CN110845584B - 一种猪瘟病毒囊膜蛋白寡聚蛋白体及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种猪瘟病毒囊膜蛋白寡聚蛋白体及其制备方法和应用。寡聚蛋白体包括猪瘟病毒囊膜蛋白分子和外源寡聚化结构片段，猪瘟病毒囊膜蛋白分子选自猪瘟病毒囊膜蛋白E2分子、猪瘟病毒囊膜蛋白E0分子，猪瘟病毒囊膜蛋白E2分子与外源寡聚化结构片段形成E2寡聚蛋白体，猪瘟病毒囊膜蛋白E0分子与外源寡聚化结构片段形成E0寡聚蛋白体。将E2、E0寡聚蛋白体作为疫苗抗原，不含任何猪瘟病毒的遗传物质RNA，生产和使用均安全。E2及E0寡聚蛋白体中的各囊膜蛋白保持其天然结构及生物活性，做为疫苗抗原免疫效果显著；寡聚蛋白体将抗原的多个亚单位蛋白聚合在一起，克服了亚单位蛋白疫苗的弱点，疫苗免疫原性显著提高，且抗原含量高，容易生产和纯化。

Description

一种猪瘟病毒囊膜蛋白寡聚蛋白体及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物工程及病毒疫苗技术领域，尤其涉及猪瘟病毒囊膜蛋白E2及E0寡聚蛋白体及其制备方法、包含有猪瘟病毒囊膜蛋白E2及E0寡聚蛋白体的新型疫苗，以及在制备猪瘟病毒抗体检测制剂或猪瘟病毒疫病监测制剂中的应用。
背景技术
猪瘟(Classic Swine Fever，CSF)是由猪瘟病毒(Classic Swine Fever Virus，CSFV)引起的猪的一种急性、热性、高度接触性传染病，目前可分为急性、亚急性、慢性和非典型猪瘟。急性猪瘟由强毒株引发，一般导致猪的高发病率和高死亡率。除引起败血症外，猪瘟病毒还可引起一系列临床表现，如妊娠母猪流产、胎儿畸形、慢性营养消耗、淋巴细胞和血小板减少等免疫系统病变，并容易继发和并发细菌或其他病毒感染。猪瘟给世界养猪业造成了巨大的经济损失。世界动物卫生组织(OIE)将其列入OIE疫病名录(OIE-listeddiseases)，为须申报的(Notifiable)动物传染病，我国也将其列为一类动物传染病。
猪瘟病毒为黄病毒科瘟病毒属成员，病毒粒子呈球形，是有囊膜的单股正链RNA病毒。基因组全长12.3kb，含有一个大的开放阅读框(Open reading frame，ORF)，该阅读框编码一个含3898个氨基酸的多聚蛋白，此多聚蛋白在宿主细胞和病毒自身蛋白酶作用下，加工形成4个结构蛋白(C、E0、E1和E2)和8个非结构蛋白(Npro、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B)。其中囊膜糖蛋白E0和E2是两个保护性抗原蛋白，可以诱导机体产生抗猪瘟的保护性免疫抗体。
近年来，猪瘟在亚洲、欧洲、南美洲等地区呈现复发的趋势，且现代猪瘟的流行趋势发生了很大变化，呈现典型猪瘟和非典型猪瘟共存，隐性感染和持续感染并现，免疫失败的现象亦时有发生。这种新的流行形式给全世界养猪业提出了新的挑战，加上用传统弱毒疫苗免疫动物后，无法区分被野毒感染与主动免疫的动物(Differentiating Infectedfrom Vaccinated Animals，DIVA)，已经不能满足现代防控和根除猪瘟的要求了。因此，研制安全、高效且具有DIVA特性的新型猪瘟疫苗对于预防和控制该病具有重要意义。
虽然近年来研制的新型猪瘟疫苗具有各自的优势，但也存在一定的缺陷。如核酸疫苗诱导产生抗体的速度慢，接种剂量大，有整合和转化染色体的潜在危险；病毒活载体疫苗对人类而言，因还不完全了解病毒的自然发生及变异机制，无法控制该类病毒的未来走向；亚单位疫苗免疫原性通常要比病毒颗粒抗原差，不能提供有效保护；基因缺失疫苗通常为弱毒活苗，其长期使用可能会改变猪瘟病毒原有的生态环境和病毒群落，使猪瘟流行毒株向远离疫苗毒的方向演化，且很难达到现代防控和根除猪瘟疫病的要求。
寡聚蛋白体，也叫多聚蛋白质或多亚基蛋白体，是指由两个或两个以上亚基蛋白组成的蛋白体。与单亚基蛋白质相比，寡聚蛋白体的分子体积大，多亚基协同，能产生变构效应以利于细胞识别和功能调节，可以做为理想的疫苗抗原。
鉴于此，本发明提供一种猪瘟病毒囊膜蛋白寡聚蛋白体及其疫苗，克服传统疫苗的不足，弥补其它基因工程疫苗的缺憾，从而有效提高疫苗的免疫原性。
发明内容
为了克服现有技术的上述不足，本发明提供了猪瘟病毒囊膜蛋白E2、E0寡聚蛋白体及其制备方法、包含有猪瘟病毒囊膜蛋白E2及E0寡聚蛋白体的新型疫苗，以及在制备猪瘟病毒抗体检测制剂或猪瘟病毒疫病监测制剂中的应用。
为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案实现的：
本发明的第一个目的是提供一种猪瘟病毒囊膜蛋白寡聚蛋白体，包括猪瘟病毒囊膜蛋白分子和外源寡聚化结构片段；所述猪瘟病毒囊膜蛋白分子选自猪瘟病毒囊膜蛋白E2分子、猪瘟病毒囊膜蛋白E0分子中的任一种；所述猪瘟病毒囊膜蛋白E2分子与外源寡聚化结构片段形成E2寡聚蛋白体，所述猪瘟病毒囊膜蛋白E0分子与外源寡聚化结构片段形成E0寡聚蛋白体。
进一步地，所述E2寡聚蛋白体是由2个、3个或4个外源寡聚化结构片段分别对应地将2个、3个或4个E2蛋白分子链接成E2二聚蛋白体、E2三聚蛋白体或E2四聚蛋白体。
进一步地，所述E0寡聚蛋白体是由2个、3个或4个外源寡聚化结构片段分别对应地将2个、3个或4个E0蛋白分子链接成E0二聚蛋白体、E0三聚蛋白体或E0四聚蛋白体。
更进一步地，所述外源寡聚化结构片段选自西尼罗病毒C蛋白寡聚化结构片段WNV-Alpha4、酵母转录因子GCN4中的任一种。
进一步地，所述猪瘟病毒囊膜蛋白E0和猪瘟病毒囊膜蛋白E2均来源于猪瘟病毒所有基因亚型毒株。
更进一步地，所述猪瘟病毒囊膜蛋白E0和猪瘟病毒囊膜蛋白E2均来源于猪瘟病毒2.1基因亚型株。
本发明的第二个目的是提供上述任一项所述的猪瘟病毒囊膜蛋白寡聚蛋白体的制备方法，包括如下步骤：
(1)人工合成寡聚蛋白体的单个融合亚基多肽基因，并将该基因克隆至质粒载体，获得猪瘟病毒囊膜蛋白寡聚蛋白体的重组表达质粒载体；所述单个融合亚基多肽基因包括亚基多肽、G6S9短肽链接、外源寡聚化结构片段及组氨酸标签短肽；
(2)将所述猪瘟病毒囊膜蛋白寡聚蛋白体的重组表达质粒载体转染宿主细胞，回收宿主细胞培养上清液，提取纯化猪瘟病毒囊膜蛋白寡聚蛋白体。
进一步地，所述质粒载体选自昆虫杆状病毒质粒、哺乳细胞表达系统质粒、细菌表达系统质粒、酵母表达系统质粒中的任一种。
进一步地，所述宿主细胞选自昆虫细胞、哺乳细胞、大肠杆菌细胞，酵母细胞中的任一种。
本发明的第三个目的是提供一种疫苗，所述疫苗包括上述任一项所述的猪瘟病毒囊膜蛋白寡聚蛋白体，所述寡聚蛋白体选自E2寡聚蛋白体、E0寡聚蛋白体中的一种或两种。
进一步地，所述疫苗还包括佐剂，所述佐剂选自水包油包水型佐剂、水包白油型佐剂、角鲨烯佐剂、植物油佐剂、纳米佐剂或弗氏佐剂中的至少一种。
本发明的第四个目的是提供上述任一项所述的猪瘟病毒囊膜蛋白寡聚蛋白体在制备猪瘟病毒抗体检测制剂或猪瘟病毒疫病监测制剂中的应用，所述制剂包含ELISA检测试剂盒、胶体金试纸条、化学发光检测盒或荧光发光检测盒中的任一种。
