CN110029116A

CN110029116A - 一种分泌表达多抗原表位猪瘟病毒e2基因的重组病毒及制备方法与应用

Info

Publication number: CN110029116A
Application number: CN201910185932.0A
Authority: CN
Inventors: 陈金顶; 黄允真; 章洋溢; 聂恺阳; 杨超; 赵明秋
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: South China Agricultural University
Priority date: 2019-03-12
Filing date: 2019-03-12
Publication date: 2019-07-19
Anticipated expiration: 2039-03-12
Also published as: CN110029116B

Abstract

本发明公开了一种分泌表达多抗原表位猪瘟病毒E2基因的重组病毒及制备方法与应用。本发明根据密码子的偏爱性，人工设计合成了含多个抗原表位的重组CSFV C株的免疫原性基因E2并构建了含有上述E2基因的重组杆状病毒，提高了E2基因在杆状病毒中表达水平和免疫原性。利用本发明的重组杆状病毒所表达rE2蛋白制备亚单位疫苗，免疫日猪后，可诱导机体产生特异性免疫反应，并免受CSFV石门株的攻击；同时所述亚单位疫苗免疫动物后，还可用于鉴别诊断区分疫苗免疫和野毒感染动物，具有较大的应用前景。

Description

一种分泌表达多抗原表位猪瘟病毒E2基因的重组病毒及制备方法与应用

技术领域

本发明涉及兽医生物技术领域，更具体地，涉及一种分泌表达多抗原表位猪瘟病毒E2基因的重组病毒及制备方法与应用。

背景技术

猪瘟(Classical Swine Fever，CSF)是由黄病毒科瘟病毒属猪瘟病毒(ClassicalSwine Fever Virus，CSFV)引起的一种高度接触性、出血性和致死性传染病，是世界范围内危害养猪业最重要的传染病之一，多年来一直是猪病防治研究的重点。我国由于长期贯彻预防为主的指导方针，坚持全面接种猪瘟兔化弱毒疫苗 (HCLV)，本病在国内大规模爆发已基本停止，但是在全国各地仍有不间断的散发流行，造成巨大的经济损失。E2蛋白是诱导机体产生中和抗体的主要保护性抗原主要成分，可以抵抗强毒的攻毒保护实验，是构建猪瘟新型基因工程疫苗的首选靶蛋白。利用CSFV E2蛋白制备的亚单位疫苗没有非结构蛋白，可以利用检测Erns蛋白的抗体来区分疫苗免疫和野毒感染猪群。尽管猪瘟兔化弱毒疫苗能有效的预防不同基因亚型病毒的感染，但是猪瘟仍在部分区域呈流行态势，并存在代毒与免疫临床发病现象。猪瘟作为我国优先防治的一类动物传染病，仍迫切需要便于鉴别诊断的新型基因工程标记疫苗以及配套的诊断试剂。

近年来，杆状病毒表达载体因其具有操作简单、安全性高，可容纳大的目的基因，表达外源蛋白效率高，有翻译后修饰的作用，表达蛋白的免疫原性、生物活性与天然的蛋白相似等优点，已经在表达载体上占了主导的地位。利用杆状病毒表达载体表达多抗原表位的猪瘟E2蛋白，制备亚单位疫苗，能有效预防猪瘟病毒感染，也有利于与野毒感染进行鉴别诊断。专利201810920169.7公开了一种杆状病毒表达的猪瘟E2亚单位疫苗，该疫苗是通过杆状病毒表达系统表达的含有信号肽的猪瘟SP-E2蛋白，虽然提高了E2蛋白的表达量，但是其免疫原性依然有待提高。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有猪瘟E2亚单位疫苗存在的缺陷和不足，提供一种分泌表达多抗原表位猪瘟病毒E2基因的重组病毒，并利用所述重组病毒表达的rE2蛋白制备亚单位疫苗，免疫日猪后，可诱导机体产生特异性免疫反应，并免受CSFV石门株的攻击。

