CN110157681A

CN110157681A - 一种猪瘟e2蛋白亚单位疫苗

Info

Publication number: CN110157681A
Application number: CN201910443709.1A
Authority: CN
Inventors: 郭伟伟; 刘大卫; 向银辉; 王玉红; 窦小龙; 刘蕾; 范根成; 杜元钊
Original assignee: Qingdao Yebio Bioengineering Co Ltd
Current assignee: Qingdao Yebio Bioengineering Co Ltd
Priority date: 2019-05-25
Filing date: 2019-05-25
Publication date: 2019-08-23
Also published as: EA202092689A1; WO2020238458A1

Abstract

本发明提供一种猪瘟E2蛋白亚单位疫苗，其中氨基酸序列为SEQ ID NO:3的抗原蛋白是使用重组猪瘟E2‑CHO细胞株表达制备的。本发明的猪瘟E2蛋白制备的亚单位疫苗具有抗原稳定性高，纯度高，特异性强，不产生其他不相关抗体，检测方法方便准确的特点，为生产猪瘟亚单位疫苗和诊断试剂奠定了坚实的基础。

Description

一种猪瘟E2蛋白亚单位疫苗

技术领域

本发明属于兽用生物制品技术领域，具体涉及一种猪瘟病毒亚单位疫苗及其制备方法。

背景技术

猪瘟是由猪瘟病毒(Classical Swine Fever Virus,CSFV)引起的一种急性、烈性、高度接触性传染病，给世界养猪业造成重大损失。目前世界上应用的猪瘟病毒弱毒疫苗虽然免疫效力好、安全性高，但是弱毒活疫苗刺激机体产生的抗体，很难和野毒感染猪产生的抗体区分开，这不利于控制猪瘟的流行与净化。研发猪瘟亚单位疫苗能够区分疫苗免疫动物和感染动物，能为猪瘟病毒净化提供便利。

E2囊膜糖蛋白是猪瘟病毒的主要结构蛋白，是猪瘟病毒毒力及宿主范围的主要决定性因素，位于病毒粒子外表面，是产生病毒中和抗体，保护免疫猪免受猪瘟病毒攻击的主要抗原蛋白。因此，猪瘟病毒E2蛋白是开发猪瘟病毒新型疫苗的重要蛋白分子。以真核细胞表达重组E2蛋白抗原研制的亚单位疫苗，用以区分自然毒感染所诱导的免疫应答和亚单位疫苗所诱导的免疫应答，这种标记疫苗将促进猪瘟病毒的净化。

我国猪瘟的流行毒株可分为2个基因群，4个基因亚群，即2.1、2.2、2.3和1.1基因亚群。研究表明，我国较大范围内流行的猪瘟毒株于传统的石门强毒和疫苗用兔化弱毒在抗原基因上存在较大的差异。我国传统的弱毒疫苗株属于1.1基因亚群，但该亚群的野毒只占很少的比例，且多发于相对偏远的散养地区。随着猪场集约化养殖的快速发展，我国猪瘟病毒的主要流行毒株为基因2群。猪瘟病毒流行病学调查发现，目前广泛使用的猪瘟传统1.1基因亚群弱毒疫苗对目前广泛流行的基因2群猪瘟病毒不能产生良好的免疫保护。

发明内容

本发明提供一种猪瘟E2蛋白亚单位疫苗，从而弥补现有技术的不足。

本发明首先提供一株能表达E2蛋白的细胞株，为包含有编码E2蛋白的核苷酸片段的E2-CHO细胞株；所述的E2蛋白，其氨基酸序列为SEQ ID NO:3；

所述的核苷酸片段，其序列为SEQ ID NO:4；

本发明所构建的重组猪瘟E2-CHO细胞株用于重组表达猪瘟病毒E2蛋白；

本发明再一个方面提供氨基酸序列为SEQ ID NO:3的E2蛋白制备的亚单位疫苗，

本发明所制备的蛋白用于制备疫苗；

本发明还提供一种猪瘟病毒亚单位疫苗，包括有抗原和疫苗佐剂，其所用的抗原为本发明制备的E2蛋白。

本发明的猪瘟E2蛋白制备的亚单位疫苗具有抗原稳定性高，纯度高，特异性强，不产生其他不相关抗体，检测方法方便准确的特点，为生产猪瘟亚单位疫苗和诊断试剂奠定了坚实的基础。