寡聚蛋白体是指由两个或两个以上亚基蛋白组成的蛋白体，与单亚基蛋白质相比，寡聚蛋白体的分子体积大，多亚基协同能产生变构效应以利于细胞识别和功能调节，可以做为理想的疫苗抗原。因此，与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
(1)本发明通过重组载体表达得到带有特别聚合功能的寡聚化结构片段、G6S9短肽链接及猪瘟病毒囊膜蛋白E2或囊膜蛋白E0的融合大分子，后者再自组装成E2寡聚蛋白体或E0寡聚蛋白体；将E2及E0寡聚蛋白体用于制备疫苗，由于不含任何猪瘟病毒的遗传物质RNA，因而生产和使用均安全；同时，抗原性好，抗体效价高，保护效果明显，适用范围广，可作为标记疫苗使用，符合我国政府进行猪瘟净化的战略要求，具有较好的实际应用价值。
(2)本发明通过构建的猪瘟病毒囊膜蛋白寡聚蛋白体重组质粒转染宿主细胞，得到细胞培养液，回收并纯化细胞培养液获得猪瘟病毒囊膜蛋白寡聚蛋白体，该方法表达水平高，安全性好，表达产物可保持天然结构、生物活性和免疫活性，且易于大规模生产和纯化猪瘟病毒囊膜蛋白寡聚蛋白体。
附图说明
图1为本发明实施例1提供的E2四亚基寡聚蛋白体的重组表达质粒E2-T的结构示意图。
图2为本发明实施例1提供的E0四亚基寡聚蛋白体的重组表达质粒E0-T的结构示意图。
图3为本发明实施例1中PCR检测带有表达质粒E2-T的重组杆状病毒DNA含有E2基因片段的凝胶电泳结果图。
图4为本发明实施例1中PCR检测带有表达质粒E0-T的重组杆状病毒DNA含有E0基因片段的凝胶电泳结果图。
图5为本发明实施例2提供的E0-T四亚基寡聚蛋白体纯化前、后进行SDS蛋白变性电泳胶的结果。
图6为本发明实施例2提供的E0-T四亚基寡聚蛋白体纯化后进行western blots的定性结果。
图7为本发明实施例2提供的E2-T四亚基寡聚蛋白体纯化前、后进行SDS蛋白变性电泳胶的结果。
图8为本发明实施例2提供的E2-T四亚基寡聚蛋白体纯化后进行western blots的定性结果。
图9为纯化后的E2-T寡聚蛋白体、E2-S蛋白经变性或还原条件处理后的westernblots比较结果。
图10为纯化后的E0-T寡聚蛋白体、E0-S蛋白经变性或还原条件处理后的westernblots比较结果。
图11为本发明实施例4提供的ELISA检测E2-T疫苗免疫小鼠的抗体水平示意图。
图12为本发明实施例5提供的ELISA检测E2-T疫苗免疫大白兔的抗体水平示意图。
图13为本发明实施例6提供的ELISA检测E2-T抗原+E0-T抗原制备的二价疫苗免疫小鼠后的E2抗体水平示意图。
图14为本发明实施例6提供的ELISA检测E2-T抗原+E0-T抗原制备的二价疫苗免疫小鼠后的E0抗体水平示意图。
具体实施方式
展示一下实例来具体说明本发明的某些实施例，且不应解释为限制本发明的范围。对本发明公开的内容可以同时从材料、方法和反应条件进行改进，所有这些改进，均应落入本发明的的精神和范围之内。
实施例1：
本实施例提供猪瘟病毒囊膜蛋白E2寡聚蛋白体和E0寡聚蛋白体表达载体的构建及检测。
1、人工合成寡聚蛋白体的单个融合亚基的DNA片段
本实施例中猪瘟病毒囊膜蛋白E2寡聚蛋白体包含4个特殊构建的囊膜蛋白E2融合亚基，每个融合亚基由四部分构成：E2亚基多肽、G6S9短肽链接、西尼罗病毒C蛋白寡聚化结构片段(WNV-Alpha4)及组氨酸(His)标签短肽。同样地，猪瘟病毒囊膜蛋白E0寡聚蛋白体亦包含四个特殊构建的囊膜蛋白E0融合亚基，每个融合亚基由四部分构成：E0亚基多肽、G6S9短肽链接、西尼罗病毒C蛋白寡聚化结构片段(WNV-Alpha4)及组氨酸(His)标签短肽。
特殊构建的E2寡聚蛋白体单个融合亚基的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其碱基序列如SEQ ID NO.2所示。特殊构建的E0寡聚蛋白体单个融合亚基的氨基酸序列如SEQID NO.3所示，其碱基序列如SEQ ID NO.4所示。
猪瘟病毒的表面抗原是E0和E2囊膜蛋白。由于氨基酸密码子的简并性，一个确定的蛋白氨基酸序列，可以有成千上万种表达序列，因此，表达猪瘟E0囊膜蛋白和E2囊膜蛋白的碱基序列并不唯一，本实施例中E0囊膜蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，其碱基序列如SEQ ID NO.6所示，E2囊膜蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，其碱基序列如SEQID NO.8所示。
根据猪瘟病毒2.1基因亚型毒株的流行趋势同时结合抗原分析和密码子优化，人工合成了E2寡聚蛋白体的单个融合亚基E2-G6S9-WNVAlpha4-His的DNA片段，以及E0寡聚蛋白体的单个融合亚基E0-G6S9-WNVAlpha4-His的DNA片段。
2、构建猪瘟病毒囊膜蛋白寡聚蛋白体的重组表达质粒载体
本实施例中，构建重组猪瘟病毒囊膜蛋白E2四亚基寡聚蛋白体的重组质粒表述为表达载体E2-T，构建重组猪瘟病毒囊膜蛋白E0四亚基寡聚蛋白体的重组质粒表述为表达载体E0-T。
(1)构建重组杆状病毒穿梭质粒
以E2-T重组杆状病毒穿梭质粒的构建为例简介实验步骤如下：用PCR扩增人工合成的E2-G6S9-WNVAlpha4-His DNA片段。扩增的DNA片段经过柱抽提纯化后，用限制性内切酶37℃两小时水解。跑凝胶电泳及再次过柱抽提纯化，备用。昆虫杆状病毒表达质粒pFastBac经同样限制性内切酶37℃两小时水解后，用上述同样方法纯化处理。在T4 DNA连接酶作用下，将上述处理好的E2-G6S9-WNVAlpha4-His DNA片段连接到经处理后的pFastBac质粒载体上。将所得的重组质粒转化DH5α感受态细胞，采用菌落蓝白斑筛选法，挑选白色菌落进行PCR反应；37℃摇床培养所选的PCR验证阳性的白色菌落细菌，进行DNA质粒抽提，获得重组穿梭质粒pFastBac-E2-G6S9-WNVAlpha4-His。
(2)构建重组蛋白表达载体
用以上所述重组杆状病毒穿梭质粒pFastBac-E2-G6S9-WNVAlpha4-His转化DH10Bac感受态细胞，采用菌落蓝白斑筛选法，挑选白色菌落，PCR反应确定出阳性菌落。37℃摇床培养所选阳性菌落细菌，进行DNA质粒抽提，获得重组蛋白表达质粒Bacmid，简称为表达载体E2-T，简化结构图如图1所示。
表达载体E0-T的构建方法及操作步骤完全如上所述。表达载体E0-T简化结构图如图2所示。
3、表达猪瘟病毒囊膜蛋白寡聚蛋白体的重组杆状病毒的制备及检测
在一个6孔细胞培养板中铺上昆虫细胞sf-9，分别用获得的重组杆状病毒表达载体E2-T或E0-T做细胞转染，六天后分别收获含有对应的重组杆状病毒的细胞培养上清液。加入含有SDS的裂解液至细胞上清液中裂解重组杆状病毒，用氯仿抽提、乙醇沉淀获得各重组杆状病毒DNA。分别以各DNA做模板，加入对应的PCR引物，进行PCR扩增反应。
其中，E2基因的上游引物序列为SEQ ID No.9所示序列；
E2基因的下游引物序列为SEQ ID No.10所示序列；
E0基因的上游引物序列为SEQ ID No.11所示序列；
E0基因的下游引物序列为SEQ ID No.12所示序列；
电泳凝胶检测PCR扩增结果如图3和图4所示。从这两图中可以看出，扩增的目的条带与目的基因片段大小一致，说明E2-T和E0-T两个表达载体构建均正确，所获得的两种重组杆状病毒均分别带有所需的外源目的基因。
