CN110003343B - 牛传染性鼻气管炎病毒多表位重组嵌合蛋白及其应用 - Google Patents

牛传染性鼻气管炎病毒多表位重组嵌合蛋白及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供牛传染性鼻气管炎病毒多表位重组嵌合蛋白及其应用。所述重组嵌合蛋白由破伤风毒素通用T细胞表位多肽P2，牛传染性鼻气管炎病毒gB上的抗原表位gB‑A、gB‑B，牛传染性鼻气管炎病毒gC上的抗原表位gC‑A、gC‑B，牛传染性鼻气管炎病毒gD上的抗原表位gD‑A、gD‑B、gD‑C以及牛IL‑6之间通过刚性Linker串联而成。本发明提供的牛传染性鼻气管炎病毒多表位重组嵌合蛋白诱导产生的抗牛传染性鼻气管炎病毒的抗体水平显著高于其他对照组，表明该重组嵌合蛋白具有良好的免疫原性。

Description

牛传染性鼻气管炎病毒多表位重组嵌合蛋白及其应用
技术领域
本发明属于分子生物学和基因工程领域，具体地说，涉及牛传染性鼻气管炎病毒多表位重组嵌合蛋白及其应用。
背景技术
牛传染性鼻气管炎病毒(Infectious bovine rhinotracheitis virus,IBRV)又称牛I型疱疹病毒(Bovine herpesvirus 1,BHV-1)，是危害养牛业发展的一种重要病原体，可导致严重的呼吸道疾病。在急性感染后，BHV-1可在三叉神经节或背部神经节建立终身潜伏感染，当受到应激因素刺激后，处于潜伏感染状态的BHV-1可被激活并重新排出体外，给控制和消灭BHV-1导致的相关疾病造成极大困难。
牛传染性鼻气管炎病毒是世界范围内引起牛传染病的一种重要病原体。它能使牛出现高热、呼吸困难、鼻炎、窦炎和上呼吸道炎症等症状，还可损害牛的生殖系统，使牛出现流产和死胎以及发生肠炎和小牛脑炎等症状，有时也发生眼结膜炎和角膜炎，但常呈亚临床经过。由病毒感染导致的细胞免疫功能降低和免疫抑制常引起继发性细菌感染，使该病的致死率升高。1955年在美国首次发现以牛传染性鼻气管炎为主要症状的疾病，并被命名为IBR。1956年Madin等人首次从患牛中分离出病毒，随后一些研究者相继从病牛的结膜、外阴、大脑和流产胎儿分离出该病毒，在1964年Hcuk鉴定其为疱疹病毒，并确定IBR在全球流行。目前，一些国家通过捕杀阳性牛和注射基因缺失疫苗根除了此病。但IBR在大多数国家阳性率仍很高。2018年Morris等人对特立尼达和多巴哥的92个牛场进行血清学调查，结果显示IBRV的阳性率为20.7％。2016年对肯尼亚西部地区的牛群进行IBR流行情况进行检测，阳性检出率为20.9％。2015年对澳大利亚维多利亚西南部地区128头公牛进行检测，阳性率为7.8％。
我国在1980年首次从新西兰进口牛群中分离到该病毒，此后，牛传染性鼻气管炎感染情况一直呈上升趋势。近年来，随着我国养牛业的发展以及养殖规模扩大，IBRV的感染情况越发严重，在全国各地以及各个品种的牛群中都有报道。2016年何小丽等人对宁夏地区部分奶牛场进行IBR流行病学调查，在135份耳组织和376份血清中，平均阳性率为85.1％。2016年谢春芳等人对上海市崇明岛地区两个规模化养殖场进行IBR流行病学检测，在共采集的385份血清样品中，阳性率分别为41.2％和74.3％。2016年刘洁琼等人对新疆地区部分养殖场进行IBR流行病学调查，在522份血清样本和208份组织样本中，阳性率达到80.7％。2016年对青藏高原横断面地区耗牛进行IBR流行病学检测，共收集西藏(988牦牛)，青海(475牦牛)和四川(377牦牛)三个省份的1840份血清样品，阳性样本中西藏样本381个(38.6％)，青海样本212个(44.6％)和四川样本105个(27.9％)。2015年蔺晓月等人对山东省部分地区IBR流行情况进行调查，对采集到的741份血清样本检测，阳性率为31.52％。通过对我国部分地区的流行病学调查分析，IBR在我国阳性率依然较高。同时，IBRV通常与多种病毒混合感染，如牛呼吸道合胞体病毒、牛副流感病毒3型等。
IBRV通过空气传播途径感染牛体后，可在上呼吸道和扁桃体的粘膜中大量复制。动物感染IBRV后2-4天，出现鼻腔出血，唾液分泌，发烧，厌食和明显抑郁等症状。在进行自然交配时，生殖器感染可导致感染性脓疱性外阴阴道炎(IPV)和传染性脓疱性阴茎头包皮炎(IPB)。由IBRV引起的呼吸系统或生殖系统疾病的普通病例通常持续约5-10天。但若继发感染细菌或其他病毒，会使病情加重导致死亡。
IBRV感染机体初期，在口、鼻腔或生殖器粘膜内复制，复制期间，疱疹病毒可进入局部神经细胞的轴突。然后，通过轴内运输，病毒到达局部神经节的神经元。通过血液、神经和被感染的组织以及细胞与细胞的相互作用实现在机体内的传播。暂时性病毒血症后，消化道、乳房和卵巢等被感染。Nyaga已经通过体外检查发现BHV-1可以感染血液单核细胞。病毒在呼吸道中繁殖，引起炎症变化，如鼻炎、喉炎和气管炎，导致气管微绒毛的破坏。
目前，IBRV疫苗主要有灭活疫苗、弱毒活疫苗和基因缺失疫苗。然而，灭活苗虽能诱导较好的体液免疫，但免疫期短，且无法与自然感染进行鉴别诊断，因此给根除IBR带来一定的障碍。弱毒苗能诱导较好体液免疫和细胞免疫，免疫期长，但是存在毒力返强可能，存在一定的安全隐患。基因缺失苗已被用于欧洲一些发达国家防治与净化IBR主要手段，但基因缺失技术不完善，还存在一定的危险性。因此，研发更有效的疫苗是防控IBR的首要问题。目前，随着基因工程技术以及生物信息学技术的发展，亚单位疫苗成为研究的热点。
BHV-1为疱疹病毒科、α疱疹病毒亚科成员。病毒粒子似球形，主要由核心、衣壳和囊膜三部分组成。BHV-1的基因组由一个长独特区(UL区)和一个短独特区(US区)组成，其中US区两端分别包含一个反向重复序列(IR和TR)。因此，US区可以反转方向，使病毒DNA具有两种异构体。在BHV-1基因组中，已经鉴定了总共73个编码蛋白质的开放阅读框(ORF)，可编码33个结构蛋白，其中13个可能与膜相关，约10个可能编码糖蛋白，其中gB、gC和gD是主要的包膜糖蛋白，可有效刺激宿主产生免疫应答，现已在亚单位疫苗的研发中被广泛用作抗原。
