JP6053036B2 - ウシ・ウイルス性下痢症ウイルス1b型ワクチン組成物および方法 - Google Patents
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Description
本出願は、「多価輸送熱ワクチンのウイルス構成要素を同定し、そして区別するための組成物および方法」と題される同時係属米国仮特許出願第61/427,404号(本明細書と同時に2010年12月27日に出願され、そしてその全体が明確に特に本明細書に援用される)に関連する。
該当なし
該当なし
本発明は、一般的に、獣医学および動物ワクチンの分野に関する。より詳細には、本発明は、免疫原性組成物、こうした組成物を作製する方法、ならびに微生物またはウイルス感染、またはその症状、および特にウシ呼吸器病症候群(BRDC)などの多因子疾患を含む、哺乳動物家畜中の呼吸器感染症を、予防、治療、改善、および/または管理するための方法に関する。開示するのは、ペスチウイルス感染、ならびに特に感受性があるまたは感染した動物における、輸送熱、BRDC、およびウシ・ウイルス性下痢症の原因となるかまたはこれらに関与するペスチウイルスの1またはそれより多い症状を予防、治療、および/または改善するための抗原性組成物、ならびに予防剤および療法剤の製剤化および投与におけるその使用法である。
BRDCは、販売経路において、そして目的地の牧場またはフィードロットで、頻繁に若い食肉牛/肥育素牛が罹患する多因子疾患症候群である。この疾患の主な細菌病原体は、マンヘミア・ヘモリチカ(Mannheimia haemolytica)、パスツレラ・マルトシダ(Pasteurella multocida)、ヒストフィルス・ソムニ(Histophilus somni)(以前のヘモフィルス・ソムヌス(Haemophilus somnus))およびマイコプラズマ・ボビス(Mycoplasma bovis)である。輸送熱と関連づけられてきたウイルス病原体は、ウシヘルペスウイルス1型(BHV−1)、パラインフルエンザ3(PI3)、ウシ呼吸器合胞体ウイルス(BRSV)およびウシ・ウイルス性下痢症ウイルス(BVDV)である。
BVDVは、現在、ウシ呼吸器病症候群(BRDC)(しばしば一般的に「輸送熱」と呼ばれる)の重要な病原体と認識される。全年齢の畜牛(授乳中の子ウシを含む)を感染させるこの疾患は、呼吸促迫、咳、抑鬱、食欲不振、目および鼻の分泌物、ならびに体温上昇によって特徴付けられる。急性大流行においては、死亡は症状の開始後24時間以内に起こりうる。BVDVの治療は、抗ウイルス療法剤が存在しないことから問題であり、そしてペスチウイルス感染による死亡率は高い。さらに、BRDCに関与する細菌性病原体の治療はまた、多くの例において、療法薬剤に対する抗微生物耐性による多くの例で複雑となっている。
本発明は、新規でそして有用な組成物、ならびにその必要がある動物に対する予防的および/または療法的剤の送達を好適に改善可能である、該組成物の使用法を含む。本発明は、慣用的な配合物より優れた利点を提供するワクチン組成物を提供し、そして1またはそれより多いペスチウイルスによって引き起こされる疾患、および特に1b型下位遺伝子型のもの(すなわちBVDV−1b)を含むBVDVウイルスによって引き起こされるものを予防するかまたは抑制する方法を特に提供する。
1またはそれより多いペスチウイルス、そして特に、ウシ科のメンバーにおけるBRDCおよび輸送熱に関与する1またはそれより多いウイルス病原体に対するより広い防御を提供するため、本発明者らは1またはそれより多いBVDV−1b特異的抗原を含む安全でそして有効なワクチン配合物を開発した。一価および多価ワクチン配合物の両方が記載されてきており、これには一価ワクチンの場合、BVDVのみに特異的な免疫反応を誘発する1またはそれより多い抗原、エピトープ、または修飾生ウイルス、あるいは多価ワクチンの場合、BVDVに対してだけではなく、1またはそれより多いさらなる病原体に対しても特異的免疫反応を誘発する1またはそれより多い抗原、エピトープ、または修飾生ウイルスを含有するものが含まれる。
本発明は、1またはそれより多いウイルス感染の予防において使用するための免疫原性組成物およびそのワクチン配合物、ならびに選択された哺乳動物における1またはそれより多い多因子疾患症候群の予防または療法において使用するための組成物を提供する。特に、本発明は、予防、予防、または療法のためのワクチン薬剤の製造における、開示する1またはそれより多い免疫原性組成物の使用、ならびに特に、哺乳動物における1またはそれより多い疾患、あるいはこうした疾患の1またはそれより多い症状、例えば家畜におけるBVDV感染を予防し、管理し、改善し、そして/または治療するための獣医学的に許容されうる薬剤の製造において使用を提供する。
本発明にはさらに、感受性動物において、1またはそれより多いウイルス病原体に対する検出可能免疫反応を誘導するための方法が含まれる。1つの好ましい方法には、必要がある動物、あるいは例えば所定の疾患または感染に関する既知のリスク要因に基づいて潜在的に必要がある動物に、動物において検出可能な免疫反応を誘導するのに十分な量の本明細書に開示するようなワクチン組成物を投与する工程が含まれる。
1またはそれより多い開示する免疫原性組成物またはこうした組成物を含む薬学的配合物を含むキット;ならびに1またはそれより多い予防的または療法的措置において、該キットを用いるための使用説明書もまた、本開示の例示的側面に相当する。こうしたキットには、好ましくは、単独で、あるいは1またはそれより多いさらなる療法化合物、薬剤等と組み合わせた、1またはそれより多い開示する免疫原性組成物またはワクチン、および動物における疾患の予防または治療における構成要素の使用のための使用説明書が含まれる。本発明記載のキットは、商品流通のためにパッケージングされることも可能であり、そしてまた場合によって、選択された動物に組成物(単数または複数)を投与するための1またはそれより多い送達デバイス(例えばシリンジ、バイアル、注射物質等)もさらに含むことも可能である。
本発明の別の重要な側面は、動物、例えば脊椎動物哺乳動物において、疾患、またはその症状を予防するか、治療するかまたは改善するための薬剤調製における、開示する免疫原性組成物(ならびに該組成物を含む配合物)を用いるための方法に関する。開示する免疫原性組成物の使用はまた、微生物またはウイルス起源の1またはそれより多い疾患の療法および/または予防においても意図される。
本発明の例示的態様を以下に記載する。明確にするために、本明細書には実際の実施のすべての特徴は記載しない。もちろん、こうした実際の態様の開発のいずれにおいても、1つの実施と別の実施とでは異なるであろう、開発者の特定の目的、例えばシステムに関連するおよびビジネスに関連する制約との適合を達成するため、多くの実施特異的決定を行わなければならないことが認識されるであろう。さらに、こうした開発上の努力は、複雑で、そして時間を消耗するが、本開示の利点を有する一般の当業者にはルーチンの作業であろうことが認識されるであろう。
「輸送熱」は、畜牛およびヒツジにおける急性の非常に伝染性が強い敗血症性症候群に与えられた用語であり、熱、気道の急性炎症、鼻分泌物、食欲不振、抑鬱、線維素性肺炎、および感染組織の壊死によって臨床的に特徴付けられる。輸送後のフィードロットで最も頻繁に見られる輸送熱は、若い畜牛の主な死因であり、そして産業に対して、推定5億ドルを超える年間損失の原因となっている。1991年のみで、輸送熱は、主に、治療、産生損失、および死亡の費用のため、米国畜牛産業に、ほぼ6億2400万ドルの概算費用を課した。
輸送熱の主な病原体は、ウシ呼吸器病(BRD)またはウシ呼吸器病症候群(BRDC)として知られる多因子状態である。BRDCは、肉牛産業における経済的損失の主因であり、ウイルスおよび細菌病原体両方による、付随する連続または同時感染によって特徴付けられる。BRDCに関与するウイルス病原体には、ウシヘルペスウイルス1(BHV−1)、ウシPI3、ウシ・ウイルス性下痢症ウイルス(BVDV)、およびウシ呼吸器合胞体ウイルス(BRSV)が含まれる。
ペスチウイルスは、世界中で動物において経済的に重要な疾患を引き起こす。フラビウイルス科内のペスチウイルス属は、3種の一本鎖+鎖RNAウイルス:ウシ・ウイルス性下痢症ウイルス(BVDV)、古典的ブタ発熱ウイルス(CSFV)、ボーダー病ウイルス(BDV)を含む。近年、BVDVに遺伝的に関連する、第四の別個の群のペスチウイルスが同定されてきており、そして文献において、ウシ・ウイルス性下痢症ウイルス2型(BVDV−2)と称される(例えば、各々、その全体が明確に特に本明細書に援用される、Thielら、1996;およびBecherら、1995を参照されたい)。その結果、現在の教科書は、2種を区別するため、BVDVの元来の種を「BVDV−1」と称する。