具体实施方式

本发明优化了分离的猪瘟基因2群流行毒株的E2蛋白基因序列，从而可以使用CHO细胞表达系统表达重组E2蛋白，与疫苗佐剂乳化制备的基因工程亚单位疫苗，免疫猪安全性和效力均良好，对流行毒株起到可靠的保护作用，并可作为猪瘟病毒净化的标记疫苗。

下面结合具体实施例对本发明进行详细的描述。本发明所应用的方法可以采用疫苗制备领域中常用的方法，而不仅限于本发明实施例的具体记载，本领域的普通技术人员可以其它常规方法来实现本发明。

实施例1、猪瘟病毒E2蛋白的筛选

2018年某猪场的已注射过现有猪瘟病毒的猪群中出现了典型的猪瘟发病症状，为了分离病原，无菌采集死亡猪的脾脏，用无菌生理盐水匀浆制成悬液，离心取上清除菌后接种ST细胞。96小时一次收取病毒液上清，再过72小时二次收取病毒液上清。收获的病毒液经纯化后进行了病毒含量、免疫原性、特异性及纯净性等方面的病毒特性的分析检测，结果表明分离的毒株与猪瘟病毒发生特异性反应，无细菌、支原体及外源病毒污染。

对于本发明筛选的毒株的性状进行检测，结果表明，该株病毒属猪瘟病毒，攻毒实验结果表明筛选的该病毒可引起猪死亡，解剖发现内脏器官出血、坏死和梗死。

对筛选鉴定毒株的结构蛋白基因E2蛋白进行了测序，E2基因全长1110bp，编码370个氨基酸，其氨基酸序列为SEQ ID NO:1，编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:2；将其与GenBank中收录的E2基因序列进行遗传进化树及核苷酸序列同源性分析，发现本发明获得毒株的E2氨基酸与目前使用的石门强毒的同源性为87％左右，与流行的2.1d基因型氨基酸的同源性为98％左右。该结果表明，猪瘟病毒已发生变异，而1.1型的疫苗已经不能保护流行的猪瘟毒株。

实施例2、表达E2基因的重组质粒的构建

2.1：E2基因的剪切、优化

将E2基因的pestivirus_E2结构域进行剪切，将N端23aa剪切掉，C端32aa剪切掉，帮助蛋白更好地折叠为三级结构，将其抗原位点更好地暴露出来。同时将其密码子进行优化，优化修饰后的氨基酸的序列为SEQ ID NO:3，能很好地表达出抗原位点。优化后的基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:4。

2.2 14.4-E2重组质粒的构建

2.2.1酶切反应

2.2.1.1标记好需要用到的1.5mL EP管，在1.5mL EP管中按照下表进行加样、混匀：反应体系为50μL，加样如下表所示：

2.2.1.2将步骤2.2.1.1中的1.5mL EP管置于37℃恒温水浴锅中，水浴2-3h。

2.2.2双酶切产物胶回收

取出上述双酶切体系，进行琼脂糖凝胶电泳以回收其中的DNA片段。

(1)标记好样品收集EP管、吸附柱以及收集管。

(2)称取标记好的空的EP管重量，并记录数值。

(3)将单一的目的DNA条带在切胶仪上从琼脂糖凝胶中用手术刀小心切下放入干净的1.5mL离心管中。

(4)向步骤(3)中的1.5mL离心管中加入600μL PC buffer50℃水浴放置5min左右，其间不断温和上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解。

(5)柱平衡：向吸附柱CB2中(吸附柱预先放入收集管中)加入500μL平衡液BL，离心12,000rpm，1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

(6)将步骤(5)所得溶液加至吸附柱CB2中，静置2min，10,000rpm，离心30s，倒掉收集管中的废液，再将吸附柱CB2放入收集管中。

(7)向吸附柱中加入600μL漂洗液PW buffer，静置3min，离心10,000rpm，30s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB2放入收集管中。