发明内容
本发明的目的是提供牛传染性鼻气管炎病毒多表位重组嵌合蛋白及其应用。
为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种牛传染性鼻气管炎病毒多表位重组嵌合蛋白，由破伤风毒素通用T细胞表位多肽P2，牛传染性鼻气管炎病毒gB上的抗原表位gB-A、gB-B，牛传染性鼻气管炎病毒gC上的抗原表位gC-A、gC-B，牛传染性鼻气管炎病毒gD上的抗原表位gD-A、gD-B、gD-C以及牛IL-6之间通过刚性Linker串联而成。
其中，P2、gB-A、gB-B、gC-A、gC-B、gD-A、gD-B、gD-C和IL-6的氨基酸序列分别如SEQID NO:3、15、17、11、13、5、7、9和19所示。其对应的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:4、16、17、12、14、6、8、10和20所示。
优选地，所述重组嵌合蛋白的结构为：P2-(gD-A)n-(gD-B)n-(gD-C)-(gC-A)n-(gC-B)-(gB-A)n-(gB-B)-IL-6。
其中，n为1-3之间的整数，优选n为3。例如，(gD-A)3表示3个抗原表位gD-A由刚性Linker串联而成。以此类推。
所述刚性Linker可以是AAYAAY，或者由其它刚性氨基酸组成的Linker，有助于蛋白的正确折叠，缓解不同表位之间的相互干扰。
在本发明的一个具体实施方式中，所述重组嵌合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
第二方面，本发明提供一种聚核苷酸，所述聚核苷酸编码上述重组融合蛋白。
进一步地，编码SEQ ID NO:1所示重组嵌合蛋白的基因序列如SEQ ID NO:2所示。应理解，考虑到密码子的简并性以及不同物种密码子的偏爱性，本领域技术人员可以根据需要使用适合特定物种表达的密码子。
第三方面，本发明提供含有上述聚核苷酸或SEQ ID NO:2所示基因的生物材料，所述生物材料包括但不限于重组DNA、表达盒、转座子、质粒载体、噬菌体载体、病毒载体或工程菌。
第四方面，本发明提供一种基因工程菌，所述工程菌携带上述聚核苷酸或SEQ IDNO:2所示基因。
优选地，出发菌种为大肠杆菌。
第五方面，本发明提供一种制备上述重组嵌合蛋白的方法，将含有编码所述牛传染性鼻气管炎病毒多表位重组嵌合蛋白的基因表达载体转化至大肠杆菌感受态细胞中，筛选阳性克隆并接种于LB液体培养基中培养，加入IPTG诱导表达获得重组嵌合蛋白。
进一步地，将阳性克隆菌接种于LB液体培养基中培养至OD600约0.5，加入IPTG至终浓度为1mM，在37℃下诱导表达重组嵌合蛋白。
第六方面，本发明提供所述重组融合蛋白在制备牛传染性鼻气管炎病毒亚单位疫苗中的应用。
第七方面，本发明提供一种牛传染性鼻气管炎病毒亚单位疫苗，其有效成分为上述重组融合蛋白。
可选地，所述疫苗辅以适量的免疫佐剂，如ISA206。
借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：
本发明提供的牛传染性鼻气管炎病毒多表位重组嵌合蛋白诱导产生的抗牛传染性鼻气管炎病毒的抗体水平与pET-28a-P2-gB/gC/gD、pET-28a-P2-gB/gC/gD+牛IL-6、pET-28a-P2-gB/gC/gD-牛IL-6(单个表位相连)及pET-28a-P2-gB/gC/gD-牛IL-2免疫组相比，在免疫后21d，pET-28a-P2-gB/gC/gD-牛IL-6组的OD450(0.670)高于pET-28a-P2-gB/gC/gD组(0.233)和pET-28a-P2-gB/gC/gD-牛IL-6(单个表位相连)组(0.302)，统计分析差异极显著(P<0.01)；且高于pET-28a-P2-gB/gC/gD+牛IL-6组(0.477)和pET-28a-P2-gB/gC/gD-牛IL-2组(0.456)，统计分析差异显著(P<0.05)。在免疫后42d，pET-28a-P2-gB/gC/gD-牛IL-6组OD450(1.148)高于pET-28a-P2-gB/gC/gD组(0.490)、pET-28a-P2-gB/gC/gD+牛IL-6组(0.799)、pET-28a-P2-gB/gC/gD-牛IL-6(单个表位相连)组(0.540)及pET-28a-P2-gB/gC/gD-牛IL-2组(0.853)，统计分析差异极显著(P<0.01)。在免疫后63d，pET-28a-P2-gB/gC/gD-牛IL-6组OD450(1.425)高于pET-28a-P2-gB/gC/gD组(0.621)、pET-28a-P2-gB/gC/gD+牛IL-6组(1.105)和pET-28a-P2-gB/gC/gD-牛IL-6(单个表位相连)组(0.732)，统计分析差异极显著(P<0.01)，且高于pET-28a-P2-gB/gC/gD-牛IL-2组(1.129)，统计分析差异显著(P<0.05)。