本发明的第一个目的是提供一种人工修饰的含多抗原表位的猪瘟病毒重组 E2基因。

本发明的第二个目的是提供一种人工修饰的含多抗原表位的猪瘟病毒重组 E2蛋白。

本发明的第三个目的是提供一种含有上述重组E2基因的杆状病毒转移载体。

本发明的第四个目的是提供一种含有上述载体的重组杆状病毒。

本发明的第五个目的是提供所述重组杆状病毒在制备猪瘟病毒亚单位疫苗中的应用。

本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：

一种人工修饰的含多抗原表位的猪瘟病毒重组E2基因，其核苷酸序列如 SEQ IDNO.1所示。

本发明参照CSFV C株序列，根据杆状病毒密码子偏好性人工合成1272bp 的含四个重复E2蛋白抗原表位的重组E2(rE2)基因序列(SEQ ID NO.1)；其中表位序列为“TAVSPTTLR”，具体为于E2基因的氨基端引入两个重复表位，于羧基端引入两个重复表位，组成含四个重复E2蛋白抗原表位的重组E2(rE2) 基因序列且于rE2基因的C端引入6his序列作为标签。

一种人工修饰的含多抗原表位的猪瘟病毒重组E2蛋白，其氨基酸序列如 SEQ IDNO.2所示。

上述重组E2基因或重组E2蛋白在制备猪瘟病毒亚单位疫苗中的应用也在本发明保护范围内。

一种含上述重组E2基因的载体。

优选地，所述载体为杆状病毒转移载体pFastBac Dual-rE2。

本发明还请求保护杆状病毒转移载体pFastBac Dual-rE2的制备方法，具体包括如下步骤：

S1.重组猪瘟病毒E2基因的获得

参照CSFV C株序列，根据杆状病毒密码子偏好性人工合成1272bp的含四个重复E2蛋白抗原表位的重组E2(rE2)基因序列，表位序列为“TAVSPTTLR”，具体为于E2基因的氨基端引入两个重复表位，于羧基端引入两个重复表位，组成含四个重复E2蛋白抗原表位的重组E2(rE2)基因序列且于rE2基因的C端引入6his序列作为标签。该序列克隆入载体pUC-19中，获得重组质粒pUC-19-rE2；

S2.杆状病毒转移载体pFastBac Dual-rE2的获得

以DH10Bac基因组DNA为模板，利用引物5’-CGGGATCCATGCTA CTAGTAAATCAG-3’(SEQ ID NO.3)；5’-GCTCTAGAGTTGCAGTGCTCCGCC GC-3’(SEQ ID NO.4)扩增杆状病毒GP67信号肽片段；以杆状病毒转移载体 pFastBac Dual为骨架，通过BamH I，Xba I分别酶切pFastBac Dual和GP67信号肽PCR产物，胶回收纯化后连接构建质粒pFastBac Dual-GP67S。以pUC-19-rE2 为模板，利用引物5’-GCTCTAG AGCCAGTATGACAGCTGT-3’(SEQ IDNO.5)； 5’-AACTGCAGTTAGTGGTGGTGGTGGTGGT GTC-3’(SEQ ID NO.6)扩增rE2 基因，PCR产物通过Xba I和Pst I处理，克隆连接到pFastBac Dual-GP67S获得质粒pFastBac Dual-rE2。

一种含有上述杆状病毒转移载体pFastBac Dual-rE2的宿主菌；具体地，所述宿主菌为大肠杆菌；更具体地，所述大肠杆菌为DH10Bac。

一种含上述杆状病毒转移载体pFastBac Dual-rE2的重组杆状病毒Ac-rE2。

本发明还请求保护所述重组杆状病毒Ac-rE2的制备方法，具体包括如下步骤：

S1.重组杆粒rBac-rE2的获得与鉴定

取pFastBac Dual-rE2与大肠杆菌感受态细胞混合，热激转化，通过蓝白斑筛选、纯化阳性菌落，经M13引物PCR鉴定获得重组杆粒rBac-rE2；

S2.重组病毒Ac-rE2的获得

利用阳离子脂质体cellfectin II介导转染，将重组杆粒rBac-rE2转染入sf9 单层细胞，经培养、观察后，收集培养上清即为P1代重组病毒Ac-rE2。

本发明还请求保护所述重组杆状病毒在制备猪瘟病毒亚单位疫苗中的应用；将重组杆状病毒Ac-rE2接种悬浮培养的昆虫细胞，感染后收集培养物，离心去除培养上清，细胞破碎后，离心去除细胞碎片，将超声上清中目的蛋白与免疫佐剂乳化即制备成亚单位疫苗。

