CN107970443A - 牛病毒性腹泻病毒e2蛋白亚单位疫苗组合物及其制备方法和应用 - Google Patents

牛病毒性腹泻病毒e2蛋白亚单位疫苗组合物及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种牛病毒性腹泻病毒E2蛋白亚单位疫苗组合物及其制备方法和应用，属于动物疫苗与兽用生物制品技术领域。该疫苗组合物包括两种亚型以上牛病毒性腹泻病毒E2蛋白和药学上可以接受的佐剂。制备该疫苗组合物包括以下步骤：1)准备水相和油相，水相和油相的体积比为46:55；2)将水相和油相预热到33℃±1℃；3)先将油相加到容器中，调整好搅拌器的高度和速度，在搅拌的过程中将水相加到油相中，继续搅拌10min～20min；4)将3)步骤乳化好的疫苗组合物置于20℃静置1h；5)将4)中疫苗组合物置于4℃静置24h；6)将5)中的疫苗组合物分装、贴标。该疫苗组合物能够保护不同亚型牛病毒性腹泻病毒的感染，且制备简单、使用量小。

Description

牛病毒性腹泻病毒E2蛋白亚单位疫苗组合物及其制备方法和 应用
技术领域
本发明涉及一种牛病毒性腹泻病毒E2蛋白亚单位疫苗组合物及其制备方法和应用，属于动物疫苗与兽用生物制品技术领域。
背景技术
牛病毒性腹泻(Bovine viral diarrhea,BVD)又称牛黏膜病(Mucosal diaease,MD)是由病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)引起的，临床表现为腹泻、高热、繁殖障碍、免疫抑制、持续性感染和严重的黏膜发炎，糜烂、坏死为特征的疾病。BVDV属于黄病毒科瘟病毒属。该病最早于1946年发现于美国，后呈爆发式全球流行。在美国、英国、德国、瑞士、澳大利亚、印度、日本等多个养牛大国广泛流行传播。1983年我国首次有报道该病发生，目前在全国已有20多个省、市、自治区存在BVD。2008年，中华人民共和国农业部发布第96号公告，将牛病毒性腹泻定义为三类疫病；世界动物卫生组织也将该病列为法定报告的动物疫病及动物胚胎交流病原名录三类疫病。该病流行范围很广，除牛外，还能感染羊、骆驼、鹿和袋鼠，甚至还有感染人的报道。BVDV主要通过消化道和呼吸道感染动物，既能水平传播也能垂直传播，大多数呈持续性感染(PI)，且免疫抑制容易继发感染黏膜病，死亡率高达100％。这给全世界的养牛业造成了严重的经济损失。
BVDV基因组为单股正链RNA，全长约12.5Kb，仅含有一个能编码约4000个氨基酸多聚蛋白的ORF，多聚蛋白经翻译和加工后，可形成11种成熟的蛋白，其中C、Erns、E1、E2是病毒的结构蛋白。E2是BVDV的囊膜蛋白，免疫原性最强，能同时诱导机体产生体液免疫和细胞免疫，并产生中和抗体，因此是制备检测抗原和疫苗的首选基因。
BVDV只有一种血清型，其与猪瘟病毒和羊边界病毒同属黄病毒科瘟病毒属，三者有较高的同源性，血清学有交叉反应。根据基因组5’-UTR、E2等区段的不同，分为BVDV-1型和BVDV-2型。2001年vileek(et al.,Bovine viral diarrhoea virusgenotype 1 can be separated into at least eleven genetic groups.Archives ofvirology,2001.146(1):p.99-115)等根据5’-UTR和Npro(P20)基因的核苷酸序列又将BVDV-1型分为11个亚群，BVDV-1a-1j群和鹿群，其中BVDV-1a和BVDV-1b已经遍布北美和欧洲。我国关于BVDV分子流行病学、基因分析以及系统发育分析的研究相对较少。王新平等将分离得到的毒株归为BVDV-1a亚型和BVDV-1b亚型；任敏从新疆、青海和山东的病料中分离出BVDV-2型病毒。即在我国，存在BVDV-1a亚型、1b亚型和BVDV-2型病毒的感染。但是，目前未见有关一种亚型的牛病毒性腹泻病毒或其E2蛋白能够交叉保护其他分型的病毒感染。且本实验室使用DNAstar软件分析BVDV E2蛋白序列，结果显示，BVDV E2蛋白各亚型之间序列差异较大，同源性不高，详细结果如附图1所示。因此，研究一种能够同时保护不同亚型的牛病毒性腹泻病毒感染的疫苗是目前研究的一个方向和重点。
本发明提供了一种能够同时保护牛免受不同分型的牛病毒性腹泻病毒感染的亚单位疫苗的组合物。该组合物能够保护牛免受不同分型的牛病毒性腹泻病毒的感染，且该组合物制备简单、使用量小。这对我国乃至世界范围内牛病毒性腹泻病毒的预防控制可以发挥重要作用。
发明内容
本发明要解决的技术问题是牛病毒性腹泻病毒不同亚型毒株之间的交叉保护差，一种亚型的疫苗不能同时保护牛免受不同亚型毒株的感染
本发明提供了一种能够同时保护牛免受不同亚型的牛病毒性腹泻病毒感染的亚单位疫苗的组合物。该组合物包括两种亚型以上牛病毒性腹泻病毒E2蛋白和药学上可以接受的佐剂。
本发明的技术方案中，优选的，所述不同亚型的牛病毒性腹泻病毒E2蛋白选自BVDV GS5 1a型-E2、BVDV JL-1 1b型-E2和BVDV XJ-04 2型-E2中的至少一种。
本发明的技术方案中，优选的，所述组合物还含有免疫增强剂。
本发明的技术方案中，优选的，所述组合物还含有防腐剂。
本发明的技术方案中，优选的，所述不同亚型的牛病毒性腹泻病毒E2蛋白按照等质量比混合。
本发明的技术方案中，优选的，所述不同亚型的牛病毒性腹泻病毒E2蛋白混合后蛋白总浓度为50μg/头份～200μg/头份。