攻毒后pET-28a-P2-gB/gC/gD-牛IL-6组体温相对于pET-28a-P2-gB/gC/gD组、pET-28a-P2-gB/gC/gD+牛IL-6组、pET-28a-P2-gB/gC/gD-牛IL-6(单个表位相连)组和pET-28a-P2-gB/gC/gD-牛IL-2组升高趋势不明显，趋于平稳。攻毒7d后，pET-28a-P2-gB/gC/gD-牛IL-6组肺脏中病毒量(101.287拷贝数)低于pET-28a-P2-gB/gC/gD组(101.939拷贝数)、pET-28a-P2-gB/gC/gD+牛IL-6组(101.841拷贝数)、pET-28a-P2-gB/gC/gD-牛IL-6(单个表位相连)组(101.923拷贝数)和pET-28a-P2-gB/gC/gD-牛IL-2组(101.771拷贝数)，统计分析差异显著(P<0.05)。表明将优势表位做3个重复的嵌合蛋白免疫效果优于单个表位相连的嵌合蛋白，且与IL-6共表达诱导产生的抗体水平与免疫保护作用高于与IL-2共表达的嵌合蛋白。本发明提供的重组嵌合蛋白P2-gB/gC/gD表位-牛IL-6为牛传染性鼻气管炎病毒亚单位疫苗的开发提供一种有效的候选蛋白。
附图说明
图1为本发明实施例1中牛传染性鼻气管炎病毒多表位串联基因的结构及所含酶切位点。其中，各个表位之间用AAYAAY Linker连接。
图2为本发明实施例2中pUC-57-P2-gB/gC/gD双酶切电泳图。其中，M为DNA MarkerDL5000，1为pUC-57-P2-gB/gC/gD质粒双酶切，2为pET-28a质粒双酶切。
图3为本发明实施例2中pET-28a-P2-gB/gC/gD质粒双酶切鉴定电泳。其中，M为DNAMarker DL10000，1为pET-28a-P2-gB/gC/gD质粒双酶切电泳图。
图4为本发明实施例2中pET-28a-P2-gB/gC/gD质粒和pUC-57-牛IL-6质粒双酶切电泳图。其中，M为DNAMarker DL10000，1为pET-28a-P2-gB/gC/gD质粒双酶切，2为pUC-57-牛IL-6质粒双酶切。
图5为本发明实施例2中pET-28a-P2-gB/gC/gD表位-牛IL-6质粒双酶切鉴定图。其中，M为DNAMarker DL10000，1为pET-28a-P2-gB/gC/gD表位-牛IL-6质粒双酶切电泳图。
图6为本发明实施例3中重组pET-28a-P2-gB/gC/gD-牛IL-6重组蛋白及实施例4中重组蛋白纯化后的SDS-PAGE电泳检测结果。其中，M为蛋白Marker，1为pET-28a未诱导前菌体，2为pET-28a菌体破碎后上清，3为pET-28a菌体破碎后沉淀，4为pET-28a-P2-gB/gC/gD-牛IL-6未诱导菌体，5为pET-28a-P2-gB/gC/gD-牛IL-6菌体破碎后上清，6为pET-28a-P2-gB/gC/gD-牛IL-6菌体破碎后沉淀，7为pET-28a-P2-gB/gC/gD-牛IL-6重组蛋白纯化结果。
图7为本发明实施例5中纯化后的重组蛋白Western blot鉴定图。其中，M为蛋白Marker，1为pET-28a-P2-gB/gC/gD-牛IL-6纯化后的重组蛋白。
图8为本发明实施例6中兔血清抗体水平检测结果。
图9为本发明实施例7中攻毒后兔体温测定结果。
图10为本发明实施例7中攻毒7d后兔肺脏中病毒量测定结果。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
实施例1牛传染性鼻气管炎病毒多表位串联基因的设计
本实施例中使用的牛传染性鼻气管炎病毒的抗原表位信息见表1。用AAYAAYLinker将破伤风毒素通用T细胞表位P2和gB、gC和gD抗原表位按不同方式排列组合，用DNAStar Protean软件对其抗原性进行分析，选取抗原性参数较好的组合，连接顺序如图1所示，并在串联基因上设置酶切位点。将设计的串联基因序列及牛IL-6(两端引入Sal I和Hind III酶切位点)基因序列委托至北京华大基因公司合成。
表1 P2、牛IL-6及gB/gC/gD抗原表位序列信息
Figure BDA0001979202250000061
实施例2含有目的片段的重组表达载体的构建
将合成的含有目的片段的pUC-57-P2-gB/gC/gD质粒转化至DH5α感受态细胞，挑取阳性单菌落至LB液体培养基中，培养12h后提取质粒，将获得的质粒及pET-28a空载体分别用Nhe I和Hind III进行双酶切，双酶切体系见表2，双酶切结果见图2。使用OMEGA胶回收试剂盒快速回收双酶切产物。将回收的P2-gB/gC/gD目的片段连接至pET-28a表达载体上，连接体系见表3，从而获得pET-28a-P2-gB/gC/gD重组质粒。重组质粒的双酶切鉴定结果见图3，双酶切体系见表4。对所构建的质粒进行DNA测序，鉴定所构建质粒的完整性和正确性。鉴定正确的质粒及合成的pUC-57-牛IL-6经Sal I和Hind III双酶切后回收双酶切产物，双酶切体系见表5，酶切结果见图4。将回收的目的片段牛IL-6连接至pET-28-P2-gB/gC/gD表位质粒上，连接体系见表6。从而获得pET-28a-P2-gB/gC/gD表位-牛IL-6重组质粒，重组质粒的双酶切鉴定结果见图5，双酶切体系见表7，将双酶切鉴定正确的质粒进行DNA测序。
具体方法如下：
(1)用Nhe I和Hind III内切酶对公司合成的含有目的片段的pUC-57重组质粒及载体pET-28a进行双酶切，双酶切体系见表2。
表2 pUC-57-P2-gB/gC/gD及pET-28a双酶切反应体系
Figure BDA0001979202250000062
Figure BDA0001979202250000071
混匀后置于37℃酶切3h，酶切完成后全部上样，进行1％琼脂糖凝胶电泳并回收酶切产物，酶切结果见图2。
(2)P2-gB/gC/gD片段与pET-28a连接，连接体系见表3。
表3 P2-gB/gC/gD片段与pET-28a连接反应体系
成分 用量
pET-28a胶回收产物 1.0μl
P2-gB/gC/gD胶回收产物 5.0μL
10×T4 DNA Ligase buffer 1.0μL
T4 DNA Ligase 0.5μL
ddH<sub>2</sub>O 2.5μL
总体积 10.0μL
混匀，16℃过夜连接，次日转化DH5α感受态细胞。
(3)双酶切鉴定pET-28a-P2-gB/gC/gD重组质粒
