进入位于10801 University Blvd., Manassas, VA, 20110-2209, USA的美国典型培养物实验室的专利保藏中心的永久收集中心，由此保藏中心为其分配登录号ATCCPTA-11553。

使用逆转录–聚合酶链式反应(RT-PCR)测定来进行MS病毒(MSV)的身份鉴定以阳性地将MS病毒鉴定为BVDV-1b。Ridpath和Bolin, 1998(特别地通过对其明确引用而整体并入本文)开发了通过PCR区分BVDV的方案。使用免疫荧光测定(IF)进行阳性鉴定 (McNulty等人, 1984)。这些病毒在得克萨斯州兽医实验室牛肾(Texas Vet Lab Bovine Kidney，TVL-BK)细胞中的复制产生可容易辨认的细胞病变变化。

微生物鉴定频率

在用生产种子病毒接种TVL-BK细胞之前，将细胞进行显微镜可视化以证实细胞显示先前所述的形态。在收获每批生产病毒之前，观察TVL-BK细胞以证实它们表现出与病毒相关的典型的细胞病变反应(CPE)。

培养或亚培养的毒力、维持和范围

通过储存在冻干或冷冻条件下且限制传代或亚培养的数目而培育这种疫苗中使用的BVDV-1b的毒力、效价和抗原性的一致性。

范围：生产病毒= MSV+10 (效力连续传代)，但可以是在5和10之间的任何代。生产细胞储存物= MCS+20 (效力连续传代)，但也可以是低于20的任何代。

种子和生产培养中使用的培养基的组成与反应

种子和生产培养中使用的培养基的组成与反应如下：工作病毒接种物(MSV+1至MSV+8)和生产病毒接种物(其通常是，但不完全在MSV+9)在TVL-BK细胞中繁殖；条件是用于病毒繁殖的TVL-BK细胞的传代数不超过从MCS的20代。生长培养基(用于工作和生产细胞制备)是Dulbeccos氏改良Eagle培养基(DMEM)。

所得MSV可以在储存于液氮中的冷冻储存介质，或在储存于-70至-85℃的冷冻储存介质中冻干储存。MCS可以储存于冷冻储存介质(液氮中)，或储存于70至-85℃的冷冻储存介质中。

制备用于播种和接种的悬浮物的方法

将含有冷冻TVL-BK细胞的冻存管迅速解冻。用培养基将培养瓶填充至推荐容量，且将悬浮细胞从冻存管无菌转移到培养瓶。通过以1:3至1:6 (cm²:cm²)范围的比例分开活跃繁殖培养物而播种培养容器。通过无菌去除生长培养基且添加1X胰蛋白酶-EDTA溶液而在烧瓶或滚瓶中从培养表面释放意在用于亚培养的TVL-BK。孵育(5 min，在35至39℃)后，分散单层。通过将分散的细胞添加至具有生长培养基的培养容器中而使胰蛋白酶失活。如果种子是冻干的，将病毒的冷冻等分试样迅速解冻或再悬浮于培养基中。用病毒接种TVL-BK细胞(+20或更少)。在适当的孵育时间和/或观察到CPE后，收集意在用于亚培养的在烧瓶或滚瓶中正在复制的病毒。然后将病毒液储存在6至-80℃或立即用于接种其他培养容器。

标准细胞培养技术用于接种种子和生产培养基。接种第20或更低代的TVL-BK细胞。将通常在MSV+9的冷冻生产病毒接种物迅速解冻。病毒接种物的体积范围为1到25 mL/每1600 cm²培养面积，以实现范围为0.01至1.0个病毒/每个细胞的感染复数。最低接种滴度如下：对于BVDV-1b 为10^5.0TCID₅₀/mL。接种的培养物在37±2℃和5 ± 1% CO₂培养2至4天。

收获

在收获当天，检查培养物的病毒特异性CPE和无菌性。典型最低孵育时间为用BVDV-1b接种后2天。典型最长孵育时间为用BVDV-1b接种后4天。从生产容器无菌收获病毒悬浮液。收集样品，以确定收获物的TCID₅₀。收获的材料储存在6至-80℃。在制备最终产物之前，收获的材料可以储存在零上持续最长达一个月，且冷冻最长达六个月。

将表现出非典型CPE或污染的证据的收获液丢弃。唯一表现出典型的CPE和无污染的收获液有资格用于进一步生产使用。最低可接受的收获病毒滴度为10⁶ TCID₅₀/mL。收获液的纯度证实如下：将2-mL收获液的样品无菌添加至38 mL SCDB且连同阴性(仅培养基)和阳性对照在35至39℃培养46至50小时。培养物以及阴性对照中没有肉眼可见的生长确定了收获液是纯的且令人满意的，可用于进一步生产使用。丢弃发现不纯的收获液。

BVDV修饰的活病毒的示例性制剂

所有操作都使用无菌技术进行。在装配连续或亚连续疫苗过程中添加合适的抗生素，如分别以15 μg和15单位/剂量的比率添加新霉素和制霉菌素(制霉菌素)。收获液根据需要在DMEM中稀释以调节浓度，且通过添加0.2-µm过滤的蔗糖溶液进行稳定，获得20 ±1%的最终蔗糖浓度。

通过使用10-kDa分子量截留滤器的无菌超滤而任选地浓缩病毒收获液。浓缩度一般不超过50倍。

分析每批收获的病毒液以确定TCID₅₀。简而言之，使用收获材料的对数稀释物(10^-1至10^-8)以接种96孔板上的TVL-BK细胞。板在37±2℃和5 ± 1% CO₂孵育96±6小时。孵育后，板以100×放大倍数进行读取且检查CPE。通过Finney改良的Spearman-Karber方法(1978)确定滴度。无菌填充已经预先灭菌的最终容器。用无菌的内密封塞部分盖住最终容器。将最终产物小瓶转移到冷冻干燥机且干燥。干燥循环时间范围为24至72小时，最高产物温度为22℃。干燥的最终产物的水分含量通常不超过5％，且最终容器中每个剂量的抗原物质的最小量优选为约8 × 10³ TCID₅₀/每个剂量。

实施例2 - BVDV-1b单价疫苗小牛攻击研究

本实施例说明了BVDV-lb单价疫苗在预防接种动物中感染的效力。

材料与方法

动物

健康的4到5个月大的混种小母牛从商业来源购买，通过随机绘制的耳标签标识，且血清学筛选对BVDV的易感性。所有小牛在到达后接受一个剂量的头孢噻呋晶体游离酸(Excede®, Pfizer Animal Health, New York, NY, USA)。小牛可以自由食用水、干草和颗粒饲料配给。

疫苗

如上所述制备BVDV-1b疫苗，修饰的活病毒。简而言之，BVDV-1b主种子病毒在TVL-BK细胞系中繁殖(第20 次传代)，在第10代收获，根据生产概要进行稳定，填充到瓶中，且冷冻干燥。如通过Spearman–Karber方法(参见例如Finney, 1978)所测定的，BVDV浓度为8 ×10³ TCID₅₀/每剂量。无菌水用作稀释剂以再水化疫苗。

小牛的接种和攻击

十九(19)只BVDV阴性小牛混合在排序组(sorting ally)中。通过使用由CVB-Biometrics (Ames, IA, USA)提供的匹配组随机化方案(表1)，将每只小牛分进两组之一中(接种组或未接种对照组)。

表1. 对匹配的随机化表

组A = 接种组；组B = 未接种对照组。

用一个剂量的BVDV-1b疫苗接种10只血清阴性的小牛。每只接种者在第0天通过皮下注射在颈部左侧给予2 ml剂量的产物。剩余的小牛没有接受任何病毒疫苗。接种后，两组小牛保持在分开但等同的围栏中，直到攻击前两天。

在到达当天收集血液样品，且测试BVDV滴度。在接种当天和攻击当天也收集血液样品。通过恒定病毒渐降血清中和法测定BVDV-1b抗体滴度 (Schefers等人，2008)。攻击前两天，为了攻击前临床观察，接种组和未接种对照组进行混合。接种后十四(14)天，用从围栏死小牛的肺部获得的BVDV-1b强毒分离物攻击接种和对照小牛。已经将病毒在使用含10％马血清的DMEM的TVL-BK细胞上体外传代。将4 mL 中的8 × 10⁷ TCID₅₀的攻击剂量在吸气期间施用于每只小牛，每个鼻孔2 mL。

对于每只小牛每天记录直肠温度，攻击前持续两天，攻击当天和攻击后持续连续14天。

对于每只小牛测定白细胞(WBC)计数，攻击前持续两天，攻击当天和攻击后持续连续14天。在EDTA Vacutainer®管中收集样品，且使用Drew Scientific (Waterbury, CT,USA), Hemavet 950™差异WBC计数器进行计数。

为了分离BVDV，从每只小牛收集鼻拭子和血沉棕黄层，攻击前两天，攻击当天和攻击后持续连续14天。使用BBL培养拭子用Liquid Stuart Media (Becton, Dickinson andCompany, Sparks, MD, USA)收集鼻拭子。来自样品的培养基进行除菌过滤，且用于接种培养中的80％汇合的TVL-BK细胞。从EDTA真空管收集血沉棕黄层，且用于接种培养中的80％汇合的TVL-BK细胞。孵育1小时后，除去血沉棕黄层。培养物在5 ± 2% CO₂和37±3℃孵育4至5天。使用由本发明人开发的BVDV-1b-特异性引物组(BVDV-1b (第一))和合适的检测探针通过RT-PCR测定来自所有培养物样品的上清液中BVDV-1b的存在：

BVDV-1b (第一)：

正向引物：

反向引物：和

BVDV-1b检测探针：。

BVDV-1b (第二)：

第二正向引物：

第二反向引物：和

第二BVDV-1b检测探针：。

尽管BVDV-1b(第一)提供了可接受的结果，但是BVDV-1b(第二)显示了更好的结果。

所有临床观察都是独立做出，且观察者是盲目的，因为接种组和未接种对照组混合在一起，唯一区别特征是耳标签编号。在研究始终的任何时候，不会向观察者提供个体试验动物的接种状况的信息，直到临床评价得出结论。

统计分析

白细胞减少：通过将第-2至0天的白细胞计数取平均值而计算每只动物的攻击前白细胞平均值。对于攻击后第1至14天每天计算每天白细胞计数相对于攻击前平均值的比率(白细胞计数作为攻击前的比例)。分析该比例数据以确定个体动物是否发展出由计数距基线25％降低所定义的白细胞减少。如Tanner和Morgan (1993)所述计算可预防分数以确定在本研究中接种是否防止白细胞减少的发展。

鼻脱落：来自鼻拭子分析的病毒分离数据基于攻击后由其分离BVDV的接种者的比例相比于由其分离BVDV的对照比例。如Tanner和Morgan (1993)所述计算对于BVDV-1b脱落的可预防分数。

病毒血症：基于攻击后由其分离BVDV-1b的接种者的比例相比于由其分离BVDV-1b的对照比例分析来自血液样品的血沉棕黄层的病毒分离数据。如Tanner和Morgan (1993)所述计算可预防分数。

抗体滴度：用Mann-Whitney U检验分析序数尺度滴度(ordinally-scaledtiters)的组比较。

直肠温度：对于每只动物测定攻击前平均直肠温度。该平均值用作方差重复量度分析(ANOVA)中的协变量，所述分析包括组、天、组*天相互作用的项。

所有统计分析使用用于Microsoft Windows®的SAS学习版本v2.0(SASInstitute, Inc., Cary, NC, USA)进行。

结果

在10个接种者之一和九个对照之八中检测到白细胞减少，导致87%的可预防分数。原始白细胞数据记录于表2中。

表 2. 白细胞计数

接种者

表 2(续)

接种者

表 2(续)

对照

表 2(续)

对照

对于每只个别小牛的攻击前平均值的每天比例显示在表3中。

表 3. 白细胞计数 – 攻击前平均值的百分比

接种者

表 3(续)

接种者

表 3(续)

对照

表 3(续)

对照

从10个接种者之一和九个对照之八的鼻分泌物分离到BVDV-1b，导致90%的可预防分数。这些数据显示于表4中。

表4. 从鼻拭子分离BVDV-1b

接种者

表 4(续)

接种者

表 4(续)

对照

表 4(续)

对照

+ 表示阳性结果； - 表示阴性结果。

从两只接种小牛和所有9只对照小牛的血沉棕黄层分离到BVDV-1b，导致80%的可预防分数。这些数据显示于表5中。

表5. 从血沉棕黄层分离BVDV-1b

接种者

表 5(续)

接种者

表 5(续)

对照

表 5(续)

对照

接种诱导BVDV-1b SN抗体滴度的统计学显著性(P < 0.05)增加。疫苗没有引起BVDV-1a或BVDV-2 SN滴度的显著性增加。个体SN抗体滴度呈现于表6中。

表6. 血清中和抗体滴度

表 6(续)

直肠温度数据分析没有揭示接种的任何统计学显著性结果。直肠温度数据显示于表7中。

表 7. 直肠温度

接种者

表 7(续)

接种者

表 7(续)

对照

表 7(续)

对照

在该研究过程期间，在任何小牛中都没有观察到BVDV感染的任何临床体征。

用一个剂量的BVBV-1b疫苗(修饰的活病毒)接种四到五个月大的混种的健康小母牛产生针对白细胞减少的87％，针对BVDV-1b 的鼻脱落的90％和针对病毒血症的80%的疫苗效力的调整估计值。血清学分析还揭示在接种小牛中的抗原应答。