ペスチウイルスの基準種は、BVDV 1型(BDVD−1)であり、そのゲノムは長さおよそ12.5kbであり、そして1つの大きなオープンリーディングフレーム(ORF)を含有する(その全体が明確に特に本明細書に援用されるCollettら、1988)。該ORFは、宿主またはウイルスプロテアーゼによって、翻訳と同時にそしてその後でプロセシングされる、およそ450kDaの大きなポリタンパク質をコードする。標準的BVDVポリタンパク質のN末端は、非構造タンパク質p20(Npro)、カプシドタンパク質p14(C);エンベロープ糖タンパク質gp48(E0)、gp25(E1)、gp53(E2);非構造タンパク質p125(NS23)、p10(NS4A)、p32(NS4B)、p58(NS5A)およびp75(NS5B)を生じる(例えば、各々、その全体が明確に特に本明細書に援用される、Tautzら、1997;Xuら、1997;Elbersら、1996;およびWiskerchenら、1991を参照されたい)。BVDV−1は、2つの生物型、細胞変性型(「cp」と称される)または非細胞変性型(「ncp」)、で存在し、これらは、細胞変性変異体において、単一の80kDaポリペプチド(非構造タンパク質p80、NS3)が産生される点が異なる(例えば、その全体が明確に特に本明細書に援用される、Gillespieら、1960を参照されたい)。
用語「約」および「およそ」は、本明細書において、交換可能であり、そして一般的に、所定の数値の周囲の数値範囲、ならびに数値の列挙される範囲中のすべての数値を指す(例えば、「約5〜15」は、別に言及しない限り、「約5〜約15」を意味する)。さらに、本明細書のすべての数値範囲は、範囲内の各整数を含むと理解されるべきである。本明細書において、用語「抗原」または「免疫原」は、宿主動物において、特異的免疫反応を誘導する物質を意味する。抗原は、全生物、死滅、弱毒化または生存生物;生物のサブユニットまたは部分;免疫原性特性を持つ挿入物を含有する組換えベクター;宿主動物への提示に際して、免疫反応を誘導可能なDNAの片または断片;タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、エピトープ、ハプテン、またはその任意の組み合わせを含むことも可能である。あるいは、免疫原または抗原は、毒素または抗毒素を含むことも可能である。抗原は、一般的に、任意の免疫原性物質、すなわち、感受性動物の組織内に導入されると、免疫反応(例えば特異的抗体分子の産生)を誘発し、そして抗原の導入に反応して産生される抗体に特異的に結合可能である、任意の物質を含む。抗原は、免疫系によって認識され、体液性免疫反応を誘導し、そして/または細胞性免疫反応を誘導して、Bおよび/またはTリンパ球の活性化を導くことが可能である。抗原には、単一エピトープ、あるいは2またはそれより多いエピトープが含まれうる。
本実施例は、BVDV−1b修飾生ウイルス(MLV)の大規模産生のための例示的方法を提供する。
ウイルスおよび微生物
BVDV−1bのTGAC株は、米国農務省(USDA)、動植物衛生検査部(APHIS)、獣医学生物学研究所(CVB−L)(米国アイオワ州エームズ)より得た。マスターシード(MS)は、続いて、「TVL−BVDV1b MS 04/27/2007 DW3−095」と名付けられ、そして現在ここにともに出願されている、本出願者の同時係属米国仮特許出願第61/427,404号に記載するように、37C.F.R.§1.14および35U.S.C.§122の下に権利を与えられている、特許および商標局長によって決定されるものに対する本特許出願の係属中に、培養へのアクセスが利用可能であることを確実にする条件下で寄託されている。寄託物は、本出願の対応物またはその成果(progeny)が出願されている国の外国特許法によって必要とされるように入手可能である。しかし、寄託物の入手可能性は、政府の法的措置によって許諾される特許権の逸脱において、本発明を実施する許可を構成しないことが理解されなければならない。本培養寄託物は、微生物寄託に関するブダペスト条約の規定にしたがって、保存され、そして公共に入手可能となり、すなわち該寄託物は、寄託物の試料の最終加工物に関する最近の要求後、少なくとも5年間、そしていかなる場合であっても、寄託日後、少なくとも30年間、または寄託された培養の開示を生じうる、任意の特許の法的効力存続期間に渡って、寄託物が生存し、そして混入されないまま維持されるために必要である、すべての注意を伴って保存されるであろう。寄託者は、寄託物の状態のために、要求された際に寄託物が試料を与えることが不可能である場合には、寄託物を交換する義務を認識している。本培養寄託物の公共に対する利用可能性に関するすべての制限は、開示する特許の付与に際して、取り消し不能に除去されるであろう。TVL BVDV1b MS 04/27/2007 DW3−095ウイルスの寄託物は、ブダペスト条約の条件下で、2010年12月21日、10801 University Blvd., Manassas, VA, 20110−2209, USAに位置する、アメリカンタイプカルチャー研究所の特許寄託物の永続的コレクションに入っており、この際、貯蔵所によって、寄託番号ATCC PTA−11553を割り当てられた。
産生シードウイルスをTVL−BK細胞に接種する前に、細胞を顕微鏡的に視覚化して、細胞が先に記載される形態を示すことを確認する。産生ウイルスの各バッチを採取する前に、TVL−BK細胞を観察して、これらが、ウイルスに関連する典型的な細胞変性効果(CPE)を示すことを確認する。
このワクチンに用いるBVDV−1bの病原性、強度、および抗原性の一貫性を、凍結乾燥または凍結条件での保存、ならびに継代または継代培養数に対する制限によって、助長した。
シードおよび産生培養に用いる培地の組成および反応は以下の通りであった:作業ウイルス接種物(MSV+1〜MSV+8)および産生ウイルス接種物(典型的には、排他的ではないがMSV+9であった)をTVL−BK細胞中で増殖させ;但し、ウイルス増殖のためのTVL−BK細胞継代数は、MCSから20継代を超えない。増殖培地(作業および産生細胞調製物両方のためのもの)は、ダルベッコの修飾イーグル培地(DMEM)であった。生じたMSVを凍結乾燥し、凍結保存培地中、液体窒素中で保存するか、または凍結保存培地中、−70〜−85℃で保存しうる。MCSを凍結保存培地中(液体窒素中)で保存しうるし、または凍結保存培地中、−70〜−85℃で保存しうる。
凍結TVL−BK細胞を含有する凍結バイアルを迅速に融解した。培養フラスコを、推奨される容量の培地で満たし、そして懸濁細胞を凍結バイアルから培養フラスコに無菌的に移した。また、1:3〜1:6(cm2:cm2)の範囲の比で、活発に増殖している培養を分割することによってもまた、培養容器に植え付けた。継代培養が意図されるフラスコまたはローラーボトル中のTVL−BKを、増殖培地を無菌的に除去し、そして1xトリプシン−EDTA溶液を添加することによって、培養表面から遊離させた。インキュベーション後(5分間、35〜39℃)、単層を分散させた。分散させた細胞を増殖培地とともに培養容器に添加することによって、トリプシンを不活化した。ウイルスの凍結アリコットを迅速に融解するか、またはシードが凍結乾燥されている場合は、培地に再懸濁した。TVL−BK細胞(+20またはそれ未満)にウイルスを接種した。フラスコまたはローラーボトル中で複製している、継代培養が意図されるウイルスを、適切なインキュベーション時間後に、そして/またはCPEを観察した後に、収集した。次いで、ウイルス液を6〜−80℃で保存するか、または直ちに用いて、他の培養容器に接種した。
採取当日、ウイルス特異的CPEおよび無菌性に関して培養を調べた。典型的な最小インキュベーション時間は、BVDV−1b接種後2日間であった。典型的な最大インキュベーション時間は、BVDV−1b接種後4日間であった。ウイルス懸濁物を産生容器から無菌的に採取した。試料を収集して、採取物のTCID50を決定した。採取材料を6〜−80℃で保存した。採取材料は、最終産物の製造前に、凍結より上では、最長1ヶ月、そして凍結状態では最長6ヶ月、保存可能であった。
無菌技術を用いて、すべての操作を行った。適切な抗生物質、例えばネオマイシンおよびナイスタチン(マイコスタチン)を、それぞれ15μgおよび15単位/用量の率で、ワクチンのシリーズまたはサブシリーズ集合中に添加した。濃度を調整するために、必要に応じて、採取液をDMEM中で希釈し、そして0.2μmでろ過したスクロース溶液を添加することによって安定化させ、20±1%の最終スクロース濃度を生じた。場合によって、10kDa分子量カットオフフィルターを用いた無菌限外ろ過によって、ウイルス採取液を濃縮した。濃縮の度合いは、典型的には50倍を超えなかった。
本実施例は、ワクチン接種動物における感染を予防する際のBVDV−1b一価ワクチンの有効性を立証する。
動物
健康な4〜5ヶ月の雑種雌子ウシを商業的供給源より購入し、ランダムに引き当てた耳標によって同定し、そしてBVDVに対する感受性に関して血清学的にスクリーニングした。すべての子ウシには、到着時に、1用量のセフチオフル結晶遊離酸(Excede(登録商標)、Pfizer Animal Health、米国ニューヨーク州ニューヨーク)を投与した。子ウシは、水、干し草およびペレット状餌配給に自由選択でアクセス可能であった。
BVDV−1bワクチン、修飾生ウイルスを上述のように調製した。簡潔には、BVDV−1bマスターシードウイルスをTVL−BK細胞株(第20継代)中で増殖させ、第10継代で採取し、産生概略にしたがって安定化させ、ボトルを満たし、そしてフリーズドライした。BVDV濃度は、Spearman−Karber法(例えばFinney、1978を参照されたい)によって決定されるように、8x103 TCID50であった。希釈剤として無菌水を用いて、ワクチンを再水和した。
19頭のBVDV陰性子ウシを選別路地(ally)中で混合した。CVB−Biometrics(米国アイオワ州エームズ)によって提供されるマッチセットランダム化スキーム(表1)を用いることによって、各子ウシを2つの群(ワクチン接種または非ワクチン接種対照)の一方に入れた。