挑取阳性单克隆菌落至LB培养基中，37℃过夜培养，提取质粒进行双酶切鉴定，双酶切体系见表4。
表4 pET-28a-P2-gB/gC/gD双酶切反应体系
成分 用量
重组质粒 10.0μL
10×Tango buffer 2.0μL
Nhe I 1.0μL
Hind III 1.0μL
ddH<sub>2</sub>O 6.0μL
总体积 20.0μL
混匀后，放在37℃水浴锅中酶切3h，将酶切产物用1％的琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，结果见图3。
(4)牛IL-6片段与pET-28a-P2-gB/gC/gD表位连接
根据设计的酶切位点用Sal I和Hind III内切酶对pET-28a-P2-gB/gC/gD表位和pUC-57-牛IL-6进行双酶切，双酶切体系见表5。
表5 pET-28a-P2-gB/gC/gD及pUC-57-牛IL-6双酶切反应体系
Figure BDA0001979202250000072
Figure BDA0001979202250000081
混匀后，置于37℃水浴锅中酶切3h，将酶切产物进行1％琼脂糖凝胶电泳并回收酶切产物，酶切结果见图4。将回收的牛-IL-6片段与pET-28a-P2-gB/gC/gD连接，连接体系见表6。
表6牛IL-6片段与pET-28a-P2-gB/gC/gD连接反应体系
成分 用量
pET-28a-P2-gB/gC/gD胶回收产物 1.0μL
牛IL-6胶回收产物 6.0μL
10×T4 DNA Ligase buffer 1.0μL
T4 DNA Ligase 0.5μL
ddH<sub>2</sub>O 1.5μL
总体积 10.0μL
混匀后，16℃过夜连接，次日转化至DH5α感受态细胞。
(5)重组表达载体pET-28a-P2-gB/gC/gD表位-牛IL-6的双酶切鉴定
挑取单克隆菌落至含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中过夜培养后，提取质粒，用Nhe I和Hind III双酶切重组质粒，酶切体系见表7。
表7 pET-28a-P2-gB/gC/gD-牛IL-6双酶切反应体系
成分 用量
重组质粒 10.0μL
10×Tango buffer 2.0μL
Nhe I 0.5μL
Hind III 0.5μL
ddH<sub>2</sub>O 7.0μL
总体积 20.0μL
混匀，于37℃酶切3h，用1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，结果见图5。
实施例3牛传染性鼻气管炎病毒多表位重组蛋白的表达
用热休克法，将已鉴定正确的pET-28a-P2-gB/gC/gD表位-牛IL-6重组质粒转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞中。挑取单克隆菌落接种于含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，当OD600达0.5时，加入IPTG(终浓度为1mM)，37℃诱导培养4h，收集菌体，将菌体用PBS重悬，置于冰上超声破碎，收集上清和沉淀，进行SDS-PAGE电泳鉴定蛋白表达情况，P2-gB/gC/gD表位-牛IL-6重组蛋白的SDS-PAGE的电泳图如图6所示。
实施例4重组嵌合蛋白的纯化
将鉴定正确并能大量表达的菌液按1:100的比例接种至含有50μg/mL卡那霉素的LB培养基中大量培养，当OD600达到0.5时，待菌液冷却至室温加入IPTG诱导剂(终浓度为1mM)，37诱导培养4h，收集菌体，用PBS洗涤3次。使用Ni-NTA纯化系统(ThermoFisherScientific)对重组嵌合蛋白进行纯化。按照纯化系统的说明书操作，向收集的菌体中加入binding buffer重悬，置于冰上超声破碎至清亮，收集上清。用pH＝6.0含8M尿素的washingbuffer和pH＝5.3含8M尿素的washing buffer洗脱杂蛋白，用pH＝4.0含8M尿素的washingbuffer洗脱目的蛋白。将洗脱下的P2-gB/gC/gD表位-牛IL-6重组蛋白进行SDS-PAGE鉴定，结果见图6。
实施例5纯化后的重组蛋白Western blot鉴定
将纯化后的重组嵌合蛋白进行SDS-PAGE电泳后，依次向半干转膜仪中放入用转膜液浸泡过的厚滤纸、PVDF膜(使用之前在无水甲醇中浸泡5min)、凝胶和厚滤纸，轻轻用滚轮去除气泡，擦干周围液体，盖上转膜仪盖子，15V电压，转膜40min。转膜完毕后，将PVDF膜放入PBST中于摇床上洗涤2min；加入5％脱脂乳，4℃封闭过夜；用PBST洗涤3次，每次5min，用5％脱脂乳按1:1000的比例稀释一抗(gD单克隆抗体)，37℃孵育1h；PBST洗涤3次，每次10min，用5％的脱脂乳按1:5000比例稀释HRP标记的羊抗小鼠二抗，37℃孵育1h；PBST洗涤3次，每次10min；向PVDF膜上加入DAB显色液，待显色后，加入ddH2O终止显色，结果见图7。
实施例6间接ELISA法测定抗体水平
采用2-3kg体重的雌性中国大白兔进行动物实验，将纯化后的P2-gB/gC/gD表位-牛IL-6重组嵌合蛋白与ISA206佐剂按体积比1:1乳化后，每隔3周给兔子腿部肌肉多点注射免疫一次，每只兔子注射1.0mL(100μg重组蛋白)，共免疫3次，同时，设置pET-28a-P2-gB/gC/gD(100μg重组蛋白)、pET-28a-P2-gB/gC/gD(100μg重组蛋白)+牛IL-6蛋白(100μg)、pET-28a-P2-gB/gC/gD-牛IL-2(100μg重组蛋白)、pET-28a-P2-gB/gC/gD-牛IL-6(单个表位相连)对照组及佐剂对照组(即用等体积的PBS代替蛋白)，其中牛IL-2基因序列GenBank登录号为AF348423。分别在免疫后3周采血(实验动物的使用、饲养遵循实验动物福利标准和规定)。
