CN112125961A - 牛病毒性腹泻-牛传染性鼻气管炎二联亚单位融合疫苗及其鉴定方法 - Google Patents

牛病毒性腹泻-牛传染性鼻气管炎二联亚单位融合疫苗及其鉴定方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体而言，提供了一种牛病毒性腹泻‑牛传染性鼻气管炎二联亚单位融合疫苗及其鉴定方法。发明人通过对BVDV‑NS3和IBRV‑VP8的基因分别进行优化，分别融合表达二者的抗原表位蛋白，得到SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2编码的多肽片段组合物。该多肽片段组合物可用于制备二联亚单位融合疫苗，免疫动物后能够产生良好的保护效力，达到同时预防牛病毒性腹泻和牛传染性鼻气管炎的目的，实现“一针两防”的效果。同时，利用本发明提供的检测试剂盒可以快速鉴别诊断牛为疫苗株免疫还是感染的野毒株，实现牛病毒性腹泻病毒和牛传染性鼻气管炎病毒的净化。

Description

牛病毒性腹泻-牛传染性鼻气管炎二联亚单位融合疫苗及其 鉴定方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种牛病毒性腹泻-牛传染性鼻气管炎二联亚单位融合疫苗及其鉴定方法。
背景技术
牛病毒性腹泻是由牛病毒性腹泻病毒(BVDV)引起的牛免疫抑制、腹泻、发烧等为主要症状的传染病，当牛持续感染后，终身带毒并排毒，造成牛场重复性污染，给养牛业造成极大的损失。
牛传染性鼻气管炎(IBR)是由I型牛疱疹病毒(BHV-1，又称为牛传染性鼻气管炎病毒IBRV)引起的一种牛呼吸道接触性疾病，临床以呼吸道症状为主，同时伴有结膜炎、乳腺炎等临症，对牛奶产量、公牛的繁殖力均有较大影响。
牛病毒性腹泻和牛传染性鼻气管炎在我国大部分牛场均有发病，在一些重要牧区的感染达到80％左右，给牛场造成重大经济损失。
牛病毒性腹泻、牛传染性鼻气管炎的主要治疗方案以抗病毒为主，但由于牛群数量庞大，治疗费用高，效果一般，很难在短时间内控制该病的发生与扩散。疫苗接种是控制牛病毒性腹泻、牛传染性鼻气管炎在牛场流行的优选方案。国内目前有牛病毒性腹泻、牛传染性鼻气管炎二联灭活疫苗，在一定程度上有可能控制该病的流行，但由于是灭活疫苗，杂蛋白含量高、副反应大，鉴别诊断难度大。亚单位疫苗在一定程度上可以解决上述问题。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种多肽片段组合物。
本发明的第二目的在于提供多肽组合物的应用。
本发明的第三目的在于提供一种牛病毒性腹泻-牛传染性鼻气管炎二联亚单位融合疫苗。
本发明的第四目的在于提供一种鉴定牛疫苗株或野毒株感染的间接 ELISA检测试剂盒。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
多肽片段组合物，包括SEQ ID NO.1编码的牛病毒性腹泻病毒NS3蛋白和SEQ IDNO.2编码的牛传染性鼻气管炎病毒VP8蛋白。
进一步地，牛病毒性腹泻病毒NS3蛋白和牛传染性鼻气管炎病毒VP8 蛋白的质量比为1：(0.5-3)，优选为1：(1-2)。
上述多肽片段组合物在制备预防牛病毒性腹泻和牛传染性鼻气管炎的疫苗中的应用。
一种牛病毒性腹泻-牛传染性鼻气管炎二联亚单位融合疫苗，所述疫苗包括上述多肽片段组合物。
进一步地，所述疫苗还包括佐剂；
优选地，所述佐剂包括ISA206VG、ISA201VG、ISA563VG或 ISA660VG。
一种鉴定牛疫苗株或野毒株感染的间接ELISA检测试剂盒，包括牛病毒性腹泻病毒E2抗原和牛病毒性鼻气管炎病毒gB抗原；
编码牛病毒性腹泻病毒E2抗原序列如SEQ ID NO.3所示；
编码牛病毒性鼻气管炎病毒gB抗原序列如SEQ ID NO.4所示；
所述疫苗株为上述牛病毒性腹泻-牛传染性鼻气管炎二联亚单位融合疫苗。
进一步地，牛病毒性腹泻病毒E2抗原和牛病毒性鼻气管炎病毒gB抗原分别包被于ELISA酶标板。
进一步地，牛病毒性腹泻病毒E2抗原和牛病毒性鼻气管炎病毒gB抗原的包被浓度均独立地为80-120μg/ml。
进一步地，还包括阳性对照、阴性对照、酶标二抗、稀释液、显色液、洗涤液或终止液中的至少一种。
一种鉴定牛疫苗株或野毒株感染的间接ELISA检测方法，采用所述检测试剂盒利用牛病毒性腹泻病毒E2抗原和牛病毒性鼻气管炎病毒gB抗原分别对待测样本中牛病毒性腹泻病毒E2蛋白抗体和牛病毒性鼻气管炎病毒 gB蛋白抗体的含量进行检测，如果牛病毒性腹泻病毒E2蛋白抗体和牛病毒性鼻气管炎病毒gB蛋白抗体的含量均不大于阈值，则判断牛疫苗株感染。
进一步地，所述阈值为OD450nm＝0.5；