本发明的技术方案中，所述免疫增强剂可以为CpG DNA或干扰素等，优选的，免疫增强剂为Quil-A，所述Quil-A的浓度为500μg/头份～750μg/头份。
本发明的技术方案中，所述防腐剂可以为汞类防腐剂，优选的，所述防腐剂为硫柳汞，所述硫柳汞的含量为每头份疫苗组合物中低于0.01％。
本发明的技术方案中，所述佐剂可以为水佐剂，如铝胶佐剂等，也可以为油佐剂如白油、ISA 206 VG等，优选的，所述佐剂为ISA 201 VG。
本发明还提供了一种制备该疫苗组合物的方法，包括以下步骤：1)准备水相和油相，水相和油相的体积比为46:55；2)将水相和油相预热到33℃±1℃；3)先将油相加到容器中，调整好搅拌器的高度和速度，在搅拌的过程中将水相加到油相中，继续搅拌10min～20min；4)将3)步骤乳化好的疫苗组合物置于20℃静置1h；5)将4)中疫苗组合物置于4℃静置24h；6)将5)中的疫苗组合物分装、贴标。
本发明的技术方案中，优选的，所述水相不同亚型的牛病毒性腹泻病毒E2蛋白；油相为佐剂ISA 201 VG。
本发明的技术方案中，优选的，所述水相还包括免疫增强剂或防腐剂或两者都含有。
本发明的技术方案中，优选的，所述搅拌速度为350rpm/min～600rpm/min。
本发明的技术方案中，制备材料和制备过程都是在无菌的条件下进行的。
与现有技术相比，本发明的组合物能够保护牛免受不同分型的牛病毒性腹泻病毒的感染，且该组合物制备简单、使用量小。这对我国乃至世界范围内牛病毒性腹泻病毒的预防控制可以发挥重要作用。
附图说明
图1表示DNAstar软件分析我国主要流行BVDV毒株E2蛋白相似性；
图2A、图2B、图2C表示免疫后中和实验结果。
具体实施方式
以下将结合附图和实施例对本发明做进一步说明，本发明的实施例仅用于说明本发明的技术方案，并非限定本发明。
本发明实施例中所使用的菌株、质粒和试剂等均为市售产品。
实施例1不同亚型牛病毒性腹泻病毒E2蛋白的制备
参照中国发明专利申请公布号为CN 105924506 A的专利申请文件或者本申请的申请号为201611208261.8的发明专利申请文件或者其他蛋白表达方式(如原核表达系统表达)的牛病毒性腹泻病毒E2蛋白的制备方法制备不同亚型的牛病毒性腹泻病毒E2蛋白，所述不同亚型的牛病毒性腹泻病毒E2蛋白，分别为BVDV GS5 1a型-E2、BVDV JL-11b型-E2和BVDV XJ-04 2型-E2。
实施例2牛病毒性腹泻病毒E2蛋白亚单位疫苗组合物的制备(以制备2ml/头份，共202ml疫苗组合物为例说明)
所用制备疫苗组合物的耗材和材料都需预先经过无菌处理，制备过程是在生物安全柜或其他可以保证整个制备过程都无菌的仪器或环境中完成。
1、油相(ISA 201 VG佐剂，购自法国SEPPIC公司)的准备：根据水相和油相体积比为46:55，量取油相体积为110ml置于预先准备好的试剂瓶中，封口，置于33℃水浴锅中预热约30min。
2、水相准备：根据水相和油相体积比为46:55，水相总体积为92ml。
根据不同亚型牛病毒性腹泻病毒E2蛋白的浓度以及疫苗组合物蛋白总浓度，计算各亚型E2蛋白取用的体积；若水相中还加入免疫增强剂Quil-A(购自Brenntag Biosector)或防腐剂硫柳汞(购自Life Sciences)，则根据Quil-A和硫柳汞的原始浓度以及疫苗组合物中Quil-A和硫柳汞的含量计算Quil-A和硫柳汞取用的体积；用PBS或其他缓冲液将水相总体积补充至92ml，混匀后置于33℃水浴锅中预热约30min。例如BVDV GS5 1a型-E2、BVDVJL-1 1b型-E2和BVDV XJ-04 2型-E2浓度均为1.5mg/ml，Quil-A的原始浓度为10mg/ml，硫柳汞的原始浓度为30mg/ml，具体配置如下表1所示。
表1
3、搅拌：将预热好的油相加到预先准备好的烧杯中，调整好搅拌机的高度和速度，再将预热好的水相迅速加到油相中，继续搅拌10～20min。一般根据制备体积选择搅拌速度和搅拌时间，如制备200ml疫苗组合物，一般选择350rpm/min搅拌10min即可，又如制备1500ml疫苗组合物，一般选择600rpm/min搅拌20min即可。
4、稳定：将3中搅拌好的疫苗组合物置于20℃水浴锅中静置1h，然后置于4℃冰箱中过夜。
5、分装：稳定好的疫苗组合物根据需要分装并写上标签。
实施例3牛病毒性腹泻病毒E2蛋白亚单位疫苗组合物免疫实验和中和实验
1、按照实施例2的方法制备如下疫苗组合物(硫柳汞可加可不加)，如下表2所示。
表2
2、筛选4-5月龄小牛45头(BVDV抗原抗体阴性)，随机分成9组，每组5头，其中一组作为空白对照组，其他8组分别免疫1中制备的8个组合物，每次每头肌肉注射1头份，初免三周后加强免疫一次，免疫前、二免前和二免后21天采集血清，进行中和实验检测。
3、中和实验：参照中国发明专利申请公布号为CN 105924506 A的专利申请文件的中和实验步骤进行中和实验，结果如图2A、图2B、图2C所示。可以看出，首免21天含有免疫增强剂的中和抗体效价较不含免疫增强剂的中和抗体效价要高，但是免疫增强剂的浓度影响不大；组合物中蛋白浓度对中和抗体效价影响不明显。
本发明通过上面的实施例进行举例说明，但是，应当理解，本发明并不限于这里所描述的特殊实例和实施方案。在这里包含这些特殊实例和实施方案的目的在于帮助本领域中的技术人员实践本发明。任何本领域中的技术人员很容易在不脱离本发明精神和范围的情况下进行进一步的改进和完善，因此本发明只受到本发明权利要求的内容和范围的限制，其意图涵盖所有包括在由附录权利要求所限定的本发明精神和范围内的备选方案和等同方案。