(8)重复步骤(7)。

(9)空吸附柱离心，12,000rpm，2min，尽量除去漂洗液。将吸附柱置于室温放置10min，彻底晾干。

(10)将吸附柱CB2放入收集管中，向吸附膜中间位置悬空滴加50μLElutionbuffer(65℃预热)，静置3min，离心12,000rpm，2min。

(11)从离心机中取出步骤(10)中离心管，丢弃中间的吸附柱CB2，盖上离心管盖子，保留离心管中的DNA样品。

(12)将步骤11中的DNA样品置于4℃保存，准备琼脂糖凝胶电泳鉴定胶回收DNA片段。

2.2.3连接反应

(1)标记需要用到的0.2mL离心管。

(2)在标记完整的0.2mL管中按照下表的20μL反应体系进行加样：

(3)完成加样后，用移液器轻轻吹打几次混匀各组分。

(4)将0.2mL离心管置于37℃反应30min，待反应完成后，立即将反应管置于冰水浴中冷却5min。

(5)步骤(4)的反应产物可直接进行转化实验，也可储存于-20℃，待需要时解冻转化。

2.2.4转化反应

(1)将10μL连接反应液快速加入100μL感受态细胞中，并吹打混匀，冰浴30min。

(2)步骤(1)完成后，取出样品管，置于42℃水浴100s，然后立即冰浴2min。

(3)步骤(2)完成后，取出样品管，在超净工作台中，向样品管中加入600μL液体LB培养基，然后将样品管置于37℃恒温摇床，220rpm，培养1h。

(4)制备转化平板，依据质粒抗性制备转化用LB抗性平板。

(5)涂板：取出步骤(3)中样品管，室温离心8,000rpm，2min，去掉600μL上清液体，剩余上清液重悬管底部的菌体，将重悬的菌液放入相应的转化平板中心，用涂菌棒将转化平板中心的菌液均匀铺开。

(6)将步骤(5)平板正置于生化恒温培养箱中，37℃培养1h后，将转化平板倒置进行培养15h。

(7)观察记录转化结果。

2.2.5质粒抽提与PCR鉴定

2.2.5.1质粒抽提

(1)用10μL移液枪头从转化平板中挑取单克隆至5ml含氨苄抗性的LB液体培养基中，37℃，220rpm摇菌过夜。

(2)吸取菌液至1.5mL EP管中，室温离心，12,000rpm，2min，弃上清。

(3)向步骤(2)中的EP管中加入250μL质粒提取试剂P1buffer，彻底悬浮菌体。

(4)向步骤(3)溶液中加入250μL P2buffer，立即温和颠倒离心管5-10次混匀。室温静置2-4min。

(5)向步骤(4)溶液中加入350μL P3buffer，立即温和颠倒离心管5-10次混匀。室温静置2-4min。

(6)将步骤(5)溶液，室温离心，14,000rpm，10min。

(7)将步骤(6)中上清溶液移至吸附柱中心，室温离心，12,000rpm，30s，倒掉收集管中液体。

(8)向吸附柱中心加入500μL Buffer DW1，室温离心，12,000rpm，30s，倒掉收集管中液体。

(9)向吸附柱中心加入500μL wash solution，室温离心，12,000rpm，30s，倒掉收集管中液体。重复一次。

(10)空吸附柱，室温离心，12,000rpm，2min。

(11)将吸附柱放入一个干净的1.5ml离心管中，向吸附膜中心加入30μLElutionbuffer，室温静置5min，室温离心，12,000rpm，2min，4℃保存管中DNA溶液。

2.2.5.2 PCR鉴定

(1)标记好需要用到的PCR管，按照下表进行加样、混匀，反应体系为25μL：

(2)PCR扩增程序：

(3)测序：将pcr鉴定阳性的质粒送测序公司进行测序。

2.3 14.4-E2-G418重组质粒的构建方法同2.2

实施例3：CHO-K1细胞的转染

(1)准备：生物安全柜紫外灭菌30min；F-12培养液置于37℃水浴锅预热至37℃。

(2)将2.5μg重组DNA、P3000加入到125μl OPTI-MEM培养液中，混匀。将3.75μllipotectamine3000加入到125μl OPTI-MEM培养液中，混匀。将脂质体与重组DNA混合，室温静止10min。