优选地，所述待测样本为牛血清。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明提供的多肽片段组合物包括SEQ ID NO.1编码的牛病毒性腹泻病毒NS3蛋白和SEQ ID NO.2编码的牛传染性鼻气管炎病毒VP8蛋白。发明人通过研究发现BVDV-NS3和IBRV-VP8均具有良好的免疫原性，通过对BVDV-NS3和IBRV-VP8的基因分别进行优化，分别融合表达二者的抗原表位蛋白，得到SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2编码的多肽片段组合物。该多肽片段组合物可用于制备二联亚单位融合疫苗，免疫动物后能够产生良好的保护效力，达到同时预防牛病毒性腹泻和牛传染性鼻气管炎的目的，实现“一针两防”的效果。此外，本发明提供的疫苗安全性好、不存在免疫干扰，通过检测牛体内的BVDV-E2蛋白和IBRV-gB蛋白的抗体含量即可快速鉴别诊断该牛为疫苗株免疫还是感染的野毒株，实现牛病毒性腹泻病毒和牛传染性鼻气管炎病毒的净化。
本发明提供鉴定牛疫苗株或野毒株感染的间接ELISA检测试剂盒，可以准确鉴别诊断区分疫苗免疫和野毒感染动物。发明人经过研究发现，在牛感染不同的病原(本发明疫苗和野毒株)后，体内的抗体种类和水平并不相同：本发明疫苗在体内仅产生所用抗原对应的抗体，而野毒株则产生除所用抗原对应抗体外的其他病毒蛋白抗体，而且呈现一定的规律。发明人经优化研究得到用于检测的牛病毒性腹泻病毒E2抗原和牛病毒性鼻气管炎病毒gB抗原，利用优化得到的两种抗原建立间接ELISA方法对牛病毒性腹泻病毒E2蛋白抗体和牛病毒性鼻气管炎病毒gB蛋白抗体的含量进行检测，通过抗体含量可以准确判断得到牛为疫苗株免疫还是感染的野毒株。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例1中各目标基因PCR凝胶电泳图，其中，M:marker， 1:BVDV-E2，2:BVDV-NS3，3:IBRV-VP8，4:control，5:IBRV-gB。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。
除非另有说明，本文中所用的专业与科学术语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法或材料也可应用于本发明中。
本发明保护一种多肽片段组合物，包括SEQ ID NO.1编码的牛病毒性腹泻病毒NS3蛋白和SEQ ID NO.2编码的牛传染性鼻气管炎病毒VP8蛋白。
ATAGAGGAAATAGGAAGACACAAGAGAGTATTAGTTCTTATACCA TTAAGGGCAGCGGCAGAGTCAGTTTACCAGTATATGAGATTAAAACAC CCAAGCATCTCTTTTAACCTAAGGATAGGAGGAGGATCTGGAGGAGG ATCTGATGAATACCATTGTGCCACTCCTGAACAACTGGCAATTATCGG AAAGATCCACAGATTTTCAGAGAGTATAAGAGTCGTCGCCATGACTGC CACGCCGGCAGGGTCGGTGACCACAACAGGTCAAAAGCACCCAATA GAGGAATTCATAGCCCCCGAGGTAATGAAAGGGGAGGATCTTGGTAG TCAGTTCCTTGATATAGCAGGGTTA(SEQ IDNO.1)。
GAGCTGTTTACGTACGCCCCTGCCCAGCCTCAGGTAGAGGTGCC GCTGCCCAGGATTTTGGAGGGCCGGGTGCGGCCCAGCGCCTTCTTCG CGCAGATGCCGCTGGACGCGCTGTGCCGCACGCCGCCCAACGATCAG CGCGTGGTGCGCGAGCGGCGCGCTTGGGAGATGGCCGGTACGGGAG GAGGATCTGGAGGAGGATCTCTGACTGCGGTGCCGGCCCTGTGCGCG CGCTACGCGGGCGCCGGGCTGCAGTCGGCCGAGCTGTACCTGCTGGC GCTAGCGCACTCAGAGGCGCCCGGCTACACGGCAAATGAGCGCTACG CGCTCTCGGCGTACCTGACGCTGTTTGTAGCGCTCGCGGA(SEQ ID NO.2)。
发明人通过研究发现BVDV-NS3和IBRV-VP8均具有良好的免疫原性，通过对BVDV-NS3和IBRV-VP8的基因分别进行优化，分别融合表达二者的抗原表位蛋白，得到SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.2编码的多肽片段组合物。该多肽片段组合物可用于制备二联亚单位融合疫苗，免疫动物后能够产生良好的保护效力，达到同时预防牛病毒性腹泻和牛传染性鼻气管炎的目的，实现“一针两防”的效果。其中，牛病毒性腹泻病毒NS3蛋白和牛传染性鼻气管炎病毒VP8蛋白的质量比优选为1：(0.5-3)，进一步地优选为1：(1-2)。牛病毒性腹泻病毒NS3蛋白和牛传染性鼻气管炎病毒VP8蛋白的质量比可以但不限于为1:0.5、1:1、1:1.5、1:2、1:2.5或1:3。