本发明的重组杆状病毒Ac-rE2猪瘟亚单位疫苗仅能诱导猪产生针对E2的特异性抗体，而无论是传统的猪瘟弱毒疫苗还是野毒株都能诱导猪产生针对E0的特异性抗体；故可以通过对猪血清E0抗体的检测可以区分重组杆状病毒Ac-rE2 猪瘟亚单位疫苗免疫猪和野毒感染猪。

因此，所述所述重组病毒在制备疫苗免疫和野毒感染的鉴别诊断试剂的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明根据密码子的偏爱性，在E2基因的氨基端和羧基端各引入了2 个重复的抗原表位(TAVSPTTLR)，人工设计合成了含多个抗原表位的重组CSFV C株的免疫原性重组E2基因，其序列如SEQ ID NO.1所示，提高了基因在杆状病毒中表达水平和免疫原性；同时于重组蛋白氨基端加入了一个gp67信号肽，以期达到分泌表达和提高表达量的目的。

(2)本发明的重组杆状病毒所表达rE2蛋白制备亚单位疫苗，免疫日猪后，可诱导机体产生特异性免疫反应，并免受CSFV石门株的攻击。

(3)本发明的重组杆状病毒表达rE2蛋白制备亚单位疫苗免疫动物后，可以通过鉴别诊断区分疫苗免疫和野毒感染动物。

附图说明

图1为转移载体pFastBac Dual-rE2的双酶切鉴定图；M：10000bp DNA Marker；1：pFastBac Dual-rE2/BamH I和Pst I双酶切。

图2为重组杆粒rBac-rE2的PCR鉴定图；M：10000bp DNA Marker；1： rBac-rE2。

图3为重组杆状病毒Ac-rE2的Western-blot分析图；M：蛋白Marker；1-2：重组杆状病毒Ac-rE2感染的细胞样品；3：正常sf9细胞样品。

图4为重组杆状病毒Ac-rE2的间接免疫荧光分析图；A、C为白光下观察； B、D为荧光下观察。

图5为猪免疫后不同时间的血清E2阻断ELISA抗体结果图；重组杆状病毒 Ac-rE2猪瘟亚单位疫苗组、E2蛋白对照组和PBS对照组免疫后第7、14、21、 28、35天的猪血清E2阻断ELISA抗体水平。

图6为重组杆状病毒Ac-rE2猪瘟亚单位疫苗组攻毒后猪每日体温图；重组杆状病毒Ac-rE2猪瘟亚单位疫苗组中有4头猪在攻毒后7天前出现轻微体温反应，体温反应持续时间为1～4天不等。

图7为E2蛋白对照组攻毒后猪每日体温图；E2蛋白对照组对照组中有4头猪出现体温反应，大部分猪体温反应发生在攻毒6天以后，且体温反应持续时间长于实验组。

图8为PBS对照组攻毒后猪每日体温图。PBS对照组的猪在攻毒后出现强烈的体温反应，且从攻毒后第3天开始陆续出现死亡。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实施例1表达重组CSFV E2蛋白的重组杆状病毒Ac-rE2的构建

(一)、重组杆状病毒Ac-rE2的获得

1、重组CSFV E2基因的获得

2、杆状病毒转移载体pFastBac Dual-rE2

以DH10Bac基因组DNA为模板，利用引物5’-CGGGATCCATGCTA CTAGTAAATCAG-3’；5’-GCTCTAGAGTTGCAGTGCTCCGCCGC-3’扩增杆状病毒GP67信号肽片段。以杆状病毒转移载体pFastBac Dual为骨架，通过BamH I， Xba I分别酶切pFastBac Dual和GP67信号肽PCR产物，胶回收纯化后连接构建质粒pFastBac Dual-GP67S。以pUC-19-rE2为模板，利用引物5’-GCTCTAG AGCCAGTATGACAGCTGT-3’；5’-AACTGCAGTTAGTGGTGGTGGTGGTGGT GTC-3’扩增rE2基因，PCR产物通过Xba I和Pst I处理，克隆连接到pFastBac Dual-GP67S获得质粒pFastBac Dual-rE2。使用限制性核酸内切酶BamH I和Pst I 进行双酶切鉴定。