フォワードプライマー:5’−CACCCTATCAGGCTGTATTCATAGC−3’(配列番号1);
リバースプライマー:5’−TGCCCACAGCACATCTTAACC−3’(配列番号2);および
BVDV−1b検出プローブ:5’−TCACCTGGACGACCC−3’(配列番号3)
BVDV−1b(第二):
第二のフォワードプライマー:5’−GTCGTCCAGGTGAAAACGGT−3’ (配列番号19);
第二のリバースプライマー:5’−GTCGTCCAGGTGAAAACGGT−3’ (配列番号20);および
第二のBVDV−1b検出プローブ:5’−GTCGTCCAGGTGAAAACGGT−3’(配列番号21)。
白血球減少症:第−2日〜第0日の白血球数を平均することによって、曝露前白血球平均値を計算した。曝露後各々第1日〜第14日まで、曝露前平均に比較して毎日の白血球数の比(曝露前の比率としての白血球数)を計算した。この比率データを分析して、ベースラインからの数の25%減少として定義されるような白血球減少症を、個々の動物が発展させたかどうかを決定した。TannerおよびMorgan(1993)によって記載されるように、予防可能分率を計算して、本研究において、ワクチン接種が白血球減少症の発展を予防したかどうかを決定した。
白血球減少症は、10頭のワクチン接種動物のうち1頭で、そして9頭の対照のうち8頭で検出され、87%の予防可能分率を生じた。白血球の生データを表2に記録する。
本実施例は、TVL−BVDV−1b MSVの安定性を評価し、これが動物に投与された際に病原性に復帰しないことを保証する。
本実施例は、上述のようなBVDV−1b MSを取り込んだ多価(六種)BRDCワクチンの調製を記載する。
用いる微生物
BHV−1: BHVのCooper(コロラド)単離体は、上気道疾患を有するウシ科の肺から、1956年に単離された(Yorkら、1957)。このマスターシードウイルスは、TVL−BHV(Cooper)PO、1997年8月5日、DW−1−21−Wと同定された。
BVDV−1a: BVDV−1aのSinger株は、APHISから得られた。このマスターシードは、TVL−BVD(Singer)P0、1998年12月、DW4−29と同定された。
BVDV−1b: BVDV−1bのTGAC株は、APHISから得られた。このマスターシードは、TVL−BVDV 1b MS 04/27/2007 DW3−095と同定された。
BVDV−2: BVDV−2の125株は、APHISから得られた。このマスターシードは、TVL−BVDV 2 株125 P0 11/01/01 DW3−90と同定された。
PI3: PI3のReisinger SF4株は、APHISから得られた。このマスターシードは、TVL−PI3(Reisinger SF−4P0、2001年4月2日(SM−83))と同定された。
BRSV: BRSVのN375株は、APHISから得られた。このマスターシードは、TVL−BRSV P0、2001年7月20日、DW3−87と同定された。
TVL−BK細胞に産生シードウイルスを接種する前に、細胞を顕微鏡的に可視化して、細胞が、先に記載される形態を示していることを確認した。産生ウイルスの各バッチを採取する前に、TVL−BK細胞を観察して、これらがウイルスに関連する典型的な細胞変性効果(CPE)を示していることを確認した。
採取当日、ウイルス特異的CPEおよび無菌性に関して培養を調べた。最小インキュベーション時間は、BHVまたはPI3接種後2日間、BVDV−1a、BVDV−1bまたはBVDV−2接種後4日間、そしてBRSV接種後5日間であった。最大インキュベーション時間は、BHVまたはPI3接種後4日間、BVDV−1a、BVDV−1b、またはBVDV−2接種後6日間、そしてBRSV接種後8日間であった。
実施例5〜10は、六価BRDC修飾生ワクチンが、含有されるウイルス各々によって引き起こされる疾患を予防する際の有効性を立証する。この第一の実施例において、ワクチンは、BVDV−1bによって引き起こされる疾患を予防する際に有効であることが示される。
六価ワクチン(修飾生ウイルス)を、上記産生法にしたがって調製した。簡潔には、BHV−1(Cooper株)、BVDV−1a(Singer株)、BVDV−1b(TGAC株)、BVDV−2(125)、PI3(Reisinger SF−4)、およびBRSV(N375)をTVL−BK細胞株(第20継代)中で増殖させた。個々の分画を第10継代で採取し、そして六種産物とともにブレンドした。欠失プラセボを有効性シリーズ各々と平行して作製した。例えば、BVDV欠失プラセボは、対応する有効性シリーズと同じBRSV、BHV、およびPI3採取バッチを含有した。BVDV構成要素の代わりに培地を用いて、有効性シリーズおよびBVDV欠失プラセボ間で同等の体積を維持した。六価ワクチンMLVの各構成要素に関して、類似の欠失プラセボを構築した。
各研究のため、およそ3〜4ヶ月齢の商業的な若い食肉牛/肥育素牛を得て、ランダム化し、そして耳標によって同定した。これらの子ウシを駆虫し、そしてパスツレラ病、マイコプラズマ病、および黒脚病に対してワクチン接種した。ワクチン接種および対照群にいる子ウシを分けて、隣接させないが、同等の囲い中で曝露2日前(第−2日)まで維持し、この時点で1つの囲い中で混合した。第0日、すべての子ウシを、関心対象のウイルスの病原性単離体に曝露した。例えば、病原性BVDV−1b(Pokey Feeders(米国カンザス州スコットシティ)の囲いで死亡した子ウシの肺から得られたもの)を、10%ウマ血清を含むDMEMを用いて、TVL−BK細胞上、in vitroで継代した。4mL中、およそ8x107 TCID50の曝露用量を各子ウシに投与し、2mLを吸気中、各鼻孔に投与した。子ウシは、水、沿岸性バミューダ乾草、および抗コクシジウム剤を含有するが、抗生物質を含有しないペレット状餌配給に自由選択でアクセス可能であった。
マッチランダム化スキームを用いて、CVB−Biometricsによって提供されるランダム化表を用い、子ウシを2つの処置群(ワクチン接種またはプラセボワクチン接種対照)に割り当てた(表1を参照されたい)。傾斜台に進入する一連の3頭の子ウシを、2:1の比で2つの処置群にランダム化した。血清学的評価のために、最初に血液を抜き取る際に、バケツからランダムに耳標を抜き取り、子ウシを同定する。曝露前、ウシの2群を分けて、しかし同等の囲いに維持した。曝露2日前(第−2日)、子ウシを1つの囲い中で混ぜた。
ブラインド化された職員は、対照またはワクチン接種動物の同一性の知識を持たなかった。すべての野外および実験室職員は、記録者を除いて、研究に対してブラインド化された。
選択された一次転帰は、曝露後の白血球減少症であった。白血球減少症は、ベースラインWBC数からの25%の減少と定義された。ワクチンの有効性をさらに支持する他の転帰には、鼻排出、ウイルス血症、発熱、抗体産生およびウイルス感染の臨床徴候が含まれた。
個々の白血球(WBC)数を、曝露前平均のパーセントに変換し、そして連続間隔スケールで測定した。これらの変換WBC数のパーセントを曝露後少なくとも14日間、毎日決定し、そして評価のための一次基準として用いた。白血球減少症の検出は、曝露に対する耐性(罹患せず)または感受性(罹患)を決定するための一次基準として働いた。罹患および非罹患群を比較して、ワクチン接種がウイルス曝露後の白血球減少症を予防したかどうかを決定した。呼吸器疾患の臨床徴候および鼻/バフィーコート試料からのウイルスの検出は、曝露に対する感受性を決定するための二次基準として働いた。白血球減少症の期間および排出期間(個々の子ウシからウイルスが検出される日数)を分析して、ワクチン接種がこれらのパラメータに対して緩和効果を有するかどうかを決定した。曝露前平均温度(ベースライン)を共変数として用いて、すべての個々の毎日直腸温度を分析した。研究開始時に、≧2のウイルス力価を有する場合、実験単位を研究から排除した。
有効性シリーズまたは対応する欠失プラセボのワクチン接種直前(第−28日〜第−21日)、子ウシから血液試料を収集した。曝露直前に(第0日)、そして再び、曝露14日後(第14日)、血液試料をまた収集した。示差WBC数およびウイルス単離用の血液試料を、第−2日〜少なくとも第14日まで収集した。試料をEDTA Vacutainer(登録商標)(Becton−Dickinson and Co.、米国ニュージャージー州フランクリンレークス)試験管中に収集し、そしてDrew Scientific、Hemavet 950示差WBC計数装置を用いて、計数を行った。ウイルス単離用の鼻スワブを第−2日〜少なくとも第14日に採取した。
第2日〜第14日、鼻試料および血液試料を収集し、そして子ウシをウイルス感染の臨床徴候に関して観察した。第−2日〜第14日、各子ウシの直腸温度を測定した。
本研究の結果は、修飾生ウシ・ウイルス性下痢症ウイルス−1b型(BVDV1b)、ウシ鼻気管炎−ウイルス下痢症−パラインフルエンザ3−呼吸器合胞体ウイルスワクチン修飾生ウイルスは抗原性であり、そしてBVDV1bによって引き起こされる疾患の予防の補助として有効である。1用量のワクチンを21頭のBVDV血清陰性子ウシに投与した。10頭の血清陰性対照子ウシに産物マッチプラセボワクチン1用量をワクチン接種した。すべての子ウシをBVDV1bに鼻内曝露した。ワクチン接種は、増加したBVDV1b抗体力価増加を生じ、そしてBVDV1b誘導性ウイルス血症、鼻排出物、発熱、疾患の臨床徴候および白血球減少症を予防するかまたは減少させた。その結果、用量あたり2x103の最小BVDV1b−TCID50が、このワクチンのBVDV1b分画に関して確立されてきている。このワクチンは、BHV−1、PI3、BRSV、BVDV1型の2つの下位遺伝子型(1aおよび1b)およびBVDV 2型を含有する。