Claims (14)

1.一种牛病毒性腹泻病毒E2蛋白亚单位疫苗组合物，其特征在于，所述组合物包括两种亚型以上牛病毒性腹泻病毒E2蛋白和药学上可以接受的佐剂。
2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述不同亚型的牛病毒性腹泻病毒E2蛋白选自BVDV GS5 1a型-E2、BVDV JL-1 1b型-E2和BVDV XJ-04 2型-E2中的至少一种。
3.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述不同亚型的牛病毒性腹泻病毒E2蛋白按照等质量比混合。
4.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述不同亚型的牛病毒性腹泻病毒E2蛋白混合后蛋白总浓度为50μg/头份～200μg/头份。
5.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述佐剂为ISA 201VG。
6.根据权利要求1～5任一所述的组合物，其特征在于，所述组合物还含有免疫增强剂、和/或防腐剂。
7.根据权利要求6所述的组合物，其特征在于，所述免疫增强剂为Quil-A，所述Quil-A的浓度为500μg/头份～750μg/头份。
8.根据权利要求6所述的组合物，其特征在于，所述防腐剂为硫柳汞，所述硫柳汞的含量为每头份疫苗组合物中低于0.01％。
9.一种制备如权利要求1～8任一所述的组合物的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
1)准备水相和油相，水相和油相的体积比为46:55；
2)将水相和油相分别预热到33℃±1℃；
3)先将油相加到容器中，调整好搅拌器的高度和速度，在搅拌的过程中将水相加到油相中，继续搅拌10min～20min；
4)将步骤3)乳化好的疫苗组合物置于20℃静置1h；
5)将4)中疫苗组合物置于4℃静置24h；
6)将5)中的疫苗组合物分装、贴标。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述水相为不同亚型的牛病毒性腹泻病毒E2蛋白；所述油相为佐剂ISA 201VG。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述水相还包括免疫增强剂或防腐剂或两者都有。
12.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述搅拌速度为350rpm/min～600rpm/min。
13.根据权利要求9-12任一权利要求所述的方法，其特征在于，制备材料和制备过程都是在无菌的条件下进行的。
14.一种如权利要求1-9任一权利要求所述的组合物在预防和治疗牛病毒性腹泻中的应用。
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