通过间接ELISA法测定每份血清中的抗体滴度。用浓缩纯化后的牛传染性鼻气管炎病毒DQ分离株(浓度为2μg/mL)包被96孔板，每孔100μL，4℃包被过夜，用PBST洗板之后拍干，每孔加入100μL用5％脱脂乳按1:100比例稀释的血清，37℃孵育1h，用PBST洗板之后，每孔加入100μL用5％脱脂乳按1:5000比例稀释HRP标记的山羊抗兔二抗，37℃孵育1h，用PBST洗板之后拍干，加入TMB显色液，37℃显色15min，加入2M H2SO4溶液，终止显色。
结果显示，P2-gB/gC/gD表位-牛IL-6重组蛋白诱导产生的抗牛传染性鼻气管炎病毒的抗体水平显著高于其他对照组，与pET-28a-P2-gB/gC/gD、pET-28a-P2-gB/gC/gD+牛IL-6、pET-28a-P2-gB/gC/gD-牛IL-6(单个表位相连)及pET-28a-P2-gB/gC/gD-牛IL-2免疫组相比，在免疫后21d，pET-28a-P2-gB/gC/gD-牛IL-6组的OD450(0.670)高于pET-28a-P2-gB/gC/gD组(0.233)和pET-28a-P2-gB/gC/gD-牛IL-6(单个表位相连)组(0.302)，统计分析差异极显著(P<0.01)；且高于pET-28a-P2-gB/gC/gD+牛IL-6组(0.477)和pET-28a-P2-gB/gC/gD-牛IL-2组(0.456)，统计分析差异显著(P<0.05)。在免疫后42d，pET-28a-P2-gB/gC/gD-牛IL-6组OD450(1.148)高于pET-28a-P2-gB/gC/gD组(0.490)、pET-28a-P2-gB/gC/gD+牛IL-6组(0.799)、pET-28a-P2-gB/gC/gD-牛IL-6(单个表位相连)组(0.540)及pET-28a-P2-gB/gC/gD-牛IL-2组(0.853)，统计分析差异极显著(P<0.01)。在免疫后63d，pET-28a-P2-gB/gC/gD-牛IL-6组OD450(1.425)高于pET-28a-P2-gB/gC/gD组(0.621)、pET-28a-P2-gB/gC/gD+牛IL-6组(1.105)和pET-28a-P2-gB/gC/gD-牛IL-6(单个表位相连)组(0.732)，统计分析差异极显著(P<0.01)，且高于pET-28a-P2-gB/gC/gD-牛IL-2组(1.129)，统计分析差异显著(P<0.05)。结果见图8。
实施例7攻毒保护性试验
在三免之后第3周，用牛传染性鼻气管炎病毒DQ株感染实验兔，以10％利多卡因麻醉兔鼻腔后，用滴管缓慢滴入鼻孔(350μL/鼻孔)，TCID50为10-6.25/100μL。分别在攻毒后前1d及攻毒后1d、3d、5d和7d测量兔子体温，结果见图9。
攻毒后pET-28a-P2-gB/gC/gD-牛IL-6组体温相对于pET-28a-P2-gB/gC/gD组、pET-28a-P2-gB/gC/gD+牛IL-6组、pET-28a-P2-gB/gC/gD-牛IL-6(单个表位相连)组和pET-28a-P2-gB/gC/gD-牛IL-2组升高趋势不明显，趋于平稳。攻毒7d后，pET-28a-P2-gB/gC/gD-牛IL-6组肺脏中病毒量(101.287拷贝数)低于pET-28a-P2-gB/gC/gD组(101.939拷贝数)、pET-28a-P2-gB/gC/gD+牛IL-6组(101.841拷贝数)、pET-28a-P2-gB/gC/gD-牛IL-6(单个表位相连)组(101.923拷贝数)和pET-28a-P2-gB/gC/gD-牛IL-2组(101.771拷贝数)，统计分析差异显著(P<0.05)。表明将优势表位做3个重复的嵌合蛋白免疫效果优于单个表位相连的嵌合蛋白，且与IL-6共表达诱导产生的抗体水平与免疫保护作用高于与IL-2共表达的嵌合蛋白。
在7d时安乐死家兔，采集肺脏，提取DNA，利用实时荧光定量方法检测各组家兔肺脏中病毒的量，结果见图10。
由此可见，P2-gB/gC/gD表位-牛IL-6重组嵌合蛋白与其他组相比可有效诱导抗牛传染性鼻气管炎病毒抗体的产生，且具有良好的免疫保护作用。因此，本发明提供的重组嵌合蛋白P2-gB/gC/gD表位-牛IL-6为牛传染性鼻气管炎病毒亚单位疫苗的开发提供一种有效的候选蛋白。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 黑龙江八一农垦大学
<120> 牛传染性鼻气管炎病毒多表位重组嵌合蛋白及其应用
<130> KHP191110576.1
<160> 20
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 596
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Ala Ser Gly Ser Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile
1 5 10 15
Thr Glu Leu Ala Ala Tyr Ala Ala Tyr Gly Ser Glu Phe Gly Glu Pro
20 25 30
Lys Pro Gly Pro Ser Pro Asp Ala Asp Arg Pro Glu Ala Ala Tyr Ala
35 40 45
Ala Tyr Gly Glu Pro Lys Pro Gly Pro Ser Pro Asp Ala Asp Arg Pro
50 55 60
Glu Ala Ala Tyr Ala Ala Tyr Gly Glu Pro Lys Pro Gly Pro Ser Pro