实施例2：
本实施例提供猪瘟病毒囊膜蛋白E2和E0四亚基寡聚蛋白体的制备方法、纯化方法和检测所表达的目的蛋白。
1、制备含有猪瘟病毒囊膜蛋白E2/E0四亚基寡聚蛋白体的细胞上清液
本实施例以表达制备猪瘟病毒囊膜蛋白E2四亚基寡聚蛋白体为例进行说明：在一个6孔细胞培养板中铺上昆虫细胞sf-9，采用脂质法将重组杆状病毒表达质粒E2-T进行转染，六天后收取细胞上清液，获得第一代重组杆状病毒毒种，称为P1代。用P1代毒种感染昆虫细胞进行毒种放大，获得第二代重组杆状病毒毒种，称为P2代。再用P2代毒种感染昆虫细胞进行毒种放大，获得P3代。以P3代作为生产毒种，制备猪瘟病毒囊膜蛋白E2四亚基寡聚蛋白体。简言之，将生长状态良好的Sf-9细胞接种到摇瓶中悬浮培养，待细胞成长至对数生长期时，稀释细胞浓度至每毫升3.0×106个细胞。将P3代毒种按MOI为0.1比率接种到细胞摇瓶中，3至4天后收获细胞上清液。
用上述同样方法制备出含有猪瘟病毒囊膜蛋白E0四亚基寡聚蛋白体的细胞上清液。
2、纯化猪瘟病毒囊膜蛋白寡聚蛋白体
因E2和E0这两个四亚基寡聚蛋白体的单个融合亚基多肽均含有组氨酸(His)标签短肽，故用亲和层析法分别纯化细胞上清液中的E2或E0四亚基寡聚蛋白体。具体纯化步骤简述如下：
用1M Tris将细胞上清液的PH值调制为PH 8.0。取1ml Ni-NTA填料装入盐析空柱中，用10-20ml平衡液(20mM Tris-HCl溶液PH 8.0)平衡Ni-NTA填料。将平衡好的Ni-NTA介质与待纯化的细胞上清液放入一个50毫升离心管中充分混合，让E2或E0四亚基寡聚蛋白体充分结合在Ni-NTA介质上。1000rpm离心5分钟，分离已结合E2或E0四亚基寡聚蛋白体的Ni-NTA介质。用20ml洗杂液(20mM Tris-HCl,0.5M NaCl,20mM咪唑,pH 8.0)清洗所述结合介质中的杂蛋白，再用洗脱液(20mM的Tris-HCl，0.5M NaCl，500mM咪唑，pH 8.0)进行洗脱，将结合介质中的E2或E0四亚基寡聚蛋白体纯化出来。
3、检测寡聚蛋白体纯化结果
采用SDS电泳分离胶及western blots检测上述E2或E0四亚基寡聚蛋白体纯化结果，操作方法如下：同时制备两块SDS电泳分离胶，一块用于考马斯亮蓝蛋白分离胶，另一块用于western blots检测。每个电泳样品分别加入10μl的样品液和10μl电泳上样液混合，进行SDS-PAGE电泳。电泳完毕后，用于进行蛋白染色的分离胶直接用考马斯亮蓝染色；用于做Western Blot的分离胶接着做印膜转印。采用商品化的抗E2蛋白兔源多抗(或抗E0蛋白兔源多抗)做为一抗进行孵育，再用羊抗兔的二抗孵育。用ECL化学发光试剂曝光及显影转印膜。图5显示的是纯化前细胞上清液、纯化后E0四亚基寡聚蛋白体经变性处理后SDS电泳胶显色结果。图6是纯化后的E0四亚基寡聚蛋白体经变性处理后的western blots定性结果。图7显示的是纯化前细胞上清液、纯化后E2四亚基寡聚蛋白体经变性处理后，SDS电泳胶显色结果。图8是纯化后E2四亚基寡聚蛋白体经变性处理后的western blots定性结果。所有结果均显示制备及纯化的蛋白为猪瘟囊膜蛋白E0或E2。
实施例3：
本实施例提供E2或E0四亚基寡聚蛋白体的聚合检测。
囊膜蛋白E2和E0在自然状态下多为二聚体形式存在。为了便于比较，含有E2-6XHis的表达质粒被构建并按上述方法进行制备和亲和纯化，命名为E2-S。E2四亚基寡聚蛋白体(在这里暂命名为E2-T以便比较)与E2-S蛋白经变性、还原性条件处理，并将处理前与处理后的样品进行Western blots检验。图9清晰显示出非还原状态下的四亚基寡聚蛋白体E2-T与囊膜蛋白E2二聚体的差别。说明制备纯化的样品即为E2四亚基寡聚蛋白体。
同样地，将E0-6XHis的表达质粒进行构建，制备并亲和纯化获得E0-6XHis蛋白，命名为E0-S。E0四亚基寡聚蛋白体(E0-T以便比较)与E0-S蛋白经变性、还原性条件处理，并将处理前与处理后的样品进行Western blots检验。图10清晰显示出非还原状态下的四亚基寡聚蛋白体E0-T与囊膜蛋白E0二聚体的差别。说明制备纯化的样品即为E0四亚基寡聚蛋白体。
实施例4：
本实施例验证制备的E2四亚基寡聚蛋白体疫苗能刺激小鼠体内产生抗体以及检测所产生的抗体效价。
1、E2四亚基寡聚蛋白体疫苗的制备
将制备并纯化好的E2四亚基寡聚蛋白体溶液与赛彼科佐剂(MONTANIDETMISA 201VG)按1：1(体积比)比率混匀，乳化成乳白色液体。取1ml乳液经5000rpm离心15分钟，不出现分层为乳化达标，疫苗制备完毕，用于免疫实验小鼠。
2、小鼠免疫试验
小鼠的免疫试验步骤如下：将12只6-8周龄的昆明小鼠分成二组，第一组10只，每只小鼠背部皮下多点注射总剂量为300μl的E2四亚基寡聚蛋白体疫苗。第二组2只，用于实验平行的阴性对照。一免后第28天加强注射一针，并于此二免后第24天采集血清，检测抗体滴度。
3、检测免疫小鼠的血清抗体效价
酶联免疫吸附间接法(ELISA)检测免疫小鼠的血清抗体效价，具体操作方法：10ml的包被液中加入10μl在实施例2中纯化好的E2四亚基寡聚蛋白体，混匀，ELISA板中每孔加入100μl，保鲜膜包好4℃过夜；第二天早上倒掉板中液体，加入PBS-T溶液200μl/孔，洗2-3次，拍干。加封闭液200μl/孔，保鲜膜包好，37℃反应2h。用PBS-T溶液200μl/孔洗3次，拍干；在酶标板上做好对应标记，用PBS按1：1000稀释采集的各实验小鼠抗体血清以及空白对照血清，混匀后在酶标板的第一排加入200μl，后边所有各排孔内先各加入100μl的PBS，之后从第一排吸取100μl稀释血清加入第二排，以此类推进行倍比稀释。最后一排不加倍比稀释血清，做为板孔的底色空白对照。加完后封好，37℃孵育1小时。倒掉反应液，加PBS-T 200μl/孔，洗涤3次，拍干；用PBS 1：5000稀释含偶联辣根过氧化物酶(HorseradishPeroxidase,HRP)的羊抗鼠二抗100μl/孔，37℃孵育45分钟；倒掉反应液，用PBS-T 200μl/孔洗涤3次，拍干；加入配好的TMB 100μl/孔，显色10-15分钟，加入终止液50μl/孔，用酶标仪取波长450测定每孔OD值(见表1)。根据空白对照孔的平均OD值，用常规cutoff公式(空白孔平均值+3x标准差SD)计算出cutoff值为0.3011，判定血清检测结果的抗体滴度，图11为ELISA检测E2四亚基寡聚蛋白体疫苗免疫小鼠后的抗体滴度示意图。
表1 ELISA检测E2四亚基寡聚蛋白体疫苗免疫小鼠的血清OD值
Figure BDA0002292265830000131
实施例5：
本实施例验证制备的E2四亚基寡聚蛋白体疫苗能刺激大白兔体内产生抗体以及检测产生的抗体效价。
E2四亚基寡聚蛋白体疫苗的制备方法如实施例4所述，即抗原与佐剂按1：1体积混匀，乳化成乳液状。取1ml乳液经5000rpm离心15分钟，不出现分层为乳化达标，疫苗制备完毕。本实施例制备的疫苗所用佐剂有两种，弗氏佐剂和赛彼科201佐剂。