リバースプライマー:TGCCCACAGCACATCTTAACC(配列番号2)
TaqMan MGBプローブ:TCACCTGGACGACCC(配列番号3)
血清中和抗体力価:本研究のすべての子ウシは、<1:2のワクチン接種前BVDV(BVDV1a、BVDV1bおよびBVDV2)血清中和抗体力価を有した。曝露日(第21日)までに、ワクチン接種群は、1:83の平均BVDV1b力価を有し、これは対照群<1:2のものより有意に(p≦.05)大きかった。BVDV1b抗体力価は、対照およびワクチン接種子ウシの両方で曝露14日後に増加し、子ウシがBVDV1bに曝露されたことを示した。
先行の記述は、BVDV1bによって引き起こされる疾患の予防における補助として、ウシ鼻気管炎−ウイルス下痢症−パラインフルエンザ3−呼吸器合胞体ウイルスワクチン修飾生ウイルスのBVDV1b分画の抗原性および有効性を立証する。この併合産物のBVDV1b分画の抗原性および有効性は、以下のように証明される:
1)対照群に比較した際のワクチン接種群におけるBVDV1bに対する抗体力価の有意な増加。ワクチン接種群におけるすべての子ウシは、1回の2ml用量の投与後、BVDV1b力価≧1:8を発展させ、9CFR 113.311(c)(5)に定義される必要条件を満たす。
2)ウイルス単離研究によって、1用量の投与が、曝露後BVDV1b誘導性ウイルス血症および鼻排出の有意な減少を生じることが明らかになった。
3)ワクチン接種子ウシは、対照子ウシに比較した際、有意に低い発熱を示し、そして疾患の臨床徴候をまったく示さなかった。
4)ワクチン接種はまた、BVDV1b誘導性白血球減少症を発展させる可能性も減少させた。
本実施例は、六価MLVワクチンのウシ呼吸器合胞体ウイルス(BRSV)分画は、BRSVによって引き起こされる疾患の予防を補助することを立証する。
BRSV欠失プラセボを調製し、そしてBVDV−1bに関して実施例5に記載したものと類似の方式の有効性シリーズと一緒に用いる。このBRSV欠失プラセボは、有効性シリーズと同じBVDV−1a、BVDV−1b、BVDV−2、BHVおよびPI3採取バッチを含有し、BRSV構成要素の代わりに培地を用いて、有効性シリーズおよびBRSV欠失プラセボ間で同等の体積を維持する。無菌希釈剤を用いて、本明細書に記載するように、六価MLVワクチンおよびBRSV欠失プラセボの両方を再水和する。
ほぼ同じ起源、種類、体重および年齢を有する比較的均質な集団由来の、およそ3〜4ヶ月齢の商業的な若い食肉牛/肥育素牛を用いる。子ウシを駆虫し、そしてパスツレラ病、マイコプラズマ病、および黒脚病に対してワクチン接種する。このプロトコルにおいて、同数のワクチン接種子ウシおよび対照子ウシを用いる;子ウシ2群を分けて、隣接させないが、同等の囲い中で維持し、そして曝露2日前(第−2日)に1つの囲い中で混合する。子ウシは、水、沿岸性バミューダ乾草、および抗コクシジウム剤を含有するが、抗生物質を含有しないペレット状餌配給に自由選択でアクセス可能である。
マッチランダム化スキームを用いて、CVB−Biometricsランダム化表を用い、子ウシを2つの処置群(ワクチン接種またはプラセボワクチン接種対照)に割り当て、ここで傾斜台に進入する一連の3頭の子ウシを、2:1の比で2つの処置群にランダム化する。血清学的評価のために、最初に血液を抜き取る際に、バケツからランダムに耳標を抜き取り、子ウシを同定する。
職員はすべて研究に対してブラインド化され(記録者を例外とする)、そして対照またはワクチン接種動物の同一性の知識を持たない。
一次転帰は、曝露後のBRSVウイルスの鼻排出の予防であり、これはプロトコル中のすべての子ウシの鼻孔から毎日収集される鼻試料におけるBRSVの存在または非存在によって決定される。他の二次転帰には、1またはそれより多いBRSV感染の減少した臨床徴候、発熱の減少、および/またはBRSVを排出する子ウシにおける排出期間の減少が含まれうる。ワクチン接種および対照群によるBRSVの排出は、曝露後14日間、毎日測定され、BRSVの検出は、曝露に対する耐性(罹患せず)または感受性(罹患)を決定するための一次基準として働く。罹患および非罹患群を比較して、ワクチン接種がBRSV曝露後のBRSV排出を予防したかどうかを決定する。呼吸器疾患の臨床徴候は、曝露に対する感受性を決定するための二次基準として働く。排出期間(個々の子ウシからBRSVが検出される日数)を分析して、ワクチン接種がこのパラメータに対して緩和効果を有するかどうかを決定する。曝露前平均温度(ベースライン)共変数に対して、すべての個々の毎日直腸温度を分析する。研究開始時に、≧2のBRSV SN力価を有する場合、実験単位を研究から排除する。
有効性シリーズまたはBRSV欠失プラセボを用いたワクチン接種直前(第−28日〜第−21日)、子ウシから血液試料を収集し、そして再び曝露直前に(第0日)、そして再び、曝露14日後(第14日)、採取する。
両方の鼻孔を、液体Stuart培地を含むBBL培養スワブ(登録商標)で拭き取ることによって、曝露日および曝露後連続14日間、各子ウシから鼻スワブを採取する。BRSVを検出するために特異的に設定されたプローブ/プライマーセットを用いたリアルタイムPCRによって、試料由来の培地をBRSVの存在に関してアッセイする。
リバースプライマー:5’−ACACTGTAATTGATGACCCCATTCT−3’(配列番号5);および
BRSV TaqMan(登録商標)MGBプローブ:5’−AAGACTTGTATGATGCTGCCAA−3’(配列番号6)
本研究の結果は、ウシ鼻気管炎−ウイルス下痢症−パラインフルエンザ3−呼吸器合胞体ウイルスワクチン修飾生ウイルスの修飾生ウシ呼吸器合胞体ウイルス(BRSV)分画が抗原性であり、そして若い食肉牛/肥育素牛におけるウシ呼吸器合胞体ウイルスの排出の予防の補助として有効であることを立証する。1用量のワクチンを22頭のBRSV血清陰性子ウシに投与した。11頭の血清陰性対照子ウシに産物マッチプラセボワクチン1用量をワクチン接種した。すべての子ウシをBRSVに鼻内曝露した。ワクチン接種は、増加したBRSV抗体力価増加を生じ、そして曝露後のBRSV排出を予防した。その結果、用量あたり7x102の最小BRSV−TCID50が、このワクチンのBRSV分画に関して確立されてきている
ワクチン接種および子ウシの曝露:33頭のBRSV陰性子ウシを選別路地中で混合した。CVB−Biometricsによって提供されるマッチセットランダム化スキームを用いることによって、各子ウシはランダムに集められる際にゲートで分けられ、3頭の子ウシが同時に、路地を通じて2つの群(群A−ワクチン接種、または群B−プラセボワクチン接種対照)の一方に分けられた。
血清中和抗体力価:本研究のすべての子ウシは、<1:2のワクチン接種前血清中和抗体力価を有した。ワクチン接種後、対照群のものに比較した際、ワクチン接種群では、血清中和抗体力価は有意に(p≦.05)大きかった。22頭のワクチン接種子ウシのうち21頭がワクチン接種後、BRSV力価の増加を示し、一方、11頭のプラセボワクチン接種対照すべてが、曝露前のワクチン接種期間全体で陰性のままであった。ワクチン接種群の平均抗体力価は8.5であり、一方、対照群の平均力価は<2であった。
先行する報告は、若い食肉牛/肥育素牛において、BRSVの排出予防における補助として、ウシ鼻気管炎−ウイルス下痢症−パラインフルエンザ3−呼吸器合胞体ウイルスワクチン修飾生ウイルスのBRSV分画の有効性を立証する。
1)ウイルス(BRSV)単離研究によって、1用量のワクチンの投与が、対照における100%感受性(11/11)に比較した際、ワクチン接種子ウシにおける86%(19/22)の防御を提供することが明らかになった(予防可能分率=0.8636)。
2)対照群に比較した際の、ワクチン接種群の排出頻度の有意な減少。対照子ウシは、ワクチン接種動物よりも、5,773日より長くBRSVを排出した。
3)対照群に比較した際のワクチン接種群のBRSVに対する抗体力価の有意な増加。
この実施例は、六価MLVワクチンのBHV−1ウイルス分画がIBRの予防に役立つことを実証する。
六価修飾した生ウイルスワクチンを上記のように調製する。つまり、BHV−1(Cooper株)、BVDV−1a(Singer株)、BVDV−1b(TGCA株)、BVDV−2(125)、PI3(Reisinger SF−4)、およびBRSV(N375)をTVL−BK細胞株(第20継代)中で増殖させる。個々の分画を第10継代で採取し、そして六種産物とともにブレンドした。BHV−1欠失プラセボを有効性シリーズと平行して作製する。BHV−1欠失プラセボは、有効性シリーズと同じBVDV−1a、BVDV−1b、BVDV−2、PI3およびBRSV採取バッチを含有する。BHV−1構成要素の代わりに培地を用いて、有効性シリーズおよびBHV−1欠失プラセボ間で同等の体積を維持する。滅菌希釈剤を使用してワクチンおよびBHV−1欠失プラセボの両方を再水和する。
子ウシのマッチランダム化スキームを用いて、子ウシを2つの処置群(ワクチン接種またはプラセボワクチン接種対照)に割り当てることができる。例えば、傾斜台に進入する一連の3頭の子ウシを、2:1の比で2つの処置群にランダム化する。血清学的評価のために、最初に血液を抜き取る際に、バケツからランダムに取った耳標を、子ウシを識別するために使用する。