65 70 75 80
Asp Ala Asp Arg Pro Glu Ala Ala Tyr Ala Ala Tyr Val Val Pro Pro
85 90 95
Tyr Phe Glu Glu Ser Lys Gly Tyr Glu Pro Pro Pro Ala Ala Ala Ala
100 105 110
Tyr Ala Ala Tyr Val Val Pro Pro Tyr Phe Glu Glu Ser Lys Gly Tyr
115 120 125
Glu Pro Pro Pro Ala Ala Ala Ala Tyr Ala Ala Tyr Val Val Pro Pro
130 135 140
Tyr Phe Glu Glu Ser Lys Gly Tyr Glu Pro Pro Pro Ala Ala Ala Ala
145 150 155 160
Tyr Ala Ala Tyr Leu Gly Ala Ala Arg Gly Tyr Thr Phe Gly Ala Cys
165 170 175
Phe Pro Ala Arg Asp Tyr Glu Gln Lys Lys Val Leu Glu Phe Glu Leu
180 185 190
Ala Ala Tyr Ala Ala Tyr Ala Gly Asn Ala Ser Arg Asp Gly Arg Pro
195 200 205
Ser Ala Ala Tyr Ala Ala Tyr Ala Gly Asn Ala Ser Arg Asp Gly Arg
210 215 220
Pro Ser Ala Ala Tyr Ala Ala Tyr Ala Gly Asn Ala Ser Arg Asp Gly
225 230 235 240
Arg Pro Ser Ala Ala Tyr Ala Ala Tyr Ser Ala Gly Thr Thr Gly Ala
245 250 255
Thr Pro Pro Thr Pro Asn Ser Pro Asp Ala Thr Pro Glu Asp Ser Thr
260 265 270
Ala Ala Tyr Ala Ala Tyr His Arg Glu His Thr Ser Tyr Ser Pro Glu
275 280 285
Arg Phe Gln Gln Ile Glu Gly Tyr Tyr Lys Arg Ala Ala Tyr Ala Ala
290 295 300
Tyr His Arg Glu His Thr Ser Tyr Ser Pro Glu Arg Phe Gln Gln Ile
305 310 315 320
Glu Gly Tyr Tyr Lys Arg Ala Ala Tyr Ala Ala Tyr His Arg Glu His
325 330 335
Thr Ser Tyr Ser Pro Glu Arg Phe Gln Gln Ile Glu Gly Tyr Tyr Lys
340 345 350
Arg Ala Ala Tyr Ala Ala Tyr Glu Gly Leu Phe Ala Ala Ala Ala Pro
355 360 365
Lys Pro Gly Pro Arg Arg Ala Arg Arg Ala Ala Pro Ala Ala Tyr Ala
370 375 380
Ala Tyr Val Asp Met Asn Ser Arg Phe Thr Ser Ala Phe Thr Pro Phe
385 390 395 400
Ala Val Ser Leu Gly Leu Leu Leu Val Met Thr Ser Ala Phe Pro Thr
405 410 415
Pro Gly Pro Leu Gly Glu Asp Phe Lys Asn Asp Thr Thr Pro Gly Arg
420 425 430
Leu Leu Leu Thr Thr Pro Glu Lys Thr Glu Ala Leu Ile Lys Arg Met
435 440 445
Val Asp Lys Ile Ser Ala Met Arg Lys Glu Ile Cys Glu Lys Asn Asp
450 455 460
Glu Cys Glu Ser Ser Lys Glu Thr Leu Ala Glu Asn Lys Leu Asn Leu
465 470 475 480
Pro Lys Met Glu Glu Lys Asp Gly Cys Phe Gln Ser Gly Phe Asn Gln
485 490 495
Ala Ile Cys Leu Ile Arg Thr Thr Ala Gly Leu Leu Glu Tyr Gln Ile
500 505 510
Tyr Leu Asp Tyr Leu Gln Asn Glu Tyr Glu Gly Asn Gln Glu Asn Val
515 520 525
Arg Asp Leu Arg Lys Asn Ile Arg Thr Leu Ile Gln Ile Leu Lys Gln
530 535 540
Lys Ile Ala Asp Leu Ile Thr Thr Pro Ala Thr Asn Thr Asp Leu Leu
545 550 555 560
Glu Lys Met Gln Ser Ser Asn Glu Trp Val Lys Asn Ala Lys Ile Ile
565 570 575
Leu Ile Leu Arg Asn Leu Glu Asn Phe Leu Gln Phe Ser Leu Arg Ala
580 585 590
Ile Arg Met Lys
595
<210> 2
<211> 1788