兔子的免疫试验步骤如下：取背景干净的实验用日本大耳白兔(1.5公斤左右)4只，分成2组，每组2只，具体分组内容见表2。每只兔子在免疫前各取血10ml，作为阴性对照使用。第一次免疫，每只兔子背部皮下多点注射1000μl的E2四亚基寡聚蛋白体疫苗。一免后第28天加强注射一针并于二免后第10天采集血清，检测抗体滴度。
表2实验兔分组安排
Figure BDA0002292265830000132
酶联免疫吸附间接法(ELISA)检测免疫兔子的血清抗体效价，具体操作按实施例4所述方法执行。图12为用E2四亚基寡聚蛋白体疫苗免疫兔子的抗体滴度示意图。
实施例6：
本实施例验证用E2四亚基寡聚蛋白体+E0四亚基寡聚蛋白体作抗原制备的二价疫苗能有效刺激小鼠体内产生相应抗体以及检测产生的抗体效价。
E2四亚基寡聚蛋白体+E0四亚基寡聚蛋白体二价疫苗的制备方法大致如实施例4所述，即E2四亚基寡聚蛋白体与E0四亚基寡聚蛋白体按1：1体积混匀作为免疫抗原。混合的免疫抗原再与弗氏佐剂按1：1体积混匀，乳化成乳液状。取1ml乳液经5000rpm离心15分钟，不出现分层为乳化达标，疫苗制备完毕。
小鼠的免疫试验步骤如下：将12只6-8周龄的昆明小鼠分成二组，第一组10只，每只小鼠背部皮下多点注射总剂量为300μl的E2四亚基寡聚蛋白体+E0四亚基寡聚蛋白体二价疫苗。第二组2只，用于实验平行的阴性对照。一免后第28天加强注射一针，并于此二免后第24天采集血清，检测抗体滴度。
酶联免疫吸附间接法(ELISA)检测免疫小鼠的血清抗体效价，具体操作按实施例4所述方法执行。图13为用二价疫苗免疫的小鼠血清中E0抗体滴度示意图。图14为用二价疫苗免疫的小鼠血清中E2抗体滴度示意图。
实施例7：
本实施例用制备的E2四亚基寡聚蛋白体(E2-T)作为抗原，有效地鉴别商品猪瘟疫苗免疫后猪血清抗体的阴阳性。
从一个规模化养猪场随机采集到20头份猪血清，每份猪血清按1：40稀释；将市面上购买的商品猪瘟E2抗原蛋白(杭州亿米诺公司产品)配制成浓度2μl/ml，做为包板的抗原；将E2四亚基寡聚蛋白体(E2-T)细胞表达上清液按1：500稀释，也作为包板的抗原。用HRP-小鼠抗猪IgG单抗(北京百奥莱博公司产品)做为二抗，按1：2000稀释。
用酶联免疫吸附间接法(ELISA)检测稀释后的每头猪血清的抗体OD值，具体ELISA检测操作方法同实施例4。实验结果分析以cutoff值均设定为0.2，将检测到的各孔OD值与之对比，判定各血清检测结果的阴阳性。实验结果见表3。根据表3中数据的比较可以看出，E2四亚基寡聚蛋白体(E2-T)能有效地检测商品猪瘟疫苗所产生的猪只免疫抗体，且与商品E2抗原一样，能有效地鉴别检验猪只血清抗体的阴阳性。
表3猪血清抗体阴阳性的鉴别比较
Figure BDA0002292265830000151
综上所述，本发明提供的猪瘟病毒囊膜蛋白E2及E0四亚基寡聚蛋白体能作为抗原，使免疫动物小鼠和兔子产生免疫应答并产生相应的抗体，因此可以将猪瘟病毒囊膜蛋白E2及E0四亚基寡聚蛋白体作为抗原应用于疫苗的制备。同时猪瘟病毒囊膜蛋白E2及E0四亚基寡聚蛋白体也可以应用于制备猪瘟病毒抗体检测试剂或猪瘟病毒疫病监测制剂。
本发明实施例1-7中所涉及的E2寡聚蛋白体或E0寡聚蛋白体，对应包含4个特殊构建的囊膜蛋白E2融合亚基或4个特殊构建的囊膜蛋白E0融合亚基。但本发明的E2寡聚蛋白体还可以是由2个或3个特殊构建的囊膜蛋白E2融合亚基形成的E2二聚蛋白体、E2三聚蛋白体，E0寡聚蛋白体还可以是由2个或3个特殊构建的囊膜蛋白E0融合亚基形成的E0二聚蛋白体、E0三聚蛋白体。本发明中具有特别聚合功能的外源寡聚化结构片段除了实施例1-7中的西尼罗病毒C蛋白寡聚化结构片段WNV-Alpha4外，还可以是酵母转录因子GCN4。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 诺华生物科技（武汉）有限责任公司
许雁
<120> 一种猪瘟病毒囊膜蛋白寡聚蛋白体及其制备方法和应用
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 409
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Met Lys Val Leu Arg Gly Gln Ile Val Gln Gly Val Ile Trp Leu Leu
1               5                   10                  15
Leu Val Thr Gly Ala Gln Gly Arg Leu Ala Cys Lys Glu Asp Tyr Arg
            20                  25                  30
Tyr Ala Ile Ser Ser Thr Asn Glu Ile Gly Leu Leu Gly Ala Gly Gly
        35                  40                  45
Leu Thr Thr Thr Trp Lys Glu Tyr Ser His Asp Leu Gln Leu Asn Asp
    50                  55                  60
Gly Thr Val Lys Ala Ile Cys Val Ala Gly Ser Phe Lys Val Thr Ala
65                  70                  75                  80
Leu Asn Val Val Ser Arg Arg Tyr Leu Ala Ser Leu His Lys Gly Ala
                85                  90                  95
Leu Leu Thr Ser Val Thr Phe Glu Leu Leu Phe Asp Gly Thr Asn Pro
            100                 105                 110
Ser Thr Glu Glu Met Gly Asp Asp Phe Gly Phe Gly Leu Cys Pro Phe
        115                 120                 125
Asp Thr Ser Pro Val Val Lys Gly Lys Tyr Asn Thr Thr Leu Leu Asn
    130                 135                 140
Gly Ser Ala Phe Tyr Leu Val Cys Pro Ile Gly Trp Thr Gly Val Ile
145                 150                 155                 160
Glu Cys Thr Ala Val Ser Pro Thr Thr Leu Arg Thr Glu Val Val Lys
                165                 170                 175