将扩增的PCR产物经1％(重量/体积，w/v)的琼脂糖凝胶进行电泳，结果显示酶切获得1300bp和5100bp左右大小的条带，大小与预期一致，表明重组转移载体pFastBacDual-rE2构建成功(图一)。其包含有SEQ ID NO.1所示的融合基因序列，该序列编码的蛋白质为SEQ ID NO.2所示。

3、重组病毒杆状病毒Ac-rE2的构建

(1)重组杆粒rBac-rE2的获得与鉴定

取3.0μL pFastBac Dual-rE2与100μL DH10Bac大肠杆菌感受态细胞混合，冰浴30min后，于42℃45s水浴进行热激，然后冰浴2min，加入900u L S.O.C 液体培养基，37℃振摇培养4h，按10^-1，10^-2，10^-3稀释后，各取100u L涂布于含有三抗(卡那霉素、庆大霉素和四环素)LB平板，使用浓度按Bac-to-Bac Baculoviruse Expression System操作说明书，37℃培养24～48h，通过蓝白斑筛选、纯化阳性菌落，提取重组杆粒rBac-rE2，通过PCR引物扩增鉴定：M13上游引物(M13F)和M13下游引物(M13R)。

M13F:5’-CCCAGTCACGACGACGTTGTAAAACG-3’；

M13R:5’-AGCGGATAACAATTTCACACAGG-3’；

PCR体系如下：

配好PCR体系后于PCR仪上按以下反应条件扩增：变性温度为95℃，预变性3分钟；然后94℃作用30秒，50℃退火30秒，72℃延伸4分钟，共30个循环；最后72℃延伸10分钟。将扩增的PCR产物经1.0％(重量/体积，w/v)的琼脂糖凝胶进行电泳，结果显示能够扩增出大小为特异目的条带，大小约4100bp 与预期一致，表明CSFV E2基因片段在大肠杆菌中已成功重组入杆状病毒基因组中(图2)。

(2)重组病毒Ac-rE2的获得

利用阳离子脂质体cellfectin II介导转染，按说明书步骤将重组杆粒rBac-rE2转染入sf9单层细胞(购自武汉大学中国典型物保藏中心)，与27℃培养箱中培养96h，于倒置显微镜下观察细胞病变情况，收集培养上清即为P1代重组病毒 Ac-rE2，于-80℃保存。

此重组病毒Ac-rE2具有与亲本毒株苜蓿银纹核型多角体病毒(AcMNPV) 相同的形态学特性和培养特性。

(二)、重组杆状病毒Ac-rE2外源基因表达的检测

1、Western-Blot分析检测外源基因的表达

将重组杆状病毒Ac-rE2按0.1M.O.I.感染单层Sf9细胞，27℃培养72h细胞。待细胞出现明显病变并出现大量细胞脱落时收集培养液于离心管中，2000rpm 离心5min后弃上清，细胞再用100μL PBS重悬，重悬后进行超声裂解破碎细胞，加入5×SDS上样缓冲液，煮沸5分钟。样品经SDS-PAGE电泳后转移至纤维素膜，以His标签单克隆抗体(碧云天公司)为一抗，HRP标记羊抗小鼠IgG(碧云天公司)为二抗进行Western-Blot检测。结果显示重组病毒感染的细胞样品中有一个特异性条带，大小约55KDa，符合预期大小。而sf9细胞对照组无此特异性条带，表明目的蛋白成功表达，结果如图3所示。

2、间接免疫荧光分析检测外源基因的表达

将重组杆状病毒Ac-rE2按1M.O.I.感染单层Sf9细胞，27℃培养，48h后进行间接免疫荧光检测E2基因的表达。以His单克隆抗体(购自碧云天公司) 为一抗，FITC标记羊抗鼠IgG(购自碧云天公司)为二抗。于荧光显微镜下观察，结果显示Ac-rE2感染的sf9细胞有很强的绿色荧光，而阴性对照细胞则没有荧光，表明目的蛋白成功在细胞内表达，结果如图4所示。

实施例2重组杆状病毒Ac-rE2制备的亚单位疫苗的免疫效力实验

1、重组杆状病毒Ac-rE2猪瘟亚单位疫苗的制备

以实施例1中制备的重组杆状病毒Ac-rE2按照1M.O.I.感染培养浓度为 2×10⁶cells/mL的sf9悬浮细胞。感染72h后收集培养物，离心去除培养上清，加等量PBS缓冲液重悬细胞，超声细胞破碎仪处理悬液，离心去除细胞碎片。测定超声上清中目的蛋白浓度后，调整蛋白浓度至100μg/mL，后与ISA 201VG佐剂(SEPPIC公司产品)乳化制备成亚单位疫苗，此时每毫升疫苗中含rE2蛋白 50μg，4℃保存，疫苗用于以下实施例。