实施例3 – BVDV-1b病毒回复传代(Backpassage)评价

本实施例评价了TVL-BVDV-1b MSV的稳定性，以确信它当施用于动物时没有恢复毒力。

将1安瓿病毒解冻且用于接种TVL-BK细胞以产生TVL-BVDV-1b +1 (5 × 10⁷TCID₅₀/mL)。该病毒用于以1 × 10⁶ TCID₅₀/每只小牛的比率鼻内接种第一组10只缺少初乳的乳牛。用来自前面小牛组的合并的鼻分泌物鼻内接种第2至5组中的小牛。

第1组由10只小牛组成，根据从第1组10只小牛脱落病毒的小牛的数目，第2至5组中小牛的数目范围为2至5只小牛。每只小牛保持在分开的围栏中，且该研究的主要结果是小牛中缺乏BVDV的临床体征和至少五个连续体内传代始终缺乏MS的遗传稳定性。

如果如恒定病毒渐降血清中和法所测定的在筛选时实验单位具有>2的BVDV-1a、BVDV-1b或BVDV-2滴度，则其被排除在研究之外。

在筛选过程中、接种当天(第0天)和研究结束时，从小牛收集血液样品用于血清学测定。在接种后第2至8天在第1组中从各个体小牛收集鼻分泌物。测定这些天中每一天来自各个体小牛的鼻分泌物的等分试样用于病毒分离且冷冻储存。确定最大数目脱落BVDV-1b的个体小牛的日期(即，最大脱落日)，且合并从那天起的所有鼻分泌物样品且用于接种第2组中的小牛。在该预定最大脱落日从随后组的小牛收获鼻分泌物。然后测定这些样品的病毒分离且冷冻储存，直到已经证实病毒的存在，合并样品且用于接种下一组的小牛或没有分离到进一步的病毒。

通过耳标签编号识别小牛，且使用一般饲养和对于品种标准的护理实践置于代乳品六到八周。

结果变量包括在随后五次连续体内传代期间的BVDV的临床体征、从鼻样品病毒脱落和病毒的遗传稳定性。观察所有小牛的BVDV感染的临床体征，且在施用回收的病毒后持续21天观察最后回复传代组。记录所有临床体征且关于临床疾病的病因学作出确定。

从小牛收集鼻分泌物标本；保持每份样品的个别等分试样用于病毒分离和分析。通过除菌过滤通过0.2-µm滤器处理样品。然后用样品接种含有TVL-MDBK(~80％汇合)的12孔板中的每个孔。每块板一个孔保持未接种且充当阴性对照。板的一个孔接种MS的稀释物且充当阳性对照。将板在3-7% CO₂和35-39℃的温度孵育5至7天。将样品亚培养到第二块板持续额外5至7天。将来自表现出典型BVDV-1b细胞病变形态的孔的培养基进一步处理，以通过PCR测定确定感染病原体的身份。

通过比较从小牛回收的最高代BVDV和主种子而分析主种子的遗传稳定性。缺乏从研究第1组中所有10只小牛的脱落或分离到还没有回复毒力的病毒(如通过缺乏BVDV的明确临床体征所显示的)提示成功的回复传代研究和MS的遗传稳定性。

实施例4 - 六价BRDC疫苗的(修饰的活病毒)的制备

本实施例描述了并入上述BVDV-1b MS的多价(6重)BRDC疫苗的制备。

材料与方法

使用的微生物

BHV-1：BHV的Cooper (Colorado)分离株是1956年从具有上呼吸道疾病的牛科动物的肺部分离的(York等，1957)。该主种子病毒被鉴定为TVL-BHV (Cooper) PO，1997年8月5日，DW-1-21-W。

BVDV-1a：BVDV-1a的Singer毒株是从APHIS分离的。该主种子被鉴定为TVL-BVD(Singer) P0，1998年12月 DW4-29。

BVDV-1b：BVDV-1b的TGAC毒株是从APHIS分离的。该主种子被鉴定为TVL-BVDV 1bMS 04/27/2007 DW3-095。

BVDV-2：BVDV-2的125毒株是从APHIS分离的。该主种子被鉴定为TVL-BVDV 2毒株125 P0 11/01/01 DW3-90。

PI₃：PI₃的Reisinger SF4毒株是从APHIS分离的。该主种子被鉴定为TVL- PI₃(Reisinger SF-4P0，2001年4月2日(SM-83)。

BRSV：BRSV的N375毒株是从APHIS分离的。该主种子被鉴定为TVL-BRSV P0 2001年7月20日，DW3-87。

方案

通过储存在冻干或冷冻条件下且限制传代或亚培养的数目而培育这种疫苗中使用的BHV-1、BVDV-1a、BVDV-1b、BVDV-2、PI₃、和BRSV的毒力、效价和抗原性的一致性。

生产病毒= MSV+10 (效力连续传代)，但可以是在5和10之间的任何代。生产细胞储存物= MCS+20 (效力连续传代)，也可以是低于20的任何代。

工作病毒接种物(MSV+1至MSV+8)和生产病毒接种物(其通常是，但不完全在MSV+9)通常在TVL-BK细胞中繁殖；条件是用于病毒繁殖的TVL-BK细胞的传代数不超过从MCS的约20代。

用于工作和生产细胞制备的生长培养基是含有5-10%马血清的DMEM。如上所述制备且储存MSV。

还通过以1:3至1:6 (cm²:cm²)范围的比例分开活跃繁殖培养物而播种培养容器。如实施例1中所述，通过无菌去除生长培养基且添加1X胰蛋白酶-EDTA溶液而在烧瓶或滚瓶中从培养表面释放TVL-BK(意在用于亚培养)。在35至39℃孵育约5 min后，分散单层。通过将分散的细胞添加至具有生长培养基的培养容器中而使胰蛋白酶失活。如果种子是冻干的，将病毒的冷冻等分试样迅速解冻或悬浮于培养基中。用病毒接种TVL-BK细胞(+20或更少)。

在适当的孵育时间和/或已经观察到CPE后，收集意在用于亚培养的在烧瓶或滚瓶中正在复制的病毒。将病毒液储存在6℃至-80℃或立即用于接种其他培养容器。标准细胞培养技术用于接种种子和生产培养基。接种第20或更低代的TVL-BK细胞。将通常在MSV+9的冷冻生产病毒接种物迅速解冻。病毒接种物的体积范围通常为1到25 mL/每1600 cm²培养面积，以实现范围为0.01至1个病毒/每个细胞的感染复数。

最低接种滴度如下：对于BHV 为10^5.5TCID₅₀/mL，对于BVDV-1a 为10^5.0TCID₅₀/mL，对于BVDV-1b 为10^5.0TCID₅₀/mL，对于BVDV-2为10^5.0TCID₅₀/mL，对于PI₃病毒为10^6.0TCID₅₀/mL，且对于BRSV 为10^4.5TCID₅₀/mL。接种的培养物在37±2℃和5 ± 1% CO₂孵育。BHV和PI₃孵育2至4天，BVDV-1a、BVDV-1b、和BVDV-2孵育4至6天，且BRSV孵育5-8天。

收获

在收获当天，检查培养物的病毒特异性CPE和无菌性。最短孵育时间为用BHV或PI₃接种后2天，用BVDV-1a、BVDV-1b或BVDV-2接种后4天，和用BRSV接种后5天。最长孵育时间为用BHV或PI₃接种后4天，用BVDV-1a、BVDV-1b或BVDV-2接种后6天，和用BRSV接种后8天。

从生产容器无菌收获病毒悬浮液。收集样品，以确定收获物的TCID₅₀。收获的材料储存在6℃至-80℃的温度。在制备最终产物之前，收获的材料可以储存在零上持续最长达一个月，且冷冻最长达六个月。

所有操作都使用标准无菌技术进行。在装配连续或亚连续疫苗过程中分别以15 μg和15单位/剂量的比率添加新霉素和制霉菌素(Mycostatin®, Bristol-Myers Squibb,New York, NY, USA)。

收获液在DMEM中稀释，且通过添加0.2-µm过滤的蔗糖溶液进行稳定，获得10 ±1%的最终蔗糖浓度。

可以通过使用10-kDa分子量截留滤器的无菌超滤而浓缩病毒收获液。浓缩度一般不超过50倍。

分析多批收获的病毒液以确定TCID₅₀(例如，Spearman-Karber方法)。

实施例5 - 六价BRDC疫苗(修饰的活病毒)的效力研究

实施例5至10展示了六价BRDC修饰的活疫苗在预防由其中含有的每种病毒引起的疾病中的有效性。在本第一个实例中，显示疫苗在预防由BVDV-1b引起的疾病中是有效的。

材料

根据上述生产方法制备六价疫苗(修饰的活病毒)。简而言之，BHV-1 (Cooper毒株)、BVDV-1a (Singer毒株)、BVDV-1b (TGAC毒株)、BVDV-2 (125)、PI₃ (Reisinger SF-4)、和BRSV (N375)在TVL-BK细胞系(第20代)中繁殖。各个部分在第10代收获，且一起掺合为六重产物。

在每个效力系列旁边制备缺失安慰剂。例如，BVDV缺失安慰剂含有和对应的效力系列相同的BRSV、BHV、和PI₃收获批次。用培养基取代BVDV组分以维持效力系列和BVDV缺失安慰剂之间的等效体积。对于六价疫苗MLV中的每个组分，构建相似的缺失安慰剂。

实验方法

对于每个研究，获取约3-4个月大的商业储料/饲料小牛，随机化，且通过耳标签标识。将这些小牛驱虫且针对巴氏杆菌病、支原体病、和黑腿病接种疫苗。在接种组和对照组中的小牛保持在分开非相邻但等同的围栏中，直到攻击前两天(第–2天)，此时它们被混合在一个围栏中。所有小牛在第0天用目的病毒的强毒分离株进行攻击。例如，强毒BVDV-1b(从Poky Feeders [Scott City, KS, USA]的围栏死小牛的肺部获得)在使用具有10％马血清的DMEM的TVL-BK细胞上进行体外传代。将4 mL 中的约8 × 10⁷ TCID₅₀的攻击剂量在吸气期间施用于每只小牛，每个鼻孔2 mL。小牛可以自由食用水、沿海Bermuda干草和含有球虫抑制药但不含抗生素的混合饲料配给。

随机化

使用由CVB-Biometrics提供的随机化表格(参见表1)使用匹配的随机化方案来将小牛分配为两个治疗组(接种或安慰剂接种对照)。以2：1比例将三只小牛进入斜槽(chute)的顺序随机化为两个治疗组。在初始采血用于血清学评价的时候从桶随机得到的耳标签标识小牛。攻击前，两组小牛保持在分开但等同的围栏中。攻击前两天(第-2天)，小牛混合在一个围栏中。

盲目化

盲目人员不知道对照或接种者的身份。除记录管理员之外，所有现场和实验室人员都对研究是盲目的。

结果

选择的主要结果是攻击后白细胞减少。白细胞减少被定义为从基线WBC计数减少25％。进一步支持疫苗效力的其他结果包括鼻脱落、病毒血症、发热、抗体产生和病毒感染的临床体征。

估计值

将个体白细胞(WBC)计数转化成攻击前平均值的百分比，且在连续的时间间隔尺度进行测量。这些转化的WBC计数百分比每天进行测定，持续攻击后至少14天，且充当用于评价的主要标准。白细胞减少的检测充当用于确定对攻击耐受(不受影响)或敏感(受影响)的主要标准。比较受影响组和不受影响组，以确定在病毒攻击暴露后接种是否防止白细胞减少。呼吸疾病的临床体征和来自鼻/血沉棕黄层样品的病毒的检测充当用于确定对于攻击敏感的第二标准。分析白细胞减少的持续时间和脱落的持续时间(从个体小牛检测到病毒的天数)，以确定接种对这些参数是否具有减轻效果。使用攻击前平均温度(基线)作为协变量分析所有个体的每天直肠温度。如果实验单位在研究开始时具有>2的病毒滴度，那么将其排除出研究。

采样构架和方法

在用效力系列或相应的缺失安慰剂临接种前(第-28至-21天)从小牛收集血液样品。还在临攻击前(第0天)和攻击后14天(第14天)再次收集血液样品。在第-2天到至少第14天收集用于差异WBC计数和病毒分离的血液样品。在EDTA Vacutainer® (Becton-Dickinson and Co., Franklin Lakes, NJ, USA)管中采集样品，且使用DrewScientific, Hemavet 950差异WBC计数器进行计数。在第-2天到至少第14天收集鼻拭子用于病毒分离。

观察和数据收集

在第2天到至少第14天收集鼻样品和血液样品，且观察小牛的病毒感染的临床体征。在第-2天到第14天测定每只小牛的直肠温度。

分析WBC计数数据以确定攻击后计数的降低。通过将第-2天至第0天的WBC计数取平均值而计算每只动物的攻击前平均值。对于攻击后第1-14天或由观察者酌情更长时间每天计算每天WBC计数相对于攻击前平均值的比率(WBC计数作为攻击前的比例)。如果比例降低25％，那么该个体被分类为白细胞减少。通过在液体Stuart培养基中以BBL CultureSwab^®擦拭两个鼻孔在攻击当天和持续攻击后连续14天而从每只小牛采集鼻拭子。在收集当天，通过除菌过滤通过0.2-µm滤器处理样品。然后用样品接种含有TVL-MDBK(~80％汇合)的12孔板中的每个孔。每块板一个孔保持未接种且充当阴性对照。板的一个孔接种攻击病毒的稀释物且充当阳性对照。将板在3-7% CO₂和35-39℃的温度孵育2至4天。收获来自每个孔的培养基且储存在-18℃至-22℃。通过RT-PCR(Ridpath和Bolin 1998)测定来自所有孔的培养基，以确定特定病毒是否存在于培养物中。对于病毒阳性培养的个体被分类为“脱落”。