Thr Phe Arg Arg Glu Lys Pro Phe Pro His Arg Met Asp Cys Val Thr
            180                 185                 190
Thr Thr Val Glu Asn Glu Asp Leu Phe Tyr Cys Lys Leu Gly Gly Asn
        195                 200                 205
Trp Thr Cys Val Lys Gly Glu Pro Val Val Tyr Thr Gly Gly Gln Val
    210                 215                 220
Lys Gln Cys Lys Trp Cys Gly Phe Asp Phe Asn Glu Pro Asp Gly Leu
225                 230                 235                 240
Pro His Tyr Pro Ile Gly Lys Cys Ile Leu Ala Asn Glu Thr Gly Tyr
                245                 250                 255
Arg Ile Val Asp Ser Thr Asp Cys Asn Arg Asp Gly Val Val Ile Ser
            260                 265                 270
Ala Glu Gly Ser His Glu Cys Leu Val Gly Asn Thr Thr Val Lys Val
        275                 280                 285
His Ala Ser Asp Glu Arg Leu Gly Pro Met Pro Cys Arg Pro Lys Glu
    290                 295                 300
Ile Val Ser Ser Ala Gly Pro Val Arg Lys Thr Ser Cys Thr Phe Asn
305                 310                 315                 320
Tyr Ala Lys Thr Leu Lys Asn Lys Tyr Tyr Glu Pro Arg Asp Ser Tyr
                325                 330                 335
Phe Gln Gln Tyr Met Leu Lys Gly Glu Tyr Gln Tyr Trp Phe Asp Leu
            340                 345                 350
Asp Val Thr Asp Arg His Ser Asp Tyr Phe Ala Glu Phe Gly Gly Gly
        355                 360                 365
Gly Gly Gly Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Lys Gln Thr Ala
    370                 375                 380
Met Lys His Leu Leu Ser Phe Lys Lys Glu Leu Gly Thr Leu Thr Ser
385                 390                 395                 400
Ala Ile Asn His His His His His His
                405
<210> 2
<211> 1230
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atgaaggtgc tgcgtggaca gatcgttcag ggtgttatct ggctcctgct cgttactgga 60
gcccaaggtc gtctcgcctg taaagaagat taccgttacg ccatcagctc aacaaacgaa 120
atcggtctgc tcggtgccgg tggtctcact acaacatgga aggaatacag ccacgacctc 180
caactcaacg acggtactgt taaggccatc tgtgtggccg gtagtttcaa ggttactgcc 240
ctcaacgttg tgagccgtcg ctatctggcc tctctgcata aaggtgccct gctgacttct 300
gttactttcg aactcctgtt cgacggtaca aaccctagca cagaagaaat gggcgacgac 360
ttcggtttcg gtctgtgtcc attcgacaca agcccagttg tcaagggcaa atacaacact 420
actctcctga acggctctgc cttctacctg gtctgcccaa tcggttggac tggcgtgatc 480
gaatgtacag ccgtctctcc tacaacactg cgcacagaag tcgtgaagac tttccgccgc 540
gaaaagccct ttccccatcg catggattgt gtgacaacta ctgtggaaaa cgaagacctg 600
ttctactgca agctgggcgg caactggaca tgcgtcaagg gcgaacccgt ggtgtatact 660
ggcggccaag tgaaacaatg caaatggtgc ggctttgatt tcaatgaacc cgatggcctg 720
ccccattacc ccattggcaa atgcattctg gccaatgaaa ctggctaccg cattgtggat 780
tctactgatt gcaatcgcga tggcgtcgtc atttcagccg aaggctctca cgaatgcctg 840
gtgggcaata caactgtcaa ggtccacgcc tcagatgaac gcctgggccc catgccctgc 900
cgccccaaag aaattgtgtc atcagccggc cccgtgcgca aaacttcttg cactttcaat 960
tatgccaaaa cactgaagaa taagtactac gaaccccgcg attcttactt ccagcaatac 1020
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tacttcgccg agtttggagg tggtggtggc ggttcctcta gttcatcctc cagctcctcc 1140