ブラインド化された職員は、対照またはワクチン接種動物の識別の知識を持たず、すべての野外および実験室職員は、(記録者を除いて)研究の間、ブラインド化される。
この研究についての一次転帰は、IBRと関連する鼻病変の差である。これは鼻病変の存在または非存在として定義する。鼻病変の期間および重症度、鼻孔からのBHV−1の単離、および体温を含むIBRの他の臨床兆候は全て二次転帰とみなす。鼻病変スコア自体を、順序を示すカテゴリーとして評価する。IBRの目に見える鼻粘膜特徴の病変の期間および重症度の両方が評価のための基準として役立つ。呼吸器疾患および鼻排出の臨床的兆候もまた、曝露に対する耐性(影響を受けない)または感受性(影響を受ける)を決定するための基準として使用されてもよい。曝露前の平均温度(ベースライン)を共変量として用いて個体の毎日の直腸温度を定期的に分析する。研究の開始時に実験単位が2以上のBHV−1SN力価を有する場合、それらを研究から除外する。有効性シリーズまたはBHV−1欠失プラセボでのワクチン接種直前(第−28日から第−21日)に子ウシから血液試料を採取する。同様に血液試料を曝露の直前(第0日)および曝露の14日後(第14日)に再び採取する。
鼻試料を採取し、第0日〜第14日に目に見える鼻粘膜の病変およびIBRの臨床徴候について子ウシを観察する。第−2日〜第14日に各々の子ウシについて直腸温度を測定する。結果因子は、IBR、直腸温度、ウイルス単離、抗体力価およびIBRの臨床徴候と一致する目に見える鼻粘膜の病変を含む。IBRの肉視的鼻病変はRosner(1968)により記載されている。観察される典型的な病変としては、出血を伴う鼻腔の炎症および浮腫ならびに粘液内層に対するフィブロネクチン滲出物の付着が挙げられる。時々、壊死滲出物は下層組織から分離される偽膜性滲出物を生成する鼻腔内にその壊死滲出物は非常に広範に及ぶことがRosnerにより報告されている。Rosnerはまた、それらの病理学的所見がIBRの推定診断をするのに高度の信頼性を与えると報告している。鼻病変スコアは、確立された基準、およびワクチン接種が、病変が観測される期間に対する軽減効果を有するかどうかを実証するのに分析される期間データに従って割り当てられ得る。直腸温度評価、ウイルス単離、抗体力価、および統計的方法は以前の実施例に記載されている。IBRの臨床徴候は、Rosner(1968)により記載され、限定されないが、呼吸促迫、食欲不振、発熱、咳嗽、鼻汁、体重減少および病態が挙げられる。臨床徴候は、曝露の2日前、曝露の日、および曝露後14日間に記録される。IBRの臨床徴候の観察はデータの分析の間に考慮され得るが、それらの徴候はまた、商業的な子ウシに一般に見出される多くの他の呼吸器疾患の指標でもあり得るため、一次転帰とみなされない。
この研究の結果は、ウシ鼻気管炎の修飾された生ウシヘルペスウイルス−1(BHV−1)分画−ウイルス性下痢症−パラインフルエンザ3−呼吸器合胞体ウイルスワクチン、修飾された生ウイルスが、ウシ伝染性鼻気管炎(IBR)の減少に役立つ抗原性があり、有効であることを実証する。2用量のワクチンを22頭のBHV−1血清陰性子ウシに投与した。2用量の生成物に頭敵するプラシボワクチンを用いて12頭の血清陰性対照子ウシにワクチン接種した。全てのウシにBHV−1を鼻腔内に曝露した。ワクチン接種により、高いBHV−1抗体力価ならびにIBRと関連する鼻病変の期間および重症度の減少が生じた。ワクチン接種はまた、典型的に子ウシにおけるBHV曝露の後に続く排出および発熱反応の期間を減少させた。したがって、5×103/用量の最小のBHV−1 TCID50がこのワクチンのBHV−1分画について確立される。
子ウシのワクチン接種および曝露:34頭のBHV−1陰性子ウシを選別路地中で混合した。CVB−Biometricsによって提供されるマッチセットランダム化スキームを用いることによって、各々の子ウシをランダムに集める際にゲートで分け、3頭の子ウシが同時に、路地を通じて2つの群(群A−ワクチン接種、または群B−プラセボワクチン接種対照)の一方に分けた。21頭の子ウシを1用量のウシ鼻気管炎−ウイルス下痢症−パラインフルエンザ3−呼吸器合胞体ワクチン、修飾された生ウイルスでワクチン接種した。各ワクチン接種動物に、第0日、首の左側への皮下注射によって、2ml用量の産物を投与した。12頭の子ウシには、産物マッチプラセボワクチン(BHV−1欠失)をワクチン接種した。鼻スワブをBHV−1ウイルス単離のために採取し、血液をBHV−1に対する感受性の血清学的確認のために全ての子ウシから抜いた。13日目に、ワクチンおよび対照子ウシに、首の右側への皮下注射によって、2回目の2ml用量の有効性シリーズおよび産物マッチプラセボを与えた。曝露2日前、ワクチン接種および対照群の両方を、曝露前臨床観察の目的のため、そしてベースライン体温読み取りを得るために混合した。ワクチン接種および対照子ウシを、曝露15日後、USDA−APHIS−CVB、Coopers株、ロット番号05−08、充填日−2005年10月26日により提供される4ml(2ml/鼻孔)のBHV−1曝露ウイルスで2回目のワクチン接種をした。CVBにより曝露ウイルス力価を108.2TCID50/2mLであると決定した。曝露ウイルスを曝露直前に滴定し、108.0TCID50/4mLであると決定し、再び曝露直後に、107.4TCID50/4mLであると決定した。曝露ウイルスは曝露プロセスの間中、冷却を維持した。ワクチン接種の日、曝露の日、曝露14日後に血液試料を採取した。一定のウイルス減少血清中和法によってウシヘルペスウイルス抗体力価を決定した。ワクチン接種の日、曝露の日および曝露後連続して14日間、鼻スワブを採取した。各子ウシについて曝露前2日、曝露の日および曝露後連続して14日間、直腸温度を毎日記録した。臨床的観察を行い、鼻病変スコアを割り当てた。BHVにより引き起こされる肉視的病変は、S.F.Rosner,JAVMA Vol153,No.12,1968年12月,p.1631−1638に記載されている。観測される典型的な病変としては、出血を伴う鼻腔の炎症および浮腫ならびに粘液内層に対するフィブロネクチン滲出物の付着が挙げられる。時々、壊死滲出物が、下層組織から分離される偽膜性滲出物を形成する鼻腔にその壊死滲出物が非常に広範に及ぶことはRosnerにより報告されている。Rosnerはまた、それらの病理学的所見が、IBRの推定診断をする際に高度の信頼性を与えることを報告している。以下に記載した基準に従って鼻病変スコアを割り当てた:
フォワードプライマー:CCATGTTAGCGCTCTGGAACC(配列番号16)
リバースプライマー:CGTCTTTACGGTCGACGACTCC(配列番号17)
TaqMan MGBプローブ:ACGGACGTGCGCGAA(配列番号18)
を使用してBHV−1の存在/非存在について個々にアッセイした。社内でプローブ/プライマーセットの特異性を確認し、PI3、BRSV、BVDV1a、BVDV1bまたはBVDV2と交差反応しなかった。Applied Biosystems7500においてTaqman(登録商標)ベースのアッセイを使用してRTqPCRアッセイを実施した。BHV−1特異的CPE陽性であった全ての試料はまた、PCR陽性でもあった。PCRアッセイにより、BHV−1特異的CPEについて陰性であり、BHVについて陽性である8個の試料が存在した。これは、PCRベースのアッセイが、BHV−1特異的CPEの観察に基づいたアッセイよりわずかに高い感受性であることを示す社内での研究と一致する。最初の培養後にBHV−1について陰性であった試料を継代培養し、CPEについて観察した。継代培養した流体からの上清を、同じ方法に従ってBHV−1の存在/非存在についてアッセイした。
血清中和抗体力価:この研究において全ての子ウシはワクチン接種前に1:2未満のBHV−1血清中和抗体力価を有した。対照群における全ての12頭の子ウシは依然として曝露の日に血清陰性であった(1:2未満の抗体力価)。22頭の子ウシのうち21頭は、曝露の日までに1:2以上の力価を有する血清変換を有した(1:4の群平均力価)。曝露後14日までに全ての子ウシはBHV−1に対する血清変換を有した(平均ワクチン接種力価>256、平均対照力価128)。
先行の報告は、若い食肉牛/肥育素牛におけるBHV−1に起因する疾患の減少に役立つ、BHV−1分画のウシ鼻気管炎−ウイルス性下痢症−パラインフルエンザ3−呼吸器合胞体ウイルスワクチン、修飾された生ウイルスの有効性を実証する。この組み合わせた生成物のBHV−1分画の有効性および抗原性は以下により証明される:
1)対照群と比較してワクチン接種した群における鼻病変の重症度および期間の減少。
2)対照群と比較してワクチン接種した群における発熱の減少。
3)対照群と比較してワクチン接種した群のBHV−1に対する血清変換。
この実施例は、六価MLVワクチンのPI3分画がPI3により引き起こされる疾患の予防に役立つことを実証する。
六価の修飾された生ウイルスワクチンは上記のように調製する。PI3欠失プラセボは有効性シリーズと共に生成する。PI3欠失プラセボは、有効性シリーズとして同じBHV−1、BVDV−1b、BVDV−2、BVDV−1a、およびBRSV収集バッチを含む。培地は、有効性シリーズとPI3欠失プラセボとの間で等体積を維持するためにPI3成分と置き換える。滅菌希釈剤を使用して、ワクチンおよびPI3欠失プラセボの両方を再水和する。