来自血液样品的血沉棕黄层用于接种含有TVL-MDBK(~80%汇合)的12孔板中的每个孔。每块板一个孔保持未接种且充当阴性对照。板的一个孔接种攻击病毒的稀释物且充当阳性对照。将板在3-7% CO₂和35-39℃的温度孵育2至4天。收获来自每个孔的培养基且储存在-18至-22℃。通过RT-PCR(Ridpath和Bolin 1998)测定来自所有孔的培养基，以确定病毒是否存在于培养物中。对于特定病毒阳性培养的个体被分类为“病毒血症的”。

在研究的第--2天和第14天之间(攻击前2天，攻击当天，和攻击后14天)记录每只动物的每天直肠温度。通过将第-2天至第0天的温度值取平均值而计算每只动物的攻击前平均值。使用基线作为协变量分析每天温度。

BVDV-1b 抗体滴度：在BVDV-1b效力的情况下，在初始接种当天(第-21天)、攻击当天(第0天)和研究结束时对于每只动物通过恒定病毒渐降血清法确定针对BVDV-1b的血清中和抗体滴度。使用特定概要A-17(Special Outline A-17)的改良方案，牛病毒性腹泻病毒1型中和抗体的滴定法确定抗体滴度。改良的测定法使用细胞病变的BVDV-1b分离株而非BVDV-1a分离株作为指示病毒。发展抗体滴度>8的动物被视为血清转化为BVDV-1b。

估计接种组和对照组之间白细胞减少、脱落和病毒血症的持续时间的差异(缓解分数)。使用攻击前平均温度(基线)作为协变量分析直肠温度。选择的置信区间为95％。

白细胞减少：白细胞减少数据的分析基于白细胞减少的接种者的比例相比于病毒攻击后白细胞减少的安慰剂接种的对照的比例。通过如Tanner和Morgan (1993)所述确定可预防分数而评价这一点。

脱落和病毒血症：脱落和病毒血症数据的分析基于脱落病毒或病毒血症的接种者的比例相比于病毒攻击后脱落或病毒血症的安慰剂接种的对照的比例。通过如Tanner和Morgan (1993)所述确定可预防分数而评价这些。

估计两组之间白细胞减少的持续时间的中值差异，且根据Fergen (2004)计算缓解分数。估计两组之间脱落持续时间的中值差异和病毒血症持续时间的中值差异，且根据Fergen (2004)计算缓解分数。

临床观察：使用方差重复量度分析(ANOVA)进行第1-14天的直肠温度分析，所述分析包括组、天、组*天相互作用的项，其使用基线作为协变量。当组*天相互作用显著(p <0.5)时，通过组的每个时间点的简单效果将接种组与对照进行比较。这些简单效果比较从组*天相互作用获得。

统计分析：用Mann-Whitney U检验分析抗体滴度的组比较。如上所述，所有统计分析使用用于MS-Windows®的SAS学习版本v2.0进行。

实施例5 a - 六价BRDC疫苗的效力研究

本研究的结果表明，修饰的活牛病毒性腹泻病毒1b型(BVDV1b)、牛鼻气管炎-病毒性腹泻- 副流感₃-呼吸道合胞病毒疫苗，修饰的活病毒，作为预防由BVDV1b引起的疾病的辅助具有抗原性和有效性。将一个剂量的疫苗施用于二十一只BVDV血清阴性小牛。用一个剂量的产物匹配安慰剂疫苗接种十只血清阴性对照小牛。所有小牛用BVDV1b进行鼻内攻击。接种导致BVDV1b抗体滴度增加，且防止或减少BVDV1b诱导的病毒血症、鼻脱落、发热、疾病和白细胞减少的临床体征。因此，对于该疫苗的BVDV1b部分已经建立了2 X 10³/每剂量的最低BVDV1b-TCID₅₀。该疫苗含有BHV-1、PI3、BRSV、BVDV 1型的两种亚基因型(1a和1b)和BVDV 2型。

接种、攻击和样品收集：三十(31)只BVDV阴性小牛混合在排序组中。通过使用匹配组随机化方案，每只小牛当它们随机成群时进行门分开(gate cut)，每次三只小牛，通过小径(alley)进入两组之一(组A – 接种者或组B – 安慰剂接种的对照)。二十一只小牛用一个剂量的牛鼻气管炎-病毒性腹泻- 副流感₃ -呼吸道合胞疫苗，修饰的活病毒进行接种。每个接种者第0天通过皮下注射在颈部左侧给予2 ml剂量的产物。用产物匹配安慰剂疫苗(BVDV缺失)接种十只小牛。攻击前两天，为了攻击前临床观察和获得基线体温和WBC读数，接种和对照组进行混合。用从围栏死小牛的肺部获得的BVDV 1b的强毒分离株接种后21天，攻击接种和对照小牛。已经将病毒在使用含10％马血清的Dubelco氏改良Eagle培养基的TVL-BK细胞上体外传代。将4 mL 中的4X10⁷ TCID₅₀的攻击剂量在吸气期间施用于每只小牛，每个鼻孔2 ml。

在接种之前、攻击当天(接种后21天)和攻击后14天收集血液样品用于确定抗体滴度。通过恒定病毒渐降血清中和法测定牛病毒性腹泻病毒抗体滴度。

通过在液体Stuart培养基中以BBL Culture Swab^®擦拭两个鼻孔在攻击当天和持续攻击后连续14天而从小牛收集鼻拭子用于病毒分离。

在攻击当天和持续攻击后连续14天通过静脉穿刺进EDTA真空管而从每只小牛收集血液样品用于血沉棕黄层病毒分离。

对于每只小牛每天记录直肠温度，攻击前持续连续两天，攻击当天和攻击后持续连续14天。

临床观察每只小牛并记录。观察者是盲目的，因为接种组和对照组混合在一起，唯一区别特征是耳标签编号。在研究始终的任何时候，不会向观察者提供个体试验动物的接种状况的信息。实验室人员不知道小牛接种状态。收集血液样品用于确定差异WBC计数，攻击前持续连续两天，攻击当天和攻击后持续连续14天。在EDTA真空管中收集样品，且使用Drew Scientific, Hemavet 950差异WBC计数器进行计数。

BVDV检测：细胞培养物-增强的PCR技术用于检测收集样品中的BVDV1b。简而言之，通过除菌过滤(0.2µm)处理鼻样品到培养中的TVL-BK细胞上。血沉棕黄层直接置于培养中的TVL-BK细胞上，持续45 – 75分钟，然后从细胞洗掉。培养物在37℃ ± 2℃和5 ± 1%CO₂培养4天。使用常规RT qPCR方法和下面的探针/引物组个别测定来自所有培养物样品的上清液中BVDV1b的存在/不存在：

正向引物：

反向引物：

TaqMan MGB探针：。

基于Differentiation of types 1a, 1b and 2 bovine viral diarrhea virus (BVDV) by PCR, Julia F. Ridpath和Steven R. Bolin, Molecular and Cellularprobes, Journal of Virological Methods, 130 (2005) 145-148)开发本方法。本方法还基于the Center for Veterinary Biologics and National Veterinary ServicesLaboratories Test Protocol – Genotyping Bovine Viral Diarrhea Virus, NumberBPPR02010.01。区分BVDV的基因型和亚基因型的这些方法都利用存在于基因组的5'非翻译区(UTR)的基因差异。专门设计该探针/引物组以扩增5’ UTR的区段，其中可以通过高度特异性探针检测独特的BVDV1b序列。内部验证探针/引物组的特异性，其不与BHV、PI3、BRSV、BVDV1a、或BVDV2交叉反应。在Applied Biosystems 7500上使用基于Taqman^®的测定进行RTqPCR测定。

统计分析：抗体滴度：用Mann-Whitney U检验分析序数尺度滴度(ordinallyscaled titers)的组比较。

病毒血症：基于攻击后由其分离BVDV1b的接种者的比例相比于由其分离BVDV1b的对照比例分析来自血液样品的血沉棕黄层的病毒分离数据。如Tanner和Morgan (1993)所述计算对于BVDV1b病毒血症的可预防分数。

鼻脱落：来自鼻拭子分析的病毒分离数据基于攻击后由其分离BVDV1b的接种者的比例相比于由其分离BVDV1b的对照比例。如Tanner和Morgan (1993)所述计算对于BVDV1b脱落的可预防分数。

疾病的临床体征：由每位观察者独立地每天记录疾病的临床体征。表现出至少一天攻击后观察结果的体征的任何小牛被认为是“影响受”的。如Tanner和Morgan (1993)所述计算对于临床体征的可预防分数。

白细胞减少：通过将第-2至0天的白细胞计数取平均值而计算每只动物的攻击前白细胞平均值。对于攻击后第1-14天每天计算每天白细胞计数相对于攻击前平均值的比率(白细胞计数作为攻击前的比例)。分析该比例数据以确定个体动物是否发展出由计数距基线40％降低所定义的白细胞减少。如Tanner和Morgan (1993)所述计算可预防分数以确定在本研究中接种是否防止白细胞减少的发展。

使用用于Windows 的SPSS版本16进行所有统计分析。

结果

血清中和抗体滴度：本研究中的所有小牛具有<1:2的接种前BVDV (BVDV1a、BVDV1b和BVDV2)血清中和抗体滴度。到攻击当天(第21天)，接种组具有1:83的平均BVDV1b滴度，其显著(p<.05)大于对照组< 1:2的平均BVDV1b滴度。在对照和接种小牛中，BVDV1b抗体滴度在攻击后14天增加，表明小牛已经用BVDV1b攻击。

从血沉棕黄层分离BVDV1b：在本研究的攻击阶段后过程中，本研究中的所有10只对照小牛具有病毒血症。然而，7只对照小牛在通常观察到BVDV攻击后病毒血症的关键时间构架过程中具有病毒血症。三只对照小牛(1、14、30)在攻击当天具有病毒血症。相同的这三只小牛连同小牛26在攻击后第二天具有病毒血症。该观察结果连同血清、鼻拭子分离和直肠温度数据表明，这些小牛在研究的接种阶段晚期自然感染，变得具有病毒血症，且在本研究的攻击阶段的早期开始脱落。在典型的攻击后病毒血症/脱落期间过程中，这四只小牛之一(小牛30)变得具有病毒血症且脱落病毒。在攻击后期间过程中，21只接种者无一具有病毒血症。使用3/10自然保护的对照和21/21保护的接种者的比例计算预防分数。这导致1.0的可预防分数。

从鼻拭子分离BVDV1b：在本研究的攻击阶段后过程中，本研究中的所有10只对照小牛脱落BVDV1b。然而，7只对照小牛在通常观察到BVDV攻击后脱落的关键时间构架过程中脱落。两只对照小牛(26和30)在攻击当天脱落。三只对照小牛(1、14、30)在攻击后第二天脱落。该观察结果连同血清学、血沉棕黄层分离和直肠温度数据表明，这些小牛在研究的接种阶段晚期自然感染，变得具有病毒血症，且在本研究的攻击阶段的早期开始脱落。在典型的攻击后病毒血症/脱落期过程中，这四只小牛之一(小牛30)变得具有病毒血症且脱落病毒。在攻击后期间间过程中，21只接种者仅有一只脱落BVDV1b。使用3/10自然保护的对照和20/21保护的接种者的比例计算预防分数。这导致0.93的可预防分数。

直肠温度：数据分析表明显著的组*天相互作用(p=.034)。天的分析表明，在攻击后第1、4、7和8天，对照组中的温度显著(p<0.05)高于接种组中的温度。在第12天，对照组的直肠温度已经下降，且显著(p<0.05)低于接种组的直肠温度。

BVDV1b的临床体征：对照组中十分之八只(8/10受影响)小牛表现出可以归因于BVDV1b感染的临床体征。临床体征包括腹泻、大量清鼻涕、呼吸急促和眼分泌物。在研究的攻击后阶段过程中，接种组中无一(0/21受影响)小牛表现出任何这些临床体征。使用2/10自然保护的对照和21/21保护的接种者的比例计算预防分数。这导致1.0的可预防分数。在任何这些小牛中没有观察到不利的接种后反应。

白细胞减少：在21只接种者之四和十只对照之五中检测到白细胞减少，导致62%的可预防分数。

结论

前述结果表明，牛鼻气管炎-病毒性腹泻- 副流感₃-呼吸道合胞病毒疫苗(修饰的活病毒)的BVDV1b部分，作为预防由BVDV1b引起的疾病的辅助具有抗原性和效力。

这种组合产物的BVDV1b部分的抗原性和效力由下列所证明：

1) 与对照组相比，接种组中针对BVDV1b的抗体滴度的显著增加。在施用一个2ml剂量之后，接种组中的所有小牛发展出BVDV1b滴度> 1:8，符合9CFR 113.311 (c) (5)中定义的要求。

2) 病毒分离研究揭示，施用一个剂量导致攻击后BVDV1b诱导的病毒血症和鼻脱落的显著减少。

3) 当对照小牛比较时，接种的小牛表现出明显更少的发热，且没有显示出任何疾病的临床体征。

4) 接种还降低了发展BVDV1b诱导的白细胞减少的概率。

本研究较少受下列事实影响：对照组中的至少三只小牛在攻击前不久被BVDV1b感染。由于所有对照小牛(包括被感染的那些)在攻击时仍然是血清阴性这一事实，可以得出结论，天然暴露发生在研究的接种阶段的后期。在接种组中没有任何天然暴露的临床证据，这可能是由于与对照组保持分开，直到攻击前2天。当在典型的商业储料/饲料小牛环境中进行攻击研究时，天然暴露是固有的可能性。根据Tanner和Morgan，由可预防分数确定的疫苗效力的估计值考虑了对于天然免疫的几个水平的观察到的保护和疫苗有效性之间的关系。