aagcagaccg ctatgaagca cctgctgtcc ttcaagaagg agctgggtac cctgacctcc 1200
gctatcaacc atcaccatca ccatcactaa                                  1230
<210> 3
<211> 253
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Met Ala Leu Leu Ala Trp Ala Val Ile Thr Ile Met Leu Tyr Gln Pro
1               5                   10                  15
Val Glu Ala Glu Asn Ile Thr Gln Trp Asn Leu Ser Asp Asn Gly Thr
            20                  25                  30
Asn Gly Ile Gln His Ala Met Tyr Leu Arg Gly Val Ser Arg Ser Leu
        35                  40                  45
His Gly Ile Trp Pro Glu Lys Ile Cys Lys Gly Val Pro Thr Tyr Leu
    50                  55                  60
Ala Thr Asp Thr Glu Leu Lys Glu Ile Gln Gly Met Met Asp Ala Ser
65                  70                  75                  80
Glu Gly Thr Asn Tyr Thr Cys Cys Lys Leu Gln Arg His Glu Trp Asn
                85                  90                  95
Lys His Gly Trp Cys Asn Trp Tyr Asn Ile Asp Pro Trp Ile Gln Leu
            100                 105                 110
Met Asn Arg Thr Gln Ala Asn Leu Ala Glu Gly Pro Pro Ala Lys Glu
        115                 120                 125
Cys Ala Val Thr Cys Arg Tyr Asp Lys Asp Ala Asp Ile Asn Val Val
    130                 135                 140
Thr Gln Ala Arg Asn Arg Pro Thr Thr Leu Thr Gly Cys Lys Lys Gly
145                 150                 155                 160
Lys Asn Phe Ser Phe Val Gly Thr Ile Ile Glu Gly Pro Cys Asn Phe
                165                 170                 175
Asn Val Ser Val Glu Asp Ile Leu Tyr Gly Asp His Glu Cys Gly Ser
            180                 185                 190
Leu Leu Gln Asp Thr Ala Leu Tyr Leu Val Asp Gly Met Thr Asn Thr
        195                 200                 205
Ile Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser
    210                 215                 220
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225                 230                 235                 240
Thr Leu Thr Ser Ala Ile Asn His His His His His His
                245                 250
<210> 4
<211> 762
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
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<210> 5
<211> 246
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Met Ala Leu Leu Ala Trp Ala Val Ile Thr Ile Met Leu Tyr Gln Pro
1               5                   10                  15
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Lys Asn Phe Ser Phe Val Gly Thr Ile Ile Glu Gly Pro Cys Asn Phe
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Leu Leu Gln Asp Thr Ala Leu Tyr Leu Val Asp Gly Met Thr Asn Thr
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Ile Glu Asn Ala Arg Gln Gly Ala Ala Arg Val Thr Ser Trp Leu Gly
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Trp Phe Gly Ala Tyr Ala
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<210> 6
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<212> DNA
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<400> 6
atggctctcc tcgcttgggc tgttatcaca atcatgctct accagcccgt cgaggctgaa 60