此外，本发明提供的牛病毒性腹泻-牛传染性鼻气管炎二联亚单位融合疫苗安全性好、不存在免疫干扰，通过检测牛体内的BVDV-E2蛋白和 IBRV-gB蛋白的抗体含量即可快速鉴别诊断该牛为疫苗株免疫还是感染的野毒株，实现牛病毒性腹泻病毒和牛传染性鼻气管炎病毒的净化。
在一些实施方式中，佐剂包括ISA206VG、ISA201VG、ISA563VG或 ISA660VG，优选为ISA206VG。
本发明提供的SEQ ID NO.1编码的牛病毒性腹泻病毒NS3蛋白可以通过原核细胞表达系统进行表达，具体地：利用分子生物学手段将目标序列重组到质粒pET-30a(+)，构建重组原核表达载体，转化到大肠杆菌BL21中培养表达，再经纯化得到本发明的牛病毒性腹泻病毒NS3蛋白。
目标序列的扩增引物如下：
BVDV-NS3-2EP-F:5’-GGGGTACCATAGAGGAAATAGGAAGACACA- 3’(SEQ ID NO.5)；
BVDV-NS3-R:5’-CCGCGGATCCTAACCCTGCTATATCAAGGAAC-3’ (SEQ ID NO.6)。
本发明提供的SEQ ID NO.2编码的牛传染性鼻气管炎病毒VP8蛋白也可以通过原核细胞表达系统进行表达，具体地：利用分子生物学手段将目标序列重组到质粒pET-30a(+)，构建重组原核表达载体，转化到大肠杆菌BL21中培养表达，再经纯化得到本发明的牛传染性鼻气管炎病毒VP8蛋白。
目标序列的扩增引物如下：
IBR-VP8-F:5’-GGGGTACCGAGCTGTTTACGTACGCCCCTG-3’ (SEQ ID NO.7)；
IBR-VP8-R:5’-CCGCGGATCCGACACGGTCGAGAGCGCGGC-3’ (SEQ ID NO.8)。
本发明提供的牛病毒性腹泻-牛传染性鼻气管炎二联亚单位融合疫苗的制备方法可以为将多肽片段组合物与佐剂混合乳化得到。佐剂和多肽片段组合物的体积比优选为64:56，牛病毒性腹泻病毒NS3蛋白的用量为 10-50μg/头份，优选为30μg/头份；牛传染性鼻气管炎病毒VP8蛋白的用量为30-70μg/头份，优选为50μg/头份。
本发明还保护鉴定牛疫苗株或野毒株感染的间接ELISA检测试剂盒，可以准确鉴别诊断区分疫苗免疫和野毒感染动物。发明人经过研究发现，在牛感染不同的病原(本发明疫苗和野毒株)后，体内的抗体种类和水平并不相同：本发明疫苗在体内仅产生所用抗原对应的抗体，而野毒株则产生除所用抗原对应抗体外的其他病毒蛋白抗体，而且呈现一定的规律。发明人经优化研究得到用于检测的牛病毒性腹泻病毒E2抗原和牛病毒性鼻气管炎病毒gB抗原，利用优化得到的两种抗原建立间接ELISA方法对牛病毒性腹泻病毒E2蛋白抗体和牛病毒性鼻气管炎病毒gB蛋白抗体的含量进行检测，通过抗体含量可以准确判断得到牛为疫苗株免疫还是感染的野毒株。编码牛病毒性腹泻病毒E2抗原序列如SEQ ID NO.3所示；编码牛病毒性鼻气管炎病毒gB抗原序列如SEQ ID NO.4所示。
CTGGGGGCTGAAGGCCTTACCACCACTTGGAAGGAATACTCACC TGGAATGAAGCTGGAAGACACAATGGTCATTGCTTGGTGCGAAGATG GGAAGTTAATGTACCTCCAAAGATGCACGAGAGAAACCAGATATCTC GCAATCTTGCATACAAGAGCCTTGCCGACCAGTGTGGTATTCAAAAAA CTCTTTGATGGGCGAAAGCAAGAGGATGTAGTCGAAATGAACGACAA CTTTGAATTTGGACTCTGCCCATGTGATGCCAAACCCATAGTAAGAGG GAAGTTCAATACAACGCTGCTGAACGGACCGGCCTTCCAGATGGTATG CCCCATAGGATGGACAGGGACTGTAAGCTGTACGTCATTCAATATGGA CACCTTAGCCACAACTGTGGTACGGACATATAGAAGGTCTAAACCATT CCCTCATAGGCAAGGCTGTATCACCCAAAAGAATCTGGGGGAGGATC TCCATAACTGCATCCTTGGAGGAAATTGGACTTGTGTGCCTGGAGACC AACTACTATACAAAGGGGGCTCTATTGAATCTTGCAAGTGGTGTGGCT ATCAATTTAAAGAGAGTGAGGGACTACCACACTACCCCATTGGCAAGT GTAAATTGGAGAACGAGACTGGTTACAGGCTAGTAGACAGTACCTCTTGCAATAGAGAAGGTGTGGCCATAGTACCACAAGGGACATTAAAGTGC AAGATAGGAAAAACAACTGTACAGGTCATAGCTATGGA(SEQ ID NO.3)。