该研究发现是统计学显著性和临床相关的，因此，表明了疫苗中含有的BVDV1b部分的效力。

实施例6 - BRSV效力方案

本实施例表明，六价MLV疫苗中的牛呼吸道合胞病毒(BRSV)部分有助于预防由BRSV引起的疾病。

材料与方法

制备BRSV缺失安慰剂，且以与实施例5中对于BVDV-1b所述的类似的方式与效力系列一起使用。该BRSV缺失安慰剂含有与效力系列相同的BVDV-1a、BVDV-1b、BVDV-2、BHV 和PI₃收获批次，用培养基取代BRSV组分以维持效力系列和BRSV缺失安慰剂之间的等效体积。无菌稀释剂用于使如本文所述的六价MLV疫苗和BRSV缺失安慰剂再水化。

实验方法

使用来自具有约相同来源、类型、重量和年龄的相对同质群体的约3-4个月的商业储料/饲料小牛。将小牛去虫且针对巴氏杆菌病、支原体病、和黑腿病接种疫苗。在方案中使用相等数目的接种和对照小牛；两组小牛在攻击前保持在分开非相邻但等同的围栏中，且在攻击前两天(第–2天)混合在一个围栏中。小牛可以自由食用水、沿海Bermuda干草和含有球虫抑制药但不含抗生素的混合饲料配给。

随机化

使用CVB-Biometrics随机化表格使用匹配的随机化方案来将小牛分配为两个治疗组(接种或安慰剂接种对照)，其中以2：1比例将三只小牛进入斜槽的顺序随机化为两个治疗组。在初始采血用于血清学评价的时候从桶随机得到的耳标签标识小牛。

盲目化

所有人员都对研究是盲目的(除记录管理员之外)，且不知道对照或接种者的身份。

结果

主要结果是预防攻击后BRSV病毒的鼻脱落，这是通过方案期间从所有小牛鼻孔每天收集的鼻样品中BRSV的存在或不存在来确定的。其他第二结果可以包括BRSV感染的一个或多个下降的临床体征、发热减少、和/或脱落BRSV的小牛中脱落的持续时间的降低。

攻击后持续14天每天确定接种组和对照组脱落BRSV，BRSV的检测充当用于确定对攻击耐受(不受影响)或敏感(受影响)的主要标准。比较受影响组和不受影响组，以确定在BRSV攻击暴露后接种是否防止BRSV的脱落。呼吸疾病的临床体征充当用于确定对攻击敏感或耐受的第二标准。分析脱落的持续时间(从个体小牛检测到BRSV的天数)，以确定接种对该参数是否具有减轻效果。针对攻击前平均温度(基线)协变量分析所有个体的每天直肠温度。如果实验单位在研究开始时具有>2的BRSV SN滴度，那么将其排除。

采样构架和方法

在用效力系列或BRSV缺失安慰剂临接种前(第-28天至第-21天)、临攻击前再次(第0天)和攻击后14天(第14天)再次从小牛收集血液样品。

观察和数据收集

通过在液体Stuart培养基中以BBL Culture Swab^®擦拭两个鼻孔在攻击当天和持续攻击后连续14天而从每只小牛收集鼻拭子。使用专门用于检测BRSV的探针/引物组通过实时PCR测定来自样品的培养基中BRSV的存在。

正向引物：

反向引物：和

BRSV TaqMan® MGB探针：。

分析持续时间数据以表明接种对于在鼻样品中检测到BRSV的持续时间具有减轻效果。

临床观察：在第-2天和第14天之间(攻击前2天，攻击当天，和攻击后14天)记录每只动物的每天直肠温度，通过将第-2天至第0天的温度值取平均值而计算每只动物的攻击前平均值。然后使用基线作为协变量分析每天温度。

在接种当天、研究的第0天和第14天对于每只动物通过恒定病毒渐降血清法确定血清中和抗体滴度(Schefers等人，2008)。

Baker (1986)以前已经描述了牛肉小牛中BRSV的临床体征。临床体征包括但不限于，鼻和泪分泌、呼吸速率增加、直肠温度升高、轻度抑郁、摄食量下降、唾液分泌过多和呼吸困难。BRSV感染的临床体征在传统攻击模型中不太明显，因为用于攻击的病毒已经通过体外繁殖进行减毒，且评价这些模型的唯一重要参数是病毒脱落(Wren，2001)。因此，攻击前两天、攻击当天和攻击后持续14天记录临床体征。BRSV的临床体征的观察在数据分析过程中进行考虑，但不被视为主要结果，因为这些体征可以提示在商品牛中常见的许多呼吸疾病。

估计被分类为受影响或不受影响的接种和安慰剂接种对照的比例(预防部分)，如同接种组和对照组之间脱落持续时间的差异(减轻分数)。

可以通过如Tanner和Morgan (1993)所述确定可预防分数而容易地评价六价MLV疫苗的BRSV病毒部分的效力。该分析基于对BRSV攻击耐受的接种者的比例相比于耐受的安慰剂接种的对照的比例。

统计分析：可以估计两组之间脱落的持续时间的中值差异，且根据Fergen (2004)的方法计算减轻分数。可以用Mann-Whitney U检验分析抗体滴度的组比较。如上所述，所有统计分析使用用于Microsoft Windows®的SAS学习版本2.0进行。

实施例6A - BRSV效力研究

本研究的结果表明，牛鼻气管炎-病毒性腹泻- 副流感₃-呼吸道合胞病毒疫苗(修饰的活病毒)的修饰的活牛呼吸道合胞病毒(BRSV)部分，作为预防储料/饲料小牛中由牛呼吸道合胞病毒的脱落的辅助具有抗原性和有效性。将一个剂量的疫苗施用于二十二只BRSV血清阴性小牛。用一个剂量的产物匹配安慰剂疫苗接种十一只血清阴性对照小牛。所有小牛用BRSV进行鼻内攻击。接种导致攻击后BRSV抗体滴度增加且防止BRSV脱落。因此，对于该疫苗的BRSV部分已经建立了7X10²/每剂量的最低BRSV-TCID₅₀。

材料与方法

小牛的接种和攻击：三十三(33)只BRSV阴性小牛混合在排序组中。通过使用CVB-Biometrics提供的匹配组随机化方案，每只小牛当它们随机成群时进行门分开(gatecut)，每次三只小牛，通过小径(alley)进入两组之一(组A – 接种者或组B – 安慰剂接种的对照)。

二十二只血清阴性小牛用一个剂量的牛鼻气管炎-病毒性腹泻- 副流感₃ -呼吸道合胞疫苗(修饰的活病毒疫苗)进行接种。每个接种者第0天通过皮下注射在颈部左侧给予2 ml剂量的产物。用产物匹配安慰剂疫苗(BRSV缺失)接种十一只小牛。收集鼻拭子，小牛采血，且血清学筛选以便通过恒定病毒渐降血清中和测定验证对BRSV的易感性。攻击前两天，为了攻击前临床观察，接种和对照组进行混合。接种后32天，用4 ml (2ml/每鼻孔)TVL-BRSV，N375分离株攻击接种和对照小牛。在临攻击前(10^6.6/ ml的TCID₅₀)和攻击后立即再次(10^6.2/ ml的TCID₅₀)滴定攻击病毒。攻击病毒在攻击过程始终保持较冷。

在接种当天、攻击当天和攻击后14天收集血液样品。通过恒定病毒渐降血清中和法测定牛呼吸道合胞病毒抗体滴度。

在接种当天、攻击当天和攻击后持续连续14天收集鼻拭子。

进行临床观察。观察者是盲目的，因为接种组和对照组混合在一起，唯一区别特征是耳标签编号。在研究始终的任何时候，不会向观察者提供个体试验动物的接种状况的信息。实验室人员不知道小牛接种状态。

BRSV检测：通过在液体Stuart培养基中以BBL Culture Swab^®擦拭两个鼻孔而从小牛收集鼻拭子。BRSV特异性CPE的目视观察结果连同细胞培养物-增强的PCR技术用于检测收集样品中的BRSV。简而言之，通过除菌过滤(0.2µm)处理样品到培养中的TVL-BK细胞上。培养物在37℃ ± 2℃和5 ± 1% CO₂培养5天。观察培养物的BRSV特异性CPE且记录结果。使用M. Boxus等人所述的探针/引物组个别测定来自所有培养物样品(+和– CPE)的上清液中BRSV的存在/不存在。(Real Time RT-PCR for the detection and quantitationof bovine respiratory syncytial virus, M. Boxus, C. Letellier, P. Kerkhofs,Journal of Virological Methods, 125 (2005) 125-130)。内部验证探针/引物组的特异性，其不与BHV、PI3、BVDV1a、BVDV1b 或BVDV2交叉反应。在Applied Biosystems 7500上使用基于Taqman^®的测定进行RT qPCR测定。

BRSV特异性CPE阳性的所有样品也是PCR阳性的。有10份样品对于BRSV特异性CPE是阴性的且通过PCR测定是BRSV阳性的。这与内部研究是一致的，表明基于PCR的测定比基于BRSV特异性CPE的观察的测定更敏感。将初始培养后对于BRSV阴性的样品亚培养，且根据相同的方法测定来自亚培养液的上清液中BRSV的存在/不存在。

统计分析：该疫苗的BRSV部分的效力主要基于脱落BRSV的接种者的比例相比于攻击后脱落BRSV的对照的比例。如Tanner和Morgan (1993)所述计算可预防分数。评价研究中从个体小牛分离出BRSV的攻击后天数。比较组以确定BRSV攻击后与对照组相比接种组的BRSV分离(脱落)的频率是否显著降低。

用Mann-Whitney U检验比较序数尺度滴度(ordinally scaled titers)数据的组比较。使用攻击前温度平均值作为协变量分析直肠温度。使用方差重复量度分析(ANOVA)进行第1-14天的攻击后温度的分析。使用用于Windows 的SAS进行所有统计分析。

结果

血清中和抗体滴度：本研究中的所有小牛具有<1:2的接种前血清中和抗体滴度。与对照组中的那些相比，接种组中的接种后血清中和抗体滴度显著(p<.05)更高。22只接种小牛中的二十一只显示出接种后BRSV滴度的增加，而所有11只安慰剂接种的对照在攻击前接种期间始终保持阴性。接种组的平均抗体滴度为8.5，而对照组的平均滴度为<2。

BRSV分离：在本研究的攻击后阶段过程中，本研究中的所有11只对照小牛脱落BRSV。在该时间过程中，22只接种者仅有3只脱落BRSV。这导致0.8636的可预防分数。脱落的频率还存在显著性差异(p<0.05)。对照组脱落BRSV持续的平均值为6.00天，而脱落的接种者为仅0.227天。这是5.773天的差异。

直肠温度：使用攻击前平均温度作为协变量的攻击后直肠温度分析揭示了组间没有统计学显著性差异。没有进行该数据的进一步分析。

BRSV的临床体征：攻击前持续连续两天、攻击当天和攻击后持续连续14天检查每只动物的呼吸疾病的临床体征。没有观察到可以明确地归因于BRSV感染的临床体征。然而，在小牛活跃脱落BRSV的相同时间期间过程中，对于11只对照中的7只，将过度的清鼻涕记录作为临床体征。在研究过程中，对于接种组没有记录到临床体征。在任何这些小牛中没有观察到不利的接种后反应。

结论

前述报道表明，牛鼻气管炎-病毒性腹泻- 副流感₃-呼吸道合胞病毒疫苗(修饰的活病毒)的BRSV部分，作为预防储料/饲料小牛中BRSV的脱落的辅助的效力。

这种组合产物的BRSV部分的效力和抗原性由下列所证明：

1) 病毒(BRSV)分离研究揭示，与对照中100% (11/11)易感性相比，施用一个剂量疫苗提供了接种小牛中86% (19/22)的保护(可预防分数= 0.8636)。

2) 与对照组相比，接种组间脱落频率的显著降低。对照小牛脱落BRSV比接种组长5.773天。

3) 与对照组相比，接种组的针对BRSV的抗体滴度的显著增加。

实施例7 - IBR (HBV-1)效力方案

本实施例表明，六价MLV疫苗中的BHV-1病毒部分有助于预防IBR。

材料与方法

如上所述制备六价修饰的活病毒疫苗。简而言之，BHV-1 (Cooper毒株)、BVDV-1a(Singer毒株)、BVDV-1b (TGAC毒株)、BVDV-2 (125)、PI₃ (Reisinger SF-4)、和BRSV(N375)在TVL-BK细胞系(第20代)中繁殖。各个部分在第10代收获，且一起掺合为六重产物。

在效力系列旁边制备BHV-1-缺失安慰剂。BHV-1缺失安慰剂含有和效力系列相同的BVDV-1a、BVDV-1b、BVDV-2、PI₃和BRSV收获批次。用培养基取代BHV-1组分以维持效力系列和BHV-1缺失安慰剂之间的等效体积。无菌稀释剂用于使疫苗和BHV-1缺失安慰剂再水化。

如上所述将约3-4个月大的商业储料/饲料小牛随机化，然后驱虫且针对巴氏杆菌病、支原体病、和黑腿病接种疫苗。所有小牛可以自由食用水、沿海Bermuda干草和含有球虫抑制药但不含抗生素的混合饲料配给。在小牛饲喂后，可以随后限制干草可用性。

约二十只或更多只接种小牛和十只或更多只对照小牛用于该单一水平研究中。攻击前，两组小牛保持在分开但等同的围栏中。然后，在攻击前两天(第-2天)，小牛混合在一个围栏中。