(3)从37℃培养箱中取出24小时前平铺的6孔板细胞，弃去上清培养基，用预温的OPTI-MEM培养液洗细胞三次，并弃去OPTI-MEM培养液。

(4)每个细胞孔加入2ml 10％、1％双抗的胎牛血清的F-12培养液。

(5)将重组DNA与脂质体的混合物轻轻加入到每孔细胞中，轻轻混匀，在37℃，5％CO2细胞培养箱中培养。

(6)转染后72小时，收取上清，进行蛋白检测，同时将细胞加入G418进行加压筛选。

(7)144小时后，将单克隆细胞进行检测，将阳性的细胞进行扩增。可用于大生产制备蛋白。

实施例4：蛋白纯化与检测

4.1重组E2蛋白在CHO细胞内的表达与鉴定

将实施例3挑选的细胞，37℃培养至240小时，每48小时收集样品，共收集5次，将5次收集的蛋白液进行SDS-PAGE蛋白分析。结果发现优化前的E2基因在CHO细胞中没有表达，而优化的E2基因在CHO细胞中有表达。

4.2重组E2蛋白的层析纯化

将收集的E2上清液，用GE的Ni Sepharose excel介质进行亲和层析。收集的上清5000rpm离心5min，作为上样液。

4.2.1用5倍柱体积的蒸馏水清洗介质。

4.2.2用5倍柱体积的平衡缓冲液清洗介质。

4.2.3上样，柱子每毫升可挂4mg蛋白。

4.2.4用20倍柱体积的洗涤缓冲液清洗介质。

4.2.5用5倍柱体积的洗脱缓冲液将蛋白洗脱。

4.3 westernblot试验

将猪瘟全病毒和4.2制备的蛋白同时进行SDS-PAGE，采用半干法20伏转印30min，将目的蛋白条带转移到PVDF膜，转印膜用封闭液封闭过夜，PBST洗涤3次，1∶500稀释的猪瘟病毒阳性血清37℃作用1.5h，PBST洗3次，用1∶2000稀释的HRP标记的羊抗猪酶标抗体37℃作用1.5h，PBST洗涤3次，底物溶液作用5min，在chemiDOC进行显色，结果全病毒条带很弱，而优化后的核苷酸序列为SEQ ID NO:4的基因在CHO细胞内表达的E2蛋白条带很亮，说明表达的E2蛋白免疫原性好。

4.4间接免疫荧光对细胞进行固定、透明、封闭等步骤之后，加入His标签单抗，37℃孵育2h后，使用PBS洗涤3次，加入绿色荧光二抗37℃孵育1h。使用倒置荧光显微镜进行观察并拍照保存。结果转染优化前的E2基因的CHO细胞没有特异性荧光，转染优化后的E2基因的CHO细胞特异性荧光强。

实施例5疫苗的制备及效果检测

1、疫苗的制备

(1)将201佐剂116℃高压40分钟，进行灭菌。使用前37℃水浴至201佐剂温度维持在37℃左右。

(2)水相制备将4.2纯化的蛋白液与无菌生理盐水适当比例混合，使每0.2ml水相中含蛋白含量不低于10ug/ml。

(3)乳化取相同重量的油相和水相，以10000r/min，乳化5分钟。乳化后，取10ml，以3000r/min离心15分钟，管底析出的水相应不超过0.5ml。

2、疫苗的效力检验

1)对兔子的免疫检测法将2.5kg的大耳白兔10只，分两组。免疫组5只兔，皮下注射0.2ml的亚单位疫苗，另5只不免疫做空白对照。免后21日，耳静脉采血，分离血清，进行ELISA抗体检测。结果显示，免疫组抗体均为阳性，阻断率均高于60％，而对照组抗体均为阴性，阻断率均在30％以下(详见表1)。