CAGTTCACCTACGACCACATCCAGGACCACGTGAACACCATGTT CAGCCGCCTGGCCACGTCCTGGTGCCTGCTGCAGAACAAGGAGCGCG CCCTGTGGGCCGAGGCGGCTAAGCTCAACCCCAGCGCGGCGGCCAGC GCTGCGCTGGACCGCCGCGCCGCCGCGCGCATGTTGGGGGACGCCAT GGCCGTGACGTACTGCCACGAGCTGGGCGAGGGGCGCGTGTTCATCG AGAACTCGATGCGCGCGCCCGGCGGCGTTTGCTACAGCCGCCCGCCG GTCTCCTTTGCCTTCGGCAACGAGAGCGAGCCGGTGGAGGGCCAGCT CGGCGAGGACAACGAGCTGCTGCCGGGCCGCGAGCTCGTGGAGCCC TGCACCGCCAACCACAAGCGCTACTTCCGCTTTGGCGCGGACTACGT GTACTACGAGAACTACGCGTACGTGCGGCGGGTCCCGCTCGCGGAGC TGGAGGTGATCAGCACCTTTGTGGACCTAAACCTCACGGTTCTGGAGGACCGCGAGTTCTTGCCGCTAGAAGTGTACACGCGCGCCGAGCTCGC CGACACGGGTCTGCTCGACTACAGCGAGATACAGCGCCGCAACCAGC TGCACGAGCTCCGGTTCTACGACATTGACCGCGTGGTCAAGACGGAC GGCAATATGGCCATCATGCGAGGGCTCGCCAACTTCTTTCAGGGCCTG GGCGCCGTCGGGCAGGCGGTGGGCACGGTGGTGCTGGGCGCCGCGG GTGCCGCGCTCTCGACCGTGTC(SEQ ID NO.4)。
上述牛病毒性腹泻病毒E2抗原和牛病毒性鼻气管炎病毒gB抗原的制备方法可以参照本发明上述提供的牛病毒性腹泻病毒NS3蛋白制备方法制备得到，具体扩增引物序列如下：
BVDV-E2-F:5’-GGGGTACCCTGGGGGCTGAAGGCCTTACCA-3’ (SEQ ID NO.9)；
BVDV-E2-R:5’-CCGCGGATCCTCCATAGCTATGACCTGTACA-3’ (SEQ ID NO.10)；
IBRV-gB-F:5’-GGGGTACCCAGTTCACCTACGACCACATCC-3’ (SEQ ID NO.11)；
IBRV-gB-R:5’-CCGCGGATCCTCCGCGAGCGCTACAAACAGC-3’ (SEQ ID NO.12)。
在一些实施方式中，将牛病毒性腹泻病毒E2抗原和牛病毒性鼻气管炎病毒gB抗原分别包被于ELISA酶标板中制备包被好的ELISA酶标板。其中，牛病毒性腹泻病毒E2抗原和牛病毒性鼻气管炎病毒gB抗原的包被浓度均独立地优选为80-120μg/ml，进一步优选为100μg/ml；ELISA酶标板每个微孔的包被量为100μl。需要说明的是，牛病毒性腹泻病毒E2抗原和牛病毒性鼻气管炎病毒gB抗原分别包被在酶标板的不同孔中，并不是混合包被。
在一些实施方式中，该检测试剂盒还可以包括阳性对照、阴性对照、酶标二抗、稀释液、显色液、洗涤液、终止液中的至少一种。其中：
包被稀释液可以为pH7.2的PBS溶液；
封闭液可以选取5％鱼精蛋白；
洗涤液可为PBST(pH 7.4)：NaCl 8.0g，KH2PO4 0.2g,NaHPO4·12H2O 2.9g，KCl0.2g，Tween20 0.5ml，加去离子水至1000ml，调至pH 7.4；
样本稀释液：1×PBS1000mL，Tween20 5mL，(pH 10.8)；
酶标二抗可以为兔抗牛IgG辣根过氧化物酶；
底物显色液：1ml柠檬酸液加入20μL TMB(3,3',5,5'-四甲基联苯胺) 溶液和1.2μL H2O2，TMB水溶液15mg/ml；柠檬酸为0.1mol/L pH 4.0；
终止液为：2mol/L H2SO4溶液。
鉴定牛疫苗株或野毒株感染的具体检测流程优选如下：
1、牛颈部采血5ml，37℃2h，1000g离心20min，取上清4℃保存；
2、包被：用包被稀释液(PBS pH7.2)分别稀释BVDV-E2抗原、IBRV-gB 抗原为100μg/ml，分别加入ELISA板不同的微孔中，每孔100μl，37℃4h；
3、封闭：弃去包被液，每孔加入5％鱼精蛋白250μl，37℃1h；
4、洗板：弃去封闭液，加入洗涤液满孔，微振5S，弃去洗涤液，洗3 遍，拍干；
5、加样：血清样品稀释1：100，每孔加100μl，37℃1h；
6、洗板：弃去样品，加入洗涤液满孔，微振5S，弃去洗涤液，洗3 遍，拍干；
7、加酶标二抗：稀释兔抗牛IgG辣根过氧化物酶1：4000，每孔加100μl， 37℃1h；
8、洗板：弃去样品，加入洗涤液满孔，微振5S，弃去洗涤液，洗3 遍，拍干；
9、加底物(现配)：每孔加底物显色溶液100μl，37℃避光放置20min；
10、终止反应：加入50μl终止液，检测OD450nm值。