随机化

可以使用小牛的匹配的随机化方案来将小牛分配为两个治疗组(接种或安慰剂接种对照)。例如，以2：1的比例将三只小牛进入斜槽的顺序随机化为两个治疗组。在初始采血用于血清学评价的时候从桶随机得到的耳标签用于标识小牛。

盲目化

盲目人员不知道对照或接种者的身份，且所有现场和实验室人员(除记录管理员之外)都对研究的持续时间是盲目的。

结果

本研究的主要结果是与IBR相关的鼻病变的差异。这被定义为鼻病变的存在或不存在。IBR的其他临床体征包括鼻病变的持续时间和严重度，从鼻孔分离BHV-1，体温，都被认为是第二结果。

将鼻病变得分自身估计为有序类别(ordinal categories)。IBR特征性的可见鼻粘膜中的病变的持续时间和严重度都充当用于评价的标准。呼吸疾病的临床体征和鼻脱落也可以用作用于确定对攻击耐受(不受影响)或敏感(受影响)的标准。通常使用攻击前平均温度(基线)作为协变量分析个体的每天直肠温度。

如果实验单位在研究开始时具有>2的BHV-1 SN滴度，那么将其排除出研究。

在用效力系列或BHV-1缺失安慰剂临接种前(第-28天至第-21天)从小牛收集血液样品。还在临攻击前(第0天)和攻击后14天(第14天)再次收集血液样品。

采样构架、数据收集、和临床观察

在第0天到第14天收集鼻样品，且观察小牛的可见鼻粘膜中的病变和IBR的临床体征。在第-2天到第14天测定每只小牛的直肠温度。

结果变量包括与IBR一致的可见鼻粘膜的病变、直肠温度、病毒分离、抗体滴度和IBR的临床体征。

Rosner (1968)已经描述了IBR的总体鼻病变。观察到的典型病变包括鼻孔的炎症和水肿以及粘液内衬固有的出血和纤维坏死渗出物。据Rosner报道，坏死渗出物有时在鼻腔中是如此广泛，以至于它形成了从基层组织脱离的假膜渗出物。Rosner还报道，这些病理发现给出了在作出IBR的假定性诊断中高度的置信度。可以根据确立的标准和分析的持续时间数据分配鼻病变得分以表明接种对于观察到病变的持续时间是否具有减轻作用。

直肠温度评价、病毒分离、抗体滴度和统计方法如前面实施例中所述。Rosner(1968)已经描述了IBR的临床体征，且包括但不限于，呼吸急促、厌食、发热、咳嗽、流鼻涕、体重下降和状况。攻击前两天、攻击当天和攻击后持续14天记录临床体征。IBR的临床体征的观察在数据分析过程中进行考虑，但不被视为主要结果，因为这些体征也可以提示在商品牛中常见的许多其他呼吸疾病。

统计分析：用Mann-Whitney U检验分析抗体滴度的组比较。如上所述，所有统计分析使用用于MS-Windows®的SAS学习版本v2.0进行。

实施例7a - IBR (HBV-1)效力研究

本研究的结果表明，牛鼻气管炎-病毒性腹泻- 副流感₃-呼吸道合胞病毒疫苗(修饰的活病毒)中修饰的活牛疱疹病毒-1(BHV-1)部分作为降低感染性牛鼻气管炎(IBR)的辅助具有抗原性和有效性。将两个剂量的疫苗施用于二十二只BHV-1血清阴性小牛。用两个剂量的产物匹配安慰剂疫苗接种十二只血清阴性对照小牛。所有小牛用BHV-1进行鼻内攻击。接种导致BHV-1抗体滴度增加和与IBR相关的鼻病变的持续时间和严重度的降低。接种还降低了小牛中通常在BHV攻击后的脱落和发热反应的持续时间。因此，对于该疫苗的BHV-1部分已经建立了5 X 10³/每剂量的最低BHV-1 TCID₅₀。

材料与方法

小牛的接种和攻击：三十四只BHV-1阴性小牛混合在排序组中。通过使用CVB-Biometrics提供的匹配组随机化方案，每只小牛当它们随机成群时进行门分开(gatecut)，每次三只小牛，通过小径(alley)进入两组之一(组A – 接种者或组B – 安慰剂接种的对照)。

二十二只小牛用一个剂量的牛鼻气管炎-病毒性腹泻- 副流感₃ -呼吸道合胞疫苗(修饰的活病毒)进行接种。每个接种者第0天通过皮下注射在颈部左侧给予2 ml剂量的产物。用产物匹配安慰剂疫苗(BHV-1缺失)接种十二只小牛。收集鼻拭子用于BHV-1病毒分离，从所有小牛收集血液用于血清学验证对BHV-1的易感性。在第13天，接种和对照小牛在颈部右侧皮下接受第二个2 ml剂量的效力系列和产物匹配的安慰剂。攻击前两天，为了攻击前临床观察和获得基线体温读数，接种和对照组进行混合。用4 ml (2ml/每鼻孔)USDA-APHIS-CVB提供的BHV-1攻击病毒(Coopers毒株，批号05-08，存档日- 2005年10月26日)第二次接种后15天，攻击接种和对照小牛。攻击病毒滴度通过CVB 测定为10^8.2 TCID₅₀/2mL。在临攻击前滴定攻击病毒且测定为10^8.0 TCID₅₀ / 4 mL，和攻击后立即再次滴定攻击病毒且测定为10^7.4 TCID₅₀ / 4 mL。攻击病毒在攻击过程始终保持较冷。

在接种当天、攻击当天和攻击后14天收集血液样品。通过恒定病毒渐降血清中和法测定牛疱疹病毒抗体滴度。

在接种当天、攻击当天和攻击后持续连续14天收集鼻拭子。

进行临床观察且分配鼻病变得分。S.F. Rosner在JAVMA 第153卷，第12期，1968年12月，第1631-1638页已经描述了由BHV引起的总体鼻病变。观察到的典型病变包括鼻孔的炎症和水肿以及粘液内衬固有的出血和纤维坏死渗出物。据Rosner报道，坏死渗出物有时在鼻腔中是如此广泛，以至于它形成了从基层组织脱离的假膜渗出物。Rosner还报道，这些病理发现给出了在作出IBR的假定性诊断中高度的置信度。

根据下列标准分配鼻病变得分：

0.没有IBR病毒病的明确病变。

1.IBR病的特征性病变的存在不超过可见鼻黏膜的10％。

2.IBR病的特征性病变的存在影响可见鼻黏膜的11-25%。

3.IBR病的特征性病变的存在影响可见鼻黏膜的26-50%。

4.IBR病的特征性病变的存在影响可见鼻黏膜的超过50%。

观察者是盲目的，因为接种组和对照组混合在一起，唯一区别特征是耳标签编号。在研究始终的任何时候，不会向观察者提供个体试验动物的接种状况的信息。实验室人员不知道小牛接种状态。

BHV-1检测：通过在液体Stuart培养基中以BBL Culture Swab^®擦拭两个鼻孔而从小牛收集鼻拭子。BHV-1特异性CPE的目视观察结果连同细胞培养物-增强的PCR技术用于检测收集样品中的BHV-1。简而言之，通过除菌过滤(0.2µm)处理样品到培养中的TVL-BK细胞上。培养物在37℃ ± 2℃和5 ± 1% CO₂培养4天。观察培养物的BHV-1特异性CPE且记录结果。使用常规RT qPCR方法和下面的探针/引物组个别测定来自所有培养物样品(+和– CPE)的上清液中BHV-1的存在/不存在：

正向引物：

反向引物：

TaqMan MGB探针：

内部验证探针/引物组的特异性，其不与PI3、BRSV、BVDV1a、BVDV1b 或BVDV2交叉反应。在Applied Biosystems 7500上使用基于Taqman^®的测定进行RT qPCR测定。BHV-1特异性CPE阳性的所有样品也是PCR阳性的。有8份样品对于BHV-1特异性CPE是阴性的且通过PCR测定是BHV阳性的。这与内部研究是一致的，表明基于PCR的测定比基于BHV-1特异性CPE的观察的测定稍微更敏感。将初始培养后BHV-1阴性的样品亚培养，且观察CPE。根据相同的方法，测定来自亚培养液的上清液中BHV-1的存在/不存在。

鼻病变：本研究的主要结果是与BHV-1相关的鼻病变的差异。基于在个体小牛中病变的存在或不存在，如Tanner和Morgan (1993)所述计算预防分数。根据B.J. Fergen,Estimating an Intervention Effect on Outcome Severity, USDA, CVB确定在受影响的小牛中病变的严重度的估计的条件性减轻分数。对于每只受影响的小牛确定病变的持续时间(从观察到病变的第一天到最后一天的天数)且估计两组之间的病变持续时间的差异。

体温：本研究的第二结果是接种组和对照组小牛之间体温的差异。使用方差重复量度分析(ANOVA)进行第1-14天的直肠温度分析，所述分析包括组、天、组*天相互作用的项，其使用基线温度作为协变量。由于组*天相互作用是显著的(p< 0.5)，通过组的每个时间点的简单效果将接种组与对照进行比较。这些简单效果比较从组*天相互作用获得。

病毒脱落：本研究的另一个第二结果是接种和对照小牛之间攻击后BHV脱落的差异。基于来自个体小牛的鼻样品中BHV的分离和鉴定，如Tanner和Morgan (1993)所述计算预防分数。对于每只受影响的小牛确定脱落的持续时间(从检测到BHV-1的第一天到最后一天的天数)且估计两组之间的脱落的持续时间的差异。

使用用于Windows 的SPSS版本17进行所有统计分析。

结果

血清中和抗体滴度：本研究中的所有小牛具有<1:2的接种前BHV-1血清中和抗体滴度。对照组中所有12只小牛在攻击当天仍然是血清阴性的(<1:2的抗体滴度)。接种组中22只小牛中的二十一只到攻击当天血清转化为> 1:2的滴度(组中值滴度为1:4)。到攻击后14天，所有小牛已经血清转化为BHV-1(中值接种滴度>256，中值对照滴度128)。

鼻病变：在所有12只对照小牛(100％)和22只接种小牛中的20只(91％)观察到鼻病变。对于观察到鼻病变的估计预防分数为9％。对于受影响小牛的严重度的估计减轻分数为90％(95% CI：72%，100%)。受影响的对照间的病变比受影响的接种者间更严重。观察到鼻病变的中值持续时间对于接种者为6天，且对于对照为10.5天。两组之间持续时间的估计转变为4.5天。

直肠温度：使用攻击前平均温度作为协变量的攻击后直肠温度分析揭示了统计学显著性的(p<0.05)组和组*天效应(group by day effect)。分析揭示，在攻击后第3到第9天和第11天，与接种组相比，对照组的温度距基线显著(p<0.05)增加。

BHV-1分离：在本研究的攻击后阶段过程中，所有对照和接种小牛脱落BHV-1。从接种组分离到BHV-1的中值持续时间为6天，且对于对照为10.5天。脱落的持续时间的估计转变为4.5天。通过PCR验证表现出BHV特异性CPE的所有样品。然而，有8份样品没有观察到CPE，但它们具有弱阳性的PCR信号。没有包括这8份样品作为该分析中的阳性。

BHV-1的临床体征：攻击前持续连续两天、攻击当天和攻击后持续连续14天检查每只动物的呼吸疾病的临床体征。观察且记录可以归因于BHV-1感染的临床体征。在任何这些小牛中没有观察到不利的接种后反应。

结论

前述报道表明，牛鼻气管炎-病毒性腹泻- 副流感₃-呼吸道合胞病毒疫苗(修饰的活病毒)中的BHV-1部分作为降低储料/饲料小牛中BHV-1引起的疾病的辅助的效力。这种组合产物的BHV-1部分的效力和抗原性由下列所证明：

1) 与对照组相比，接种组中鼻病变的严重度和持续时间的降低。

2) 与对照组相比，接种组中发热的降低。

3) 与对照组相比，接种组的血清转化为BHV-1。

实施例8 – PI₃效力方案

本实施例表明，六价MLV疫苗中的PI₃部分有助于预防由PI₃引起的疾病。

材料与方法

如上所述制备六价修饰的活病毒疫苗。在效力系列旁边制备PI₃-缺失安慰剂。PI₃缺失安慰剂含有和效力系列相同的BHV-1、BVDV-1b、BVDV-2、BVDV-1a、和BRSV收获批次。用培养基取代PI₃组分以维持效力系列和PI₃缺失安慰剂之间的等效体积。无菌稀释剂用于使疫苗和PI₃缺失安慰剂再水化。

随机化

使用小牛的匹配的随机化方案来将小牛分配为两个治疗组(接种或安慰剂接种对照)。例如，以2：1的比例将三只小牛进入斜槽的顺序随机化为两个治疗组。在初始采血用于血清学评价的时候从桶随机得到的耳标签用于标识小牛。

盲目化

盲目人员不知道对照或接种者的身份。除记录管理员之外，所有现场和实验室人员都对研究的持续时间是盲目的。

结果

本研究的主要结果是预防攻击后PI₃病毒的鼻脱落。这是通过研究期间过程中从所有小牛鼻孔每天收集的鼻样品中PI₃的存在或不存在来确定的。其他预期的第二结果包括脱落PI₃的小牛中PI₃感染的临床体征降低、发热减少、和/或脱落的持续时间降低。如果实验单位在研究开始时具有>2的PI₃滴度，那么将其排除出研究。

采样构架、数据收集、和临床观察

在用效力系列或PI₃缺失安慰剂临接种前(第-28天至第-21天)从小牛收集血液样品。还在临攻击前(第0天)和攻击后14天(第14天)再次收集血液样品。在第-2天到至少第14天收集用于差异WBC计数的血液样品。在EDTA Vacutainer®管中收集所有样品，且使用Drew Scientific, Hemavet 950差异WBC计数器进行计数。在第-2天到至少第14天收集鼻拭子用于病毒分离。