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ctcgtcgacg gtatgaccaa caccatcgag aacgctcgtc aaggagctgc tcgtgttact 660
agttggttgg gaaggcaatt gtccaccgct ggaaagcgtt tggagggaag gagtaagact 720
tggttcggag cttacgctta a                                           741
<210> 7
<211> 396
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Met Lys Val Leu Arg Gly Gln Ile Val Gln Gly Val Ile Trp Leu Leu
1               5                   10                  15
Leu Val Thr Gly Ala Gln Gly Arg Leu Ala Cys Lys Glu Asp Tyr Arg
            20                  25                  30
Tyr Ala Ile Ser Ser Thr Asn Glu Ile Gly Leu Leu Gly Ala Gly Gly
        35                  40                  45
Leu Thr Thr Thr Trp Lys Glu Tyr Ser His Asp Leu Gln Leu Asn Asp
    50                  55                  60
Gly Thr Val Lys Ala Ile Cys Val Ala Gly Ser Phe Lys Val Thr Ala
65                  70                  75                  80
Leu Asn Val Val Ser Arg Arg Tyr Leu Ala Ser Leu His Lys Gly Ala
                85                  90                  95
Leu Leu Thr Ser Val Thr Phe Glu Leu Leu Phe Asp Gly Thr Asn Pro
            100                 105                 110
Ser Thr Glu Glu Met Gly Asp Asp Phe Gly Phe Gly Leu Cys Pro Phe
        115                 120                 125
Asp Thr Ser Pro Val Val Lys Gly Lys Tyr Asn Thr Thr Leu Leu Asn
    130                 135                 140
Gly Ser Ala Phe Tyr Leu Val Cys Pro Ile Gly Trp Thr Gly Val Ile
145                 150                 155                 160
Glu Cys Thr Ala Val Ser Pro Thr Thr Leu Arg Thr Glu Val Val Lys
                165                 170                 175
Thr Phe Arg Arg Glu Lys Pro Phe Pro His Arg Met Asp Cys Val Thr
            180                 185                 190
Thr Thr Val Glu Asn Glu Asp Leu Phe Tyr Cys Lys Leu Gly Gly Asn
        195                 200                 205
Trp Thr Cys Val Lys Gly Glu Pro Val Val Tyr Thr Gly Gly Gln Val
    210                 215                 220
Lys Gln Cys Lys Trp Cys Gly Phe Asp Phe Asn Glu Pro Asp Gly Leu
225                 230                 235                 240
Pro His Tyr Pro Ile Gly Lys Cys Ile Leu Ala Asn Glu Thr Gly Tyr
                245                 250                 255
Arg Ile Val Asp Ser Thr Asp Cys Asn Arg Asp Gly Val Val Ile Ser
            260                 265                 270
Ala Glu Gly Ser His Glu Cys Leu Val Gly Asn Thr Thr Val Lys Val
        275                 280                 285
His Ala Ser Asp Glu Arg Leu Gly Pro Met Pro Cys Arg Pro Lys Glu
    290                 295                 300
Ile Val Ser Ser Ala Gly Pro Val Arg Lys Thr Ser Cys Thr Phe Asn
305                 310                 315                 320
Tyr Ala Lys Thr Leu Lys Asn Lys Tyr Tyr Glu Pro Arg Asp Ser Tyr
                325                 330                 335
Phe Gln Gln Tyr Met Leu Lys Gly Glu Tyr Gln Tyr Trp Phe Asp Leu
            340                 345                 350
Asp Val Thr Asp Arg His Ser Asp Tyr Phe Ala Glu Phe Val Val Leu
        355                 360                 365