本发明最后提供一种鉴定牛疫苗株或野毒株感染的间接ELISA检测方法，采用本发明提供的检测试剂盒分别对待测样本中牛病毒性腹泻病毒E2 蛋白抗体和牛病毒性鼻气管炎病毒gB蛋白抗体的含量进行检测，如果牛病毒性腹泻病毒E2蛋白抗体和牛病毒性鼻气管炎病毒gB蛋白抗体的含量均不大于阈值，则判断牛疫苗株感染。发明人根据实验结果统计计算得到检测试剂盒的判断阈值为OD450nm＝0.5。可以理解的是，由于显色底物的不同，含量检测的吸收光波长也会有所改变，从而可能得到不同或相近的阈值，然而这些诊断标准均在本申请的保护范围内。
下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。
实施例1
通过生物公司合成SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4的目标基因，在利用合成的SEQ ID NO.5-SEQ ID NO.12引物序列分别扩增上述目标基因。结果如图1所示(其中，M:marker，1:BVDV-E2， 2:BVDV-NS3，3:IBRV-VP8，4:control，5:IBRV-gB)。
实施例2
连接与转化
1、将质粒pET-30a(+)、BVDV-NS3基因(SEQ ID NO.1)、BVDV-E2 基因(SEQ IDNO.3)、IBRV-VP8基因(SEQ ID NO.2)、IBRV-gB基因(SEQ ID NO.4)分别进行KpnI、BamHI双酶切；
2、酶切产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，凝胶回收目的条带并纯化；
3、T4-DNA连接酶分别连接质粒和各基因；
4、卡那霉素(100ml/L)固体培养基筛选BVDV-NS3-pET-30a(+)、 BVDV-E2-pET-30a(+)、IBRV-VP8-pET-30a(+)和IBRV-gB-pET-30a(+)转化至大肠杆菌BL21阳性株；
5、双酶切鉴定重组原核表达载体。
原核表达与纯化
1、挑取含有表达载体的大肠杆菌BL21在LB固体培养基(含100mg/L 卡那霉素)单个菌落于20mL的LB液体培养基(含100mg/L卡那霉素)过夜培养；
2、取5ml培养菌液接种至500ml的LB液体培养基(含100mg/L卡那霉素)，培养至OD600到0.6，加入IPTG(0.4mmol/L)溶液，28℃，140rpm诱导3h；
3、6000rpm，10min离心，沉淀菌体；
4、加入10mL裂解液重悬菌体；
5、超声破碎；
6、按照Ni柱纯化步骤进行表达蛋白纯化；
7、SDS-PAG检测蛋白纯度，Bradford方法检测蛋白浓度。
实施例3
免疫实验
1、取纯化后原核表达的BVDV-NS3 300μg、IBRV-VP8蛋白500μg，与佐剂ISA206VG混合乳化，制备10头份牛用疫苗。
2、随机选取牛病毒性腹泻、牛传染性鼻气管炎阴性牛场3月龄以上牛 20头，随机分为实验组和对照组，每组10头。实验组采用肌肉接种免疫，每头份1ml含BVDV-NS3 30μg、IBRV-VP8蛋白50μg；对照组接种生理盐水，每头份接种1ml。
3、免疫后持续观察14d，监测体温变化、食欲、精神变化。结果发现实验组与对照组相比，牛在接种疫苗24h后体温会发生波动，波动范围± 1℃，48h后恢复正常，注射部位无红肿现象，食欲和精神状态良好，未见其他副反应。表明该疫苗具有良好的安全性。
4、一免21天后，同样剂量加强免疫1次。
5、血清制备：二免后14d颈部采血5ml，37℃2h，1000g离心20min, 取上清4℃保存。
6、中和抗体检测：按照中和抗体检测方法步骤检测中和抗体，判断疫苗的保护效力。结果表明BVDV中抗体滴度在1：2048～1：4096之间，IBR 中和抗体在1：128～1：1024之间，对照组中和抗体滴度＜1：4，表明该疫苗具体有良好的保护效力。结果见表1。
表1中和抗体滴度检测结果
Figure BDA0002608069220000131
实施例4
选取牛病毒性腹泻与牛传染性鼻气管炎的阴性牛场、接种二联亚单位融合疫苗的免疫牛场、牛病毒性腹泻与牛传染性鼻气管炎的阳性牛场，随机各选取10头牛。按照间接ELISA方法步骤检测血清中牛病毒性腹泻病毒 E2蛋白抗体和牛病毒性鼻气管炎病毒gB蛋白抗体的含量(结果见表2)。
1、牛颈部采血5ml，37℃2h，1000g离心20min，取上清4℃保存；
2、包被：用包被稀释液(PBS pH7.2)分别稀释BVDV-E2抗原、IBRV-gB 抗原为100μg/ml，分别加入ELISA板不同的微孔中，每孔100μl，37℃4h；
3、封闭：弃去包被液，每孔加入5％鱼精蛋白250μl，37℃1h；
4、洗板：弃去封闭液，加入洗涤液满孔，微振5S，弃去洗涤液，洗3 遍，拍干；
5、加样：血清样品稀释1：100，每孔加100μl，37℃1h；