攻击后持续14天，每天测定接种和对照组的PI₃脱落。PI₃的检测充当用于确定对攻击耐受(不受影响)或敏感(受影响)的主要标准。比较受影响组和不受影响组，以确定在PI₃攻击暴露后接种是否防止PI₃的脱落。呼吸疾病的临床体征充当用于确定对攻击敏感或耐受的第二标准。分析脱落的持续时间(从个体小牛检测到PI₃的天数)，以确定接种对该参数是否具有减轻效果。使用攻击前平均温度(基线)作为协变量分析所有个体的每天直肠温度。

PI ₃ 检测：通过在液体Stuart培养基中以BBL Culture Swab^®擦拭两个鼻孔在攻击当天和持续攻击后连续14天而从每只小牛收集鼻拭子。使用本文所述的PI₃-特异性探针/引物组通过实时PCR测定来自样品的培养基中PI₃的存在。

脱落的持续时间：脱落的持续时间被定义为在个体小牛的鼻拭子中检测到PI₃的天数。分析收集的持续时间数据以确定接种对于在鼻样品中检测到PI₃的持续时间是否具有减轻效果。

直肠温度：在第-2天和第14天之间(攻击前2天，攻击当天，和攻击后14天)记录每只动物的每天直肠温度。通过将第-2天至第0天的温度值取平均值而计算每只动物的攻击前平均值。使用基线作为协变量分析每天温度。

抗体滴度：在接种当天、研究的第0天和第14天对于每只动物通过恒定病毒渐降血清法确定血清中和抗体滴度。

临床体征：Bryson等人(1989)已经描述了PI₃的临床体征。临床体征包括但不限于迟钝、呼吸急促、发热、咳嗽、不定和/或粗糙肺音。攻击前两天、攻击当天和攻击后持续14天记录临床体征。PI₃的临床体征的观察在数据分析过程中进行考虑，但不被视为主要结果，因为这些体征可以提示在商品牛中常见的许多呼吸疾病这一事实。

实施例8a - PI₃效力研究

本研究的结果表明，牛鼻气管炎-病毒性腹泻- 副流感₃-呼吸道合胞病毒疫苗(修饰的活病毒)的修饰的牛副流感₃病毒(PI3)部分，作为预防储料/饲料小牛中牛副流感₃病毒的脱落的辅助具有抗原性和有效性。将两个剂量的疫苗施用于二十只PI3血清阴性小牛。用两个剂量的产物匹配安慰剂疫苗接种十只血清阴性对照小牛。所有小牛用PI3进行鼻内攻击。接种导致攻击后PI3抗体滴度增加且防止PI3脱落。因此，对于该疫苗的PI3部分已经建立了6 X 104/每剂量的最低PI3-TCID₅₀。

材料与方法

小牛的接种和攻击：三十(30)只PI3阴性小牛混合在排序组中。通过使用CVB-Biometrics提供的匹配组随机化方案，每只小牛当它们随机成群时进行门分开(gatecut)，每次三只小牛，通过小径(alley)进入两组之一(组A – 接种者或组B – 安慰剂接种的对照)。

二十只小牛用一个剂量的牛鼻气管炎-病毒性腹泻- 副流感₃ -呼吸道合胞疫苗(修饰的活病毒)进行接种。每个接种者第0天通过皮下注射在颈部左侧给予2 ml剂量的产物。用产物匹配安慰剂疫苗(PI3缺失)接种十只小牛。收集鼻拭子用于PI3病毒分离，从所有小牛采集血液用于血清学验证对PI3的易感性。在第25天，接种和对照小牛在颈部右侧皮下接受第二个2 ml剂量的效力系列和产物匹配的安慰剂。攻击前两天，为了攻击前临床观察和获得基线体温读数，接种和对照组进行混合。用4 ml (2ml/每鼻孔)USDA-APHIS-CVB提供的PI3攻击病毒(Reisinger毒株，批号05-07，存档日- 2005年7月26日)第二次接种后15天，攻击接种和对照小牛。攻击病毒滴度通过CVB 测定为10^8.2 TCID₅₀/2mL。在临攻击前滴定攻击病毒且测定为10^8.3 TCID₅₀ / 4 mL，且攻击后立即再次滴定攻击病毒且测定为10^8.2TCID₅₀ / 4 mL。攻击病毒在攻击过程始终保持较冷。

在接种当天、接种后6天、攻击当天、攻击后6天和攻击后14天收集血液样品。通过恒定病毒渐降血清中和法测定牛副流感₃病毒抗体滴度。

在接种当天、攻击当天和攻击后持续连续10天收集鼻拭子。

PI3检测：通过在液体Stuart培养基中以BBL Culture Swab^®擦拭两个鼻孔而从小牛收集鼻拭子。PI3特异性CPE的目视观察结果连同细胞培养物-增强的PCR技术用于检测收集样品中的PI3。简而言之，通过除菌过滤(0.2µm)处理样品到培养中的TVL-BK细胞上。培养物在37℃ ± 2℃和5 ± 1% CO₂培养4天。观察培养物的PI3特异性CPE且记录结果。使用常规RT qPCR方法和下面的探针/引物组个别测定来自所有培养物样品(+和– CPE)的上清液中PI3的存在/不存在：

正向引物：

反向引物：

TaqMan MGB探针：

该方法的开发基于A. Hu等人的工作 (Development of a real-time RT-PCRassay for detection and quantitation of parainfluenza virus 3. A. Hu, M.Colella, P. Zhao, F. Li, J.S. Tam, R. Rappaport, S.M. Cheng. Journal ofVirological Methods, 130 (2005) 145-148)。内部验证探针/引物组的特异性，其不与BHV、BRSV、BVDV1a、BVDV1b 或BVDV2交叉反应。在Applied Biosystems 7500上使用基于Taqman^®的测定进行RT qPCR测定。

PI3特异性CPE阳性的所有样品也是PCR阳性的。有17份样品对于PI3特异性CPE是阴性的且通过PCR测定是PI3阳性的。这与内部研究是一致的，表明基于PCR的测定比基于PI3特异性CPE的观察的测定更敏感。将初始培养后PI3阴性的样品亚培养，且观察CPE。根据相同的方法，测定来自亚培养液的上清液中PI3的存在/不存在。

统计分析：该疫苗的PI3部分的效力主要基于脱落PI3的接种者的比例相比于攻击后脱落PI3的对照的比例。如Tanner和Morgan (1993)所述计算可预防分数。用Mann-Whitney U检验比较序数尺度滴度(ordinally scaled titers)数据的组比较。使用攻击前温度平均值作为协变量分析直肠温度。使用方差重复量度分析(ANOVA)进行第1-14天的攻击后温度的分析。使用用于Windows 的SAS进行所有统计分析。

结果

血清中和抗体滴度：本研究中的所有小牛具有<1:2的接种前PI3血清中和抗体滴度。接种的小牛无一表现出针对疫苗的记忆性免疫应答。到攻击当天，接种组具有1:16的平均PI3滴度，其显著(p<.05)大于对照组1:3的平均PI3滴度。对照组中的一只小牛，小牛7，在研究期间过程中发展出1:16的滴度。该小牛在攻击后6天也显示出针对攻击的记忆性应答，且具有1:128的滴度。其他9只对照小牛在攻击当天仍然是血清阴性的，且没有表现出针对攻击的记忆性应答。

PI3分离：在本研究的攻击后阶段过程中，本研究中的所有10只对照小牛脱落PI3。在该时间过程中，20只接种者仅有4只脱落PI3。这导致0.80的可预防分数。通过PCR验证表现出PI3特异性CPE的所有样品。然而，有17份样品没有观察到CPE，但它们具有弱阳性的PCR信号。还没有包括这17份样品作为该分析中的PI3阳性。

PI3的临床体征：攻击前持续连续两天、攻击当天和攻击后持续连续14天检查每只动物的呼吸疾病的临床体征。没有观察到可以明确地归因于PI3感染的临床体征。在任何这些小牛中没有观察到不利的接种后反应。

结论

前述报道表明，牛鼻气管炎-病毒性腹泻- 副流感₃-呼吸道合胞病毒疫苗(修饰的活病毒)的PI3部分作为预防储料/饲料小牛中PI3的脱落的辅助的效力。

这种组合产物的PI3部分的效力和抗原性由下列所证明：

1) 病毒(PI3)分离研究揭示，与对照中100% (10/10)易感性相比，施用两个剂量疫苗提供了接种小牛中80% (16/20)的保护(可预防分数= 0.80)。

2) 与对照组相比，接种组的针对PI3的抗体滴度的显著增加。

实施例9 – BVDV-2效力方案

本实施例表明，六价MLV疫苗中的BVDV 2型部分有助于预防由BVDV-2引起的疾病。

材料与方法

如上所述制备六价修饰的活病毒疫苗。在效力系列旁边制备BVDV-2缺失安慰剂。BVDV-2缺失安慰剂含有和效力系列相同的BHV-1、BVDV-1b、BVDV-1a、PI₃和BRSV收获批次。用培养基取代BVDV-2组分以维持效力系列和BVDV-2缺失安慰剂之间的等效体积。无菌稀释剂用于使疫苗和BVDV-2缺失安慰剂再水化。

随机化、盲目化和结果

随机化、盲目化和结果如实施例10中所述。

采样构架、数据收集、和临床观察

在用效力系列或BVDV-2缺失安慰剂临接种前(第-28天至第-21天)从小牛收集血液样品。还在临攻击前(第0天)和攻击后14天(第14天)再次收集血液样品。在第-2天到至少第14天收集用于差异WBC计数的血液样品。在EDTA Vacutainer®管中收集所有样品，且使用Drew Scientific, Hemavet 950差异WBC计数器进行计数。在第-2天到至少第14天收集鼻拭子用于病毒分离。

结果变量包括白细胞减少、发热、鼻病毒脱落、病毒血症、中和抗体产生和临床体征。主要结果是在BVDV-2攻击后与对照组相比预防接种组中的BVDV-2引起的白细胞减少。

白细胞减少：分析WBC计数数据以确定攻击后计数是否降低。通过将第-2至0天的WBC计数取平均值而计算每只动物的攻击前平均值。对于攻击后第1-14天或由观察者酌情更长时间每天计算每天WBC计数相对于攻击前平均值的比率(WBC计数作为攻击前的比例)。如果比例降低25％，那么该个体被分类为白细胞减少。

脱落：通过在液体Stuart培养基中以BBL Culture Swab^®擦拭两个鼻孔在攻击当天和持续攻击后连续14天而从每只小牛收集鼻拭子。在收集当天，通过除菌过滤通过0.2-µm滤器处理样品。然后用样品接种含有TVL-MDBK(~80％汇合)的12孔板中的每个孔。每块板一个孔保持未接种且充当阴性对照。板的一个孔接种攻击病毒的稀释物且充当阳性对照。将板在3-7% CO₂和35-39℃的温度孵育2至4天。收获来自每个孔的培养基且储存在-18至-22℃。将来自表现出典型BVDV-1a细胞病变形态的孔的培养基进一步处理，以测定确定感染病原体的身份。阳性培养的个体被分类为“脱落”。

病毒血症：来自血液样品的血沉棕黄层用于接种含有TVL-MDBK(~80%汇合)的12孔板中的每个孔。每块板一个孔保持未接种且充当阴性对照。板的一个孔接种攻击病毒的稀释物且充当阳性对照。将板在3-7% CO₂和35-39℃的温度孵育2至4天。收获来自每个孔的培养基且储存在-18至-22℃。将来自表现出典型BVDV-2细胞病变形态的孔的培养基进一步处理，以测定确定感染病原体的身份。对于BVDV-2阳性培养的个体被分类为“病毒血症的”。

抗体滴度：在初始接种当天(第-21天)、攻击当天(第0天)和研究结束时对于每只动物通过恒定病毒渐降血清法确定针对BVDV-2的血清中和抗体滴度。根据特定概要A-17(Special Outline A-17)，牛病毒性腹泻病毒2型中和抗体的滴定法确定抗体滴度。发展抗体滴度>8的动物被视为血清转化为BVDV-2。

临床体征：BVDV-2的临床体征包括但不限于发热、白细胞减少、呼吸困难、流鼻涕和稀便。攻击前两天、攻击当天和攻击后持续14天记录BVDV感染的所有相关临床体征。BVDV-2的临床体征的观察在数据分析过程中进行考虑，但不被视为主要结果，因为这些体征可以提示在这种类型的牛中通常遇见的其他疾病。

实施例9a – BVDV-2效力研究

本研究的结果表明，牛鼻气管炎-病毒性腹泻- 副流感₃-呼吸道合胞病毒疫苗(修饰的活病毒)的修饰的活牛病毒性腹泻病毒2型(BVDV2)部分作为预防由BVDV2引起的疾病的辅助具有抗原性和有效性。将一个剂量施用于二十只BVDV血清阴性小牛。用一个剂量的产物匹配安慰剂疫苗接种十只血清阴性对照小牛。所有小牛用BVDV2 (毒株1373)进行鼻内攻击。接种导致BVDV2抗体滴度增加(平均从<2至24)和攻击后死亡率降低(7/10对照死亡，0/20接种者死亡)。因此，对于该疫苗的BVDV2部分已经建立了3 X 10³TCID₅₀/每剂量的最低BVDV2-TCID₅₀。