表1亚单位疫苗免兔后21日抗体检测

注：“/”指对照组未免疫；

2)对猪的免疫原性结果用健康易感(猪瘟抗原、ELISA抗体均为阴性)猪15头，随机分为3组，每组5头。第1组为免疫全病毒组，各肌肉注射疫苗1.0ml，一免后21日用相同的疫苗，同等剂量进行二免；第2组为免疫市场已有的疫苗组，各肌肉注射疫苗1.0ml，一免后21日用相同的疫苗，同等剂量进行二免；第三组不免疫作为对照组。二免后14日，采血，检测猪瘟病毒ELISA抗体，然后所有猪各颈部肌肉注射实施例1分离的毒株1.0ml(含不少于10^5.0MLD)，观察16日。观察期内如有死亡猪，立即剖检，剩余猪试验结束时(攻毒后16日)全部剖检，记录试验结果。

结果表明亚单位组、市场疫苗组5头仔猪抗体均为阳性，阻断率分别为80％、60％、，对照组抗体均为阴性，阻断率均在30％以下。攻毒后，对照全部死亡，亚单位组均保护，而市场疫苗组3只保护，2只发病。(详见表3)。

表3：表达E2蛋白免疫原性试验猪一免后35日抗体检测结果

注：“1.0+1.0”指免疫组免疫两次，每次1.0ml/头；“/”指对照组未免疫。

综上，本发明的E2亚单位疫苗对于流行毒株的攻毒防护效果最好，表明流行毒株已发生了变异，目前市场的疫苗已经不能保护流行毒株的攻击。针对流行毒株的疫苗迫在眉睫，而我们的E2蛋白亚单位疫苗安全、稳定、保护效果好，市场前景很好。

序列表

<110> 青岛易邦生物工程有限公司

<120> 一种猪瘟E2蛋白亚单位疫苗

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 373

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Arg Leu Ser Cys Lys Glu Asp Tyr Arg Tyr Ala Ile Ser Ser Thr Asn