2、重组杆状病毒Ac-rE2猪瘟亚单位疫苗技术指标的检验

(1)物理性状

本品外观为乳白色均匀乳液

本品剂型为水包油包水，取1mL滴于冷水表面，液滴均匀铺于水面不分散。

取本品10mL加入离心管中,用离心机按每分钟3000r离心15min，无水相油相析出。

用1mL吸管(规格要求：吸管吸入内径1.2mm，吸出内径2.7mm)，吸取 25℃左右的本品1mL，样品垂直自然状态流出，0.5mL流出需要8秒钟。

(2)无菌检验

按照《中国兽药典》附录进行，结果显示本品为无菌制剂。

(3)安全性检验

取本品0.2mL，皮下注射于1月龄BALB/c小鼠，共5只，观察14天，结果显示注射本品后小鼠无不良反应。

3、重组杆状病毒Ac-rE2猪瘟亚单位疫苗对猪的免疫效力实验

为了评价上述制备的亚单位疫苗对猪的免疫效力，选取约2月龄大小的猪瘟抗体阴性猪15头，随机分成3组，每组5头。实验组按照每头猪50μg的rE2 蛋白的剂量进行颈部肌肉注射，并于3周后加强免疫一次；E2蛋白对照组，即以未添加额外抗原表位的猪瘟病毒E2蛋白作为抗原，疫苗制备及技术检验按实施例2中所述进行，同样按照每头猪50μg的E2蛋白的剂量进行颈部肌肉注射，并于3周后加强免疫一次；阴性对照组每头猪颈部肌肉注射1mL的以PBS为水相制备的油乳剂，并于3周后加强免疫一次。首免后第7、14、21、28、35天分别进行前腔静脉采血，分离血清，评价其特异性抗体水平和中和抗体水平。首面后第36天，每头猪颈部肌肉注射1mL猪瘟强毒血毒进行攻毒。攻毒后每天测量 2次体温，并于攻毒后第15天对所有猪进行剖检。

将免疫后不同时间点采的猪血清用美国IDEXX公司的猪瘟E2抗体阻断 ELISA试剂盒检测血清中的特异性抗体水平，结果如图5所示，重组杆状病毒 Ac-rE2猪瘟亚单位疫苗能在二免后诱导猪产生较高滴度的E2特异性抗体，抗体封闭率高于80％。二免后重组蛋白rE2免疫组和E2蛋白免疫组的抗体水平无差异，PBS对照组血清无特异性抗体。

收集首次免疫后第35天的血清，并56℃水浴30分钟灭活血清。取已灭活处理的血清，在96孔微量细胞培养板上，用稀释液作一系列倍比稀释，使其稀释度分别为原血清的1:40，1:80，1:160，1:320，1:640，1:1280，1:2560，1:5120 稀释，每个稀释度做4个平行孔。每个血清稀释孔中加入50μL(100TCID50/50μL) CSFV石门株病毒液，轻混病毒－血清混和物，37℃5％CO₂培养箱中孵育1h。上述96孔板孵育1h后，每孔中接入1.0×10⁴个PK15细胞，37℃5％CO₂培养箱中孵育3天。通过间接免疫荧光实验测定残余病毒感染性。血清样品中的中和抗体滴度表示为引起50％中和的最高稀释度的倒数。结果如表1所示，实验组和E2蛋白对照组血清均具有高中和抗体滴度，PBS对照组血清无中和抗体。

表1血清中和抗体滴度

攻毒后每天测量猪的体温，结果显示：重组杆状病毒Ac-rE2猪瘟亚单位疫苗组中有4头猪在攻毒后7天前出现轻微一过性体温反应，体温反应持续时间为 1～4天不等(如图6所示)；E2蛋白对照组对照组中也有4头猪出现体温反应，不同的是大部分体温反应发生在攻毒6天以后，且体温反应出现反复、持续时间长(如图7所示)。PBS对照组的猪在攻毒后出现强烈的体温反应，且从攻毒后第3天开始陆续出现死亡(如图8所示)。实验结果表明本发明的重组杆状病毒 Ac-rE2猪瘟亚单位疫苗具有良好的免疫效力，且免疫效力略强于无表位添加的 E2蛋白亚单位疫苗。