6、洗板：弃去样品，加入洗涤液满孔，微振5S，弃去洗涤液，洗3 遍，拍干；
7、加酶标二抗：稀释兔抗牛IgG辣根过氧化物酶1：4000，每孔加100μl， 37℃1h；
8、洗板：弃去样品，加入洗涤液满孔，微振5S，弃去洗涤液，洗3 遍，拍干；
9、加底物(现配)：每孔加底物显色溶液100μl，37℃避光放置20min；
10、终止反应：加入50μl终止液，检测OD450nm值。
表2不同牛场血清样本ELISA检测结果
Figure BDA0002608069220000141
通过对上述表格中的数据进行统计学分析，得到判断牛疫苗株和野毒株感染的标准：牛病毒性腹泻病毒E2蛋白抗体和牛病毒性鼻气管炎病毒gB 蛋白抗体的含量均不大于阈值0.5时，判断为牛接种疫苗；二者均大于0.5 时，判断为牛感染野毒株。
尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。
SEQUENCE LISTING
<110> 天康生物股份有限公司
<120> 牛病毒性腹泻-牛传染性鼻气管炎二联亚单位融合疫苗及其鉴定方法
<160> 12
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 354
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
atagaggaaa taggaagaca caagagagta ttagttctta taccattaag ggcagcggca 60
gagtcagttt accagtatat gagattaaaa cacccaagca tctcttttaa cctaaggata 120
ggaggaggat ctggaggagg atctgatgaa taccattgtg ccactcctga acaactggca 180
attatcggaa agatccacag attttcagag agtataagag tcgtcgccat gactgccacg 240
ccggcagggt cggtgaccac aacaggtcaa aagcacccaa tagaggaatt catagccccc 300
gaggtaatga aaggggagga tcttggtagt cagttccttg atatagcagg gtta 354
<210> 2
<211> 365
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gagctgttta cgtacgcccc tgcccagcct caggtagagg tgccgctgcc caggattttg 60
gagggccggg tgcggcccag cgccttcttc gcgcagatgc cgctggacgc gctgtgccgc 120
acgccgccca acgatcagcg cgtggtgcgc gagcggcgcg cttgggagat ggccggtacg 180
ggaggaggat ctggaggagg atctctgact gcggtgccgg ccctgtgcgc gcgctacgcg 240
ggcgccgggc tgcagtcggc cgagctgtac ctgctggcgc tagcgcactc agaggcgccc 300
ggctacacgg caaatgagcg ctacgcgctc tcggcgtacc tgacgctgtt tgtagcgctc 360
gcgga 365
<210> 3
<211> 749
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ctgggggctg aaggccttac caccacttgg aaggaatact cacctggaat gaagctggaa 60
gacacaatgg tcattgcttg gtgcgaagat gggaagttaa tgtacctcca aagatgcacg 120
agagaaacca gatatctcgc aatcttgcat acaagagcct tgccgaccag tgtggtattc 180
aaaaaactct ttgatgggcg aaagcaagag gatgtagtcg aaatgaacga caactttgaa 240
tttggactct gcccatgtga tgccaaaccc atagtaagag ggaagttcaa tacaacgctg 300
ctgaacggac cggccttcca gatggtatgc cccataggat ggacagggac tgtaagctgt 360
acgtcattca atatggacac cttagccaca actgtggtac ggacatatag aaggtctaaa 420
ccattccctc ataggcaagg ctgtatcacc caaaagaatc tgggggagga tctccataac 480