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gctagcggat cccagtatat caaagcaaac agcaaattta tcggcatcac cgaactggca 60
gcatatgcag cctatggatc cgaattcggt gaaccgaaac cgggtccgag tccggatgca 120
gatcgtccgg aagcagcgta tgccgcatat ggcgaaccta aacctggtcc ttcacctgat 180
gcggatcgcc ctgaagctgc ctatgcagcg tacggcgagc caaaaccggg accgtcaccg 240
gatgccgaca gaccggaagc cgcatacgca gcttatgttg ttccgcctta ttttgaagaa 300
agcaaaggtt atgaaccgcc tccggcagca gcagcctacg cagcatacgt tgtgcctccg 360
tatttcgaag aatcaaaagg ctacgaacct ccgcctgcag cagccgcata tgcagcgtat 420
gtggtgcctc cgtactttga agagagtaaa ggatacgagc caccgccagc tgccgcagcg 480
tacgcagcct atctgggtgc agcacgtggt tatacctttg gtgcatgttt tccggcacgt 540
gattatgaac agaaaaaagt tctggaattc gagctcgcag cttatgcagc atatgccggt 600
aatgcaagcc gtgatggtcg tccgagcgca gcatacgcag cctacgcagg taatgcctca 660
cgtgatggcc gaccgtcagc agcgtatgca gcttatgctg gcaacgcgag tcgcgacggt 720
cgtccgtctg cagcttacgc tgcctatagc gcaggcacca ccggtgcaac ccctccgaca 780
ccgaatagcc ctgatgcaac accggaagat agcaccgcag cttacgcagc gtaccatcgt 840
gaacatacca gctatagtcc ggaacgtttt cagcagattg aaggttatta caaacgtgca 900
gcctatgctg cctatcatcg tgaacacacc tcatattcac cggaacgctt ccagcaaatc 960
gagggctact ataaacgtgc tgcttacgca gcatatcacc gcgagcatac cagttactca 1020
cctgagcgtt ttcaacaaat agaagggtat tataagcgtg ctgcctatgc cgcttatgaa 1080
ggtctgtttg cagccgcagc accaaaacca ggtccgcgtc gtgcacgtcg tgccgcacca 1140
gcagcctatg cagcgtatgt cgacatgaat agccgtttta ccagcgcatt taccccgttt 1200
gcagttagcc tgggtctgct gctggttatg accagcgcct ttccgacacc gggtccgctg 1260
ggtgaagatt tcaaaaatga taccactccg ggtcgcctgc tgctgaccac accggaaaaa 1320
accgaagcac tgattaaacg tatggtggat aaaatcagcg ccatgcgtaa agaaatctgc 1380
gaaaaaaatg atgaatgcga aagcagcaaa gaaaccctgg cagaaaataa actgaatctg 1440
ccgaaaatgg aagagaaaga tggttgtttt cagagcggtt ttaatcaggc catttgtctg 1500
attcgtacca ccgcaggtct gctggaatat cagatttatc tggattatct gcagaacgag 1560
tatgaaggca atcaagaaaa tgttcgtgat ctgcgtaaaa acattcgtac cctgattcag 1620
atcctgaaac agaaaattgc cgatctgatt acaacaccgg caaccaatac cgacctgctg 1680
gaaaaaatgc agagcagcaa tgaatgggtt aaaaacgcca aaattatcct gattctgcgc 1740
aacctggaaa actttctgca gtttagtctg cgtgcaatcc gcatgaaa 1788
<210> 3
<211> 15
<212> PRT
<213> 破伤风杆菌(Clostridium tetani)
<400> 3
Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu
1 5 10 15
<210> 4
<211> 45
<212> DNA
<213> 破伤风杆菌(Clostridium tetani)
<400> 4
cagtatataa aagcaaattc taaatttata ggtataactg aacta 45
<210> 5
<211> 15
<212> PRT
<213> 牛I型疱疹病毒(Bovine herpesvirus 1)
<400> 5
Gly Glu Pro Lys Pro Gly Pro Ser Pro Asp Ala Asp Arg Pro Glu