猪瘟病毒E0蛋白也是一个重要的保护性抗原，它能诱导猪产生一定的特异性抗体，所以无论是传统的猪瘟弱毒疫苗还是野毒株都能诱导猪产生针对E0的特异性抗体。而本发明的重组杆状病毒Ac-rE2猪瘟亚单位疫苗仅能诱导猪产生针对E2的特异性抗体，故可以通过对猪血清E0抗体的检测可以区分重组杆状病毒Ac-rE2猪瘟亚单位疫苗免疫猪和野毒感染猪，利于猪厂的猪瘟根除与净化。

序列表

<110> 华南农业大学

<120> 一种分泌表达多抗原表位猪瘟病毒E2基因的重组病毒及制备方法与应用

<141> 2019-03-11

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1272

<212> DNA

<213> 猪瘟病毒(Classical Swine Fever Virus)

<400> 1

atgacagctg tgagcccaac aactctgaga ggtggtggta cagctgtgag cccaacaact 60

ctgagacggc tcgcctgcaa ggaagactac aggtacgcta tctcatcaac caacgagatc 120

ggtctcctcg gtgccggagg tctcactacc acctggaagg aatacagcca cgacttgcag 180

ctgaacgacg gtaccgttaa ggccatctgc gtggctggtt ccttcaaggt cacagctctg 240

aacgtggtca gtaggaggta cttggcttca ttgcacaagg gtgctttgct cacttccgtg 300

acattcgagc tcctgttcga cggtaccaac ccatcaaccg aagaaatggg agacgacttc 360

ggtttcggtc tgtgcccttt cgacacgagt cctgttgtca agggaaagta caacacaacc 420

ttgttgaacg gtagcgcttt ctacctggtc tgcccaatcg gttggacggg tgttatcgag 480

tgcacagctg tgagcccaac aactctgaga acagaagtgg tgaagacctt caggagagag 540

aagcctttcc cacacagaat ggactgcgtg accaccacag tggaaaacga agacctcttc 600

tactgcaagt tgggtggcaa ctggacatgc gtgaagggtg aaccagtggt ctacacaggt 660

ggtcaggtga agcagtgcaa gtggtgcggc ttcgacttca acgagcctga cggactccca 720

cactacccca tcggtaagtg catcttggct aacgagacag gttacaggat cgtggactca 780

acggactgca acagagacgg cgttgtgatc agcgctgagg gtagtcacga gtgcttggtc 840

ggcaacacaa ctgtcaaggt gcacgcttca gacgaaagac tgggccctat gccatgcaga 900

cctaaggaga tcgtctctag tgctggacct gtgaggaaga cttcctgcac attcaactac 960

gctaagacct tgaagaacaa gtactacgag cccagggaca gctacttcca gcagtacatg 1020

ctcaagggcg agtaccagta ctggttcgac ctggacgtga cagaccgcca ctcagactac 1080

ttcgctgaat tcgttgtctt ggtggtggtg gctctgttgg gaggaagata cgtcctgtgg 1140

ctgatcgtga cctacatcgt tctcacagaa cagctcgccg ctggtctcac agctgtgagc 1200

ccaacaactc tgagaggtgg tggtacagct gtgagcccaa caactctgag acaccaccac 1260

caccaccact aa 1272

<210> 2

<211> 423

<212> PRT

<213> 猪瘟病毒(Classical Swine Fever Virus)