子ウシのマッチランダム化スキームを用いて、子ウシを2つの処置群(ワクチン接種またはプラセボワクチン接種対照)に割り当てる。例えば、傾斜台に進入する一連の3頭の子ウシを、2:1の比で2つの処置群にランダム化できる。血清学的評価のために、最初に血液を抜き取る際に、バケツからランダムに取った耳標を、子ウシを識別するために使用する。
この研究についての一次転帰は、曝露後のPI3ウイルスの鼻排出の予防である。これは研究過程の間に全ての子ウシの鼻孔から毎日採取した鼻試料中のPI3の存在または非存在により決定される。他の予測される二次転帰は、PI3を排出する子ウシにおけるPI3感染の減少した臨床徴候、発熱の減少および排出器官の減少を含む。実験単位は、それらが研究の開始時に2以上のPI3力価を有する場合、この研究から除外する。
有効性シリーズまたはPI3欠失プラセボのワクチン接種直前(−28日〜−21日)に子ウシから血液試料を収集する。曝露直前に(0日)および再び曝露14日後(14日)に血液試料をまた収集する。示差WBC数用の血液試料を、第−2日〜少なくとも第14日まで収集する。全ての試料をEDTA Vacutainer(登録商標)管中に収集し、Drew Scientific、Hemavet950示差WBC計数装置を使用して計数を実施する。第−2日〜少なくとも第14日に鼻スワブをウイルス単離のために採取する。ワクチン接種および対照群によるPI3の排出を、曝露後14日間、毎日決定する。PI3の検出は、曝露に対する耐性(影響を受けていない)または感受性(影響を受けた)を決定するための一次基準として役立つ。PI3曝露後にワクチン接種がPI3の排出を予防するかどうかを決定するために影響を受けた群と影響を受けていない群を比較する。呼吸器疾患の臨床徴候は、曝露に対する感受性または耐性を決定するための二次基準として役立つ。ワクチン接種がこのパラメータに対して軽減した作用を有するかどうかを決定するために排出期間(PI3が個々のウシから検出された日数)を分析する。共変量として曝露前の平均温度(ベースライン)を使用して全ての個体の毎日の直腸温度を分析する。
この研究の結果は、ウシ鼻気管炎の修飾された生ウシパラインフルエンザ3ウイルス(PI3)分画−ウイルス性下痢症−パラインフルエンザ3−呼吸器合胞体ウイルスワクチン、修飾された生ウイルスが、食肉牛/肥育素牛におけるウシパラインフルエンザ3ウイルスの排出の予防に役立つ抗原性があり、有効であることを実証する。20頭のPI3血清陰性子ウシに2用量のワクチンを投与した。10頭の血清陰性対照子ウシを、産物マッチプラセボワクチンでワクチン接種した。全ての子ウシにPI3を鼻内に曝露した。ワクチン接種により、曝露後、増加したPI3抗体力価および予防されたPI3排出が生じた。従って、6×104/用量の最小PI3−TCID50をこのワクチンのPI3分画について確立した。
子ウシのワクチン接種および曝露:三十(30)頭のPI3陰性子ウシを選別路地中で混合した。マッチセットランダム化スキームを用いることによって、各子ウシはランダムに集められる際にゲートで分けられ、3頭の子ウシが同時に、路地を通じて2つの群(A群−ワクチン接種またはB群−プラセボワクチン接種対照)の一方に分けられた。21頭の子ウシを1用量のウシ鼻気管炎−ウイルス下痢症−パラインフルエンザ−3−呼吸器合胞体枠林、修飾した性ウイルスでワクチン接種した。各ワクチン接種動物に、0日、首の左側への皮下注射によって、2ml用量の産物を投与した。10頭の子ウシには、産物マッチプラセボワクチン(PI3欠失)をワクチン接種した。PU3ウイルス単離のために鼻スワブを収集し、PI3に対する感受性の血清学的確認のために全ての子ウシから血液を抜き取った。25日に、ワクチン接種した子ウシおよび対照子ウシに、首の右側への皮下注射によって、2回目の2ml用量の有効性シリーズおよび産物マッチプラセボを与えた。曝露2日前、ワクチン接種および対照群の両方を、曝露前臨床観察の目的のため、およびベースライン体温読み取り値を得るために混合した。ワクチン接種した子ウシおよび対照子ウシを、2回目のワクチン接種の15日後に、USDA−APHIS−CVB、Reisinger株、ロット番号05−07、充填日2005年6月26日により提供される4ml(2ml/鼻孔)のPI3曝露ウイルスで曝露した。曝露ウイルス力価をCVBにより108.2TCID50/2mLであると決定した。曝露直前に曝露ウイルスを滴定し、108.3TCID50/4mLであると決定し、再び曝露直後に108.2TCID50/4mLであると決定した。曝露プロセスの間中、曝露ウイルスを冷却して維持した。
フォワードプライマー:GGAGACCAAGACCAAGGAGATG(配列番号13)
リバースプライマー:CGTCTGCCCATGCATAAGG(配列番号14)
TaqMan MGBプローブ:ACCTCGGTCATCCATAG(配列番号15)
を使用してBHV−1の存在/非存在について個々にアッセイした。
血清中和抗体力価:本研究のすべての子ウシは、<1:2のワクチン接種前PI3血清中和抗体力価を有した。ワクチン接種した子ウシのどれも、ワクチンに対する既往の免疫反応を示さなかった。曝露日までに、ワクチン接種群は、1:16の平均PI3力価を有し、これは対照群<1:3のものより有意に(p≦.05)大きかった。この研究過程の間、対照群の1頭の子ウシ、子ウシ7は1:16の力価を発生した。この子ウシはまた、曝露に対する既往反応を示し、曝露後6日に1:128の力価を有した。他の9頭の対照子ウシは曝露の日に血清陰性であり、曝露に対する既往反応を示さなかった。
以前の報告は、若い食肉牛/肥育素牛のPI3の排出の予防に役立つとしてPI3分画ウシ鼻気管炎−ウイルス下痢症−パラインフルエンザ3−呼吸器合胞体ウイルスワクチン、修飾生ウイルスの効果を実証している。
1)ウイルス(PI3)単離研究により、2ワクチンの用量の投与が、対照(予防可能な分画=0.80)における100%(10/10)感受性と比較して、ワクチン接種した子ウシにおいて80%(16/20)防御を与えたことが明らかになった。
2)対照群と比較してワクチン接種した群のPI3に対する抗体力価の顕著な増加。
この実施例は、六価MLVワクチンのBVDV2型分画が、BVDV−2により引き起こされる疾患の予防に役立つことを実証する。
六価修飾生ウイルスワクチンを上記のように調製する。BVDV−2欠失プラセボを有効性シリーズと共に生成する。BVDV−2欠失プラセボは、有効シリーズとして同じBHV−1、BVDV−1b、BVDV−1a、PI3およびBRSV収集バッチを含有する。有効性シリーズとBVDV−2欠失プラセボとの間の等体積を維持するために培地をBVDV−2成分と置き換える。滅菌希釈剤を使用して、ワクチンおよびBVDV−2欠失プラセボの両方を再水和する。
ランダム化、ブラインド化、および転帰を実施例10に記載する。
有効性シリーズまたはBVDV−2欠失プラセボのワクチン接種直前(第−28日〜第−21日)、子ウシから血液試料を収集する。曝露直前に(第0日)、そして再び、曝露14日後(第14日)、血液試料をまた収集する。示差WBC数用の血液試料を、第−2日〜少なくとも第14日まで収集する。全ての試料をEDTA Vacutainer(登録商標)管中に収集し、Drew Scientific,Hemavet950示差WBC計数装置を使用して計数を実施する。ウイルス単離用の鼻スワブを第−2日〜少なくとも第14日に単離する。
この研究の結果により、ウシ鼻気管炎の修飾生ウシ・ウイルス性下痢症ウイルス−2型(BVDV2)分画−ウイルス性下痢症−パラインフルエンザ3−呼吸器合胞体ウイルス、修飾生ウイルスは抗原性であり、BVDV2により引き起こされる疾患の予防に役立つことが実証される。1用量を20頭のBVDV血清陰性子ウシに投与した。10頭の血清陰性対照子ウシに、1用量の産物マッチプラセボワクチンをワクチン接種した。全ての子ウシにBVDV2(株1373)を鼻腔内に曝露した。ワクチン接種により、高いBVDV2抗体力価(<2の平均〜24)、曝露後の低い死亡率(7/10の対照の死、0/20のワクチン接種した死)が得られた。したがって、3×103TCID50/用量の最小のBVDV2−TCID50を、このワクチンのBVDV2分画について確立する。
この実施例は、六価MLVワクチンのBVDV1a型分画が、BVDV−1aにより引き起こされる疾患の予防に役立つことを実証する。
六価修飾生ウイルスワクチンを上記のように調製する。BVDV−1a−欠失プラセボを有効性シリーズと共に生成する。BVDV−1a欠失プラセボは、有効性シリーズとして同じBHV−1、BVDV−1b、BVDV−2、PI3およびBRSV収集バッチを含有する。有効性シリーズとBVDV−1a欠失プラセボとの間で同等の体積を維持するために培地をBVDV−1a成分と置き換える。滅菌希釈物を使用して、ワクチンおよびBVDV−1a欠失プラセボの両方を再水和する。約3〜4ヶ月齢の商業的な若い食肉牛/肥育素牛を上記のようにランダム化し、次いで駆虫し、パスツレラ病、マイコプラズマ病および黒脚病に対してワクチン接種する。全ての子ウシは、水、沿岸性バミューダ乾草、および抗コクシジウム剤を含有するが、抗生物質を含有しないペレット状餌配給に自由選択でアクセス可能であった。子ウシに給餌した後、干し草利用可能性は後で制限できる。約20頭以上のワクチン接種子ウシおよび10頭以上の対照子ウシをこの単一レベルの研究に使用する。曝露前に2群の子ウシを別であるが、同等の囲いに維持する。次いで子ウシを曝露の2日前(第−2日)に1つの囲いに混合する。