Val Val Val Ala Leu Leu Gly Gly Arg Tyr Val Leu Trp Leu Ile Val
    370                 375                 380
Thr Tyr Ile Val Leu Thr Glu Gln Leu Ala Ala Gly
385                 390                 395
<210> 8
<211> 1191
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
atgaaggtgc tgcgtggaca gatcgttcag ggtgttatct ggctcctgct cgttactgga 60
gcccaaggtc gtctcgcctg taaagaagat taccgttacg ccatcagctc aacaaacgaa 120
atcggtctgc tcggtgccgg tggtctcact acaacatgga aggaatacag ccacgacctc 180
caactcaacg acggtactgt taaggccatc tgtgtggccg gtagtttcaa ggttactgcc 240
ctcaacgttg tgagccgtcg ctatctggcc tctctgcata aaggtgccct gctgacttct 300
gttactttcg aactcctgtt cgacggtaca aaccctagca cagaagaaat gggcgacgac 360
ttcggtttcg gtctgtgtcc attcgacaca agcccagttg tcaagggcaa atacaacact 420
actctcctga acggctctgc cttctacctg gtctgcccaa tcggttggac tggcgtgatc 480
gaatgtacag ccgtctctcc tacaacactg cgcacagaag tcgtgaagac tttccgccgc 540
gaaaagccct ttccccatcg catggattgt gtgacaacta ctgtggaaaa cgaagacctg 600
ttctactgca agctgggcgg caactggaca tgcgtcaagg gcgaacccgt ggtgtatact 660
ggcggccaag tgaaacaatg caaatggtgc ggctttgatt tcaatgaacc cgatggcctg 720
ccccattacc ccattggcaa atgcattctg gccaatgaaa ctggctaccg cattgtggat 780
tctactgatt gcaatcgcga tggcgtcgtc atttcagccg aaggctctca cgaatgcctg 840
gtgggcaata caactgtcaa ggtccacgcc tcagatgaac gcctgggccc catgccctgc 900
cgccccaaag aaattgtgtc atcagccggc cccgtgcgca aaacttcttg cactttcaat 960
tatgccaaaa cactgaagaa taagtactac gaaccccgcg attcttactt ccagcaatac 1020
atgctgaagg gcgaatacca atactggttc gatctggatg tgactgatcg ccactcagat 1080
tacttcgccg agtttgtggt gctggtggtc gtggccctgc tcggcggccg ttatgtgctg 1140
tggctcattg tgacttacat tgtgctgaca gaacaactgg ccgccggcta a          1191
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
atgaaggtgc tgcgtggaca g 21
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ttagtgatgg tgatggtgat g 21
<210> 11
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
atggctctcc tcgcttggg 19
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
ttagtgatgg tgatggtgat g 21

Claims (5)

1.一种疫苗，其特征在于，所述疫苗包括猪瘟病毒囊膜蛋白寡聚蛋白体，所述猪瘟病毒囊膜蛋白寡聚蛋白体选自E2寡聚蛋白体；
或，所述猪瘟病毒囊膜蛋白寡聚蛋白体为E2寡聚蛋白体和E0寡聚蛋白体；
猪瘟病毒囊膜蛋白E2分子与外源寡聚化结构片段形成所述E2寡聚蛋白体，所述E2寡聚蛋白体为四聚蛋白体，所述外源寡聚化结构片段选自西尼罗病毒C蛋白寡聚化结构片段WNV-Alpha4，所述E2寡聚蛋白体的单个融合亚基的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；
猪瘟病毒囊膜蛋白E0分子与外源寡聚化结构片段形成所述E0寡聚蛋白体，所述E0寡聚蛋白体为四聚蛋白体，所述外源寡聚化结构片段选自西尼罗病毒C蛋白寡聚化结构片段WNV-Alpha4，所述E0寡聚蛋白体的单个融合亚基的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
2.根据权利要求1所述的一种疫苗，其特征在于，所述疫苗还包括佐剂，所述佐剂选自水包油包水型佐剂、水包白油型佐剂、角鲨烯佐剂、植物油佐剂、纳米佐剂或弗氏佐剂中的至少一种。
3.权利要求1或2中的猪瘟病毒囊膜蛋白寡聚蛋白体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）人工合成寡聚蛋白体的单个融合亚基多肽基因，并将该基因克隆至质粒载体，获得猪瘟病毒囊膜蛋白寡聚蛋白体的重组表达质粒载体；所述单个融合亚基多肽基因包括亚基多肽、G6S9短肽链接、外源寡聚化结构片段及组氨酸标签短肽；E2寡聚蛋白体的单个融合亚基多肽基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；E0寡聚蛋白体的单个融合亚基多肽基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
（2）将所述猪瘟病毒囊膜蛋白寡聚蛋白体的重组表达质粒载体转染宿主细胞，回收宿主细胞培养上清液，提取纯化猪瘟病毒囊膜蛋白寡聚蛋白体。
4.根据权利要求3所述的猪瘟病毒囊膜蛋白寡聚蛋白体的制备方法，其特征在于，所述质粒载体选自昆虫杆状病毒质粒、哺乳细胞表达系统质粒、细菌表达系统质粒和酵母表达系统质粒中的任一种。
5.根据权利要求3所述的猪瘟病毒囊膜蛋白寡聚蛋白体的制备方法，其特征在于，所述宿主细胞选自昆虫细胞、哺乳细胞、大肠杆菌细胞和酵母细胞中的任一种。
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