实施例10 – BVDV-1a效力方案

本实施例表明，六价MLV疫苗中的BVDV 1a型部分有助于预防由BVDV-1a引起的疾病。

材料与方法

如上所述制备六价修饰的活病毒疫苗。

在效力系列旁边制备BVDV-1a-缺失安慰剂。BVDV-1a缺失安慰剂含有和效力系列相同的BHV-1、BVDV-1b、BVDV-2、PI₃和BRSV收获批次。用培养基取代BVDV-1a组分以维持效力系列和BVDV-1a缺失安慰剂之间的等效体积。无菌稀释剂用于使疫苗和BVDV-1a缺失安慰剂再水化。

随机化

盲目化

盲目人员不知道对照或接种者的身份；所有现场和实验室人员(除记录管理员之外)都对研究的持续时间是盲目的。

结果

主要结果是攻击后白细胞减少。白细胞减少被定义为从基线WBC计数减少25％。可以进一步支持疫苗效力的其他结果包括鼻脱落、病毒血症、发热、抗体产生和BVDV的临床体征。

如果实验单位在研究开始时具有>2的BVDV-1滴度，那么将其排除出研究。

采样构架、数据收集、和临床观察

在用效力系列或BVDV缺失安慰剂临接种前(第-28天至第-21天)从小牛收集血液样品。还在临攻击前(第0天)和攻击后14天(第14天)再次收集血液样品。在第-2天到至少第14天收集用于差异WBC计数的血液样品。在EDTA Vacutainer®管中收集所有样品，且使用Drew Scientific, Hemavet 950差异WBC计数器进行计数。在第-2天到至少第14天采集鼻拭子用于病毒分离。

结果变量包括白细胞减少、发热、鼻病毒脱落、病毒血症、中和抗体产生和临床体征。主要结果是在BVDV-1a攻击后与对照组相比预防接种组中的BVDV引起的白细胞减少。

白细胞减少、脱落和病毒血症：如实施例9中所述分析WBC计数数据；也如实施例9中所述，通过在液体Stuart培养基中以BBL Culture Swab^®擦拭两个鼻孔在攻击当天和持续攻击后连续14天而从每只小牛采集鼻拭子，以测定脱落。来自血液样品的血沉棕黄层用于接种含有TVL-MDBK(~80%汇合)的12孔板中的每个孔且如实施例9中所述进行测定。

抗体滴度：在初始接种当天(第-21天)、攻击当天(第0天)和研究结束时对于每只动物通过“恒定病毒渐降血清”法确定针对BVDV-1a的血清中和抗体滴度。根据特定概要A-17(Special Outline A-17)，牛病毒性腹泻病毒1a型中和抗体的滴定法确定抗体滴度。发展抗体滴度>8的动物被视为血清转化为BVDV-1a。

临床体征：BVDV-1a的临床体征包括但不限于发热、白细胞减少、呼吸困难、流鼻涕和稀便。攻击前两天、攻击当天和攻击后持续14天记录BVDV感染的所有相关临床体征。BVDV-1的临床体征的观察在数据分析过程中进行考虑，但不被视为主要结果，因为这些体征可以提示在这种类型的牛中通常遇见的其他疾病。

实施例10a – BVDV-1a效力研究

本研究的结果表明，牛鼻气管炎-病毒性腹泻- 副流感₃-呼吸道合胞病毒疫苗(修饰的活病毒)的修饰的活牛病毒性腹泻病毒1a型(BVDV1a)部分，作为预防由BVDV1a引起的感染的辅助具有抗原性和有效性。将一个剂量的疫苗施用于二十只BVDV血清阴性小牛。用一个剂量的产物匹配安慰剂疫苗接种十只血清阴性对照小牛。所有小牛用BVDV1a进行鼻内攻击。接种导致BVDV1a抗体滴度增加，且防止或减少BVDV1a诱导的病毒血症、鼻脱落、发热、淋巴细胞减少和白细胞减少。因此，对于该疫苗的BVDV1a部分已经建立了5 X 10³TCID₅₀/每剂量的最低BVDV1a-TCID₅₀。

材料与方法

接种、攻击和样品收集：三十只BVDV阴性小牛混合在排序组中。通过使用CVB-Biometrics提供的匹配组随机化方案，每只小牛当它们随机成群时进行门分开(gatecut)，每次三只小牛，通过小径(alley)进入两组之一(组A – 接种者或组B – 安慰剂接种的对照)。

二十只小牛用一个剂量的牛鼻气管炎-病毒性腹泻- 副流感₃ -呼吸道合胞疫苗(修饰的活病毒)进行接种。每个接种者第0天通过皮下注射在颈部左侧给予2 ml剂量的产物。用产物匹配安慰剂疫苗(BVDV缺失)接种十只小牛。攻击前两天，为了攻击前临床观察和获得基线体温和WBC读数，接种和对照组进行混合。用从Hanston, Kansas的Ruff农场的围栏死小牛的肺部获得的BVDV1a的强毒分离株接种后21天，攻击接种和对照小牛。已经将病毒在使用含10％马血清的Dubelco氏改良Eagle培养基的TVL-BK细胞上体外传代。在临攻击前滴定攻击病毒且测定为10^7.8 TCID₅₀ / 4ml，和攻击后立即滴定攻击病毒且测定为10^7.3TCID₅₀ / 4ml。在吸气过程中将2 ml攻击病毒施用到各鼻孔。攻击病毒在攻击过程始终保持较冷。

BVDV检测：CPE的观察和细胞培养物-增强的PCR技术用于检测收集样品中的BVDV1a。简而言之，通过除菌过滤(0.2µm)处理鼻样品到培养中的TVL-BK细胞上。血沉棕黄层直接置于培养中的TVL-BK细胞上，持续45 – 75分钟，然后从细胞洗掉。培养物在37℃ ±2℃和5 ± 1% CO₂培养4天。观察各培养物的BVDV特异性CPE的存在/不存在，且使用常规RTqPCR方法和下面的探针/引物组个别测定来自各培养物的上清液中BVDV1a的存在/不存在：

正向引物：

反向引物：

TaqMan MGB探针：

该方法的开发基于(Differentiation of types 1a, 1b and 2 bovine viraldiarrhea virus (BVDV) by PCR, Julia F. Ridpath and Steven R. Bolin, Molecularand Cellular probes, Journal of Virological Methods, 130 (2005) 145-148)。该方法还基于the Center for Veterinary Biologics and National Veterinary ServicesLaboratories Test Protocol – Genotyping Bovine Viral Diarrhea Virus，编号BPPR02010.01。区分BVDV的基因型和亚基因型的这些方法都利用存在于基因组的5'非翻译区(UTR)的基因差异。专门设计该探针/引物组以扩增5’ UTR的区段，其中可以通过高度特异性探针检测独特的BVDV1a序列。内部验证探针/引物组的特异性，其不与BHV、PI3、BRSV、BVDV1b、或BVDV2交叉反应。在Applied Biosystems 7500上使用基于Taqman^®的测定进行RTqPCR测定。

鼻脱落：来自鼻拭子分析的病毒分离数据基于攻击后由其分离BVDV1a的接种者的比例相比于由其分离BVDV1a的对照比例。基于CPE的观察和通过PCR独立检测而计算可预防分数。如Tanner和Morgan (1993)所述计算对于BVDV1a脱落的可预防分数。

病毒血症：基于攻击后由其分离BVDV1a的接种者的比例相比于由其分离BVDV1a的对照比例分析来自血液样品的血沉棕黄层的病毒分离数据。基于CPE的观察和通过PCR独立检测而计算可预防分数。如Tanner和Morgan (1993)所述计算对于BVDV1a病毒血症的可预防分数。

疾病的临床体征：由每位观察者独立地每天记录临床体征。

淋巴细胞减少：通过将第-2至0天的淋巴细胞计数取平均值而计算每只动物的攻击前淋巴细胞平均值。对于攻击后第1-14天每天计算每天淋巴细胞计数相对于攻击前平均值的比率(淋巴细胞计数作为攻击前的比例)。分析该比例数据以确定个体动物是否发展出由计数距基线25％降低所定义的淋巴细胞减少。如Tanner和Morgan (1993)所述计算可预防分数以确定在本研究中接种是否防止淋巴细胞减少的发展。

白细胞减少：通过将第-2至0天的白细胞计数取平均值而计算每只动物的攻击前白细胞平均值。对于攻击后第1-14天每天计算每天白细胞计数相对于攻击前平均值的比率(白细胞计数作为攻击前的比例)。分析该比例数据以确定个体动物是否发展出由计数距基线25％降低所定义的白细胞减少。如Tanner和Morgan (1993)所述计算可预防分数以确定在本研究中接种是否防止白细胞减少症的发展。

使用用于Windows 的SPSS版本16进行所有统计分析。

结果

血清中和抗体滴度：本研究中的所有小牛具有<1:2的接种前BVDV (BVDV1a、BVDV1b和BVDV2)血清中和抗体滴度。到攻击当天(第21天)，接种组具有1:21的平均BVDV1a滴度，其显著(p<.05)大于对照组< 1:2的平均BVDV1a滴度。在对照和接种小牛中，BVDV1a抗体滴度在攻击后14天增加，表明小牛已经用BVDV1a攻击。

从鼻拭子分离BVDV1a：基于BVDV特异性CPE的观察，在本研究的攻击后阶段过程中，本研究中的所有10只对照小牛脱落BVDV1a。在攻击后期间过程中，20只接种者仅有3只脱落BVDV1a。使用0/10自然保护的对照和17/20保护的接种者的比例计算预防分数。这导致0.85的可预防分数。

基于BVDV1a 的细胞培养增强的PCR检测，在本研究的攻击后阶段过程中，本研究中的所有10只对照小牛都脱落BVDV1b。在攻击后期间过程中，20只接种者仅有5只脱落BVDV1a。使用0/10自然保护的对照和15/20保护的接种者的比例计算预防分数。这导致0.75的可预防分数。

从血沉棕黄层分离BVDV1a：基于BVDV特异性CPE的观察，在本研究的攻击后阶段过程中，本研究中的10只对照小牛中的6只具有病毒血症。在攻击后期间过程中，20只接种者无一具有病毒血症。使用4/10自然保护的对照和20/20保护的接种者的比例计算预防分数。这导致1.0的可预防分数。

基于BVDV1a 的细胞培养增强的PCR检测，在本研究的攻击后阶段过程中，本研究中的10只小牛中的7只具有病毒血症。在攻击后期间过程中，20只接种者中的两只具有病毒血症。使用3/10自然保护的对照和18/20保护的接种者的比例计算预防分数。这导致0.86的可预防分数。

直肠温度：使用攻击前平均温度作为协变量的攻击后直肠温度分析揭示了统计学显著性的(p<0.05)组和组*天效应。分析揭示，在第6、8和14天，对照组的温度显著(p<0.05)高于接种组，且在第5和11天接近显著性。

BVDV1a的临床体征：对照组中一只小牛表现出可以归因于BVDV1a感染的临床体征。从小牛21观察到的临床体征是大量粘脓性鼻涕。在研究的攻击后阶段过程中，接种组中无一小牛表现出BVDV1a感染的任何临床体征。在任何这些小牛中没有观察到任何不利的接种后反应。

淋巴细胞减少：在20只接种者之二和十只对照之五中检测到淋巴细胞减少，导致80%的可预防分数。比例数据的每天平均值揭示了对照小牛对BVDV攻击的典型应答(淋巴细胞减少，随后为反弹峰)。接种的小牛没有以类似方式应答。

白细胞减少：在20只接种者之五和十只对照之四中检测到白细胞减少，导致37%的可预防分数。比例数据的每天平均值图示表示在图3中。

结论

前述报道表明，牛鼻气管炎-病毒性腹泻- 副流感₃-呼吸道合胞病毒疫苗(修饰的活病毒)的BVDV1a部分作为预防由BVDV1a引起的感染的辅助具有抗原性和效力。

这种组合产物的BVDV1a部分的抗原性和效力由下列所证明：

1) 与对照组相比，接种组中针对BVDV1a的抗体滴度的显著增加。在施用一个2ml剂量的疫苗之后，接种组中的20只小牛中的19只发展出BVDV1a滴度> 1:8，符合9CFR113.311 (c) (5)中定义的要求。

2) 病毒分离研究揭示，施用一个剂量降低了攻击后小牛中BVDV1a诱导的鼻脱落和病毒血症。

3) 当对照小牛比较时，接种的小牛表现出明显更少的发热。

4) 接种还降低了攻击后小牛中BVDV1a诱导的淋巴细胞减少和白细胞减少。

本研究的发现是统计学显著性且临床相关的，因此，表现出牛鼻气管炎-病毒性腹泻- 副流感₃-呼吸道合胞病毒疫苗(修饰的活病毒)中含有的BVDV1a部分的效力。

实施例11 - 用于船运热疫苗的效力测定方案

在题为“Compositions and Methods for Identifying and DifferentiatingViral Components of Multivalent Shipping Fever Vaccines”的共同未决的美国临时专利申请号61/427,404(2010年12月27日与此同时提交，且特别地通过对其明确引用而整体并入本文)中，本发明人报道了可用于获得多价疫苗中每种个别病毒组分的直接病毒定量(即，“效价”)的修改的基于遗传的测定方案的开发。本发明用RT-qPCR测定替代常规FA/IFA 测定(诸如现有的SAM 101测定中所述的那些)，以确定在个别测定孔(即稀释物)中特定的病毒种类、类型或亚型的存在或不存在。

通过用个别孔的RT-qPCR/qPCR分析取代CPE的目视观察，也可以使多价疫苗诸如本文所述的六价MLV疫苗的个别组分的效价试验变得更加客观。例如，病毒滴定测定中CPE的观察可以是相当主观的，且通常被认为是测试设施之间MLV疫苗滴度的差异来源。然而，通过增加测定的客观性，实验室之间的再现性也应当增加。