tgcatccttg gaggaaattg gacttgtgtg cctggagacc aactactata caaagggggc 540
tctattgaat cttgcaagtg gtgtggctat caatttaaag agagtgaggg actaccacac 600
taccccattg gcaagtgtaa attggagaac gagactggtt acaggctagt agacagtacc 660
tcttgcaata gagaaggtgt ggccatagta ccacaaggga cattaaagtg caagatagga 720
aaaacaactg tacaggtcat agctatgga 749
<210> 4
<211> 770
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
cagttcacct acgaccacat ccaggaccac gtgaacacca tgttcagccg cctggccacg 60
tcctggtgcc tgctgcagaa caaggagcgc gccctgtggg ccgaggcggc taagctcaac 120
cccagcgcgg cggccagcgc tgcgctggac cgccgcgccg ccgcgcgcat gttgggggac 180
gccatggccg tgacgtactg ccacgagctg ggcgaggggc gcgtgttcat cgagaactcg 240
atgcgcgcgc ccggcggcgt ttgctacagc cgcccgccgg tctcctttgc cttcggcaac 300
gagagcgagc cggtggaggg ccagctcggc gaggacaacg agctgctgcc gggccgcgag 360
ctcgtggagc cctgcaccgc caaccacaag cgctacttcc gctttggcgc ggactacgtg 420
tactacgaga actacgcgta cgtgcggcgg gtcccgctcg cggagctgga ggtgatcagc 480
acctttgtgg acctaaacct cacggttctg gaggaccgcg agttcttgcc gctagaagtg 540
tacacgcgcg ccgagctcgc cgacacgggt ctgctcgact acagcgagat acagcgccgc 600
aaccagctgc acgagctccg gttctacgac attgaccgcg tggtcaagac ggacggcaat 660
atggccatca tgcgagggct cgccaacttc tttcagggcc tgggcgccgt cgggcaggcg 720
gtgggcacgg tggtgctggg cgccgcgggt gccgcgctct cgaccgtgtc 770
<210> 5
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
ggggtaccat agaggaaata ggaagacaca 30
<210> 6
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
ccgcggatcc taaccctgct atatcaagga ac 32
<210> 7
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
ggggtaccga gctgtttacg tacgcccctg 30
<210> 8
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
ccgcggatcc gacacggtcg agagcgcggc 30
<210> 9
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
ggggtaccct gggggctgaa ggccttacca 30
<210> 10
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
ccgcggatcc tccatagcta tgacctgtac a 31
<210> 11
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
ggggtaccca gttcacctac gaccacatcc 30
<210> 12
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
ccgcggatcc tccgcgagcg ctacaaacag c 31

Claims (10)