1 5 10 15

Glu Ile Gly Pro Leu Gly Ala Glu Gly Leu Thr Thr Thr Trp Lys Glu

20 25 30

Tyr Asn His Gly Leu Gln Leu Asp Asp Gly Thr Val Arg Ala Ile Cys

35 40 45

Thr Ala Gly Ser Phe Lys Val Thr Ala Leu Asn Val Val Ser Arg Arg

50 55 60

Tyr Leu Ala Ser Leu His Lys Arg Ala Leu Ser Thr Ser Val Thr Phe

65 70 75 80

Glu Leu Leu Phe Asp Gly Thr Thr Pro Gly Ile Glu Glu Met Gly Asp

85 90 95

Asp Phe Gly Phe Gly Leu Cys Pro Phe Asp Thr Ile Pro Val Val Lys

100 105 110

Gly Lys Tyr Asn Thr Thr Leu Leu Asn Gly Ser Ala Phe Tyr Leu Val

115 120 125

Cys Pro Ile Gly Trp Thr Gly Val Ile Glu Cys Thr Ala Val Ser Pro

130 135 140

Thr Thr Leu Arg Thr Glu Val Val Lys Thr Phe Lys Arg Glu Lys Pro

145 150 155 160

Phe Pro His Arg Val Asp Cys Val Thr Thr Ile Val Glu Lys Glu Asp

165 170 175

Leu Phe Tyr Cys Lys Ile Gly Gly Asn Trp Thr Cys Val Lys Gly Asn

180 185 190

Pro Val Thr Tyr Met Gly Gly Gln Val Lys Gln Cys Arg Trp Cys Gly

195 200 205

Phe Asp Phe Lys Glu Pro Asp Gly Leu Pro His Tyr Pro Ile Gly Lys

210 215 220

Cys Ile Leu Ala Asn Glu Thr Gly Tyr Arg Val Val Asp Ser Thr Asp

225 230 235 240

Cys Asn Arg Glu Gly Val Val Ile Ser Thr Glu Gly Glu His Glu Cys

245 250 255

Leu Ile Gly Asn Thr Thr Val Lys Val His Ala Leu Asp Glu Arg Leu

260 265 270

Ala Pro Met Pro Cys Arg Pro Lys Glu Ile Val Ser Ser Ala Gly Pro

275 280 285

Val Arg Lys Thr Ser Cys Thr Phe Asn Tyr Thr Lys Thr Leu Arg Asn

290 295 300

Lys Tyr Tyr Glu Pro Arg Asp Ser Tyr Phe Gln Gln Tyr Met Leu Lys

305 310 315 320

Gly Glu Tyr Gln Tyr Trp Phe Asp Leu Asp Val Thr Asp His His Thr

325 330 335

Asp Tyr Phe Ala Glu Phe Ile Val Leu Val Val Val Ala Leu Leu Gly

340 345 350

Gly Arg Tyr Val Leu Trp Leu Ile Val Thr Tyr Ile Val Leu Thr Glu

355 360 365

Gln Leu Ala Ala Gly

370

<210> 2

<211> 1119

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cggttgtcct gtaaggaaga ctacaggtat gctatatcat caaccaatga gatagggcca 60

ctaggggctg aaggtctcac caccacttgg aaagaataca accacggctt gcagctggac 120

gacgggactg tcagggccat ttgcactgca gggtctttca aagttacagc acttaatgtg 180

gttagtagga ggtacctagc atcattacat aagagggctt tgtccacctc agttacattt 240

gaactcctat ttgatgggac caccccaggt attgaggaaa tgggagatga cttcggattt 300

gggctgtgcc cttttgacac aatccctgtg gtcaaaggga agtacaacac cactttatta 360

aacggcagtg ctttctatct agtctgccca atagggtgga cgggcgtcat agagtgcacg 420

gcagtgagcc ccactacctt gagaacagaa gtggtaaaaa cctttaagag agagaagccc 480

ttcccgcaca gagtggattg cgtgaccact atagtagaaa aagaggacct gttctactgc 540

aagatcgggg gcaattggac atgtgtgaaa ggcaacccgg tgacctacat gggggggcaa 600

gtaaagcaat gcaggtggtg cgggtttgac ttcaaagaac ccgatgggct cccgcattac 660

cccataggca agtgcatcct agcaaatgag acgggttaca gggtagtgga ttccacagac 720

tgcaacagag aaggtgttgt tataagtact gaaggagaac atgagtgctt gatcggcaac 780

accaccgtaa aagtacacgc gttggatgaa agactggccc ctatgccgtg tagacccaaa 840

gagatcgtct ctagtgcggg acctgtaagg aaaacttctt gcactttcaa ctatacaaag 900

actctaagaa acaagtacta tgagcctagg gacagctact tccagcagta tatgcttaag 960

ggagagtacc aatactggtt tgatctggac gtgactgacc accacacaga ctactttgct 1020

gaatttattg tcttggtggt agtggcacta ttagggggaa ggtacgttct gtggctaata 1080

gtaacctaca tagtactaac agagcaactt gctgccggt 1119

<210> 3

<211> 318

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Glu Gly Leu Thr Thr Thr Trp Lys Glu Tyr Asn His Gly Leu Gln Leu