可以使用副流感3型病毒疫苗滴定(MVSAM102.01)的修改的补充测定方法进行PI₃的效价测试。可以使用疫苗中牛呼吸道合胞病毒滴定(MVSAM0129.01)的修改的补充测定方法进行BRSV的效价测试。通过用个别孔的实时qPCR分析取代CPE的目视观察而修改这些测定。使用疫苗中感染性牛鼻气管炎病毒滴定(MVSAM0105.01)的修改的补充测定方法进行BHV部分的滴定。在该测定中，为了使用于多价疫苗分析的测定标准化，可以使用96孔形式而非标准的6孔形式。重要的是，该方案包括用个别孔的qPCR分析取代目视观察和计数BHV噬斑以提供更准确和可靠的测定。

本实施例表明了使用在本发明人的共同未决的美国临时专利申请号61/427,404中所述的定量(实时)聚合酶链式反应(qPCR)技术来成功地确定本文所述六价MLV疫苗的六种个别病毒组分中每一种的效价。本发明人显示，在确定多价实例中基因相关毒株的个别效价中，该测定法相比于现有方法特别有优势。使用六价MLV BRDC疫苗作为模型，证明该测定法可以有效定量其中含有的BVDV-1a、BVDV-1b和BVDV-2三种基因亚基因型中的个别效价。

材料与方法

细胞培养

如Freshney (1987)所述使用常规技术和供应材料制备所有培养物。培养时表现出典型上皮样形态的TVL牛肾细胞系用于所有培养测定。

引物/探针组的特异性

从来自下列美国农业部(USDA)批准的病毒种子中每一种的病毒液提取RNA：BVDV-1a (Singer毒株)、BVDV-1b (TGAC毒株)、BVDV-2 (125)、PI₃ (Reisinger SF-4)、和BRSV(N375) (没有在BHV-1 [Cooper毒株]上进行任何提取过程，因为它是DNA病毒)。使用RNAqueous^®-4PCR (Ambion；Austin, TX, USA)进行提取。

每种RNA病毒样品用作使用TaqMan®一步RT-PCR化学物的6组引物/探针组中每一组的分开RT-qPCR反应中的模板(样品)。DNA病毒(BHV-1)还用作使用上述6组引物/探针组中每一组的分开qPCR反应中的模板(样品)。针对六价疫苗中所有六个病毒部分的BRSV引物/探针组的分析表明每组引物/探针组与任何其他病毒部分没有交叉反应性。

qPCR测定

使用Applied Biosystems 7500实时PCR系统进行qPCR测定。

寡核苷酸引物和标记的分子探针

下列定制的TaqMan®探针和病毒特异性正向和反向引物对由AppliedBiosystems (Foster City, CA, USA)制备。

BVDV-1b (第一)：

正向引物：

反向引物：和

BVDV-1b TaqMan® MGB探针：.

BVDV-1b (第二)：

第二正向引物：

第二反向引物：和

第二BVDV-1b检测探针：.

BRSV:

正向引物：

反向引物：和

BRSV TaqMan® MGB探针：.

BVDV-1a:

正向引物：

反向引物：和

BVDV-1a TaqMan® MGB探针：.

BVDV-2:

正向引物：

反向引物：和

BVDV-2 TaqMan® MGB探针：.

PI₃:

正向引物：

反向引物：和

PI₃ TaqMan® MGB探针：.

BHV-1:

正向引物：

反向引物：和

BHV-1 TaqMan® MGB探针：。

单价疫苗的效价测定

下列测定中每一种的方案采用Applied Biosystems 7500比较阈值循环(C_T)方法来确定滴定板的个别孔是否比等同参考孔含有更大量的病毒。大多数病毒样品含有可以通过PCR测定检测到的一些非存活病毒颗粒，从而给出潜在的假阳性结果。该问题通过使用没有细胞的参考板来解决。正如在测定板中一样将样品在参考板中稀释，但不含细胞以消除病毒复制的可能性。参考板用于生成作为每个测定中每个孔的基线或背景C_T值。如果测定板上的孔具有比相应的背景孔更高的C_T值，那么病毒复制已经发生且该孔被认为是阳性的。如果对于孔没有测得C_T值或C_T值等同于背景C_T值，那么该孔被认为是阴性的。

多价疫苗的效价测定

如本文所述制备IBR/BVDV-1a、-1b、-2/PI₃/RSV六价疫苗(修饰的活病毒)的中试系列。简而言之，BHV-1 (Cooper毒株)、BVDV-1a (Singer毒株)、BVDV-1b (TGAC毒株)、BVDV-2 (125)、PI₃ (Reisinger SF-4)、和BRSV (N375)在TVL-BK细胞系(第20代)中繁殖。各个部分在第10代收获，且一起掺合为六重产物。可以如本文所述通过添加适当的中和抗血清而进行6重疫苗中各部分的效价测定。基于CPE/FA/IFA 结果确定各病毒部分的TCID50且与基于RT-qPCR/qPCR的那些相比较。

BVDV-1a、-1b和-2效价测试

可以根据疫苗中牛病毒性腹泻病毒滴定(SAM 101)的补充测定方法分开滴定单价BVDV-1a、BVDV-1b和BVDV-2样品。简而言之，一式两份进行测定，一块板用于基于如所述的CPE和/或FA/IFA的滴度计算。另一块板用来确定基于RT-qPCR的滴度。如上所述对于每种病毒包括缺乏细胞的参考板。

PI₃效价测试

一式两份进行PI₃的效价测试，一块板用于基于CPE的滴度计算。另一块板用来确定基于如通过RT-qPCR测定的PI₃的比较C_T值的滴度。如上所述包括缺乏细胞的参考板。

BRSV效价测试

一式两份进行BRSV的效价测试，一块板用于基于如上所述的CPE的滴度计算，剩余板用来确定基于如通过RT-qPCR测定的BRSV的比较C_T值的滴度。如上所讨论的，在测定中还包括缺乏细胞的参考板。

BHV效价测试

通过用个别孔的qPCR分析取代噬斑的常规目视观察和计数而在96孔形式中进行BHV的效价测试。一式两份进行测定，一块板用于基于个别孔(稀释物)中CPE的存在或不存在的滴度计算，而剩余板用来确定基于如通过QPCR测定的BHV的比较C_T值的滴度。如上所述包括缺乏细胞的参考板。

参考文献

下列参考文献，在它们为本文所述的那些提供示例性程序上或其他详细补充的程度上，特别地通过对其明确引用而整体并入本文：

Caruthers等人的美国专利号4,415,732

Caruthers等人的美国专利号4,458,066

Mullis等人的美国专利号4,683,195

Mullis等人的美国专利号4,683,202

Koster等人的美国专利号4,725,677

Caruthers等人的美国专利号4,973,679

Molko等人的美国专利号4,980,460

Picone等人的美国专利号5,614,388

。

本文公开和要求保护的所有组合物和方法可以根据本公开内容在无需过度实验的情况下进行和实施。尽管本发明的组合物和方法已经在示例性实施方案方面进行了描述，但是对于本领域普通技术人员很明显，在不背离本发明的概念、精神和范围的情况下，可以对本文所述的组合物、方法和方法的步骤顺序进行变化。更具体地，显然，可以用化学和生理学相关的某些试剂取代本文所述的试剂，同时可以获得同样或相似的结果。所有这种对本领域普通技术人员显而易见的相似的取代和修改被视为在所附的权利要求定义的本发明的精神、范围和概念之内。因此，寻求取得专利的专用权如下列权利要求中所述。

序列表

<110> Eli Lilly and Company

Weise, Dale W

Harris, James R

<120> 牛病毒性腹泻病毒1b型疫苗组合物和方法

<130> X19557

<150> 61/427361

<151> 2010-12-27

<160> 21

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体 - 引物

<400> 1

caccctatca ggctgtattc atagc 25

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<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> 合成构建体 - 引物

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tgcccacagc acatcttaac c 21

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gcaatgctgc aggactaggt ataat 25

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<210> 9

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ggagaccaag accaaggaga tg 22

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gtcgtccagg tgaaaacggt 20

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<223> 合成构建体 - 引物

<400> 21

gtcgtccagg tgaaaacggt 20

Claims

1.免疫原性组合物，包含由修饰的活牛病毒性腹泻病毒1b型(BVDV-1b)组成的免疫原；

其中所述修饰的活BVDV-1b是通过在组织培养细胞中传代而改变的BVDV-1b的TGAC毒株；且

其中所述免疫原性组合物在有需要的动物中产生针对瘟病毒感染的保护性免疫应答，

其中所述修饰的活BVDV-1b是ATCC PTA-11553。

2.权利要求1的免疫原性组合物，其中所述修饰的活牛病毒性腹泻病毒是细胞病变性BVDV-lb病毒。

3.免疫原性组合物，包含：

由修饰的活牛病毒性腹泻病毒1b型(BVDV-1b)组成的第一免疫原；其中所述修饰的活BVDV-1b是通过在组织培养细胞中传代而改变的BVDV-1b的TGAC毒株；和

由以下中的一种或多种组成的至少一种第二免疫原：

修饰的活牛呼吸道合胞病毒(BRSV)；其中所述修饰的活BRSV是通过在组织培养细胞中传代而改变的BRSV的N375毒株；

修饰的活牛疱疹病毒(BHV-1)；其中所述修饰的活BHV-1是通过在组织培养细胞中传代而改变的BHV-1的Cooper毒株；

修饰的活牛病毒性腹泻病毒(BVDV-1a)；其中所述修饰的活BVDV-1a是通过在组织培养细胞中传代而改变的BVDV-1a的Singer毒株；

修饰的活牛病毒性腹泻病毒(BVDV-2)；其中所述修饰的活BVDV-2是通过在组织培养细胞中传代而改变的BVDV-2的125毒株；或

修饰的活副流感病毒3型(PI₃)；其中所述修饰的活PI₃是通过在组织培养细胞中传代而改变的PI₃的Reisinger SF4毒株；且

其中所述修饰的活BVDV-1b是ATCC PTA-11553。

4.免疫原性组合物，包含：

由免疫有效量的至少一种额外抗原组成的至少一种第二免疫原；其中所述至少一种额外抗原对于选自以下的生物体是特异性的：放线杆菌属、放线菌属、芽孢杆菌属、博德特氏菌属、短螺菌属、弯曲杆菌属、梭菌属、埃立克体属、丹毒丝菌属、埃希氏菌属、嗜组织菌属、钩端螺旋体属、李斯特菌属、曼海姆菌属、莫拉氏菌属、分枝杆菌属、支原体属、巴斯德氏菌属、沙门氏菌属、和链球菌属；

其中所述修饰的活BVDV-1b是ATCC PTA-11553。

5.疫苗，包含权利要求1-4中任一项的免疫原性组合物和佐剂；

其中所述免疫原性组合物包含每个剂量至少2x10³ TCID₅₀的修饰的活BVDV-lb；且

其中所述疫苗在有需要的动物中产生针对瘟病毒感染的保护性免疫应答。

6.权利要求5的疫苗，进一步包含免疫有效量的至少一种灭活的微生物病原体。

7.用于预防动物中的船运热的组合物，所述组合物包含由修饰的活BVDV-1b病毒组成的免疫原；

其中所述组合物包含每个剂量至少2x10³ TCID₅₀的修饰的活BVDV-lb，

其中所述修饰的活BVDV-1b是ATCC PTA-11553。

8.权利要求7的用于预防动物中的船运热的组合物，其中所述动物被瘟病毒感染或易受瘟病毒感染。

9.用于预防、治疗、控制或改善易受瘟病毒感染的动物中的瘟病毒引起的疾病的一种或多种症状的组合物，所述组合物包含由修饰的活BVDV-1b病毒组成的免疫原；

其中所述免疫原性组合物包含每个剂量至少2x10³ TCID₅₀的修饰的活BVDV-lb，

其中所述修饰的活BVDV-1b是ATCC PTA-11553。

10.权利要求9的用于预防、治疗、控制或改善易受瘟病毒感染的动物中的瘟病毒引起的疾病的一种或多种症状的组合物，其中所述组合物进一步包含源自牛轮状病毒、BRSV、BHV-1、牛冠状病毒、PI₃、牛副粘病毒、口蹄疫病毒、BRV、BVDV-1a、BVDV-2、溶血性曼海姆菌Al型、溶血性曼海姆菌A6型、多杀巴斯德氏菌、睡眠嗜组织菌和牛支原体中的一种或多种的免疫原。

11.权利要求7的用于预防动物中的船运热的组合物或权利要求9的用于预防、治疗、控制或改善易受瘟病毒感染的动物中的瘟病毒引起的疾病的一种或多种症状的组合物，其中所述动物是牛科动物。

12.用于保护动物免于船运热、牛呼吸疾病复合症、或牛病毒性腹泻的组合物，所述组合物包含由修饰的活BVDV-1b病毒组成的免疫原；

其中所述修饰的活BVDV-1b是ATCC PTA-11553。

13.权利要求12的用于保护动物免于船运热、牛呼吸疾病复合症、或牛病毒性腹泻的组合物，其中所述组合物与牛鼻气管炎病毒、牛呼吸道合胞病毒、或副流感病毒3病毒、或它们的组合共同施用。

14.权利要求5的疫苗，其进一步包含以下中的一种或多种：

每个剂量至少5x10³ TCID₅₀的修饰的活BHV-1；

每个剂量至少5x10³ TCID₅₀的修饰的活BVDV-1a；

每个剂量至少3x10³ TCID₅₀的修饰的活BVDV-2；

每个剂量至少6x10⁴ TCID₅₀的修饰的活PI₃；或

每个剂量至少7x10² TCID₅₀的修饰的活BRSV。