子ウシのマッチしたランダム化スキームを使用して、子ウシを2つの処置群(ワクチン接種またはプラセボワクチン接種した対照)に割り当てることができる。例えば、傾斜台に進入する一連の3頭の子ウシを、2:1の比で2つの処置群にランダム化できる。血清学的評価のために、最初に血液を抜き取る際に、バケツからランダムに抜き取った耳標を使用して子ウシを識別する。
ブラインド化された職員は、対照またはワクチン接種動物の同一性の知識を持たなかった。すべての野外および実験室職員(記録者を除く)は、研究の期間、ブラインド化される。
一次転帰は曝露後の白血球減少症である。白血球減少症はベースラインWBC数から25%減少と定義する。ワクチンの効果をさらに支持する他の転帰には、鼻排出、ウイルス血症、発熱、抗体産生およびBVDVの臨床徴候が含まれる。実験単位が研究の開始時にBVDV−1力価≧2を有する場合、この研究から排除する。
有効性シリーズまたはBVDV欠失プラセボのワクチン接種直前(第−28日〜第−21日)、子ウシから血液試料を収集する。曝露直前に(第0日)、そして再び、曝露14日後(第14日)、血液試料をまた収集する。示差WBC数用の血液試料を、第−2日〜少なくとも第14日まで収集する。全ての試料をEDTA Vacutainer(登録商標)管中に収集し、Drew Scientific,Hemavet950示差WBC計数装置を使用して計数を実施する。ウイルス単離用の鼻スワブを第−2日〜少なくとも第14日に単離する。
この研究の結果は、ウシ鼻気管炎の修飾生ウイルスウシ・ウイルス性下痢症ウイルス−1a型(BVDV1a)分画−ウイルス性下痢症−パラインフルエンザ3−呼吸器合胞体ウイルスワクチン、修飾生ウイルスが、抗原性で、有効性である、BVDV1aにより引き起こされる感染の予防に役立つことを実証する。ワクチンの1用量を20頭のBVDV血清陰性子ウシに投与した。10頭の血清陰性対照子ウシに、1用量の産物マッチプラセボワクチンをワクチン接種した。全ての子ウシにBVDV1aを鼻孔内に曝露した。ワクチン接種により、高いBVDV1a抗体力価が得られ、BVDV1aにより誘発されるウイルス血症、鼻排出、発熱、リンパ球減少症および白血球減少症を予防または減少させた。したがって、5×103TCID50/用量の最小BVDV1a−TCID50を、このワクチンのBVDV1a分画について確立する。
ワクチン接種、曝露および試料採取:30頭のBVDV陰性子ウシを選別路地中で混合した。各子ウシはランダムに集められる際にゲートで分けられ、3頭の子ウシが同時に、CVB−Biometricsにより提供されるマッチしたセットランダム化スキームを使用することによって、路地を通じて2つの群(群A−ワクチン接種、または群B−プラセボワクチン接種対照)の一方に分けられた。
フォワードプライマー:GGTCGCCCAGGTAAAAGCA(配列番号7)
リバースプライマー:GCCTCTGCAGCACCCTATCA(配列番号8)
TaqMan MGBプローブ:AACCGACTGTTACGAATAC(配列番号9)
を使用してBVDV1aの存在/非存在について個々にアッセイした。
血清中和抗体力価:この研究における全ての子ウシは、ワクチン接種前に<1:2のBVDV(BVDV1a、BVDV1bおよびBVDV2)血清中和抗体力価を有した。曝露の日(第21日)までに、ワクチン接種群は、1:21の平均BVDV1a力価を有し、これは対照群<1:2のものより有意(p≦0.5)であった。対照子ウシおよびワクチン接種子ウシの両方における曝露後14日のBVDV1a抗体力価は増加し、子ウシがBVDV1aで曝露されたことを示す。
上記の報告により、BVDV1aにより引き起こされる感染の予防に役立つ、BVDV1a分画ウシ鼻気管炎ウイルス−ウイルス性下痢症−パラインフルエンザ3−呼吸器合胞体ウイルスワクチン、修飾生ウイルスの抗原性および有効性が実証される。この混合した産物のBVDV1a分画の抗原性および有効性を以下により証明する:
1)対照群と比較してワクチン接種群におけるBVDV1aに対する抗体力価の有意な増加。ワクチン接種群における20頭の子ウシのうちの19頭は、2ml用量ワクチンの投与後、BVDV1a力価≧1:8を発生し、これは9CFR113.311(c)(5)に定義された必要性を満たす。
2)ウイルス単離研究により、1用量の投与が、曝露後のウシにおいてBVDV1aにより誘発される鼻排出およびウイルス血症を減少させることが明らかにされた。
3)ワクチン接種子ウシは、対照子ウシと比較して、有意に低い熱を示した。
4)ワクチン接種はまた、曝露後のウシにおいてBVDV1aにより誘発されるリンパ球減少症および白血球減少症を減少させた。
「Compositions and Methods for Identifying and Differentiating Viral Components of Multivalent Shipping Fever Vaccines」という発明の名称の同時係属の米国仮特許出願第61/427,404号(2010年12月27日において本願と同時に出願され、その全体は本明細書に参照することにより具体的に組み込まれる)において、本発明者らは、多価ワクチンにおける個々のウイルス成分の各々の直接ウイルス定量(すなわち「有効性」)を得るのに有用な修飾された遺伝子ベースのアッセイプロトコルの開発を報告した。本発明は、従来のFA/IFAアッセイ(現在のSAM101アッセイに記載されているものなど)をRT−qPCRアッセイと置き換えて、個々のアッセイウェル(すなわち希釈物)における特定のウイルス種、型、または亜種の存在または非存在を測定する。
細胞培養
従来の技術、およびFreshney(1987)に記載されている供給物を使用して全ての培養物を調製する。培養物中の典型的な上皮様形態を示す、TVL−ウシ腎臓細胞株を全ての培養アッセイに使用する。
RNAを、以下の米国農務省(USDA)により承認されたウイルス種:BVDV−1a(Singer株)、BVDV−1b(TGAC株)、BVDV−2(125)、PI3(Reisinger SF−4)、およびBRSV(N375)(抽出プロセスはBHV−1[銅株]において実施しない。なぜならそれらはDNAウイルスだからである)の各々由来のウイルス流体から抽出する。RNAqueous(登録商標)−4PCR(Ambion;Austin,TX,USA)を使用して抽出を実施する。
Applied Biosystems7500リアルタイムPCRシステムを使用してqPCRアッセイを実施する。
以下の慣用のTaqMan(登録商標)プローブおよびウイルス特異的フォワードおよびリバースプライマー対をApplied Biosystems(Foster City,CA,USA)により作製した。
フォワードプライマー:5’−CACCCTATCAGGCTGTATTCATAGC−3’(配列番号1);
リバースプライマー:5’−TGCCCACAGCACATCTTAACC−3’(配列番号2);および
BVDV−1b TaqMan(登録商標)MGBプローブ:5’−TCACCTGGACGACCC−3’(配列番号3)。
第2のフォワードプライマー:5’−GTCGTCCAGGTGAAAACGGT−3’(配列番号19);
第2のリバースプライマー:5’−GTCGTCCAGGTGAAAACGGT−3’(配列番号20);および
第2のBVDV−1b検出プローブ:5’−GTCGTCCAGGTGAAAACGGT−3’(配列番号21)。
フォワードプライマー:5’−GCAATGCTGCAGGACTAGGTATAAT−3’(配列番号4);
リバースプライマー:5’−ACACTGTAATTGATGACCCCATTCT−3’(配列番号5);および
BRSV TaqMan(登録商標)MGBプローブ:5’−AAGACTTGTATGATGCTGCCAA−3’(配列番号6)。
フォワードプライマー:5’−GGTCGCCCAGGTAAAAGCA−3’(配列番号7);
リバースプライマー:5’−GCCTCTGCAGCACCCTATCA−3’(配列番号8);および
BVDV−1a TaqMan(登録商標)MGBプローブ:5’−AACCGACTGTTACGAATAC−3’(配列番号9)。
フォワードプライマー:5’−GCTAGCCATGCCCTTAGTAGGAC−3’(配列番号10);
リバースプライマー:5’−GACGAGTCCCCTGTACTCAGG−3’(配列番号11);および
BVDV−2 TaqMan(登録商標)プローブ:5’−CAGTGAGTCCATTGGATGG−3’(配列番号12)。
フォワードプライマー:5’−GGAGACCAAGACCAAGGAGATG−3’(配列番号13);
リバースプライマー:5’−CGTCTGCCCATGCATAAGG−3’(配列番号14);および
PI3TaqMan(登録商標)プローブ:5’−ACCTCGGTCATCCATAG−3’(配列番号15)。
フォワードプライマー:5’−CCATGTTAGCGCTCTGGAACC−3’(配列番号16);
リバースプライマー:5’−CGTCTTTACGGTCGACGACTCC−3’(配列番号17);および
BHV−1 TaqMan(登録商標)MGBプローブ:5’−ACGGACGTGCGCGAA−3’(配列番号18)。