<400> 2

Met Thr Ala Val Ser Pro Thr Thr Leu Arg Gly Gly Gly Thr Ala Val

1 5 10 15

Ser Pro Thr Thr Leu Arg Arg Leu Ala Cys Lys Glu Asp Tyr Arg Tyr

20 25 30

Ala Ile Ser Ser Thr Asn Glu Ile Gly Leu Leu Gly Ala Gly Gly Leu

35 40 45

Thr Thr Thr Trp Lys Glu Tyr Ser His Asp Leu Gln Leu Asn Asp Gly

50 55 60

Thr Val Lys Ala Ile Cys Val Ala Gly Ser Phe Lys Val Thr Ala Leu

65 70 75 80

Asn Val Val Ser Arg Arg Tyr Leu Ala Ser Leu His Lys Gly Ala Leu

85 90 95

Leu Thr Ser Val Thr Phe Glu Leu Leu Phe Asp Gly Thr Asn Pro Ser

100 105 110

Thr Glu Glu Met Gly Asp Asp Phe Gly Phe Gly Leu Cys Pro Phe Asp

115 120 125

Thr Ser Pro Val Val Lys Gly Lys Tyr Asn Thr Thr Leu Leu Asn Gly

130 135 140

Ser Ala Phe Tyr Leu Val Cys Pro Ile Gly Trp Thr Gly Val Ile Glu

145 150 155 160

Cys Thr Ala Val Ser Pro Thr Thr Leu Arg Thr Glu Val Val Lys Thr

165 170 175

Phe Arg Arg Glu Lys Pro Phe Pro His Arg Met Asp Cys Val Thr Thr

180 185 190

Thr Val Glu Asn Glu Asp Leu Phe Tyr Cys Lys Leu Gly Gly Asn Trp

195 200 205

Thr Cys Val Lys Gly Glu Pro Val Val Tyr Thr Gly Gly Gln Val Lys

210 215 220

Gln Cys Lys Trp Cys Gly Phe Asp Phe Asn Glu Pro Asp Gly Leu Pro

225 230 235 240

His Tyr Pro Ile Gly Lys Cys Ile Leu Ala Asn Glu Thr Gly Tyr Arg

245 250 255

Ile Val Asp Ser Thr Asp Cys Asn Arg Asp Gly Val Val Ile Ser Ala

260 265 270

Glu Gly Ser His Glu Cys Leu Val Gly Asn Thr Thr Val Lys Val His

275 280 285

Ala Ser Asp Glu Arg Leu Gly Pro Met Pro Cys Arg Pro Lys Glu Ile

290 295 300

Val Ser Ser Ala Gly Pro Val Arg Lys Thr Ser Cys Thr Phe Asn Tyr

305 310 315 320

Ala Lys Thr Leu Lys Asn Lys Tyr Tyr Glu Pro Arg Asp Ser Tyr Phe

325 330 335

Gln Gln Tyr Met Leu Lys Gly Glu Tyr Gln Tyr Trp Phe Asp Leu Asp

340 345 350

Val Thr Asp Arg His Ser Asp Tyr Phe Ala Glu Phe Val Val Leu Val

355 360 365

Val Val Ala Leu Leu Gly Gly Arg Tyr Val Leu Trp Leu Ile Val Thr

370 375 380

Tyr Ile Val Leu Thr Glu Gln Leu Ala Ala Gly Leu Thr Ala Val Ser

385 390 395 400

Pro Thr Thr Leu Arg Gly Gly Gly Thr Ala Val Ser Pro Thr Thr Leu

405 410 415

Arg His His His His His His

420

<210> 3

<211> 26

<212> DNA

<213> 猪瘟病毒(Classical Swine Fever Virus)

<400> 3

cgggatccat gctactagta aatcag 26

<210> 4

<211> 26

<212> DNA

<213> 猪瘟病毒(Classical Swine Fever Virus)

<400> 4

gctctagagt tgcagtgctc cgccgc 26

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> 猪瘟病毒(Classical Swine Fever Virus)

<400> 5

gctctagagc cagtatgaca gctgt 25

<210> 6

<211> 31

<212> DNA

<213> 猪瘟病毒(Classical Swine Fever Virus)

<400> 6

aactgcagtt agtggtggtg gtggtggtgt c 31

Claims

1.一种人工修饰的含多抗原表位的猪瘟病毒重组E2基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种人工修饰的含多抗原表位的猪瘟病毒重组E2蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.权利要求1所述重组E2基因或权利要求2所述重组E2蛋白在制备猪瘟病毒亚单位疫苗中的应用。

4.一种含权要求1所述重组E2基因的载体。

5.根据权利要求5所述的载体，其特征在于，所述载体为杆状病毒转移载体pFastBacDual-rE2。

6.一种含权利要求5所述载体的重组杆状病毒Ac-rE2。

7.权利要求6所述重组杆状病毒在制备猪瘟病毒亚单位疫苗中的应用。

8.权利要求6所述重组病毒在制备疫苗免疫和野毒感染的鉴别诊断试剂的应用。