1.多肽片段组合物，其特征在于，包括SEQ ID NO.1编码的牛病毒性腹泻病毒NS3蛋白和SEQ ID NO.2编码的牛传染性鼻气管炎病毒VP8蛋白。
2.根据权利要求1所述的多肽片段组合物，其特征在于，牛病毒性腹泻病毒NS3蛋白和牛传染性鼻气管炎病毒VP8蛋白的质量比为1：(0.5-3)，优选为1：(1-2)。
3.权利要求1或2所述的多肽片段组合物在制备预防牛病毒性腹泻和牛传染性鼻气管炎的疫苗中的应用。
4.一种牛病毒性腹泻-牛传染性鼻气管炎二联亚单位融合疫苗，其特征在于，所述疫苗包括权利要求1或2所述的多肽片段组合物。
5.根据权利要求4所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗还包括佐剂；
优选地，所述佐剂包括ISA206VG、ISA201VG、ISA563VG或ISA660VG佐剂。
6.一种鉴定牛疫苗株或野毒株感染的间接ELISA检测试剂盒，其特征在于，包括牛病毒性腹泻病毒E2抗原和牛病毒性鼻气管炎病毒gB抗原；
编码牛病毒性腹泻病毒E2抗原序列如SEQ ID NO.3所示；
编码牛病毒性鼻气管炎病毒gB抗原序列如SEQ ID NO.4所示；
所述疫苗株为权利要求4或5所述的疫苗。
7.根据权利要求6所述的检测试剂盒，其特征在于，牛病毒性腹泻病毒E2抗原和牛病毒性鼻气管炎病毒gB抗原分别包被于ELISA酶标板。
8.根据权利要求7所述的检测试剂盒，其特征在于，牛病毒性腹泻病毒E2抗原和牛病毒性鼻气管炎病毒gB抗原的包被浓度均独立地为80-120μg/ml。
9.根据权利要求6-8任一项所述的检测试剂盒，其特征在于，还包括阳性对照、阴性对照、酶标二抗、稀释液、显色液、洗涤液或终止液中的至少一种。
10.一种鉴定牛疫苗株或野毒株感染的间接ELISA检测方法，其特征在于，采用权利要求6-9任一项所述的检测试剂盒分别对待测样本中牛病毒性腹泻病毒E2蛋白抗体和牛病毒性鼻气管炎病毒gB蛋白抗体的含量进行检测，如果牛病毒性腹泻病毒E2蛋白抗体和牛病毒性鼻气管炎病毒gB蛋白抗体的含量均不大于阈值，则判断牛疫苗株感染；
优选地，所述阈值为OD450nm＝0.5；
优选地，所述待测样本为牛血清。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110003343A (zh) * 2019-02-26 2019-07-12 黑龙江八一农垦大学 牛传染性鼻气管炎病毒多表位重组嵌合蛋白及其应用
CN113388588A (zh) * 2021-07-06 2021-09-14 天康制药(苏州)有限公司 表达牛疱疹病毒Ⅰ型gB基因的重组牛结节疹病毒及其应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104162154A (zh) * 2013-05-17 2014-11-26 华威特（北京）生物科技有限公司 牛病毒性腹泻、牛传染性鼻气管炎二价灭活疫苗及其制备方法和应用
CN107174660A (zh) * 2017-01-13 2017-09-19 浙江海隆生物科技有限公司 牛病毒性腹泻‑牛传染性鼻气管炎二联亚单位疫苗及其制备方法和应用
CN110554187A (zh) * 2018-05-30 2019-12-10 内蒙古元山生物科技有限公司 一种用于检测牛病毒性腹泻病毒抗体的表达蛋白、elisa试剂盒及其制备方法和应用

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104162154A (zh) * 2013-05-17 2014-11-26 华威特（北京）生物科技有限公司 牛病毒性腹泻、牛传染性鼻气管炎二价灭活疫苗及其制备方法和应用
CN107174660A (zh) * 2017-01-13 2017-09-19 浙江海隆生物科技有限公司 牛病毒性腹泻‑牛传染性鼻气管炎二联亚单位疫苗及其制备方法和应用
CN110554187A (zh) * 2018-05-30 2019-12-10 内蒙古元山生物科技有限公司 一种用于检测牛病毒性腹泻病毒抗体的表达蛋白、elisa试剂盒及其制备方法和应用

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110003343A (zh) * 2019-02-26 2019-07-12 黑龙江八一农垦大学 牛传染性鼻气管炎病毒多表位重组嵌合蛋白及其应用
CN110003343B (zh) * 2019-02-26 2022-09-02 黑龙江八一农垦大学 牛传染性鼻气管炎病毒多表位重组嵌合蛋白及其应用
CN113388588A (zh) * 2021-07-06 2021-09-14 天康制药(苏州)有限公司 表达牛疱疹病毒Ⅰ型gB基因的重组牛结节疹病毒及其应用

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