以下のアッセイの各々についてのプロトコルは、力価プレートの個々のウェルが等価の基準ウェルより多量のウイルスを含有するかどうかを決定するために、Applied Biosystems7500比較閾値サイクル(CT)方法を利用する。ほとんどのウイルス試料はPCRアッセイにより検出できるいくらかの非生存ウイルス粒子を含有するので、潜在的に偽陽性結果を与える。この問題は細胞を含まない基準プレートの使用により解決される。試料は、ウイルス複製についての可能性を排除するために細胞を含まないが、アッセイプレートにおけるように、基準プレート中で正確に希釈される。各アッセイにおけるウェルの各々についてベースラインまたはバックグランドCT値を生成するために基準プレートが使用される。アッセイプレートにおけるウェルがより高い。アッセイプレートにおけるウェルが対応するバックグランドウェルより高いCT値を有する場合、ウイルス複製が生じ、ウェルは陽性であるとみなされる。ウェルについてのCT値を測定しない場合、またはCT値がバックグランドCT値と等しい場合、ウェルは陰性であるとみなされる。
IBR/BVDV−1a、−1b、−2/PI3/RSV六価ワクチン、修飾生ウイルアスのパイロットシリーズを本明細書に記載されるように調製した。手短に述べると、BHV−1(Cooper株)、BVDV−1a(Singer株)、BVDV−1b(TGAC株)、BVDV−2(125)、PI3(Reisinger SF−4)、およびBRSV(N375)をTVL−BK細胞株(第20継代)中で増殖させた。六種ワクチンの各分画についての有効性試験を、適切な中和抗血清を加えることにより本明細書に記載されるように実施できる。各々のウイルス分画のTCID50を、CPE/FA/IFA結果に基づいて決定し、RT−qPCR/qPCRに基づいたものと皮革する。
一価BVDV−1a、BVDV−1bおよびBVDV−2試料は、ワクチン(SAM101)中のウシ・ウイルス性下痢症ウイルスの滴定のための捕捉アッセイ法に従って別々に滴定できる。手短に述べると、アッセイを二連で実施し、プレートの1つを上記のようにCPEおよび/またはFA/IFAに基づいた力価計算のために使用する。もう1つのプレートはRT−qPCRに基づいた力価を測定するために使用する。細胞欠損基準プレートはウイルスの各々について上記のように含まれる。
PI3についての有効性試験を二連で実施し、プレートの1つはCPEに基づいた力価計算のために使用する。もう1つのプレートは、RT−qPCRにより測定されるようにPI3の比較CT値に基づいた力価を測定するために使用する。細胞欠損基準プレートは上記のように含まれる。
BRSVについての有効性試験を二連で実施し、プレートの1つは上記のようにCPEに基づいた力価計算のために使用し、残りのプレートは、RT−qPCRにより測定されるBRSVの比較CT値に基づいた力価を決定するために使用する。上記に説明したように、細胞欠損基準プレートもまた、このアッセイに含まれる。
BHVについての有効性試験を、従来の視覚観察を個々のウェルのqPCR分析に置き換え、プラークを計数することにより、96ウェルフォーマットにおいて実施する。このアッセイは二連で実施し、プレートの1つは、個々のウェル(希釈物)中のCPEの存在または非存在に基づいた力価計算のために使用し、一方で、残りのプレートは、QPCRにより測定されるようにBHVの比較CT値に基づいて力価を計算するために使用する。細胞欠損プレートは上記のように含まれる。
以下の参考文献は、それらが例示的な手順または本明細書に記載されるものに対する他の詳細な補足を与える程度に、それらの全体が本明細書に参照することにより本明細書に具体的に組み込まれる。
Caruthersらによる米国特許出願第4,415,732号
Caruthersらによる米国特許出願第4,458,066号
Mullisらによる米国特許出願第4,683,195号
Mullisらによる米国特許出願第4,683,202号
Kosterらによる米国特許出願第4,725,677号
Caruthersらによる米国特許出願第4,973,679号
Molkoらによる米国特許出願第4,980,460号
Piconeらによる米国特許出願第5,614,388号
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Claims (19)
- 修飾生ウシ・ウイルス性下痢症ウイルス1b型(BVDV−1b)、および獣医学的に許容可能な担体を含む、免疫原性組成物であって、前記修飾生BVDV−1bがATCC寄託番号PTA−11553で寄託される株である、免疫原性組成物。
- 該修飾生ウシ・ウイルス性下痢症ウイルスが細胞変性BVDV−1bウイルスである、請求項1に記載の免疫原性組成物。
- 修飾生パラインフルエンザウイルス3型(PI3)、
修飾生ウシ呼吸器合胞体ウイルス(BRSV)、
修飾生ウシヘルペスウイルス(BHV−1)、
修飾生ウシ・ウイルス性下痢症ウイルス1a型(BVDV−1a)、または
修飾生ウシ・ウイルス性下痢症ウイルス2型(BVDV−2)
の1種以上をさらに含む、請求項1に記載の免疫原性組成物。 - 免疫学的に有効量の少なくとも1つのさらなる抗原をさらに含む、請求項1に記載の免疫原性組成物であって、前記少なくとも1つのさらなる抗原が、アクチノバチルス(Actinobacillus)、アクチノマイセス(Actinomyces)、バチルス(Bacillus)、ボルデテラ(Bordetella)、ブラキスピラ(Brachyspira)、カンピロバクター(Campylobacter)、クロストリジウム(Clostridium)、エーリキア(Ehrlichia)、エリジペロトリックス(Erysipelothrix)、エシェリキア(Escherichia)、ヒストフィルス(Histophilus)、レプトスピラ(Leptospira)、リステリア(Listeria)、マンヘミア(Mannheimia)、モラクセラ(Moraxella)、マイコバクテリウム(Mycobacterium)、マイコプラズマ(Mycoplasma)、パスツレラ(Pasteurella)、サルモネラ(Salmonella)、およびストレプトコッカス(Streptococcus)からなる群から選択される生物に特異的である、免疫原性組成物。
- 該少なくとも1つのさらなる抗原が不活性化された微生物病原体である、請求項4に記載の免疫原性組成物。
- 非ヒト哺乳動物におけるウシ・ウイルス性下痢症ウイルス1b型(BVDV−1b)特異的免疫反応を誘発する方法であって、請求項1に記載の免疫原性組成物を該非ヒト哺乳動物に投与する工程を含み、前記組成物が、用量あたり少なくとも2x103 TCID50の修飾生BVDV−1bを含む、方法。
- 該組成物が予防的に該非ヒト哺乳動物に投与される、請求項6に記載の方法。
- 非ヒト動物における輸送熱を予防する方法であって、請求項1に記載の免疫原性組成物を該非ヒト動物に投与する工程を含み、前記組成物が、用量あたり少なくとも2x103 TCID50の修飾生BVDV−1bを含む、方法。
- 該非ヒト動物が、ペスチウイルスにより感染されているか、またはペスチウイルスからの感染に感受性がある、請求項8に記載の方法。
- 該非ヒト動物がウシである、請求項8に記載の方法。
- ペスチウイルス感染に感受性がある非ヒト動物においてペスチウイルスにより引き起こされる疾患の1つ以上の症状を予防、処置、管理、または改善する方法であって、請求項1に記載の免疫原性組成物を該非ヒト動物に投与する工程を含み、前記組成物が、用量あたり少なくとも2x103 TCID50の修飾生BVDV−1bを含む、方法。
- 該組成物が、ウシロタウイルス、BRSV、BHV−1、ウシコロナウイルス、PI3、ウシパラミクソウイルス、口蹄疫ウイルス、BVDV−1a、BVDV−2、マンヘモア・ヘモリチカ(Mannheimia haemolytica)A1型、マンヘモア・ヘモリチカ(Mannheimia haemolytica)A6型、パスツレラ・ムルトシダ(Pasteurella multocida)、ヒストフィルス・ソムニ(Histophilus somni)、およびマイコプラズマ・ボビス(Mycoplasma bovis)の1種以上に由来する免疫原をさらに含む、請求項11に記載の方法。
- 該非ヒト動物がウシである、請求項11に記載の方法。
- BVDV−1bにより引き起こされる疾患に対して非ヒト動物を予防する方法であって、請求項1に記載の免疫原性組成物を該非ヒト動物に投与する工程を含み、前記組成物が、用量あたり少なくとも2x103 TCID50の修飾生BVDV−1bを含む、方法。
- ウシ鼻気管炎ウイルス、ウシ呼吸器合胞体ウイルス、もしくはパラインフルエンザ3ウイルス、またはそれらの組み合わせの同時投与をさらに含む、請求項14に記載の方法。
- 該疾患が、輸送熱、ウシ呼吸器病症候群、またはウシ・ウイルス性下痢症である、請求項14に記載の方法。
- 請求項1に記載の免疫原性組成物およびアジュバントを含むワクチンであって、前記免疫原性組成物が、用量あたり少なくとも2x103 TCID50の修飾生BVDV−1bを含む、ワクチン。
- 免疫学的有効量の少なくとも1つの不活性化された微生物病原体をさらに含む、請求項17に記載のワクチン。
- 用量あたり少なくとも5x103 TCID50の修飾生BHV−1、
用量あたり少なくとも5x103 TCID50の修飾生BVDV−1a、
用量あたり少なくとも3x103 TCID50の修飾生BVDV−2、
用量あたり少なくとも6x104 TCID50の修飾生PI3、および
用量あたり少なくとも7x102 TCID50の修飾生BRSV
の1種以上をさらに含む、請求項17に記載のワクチン。
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