1 5 10 15

Asp Asp Gly Thr Val Arg Ala Ile Cys Thr Ala Gly Ser Phe Lys Val

20 25 30

Thr Ala Leu Asn Val Val Ser Arg Arg Tyr Leu Ala Ser Leu His Lys

35 40 45

Arg Ala Leu Ser Thr Ser Val Thr Phe Glu Leu Leu Phe Asp Gly Thr

50 55 60

Thr Pro Gly Ile Glu Glu Met Gly Asp Asp Phe Gly Phe Gly Leu Cys

65 70 75 80

Pro Phe Asp Thr Ile Pro Val Val Lys Gly Lys Tyr Asn Thr Thr Leu

85 90 95

Leu Asn Gly Ser Ala Phe Tyr Leu Val Cys Pro Ile Gly Trp Thr Gly

100 105 110

Val Ile Glu Cys Thr Ala Val Ser Pro Thr Thr Leu Arg Thr Glu Val

115 120 125

Val Lys Thr Phe Lys Arg Glu Lys Pro Phe Pro His Arg Val Asp Cys

130 135 140

Val Thr Thr Ile Val Glu Lys Glu Asp Leu Phe Tyr Cys Lys Ile Gly

145 150 155 160

Gly Asn Trp Thr Cys Val Lys Gly Asn Pro Val Thr Tyr Met Gly Gly

165 170 175

Gln Val Lys Gln Cys Arg Trp Cys Gly Phe Asp Phe Lys Glu Pro Asp

180 185 190

Gly Leu Pro His Tyr Pro Ile Gly Lys Cys Ile Leu Ala Asn Glu Thr

195 200 205

Gly Tyr Arg Val Val Asp Ser Thr Asp Cys Asn Arg Glu Gly Val Val

210 215 220

Ile Ser Thr Glu Gly Glu His Glu Cys Leu Ile Gly Asn Thr Thr Val

225 230 235 240

Lys Val His Ala Leu Asp Glu Arg Leu Ala Pro Met Pro Cys Arg Pro

245 250 255

Lys Glu Ile Val Ser Ser Ala Gly Pro Val Arg Lys Thr Ser Cys Thr

260 265 270

Phe Asn Tyr Thr Lys Thr Leu Arg Asn Lys Tyr Tyr Glu Pro Arg Asp

275 280 285

Ser Tyr Phe Gln Gln Tyr Met Leu Lys Gly Glu Tyr Gln Tyr Trp Phe

290 295 300

Asp Leu Asp Val Thr Asp His His Thr Asp Tyr Phe Ala Glu

305 310 315

<210> 4

<211> 960

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atggaagggc tcaccacaac ctggaaagaa tacaaccacg ggttgcagct tgacgacggt 60

acagtgaggg ccatctgtac agcaggatct tttaaggtga ccgctttgaa tgttgtttca 120

cggcggtatc tggcaagtct tcacaaaagg gcactctcca caagtgttac tttcgagctc 180

ctttttgacg gcaccacacc cggcatcgaa gagatggggg acgattttgg attcggattg 240

tgtcctttcg acactattcc agttgtcaag ggtaagtaca acactactct gctcaacgga 300

tccgcattct atcttgtctg tcctatcggt tggacaggtg ttattgaatg caccgctgtc 360

agtccaacta ccctgagaac tgaagtcgtt aaaaccttca aaagggaaaa gcccttcccc 420

caccgcgttg attgcgtcac aactattgtg gaaaaagaag atttgttcta ctgtaagata 480

ggaggcaatt ggacctgtgt caaaggaaat cccgttacct acatgggcgg acaggtgaaa 540

cagtgtagat ggtgtggttt cgacttcaaa gaacctgacg gacttccaca ttaccctatc 600

ggtaaatgta tattggcaaa tgaaacaggg taccgagtag ttgactctac cgattgcaac 660

cgcgagggtg tcgtaatttc tactgaggga gagcacgaat gcctgatagg aaacacaacc 720

gtgaaagtac atgctcttga cgaacgactc gcacccatgc catgccgccc aaaggaaatc 780

gtctcatctg ccggacctgt gcgaaaaact tcctgtacct tcaactacac caagactctg 840

agaaataagt attatgaacc cagagattct tatttccagc agtatatgct gaaaggagag 900

tatcagtatt ggttcgatct cgacgttaca gaccatcaca ctgactactt tgcagaataa 960

Claims

1.一种用于表达E2蛋白的细胞株，其特征在于，所述的细胞株为包含有编码E2蛋白的核苷酸片段的CHO细胞株；所述的E2蛋白，其氨基酸序列为SEQ ID NO:3。

2.如权利要求1所述的细胞株，其特征在于，所述的核苷酸片段，其序列为SEQ ID NO:4。

3.权利要求1或2所述的细胞株在重组表达猪瘟病毒E2蛋白中的应用。

4.一种E2蛋白，其特征在于，所述的E2蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:3。

5.权利要求4所述的E2蛋白在制备亚单位疫苗中的应用。

6.一种猪瘟病毒亚单位疫苗，其特征在于，所述的亚单位疫苗包含有抗原和疫苗佐剂，其所用的抗原为权利要求4所述的E2蛋白。