1 5 10 15
<210> 6
<211> 45
<212> DNA
<213> 牛I型疱疹病毒(Bovine herpesvirus 1)
<400> 6
ggcgagccga aacccggccc cagccccgac gccgaccgcc ccgaa 45
<210> 7
<211> 18
<212> PRT
<213> 牛I型疱疹病毒(Bovine herpesvirus 1)
<400> 7
Val Val Pro Pro Tyr Phe Glu Glu Ser Lys Gly Tyr Glu Pro Pro Pro
1 5 10 15
Ala Ala
<210> 8
<211> 54
<212> DNA
<213> 牛I型疱疹病毒(Bovine herpesvirus 1)
<400> 8
gtcgttccgc cgtattttga ggagtcgaag ggctacgagc cgccgcctgc cgcc 54
<210> 9
<211> 24
<212> PRT
<213> 牛I型疱疹病毒(Bovine herpesvirus 1)
<400> 9
Leu Gly Ala Ala Arg Gly Tyr Thr Phe Gly Ala Cys Phe Pro Ala Arg
1 5 10 15
Asp Tyr Glu Gln Lys Lys Val Leu
20
<210> 10
<211> 72
<212> DNA
<213> 牛I型疱疹病毒(Bovine herpesvirus 1)
<400> 10
ctcggcgcgg ctcgcgggta cacctttggc gcgtgcttcc cggcccggga ttacgagcaa 60
aagaaggttc tg 72
<210> 11
<211> 11
<212> PRT
<213> 牛I型疱疹病毒(Bovine herpesvirus 1)
<400> 11
Ala Gly Asn Ala Ser Arg Asp Gly Arg Pro Ser
1 5 10
<210> 12
<211> 33
<212> DNA
<213> 牛I型疱疹病毒(Bovine herpesvirus 1)
<400> 12
gctggcaacg cgagccgcga tgggcgacct agc 33
<210> 13
<211> 23
<212> PRT
<213> 牛I型疱疹病毒(Bovine herpesvirus 1)
<400> 13
Ser Ala Gly Thr Thr Gly Ala Thr Pro Pro Thr Pro Asn Ser Pro Asp
1 5 10 15
Ala Thr Pro Glu Asp Ser Thr
20
<210> 14
<211> 69
<212> DNA
<213> 牛I型疱疹病毒(Bovine herpesvirus 1)
<400> 14
tccgccggga ccaccggcgc aacgcccccc acgcccaaca gccccgacgc tacgccagag 60
gacagcacg 69
<210> 15
<211> 21
<212> PRT
<213> 牛I型疱疹病毒(Bovine herpesvirus 1)
<400> 15
His Arg Glu His Thr Ser Tyr Ser Pro Glu Arg Phe Gln Gln Ile Glu
1 5 10 15
Gly Tyr Tyr Lys Arg
20
<210> 16
<211> 63
<212> DNA
<213> 牛I型疱疹病毒(Bovine herpesvirus 1)
<400> 16
caccgcgagc acaccagcta ctcgccggag cgcttccagc agatcgaggg ctactacaag 60
cgc 63
<210> 17
<211> 21
<212> PRT
<213> 牛I型疱疹病毒(Bovine herpesvirus 1)
<400> 17
Glu Gly Leu Phe Ala Ala Ala Ala Pro Lys Pro Gly Pro Arg Arg Ala
1 5 10 15
Arg Arg Ala Ala Pro
20
<210> 18
<211> 63
<212> DNA
<213> 牛I型疱疹病毒(Bovine herpesvirus 1)
<400> 18
gaggggctgt tcgccgccgc ggcgcccaag ccgggcccgc ggcgcgcgcg ccgcgccgcg 60
ccg 63
<210> 19
<211> 208
<212> PRT
<213> 牛(Bovine)
<400> 19
Met Asn Ser Arg Phe Thr Ser Ala Phe Thr Pro Phe Ala Val Ser Leu
1 5 10 15
Gly Leu Leu Leu Val Met Thr Ser Ala Phe Pro Thr Pro Gly Pro Leu
20 25 30
Gly Glu Asp Phe Lys Asn Asp Thr Thr Pro Gly Arg Leu Leu Leu Thr
35 40 45
Thr Pro Glu Lys Thr Glu Ala Leu Ile Lys Arg Met Val Asp Lys Ile
50 55 60
Ser Ala Met Arg Lys Glu Ile Cys Glu Lys Asn Asp Glu Cys Glu Ser
65 70 75 80
Ser Lys Glu Thr Leu Ala Glu Asn Lys Leu Asn Leu Pro Lys Met Glu
85 90 95
Glu Lys Asp Gly Cys Phe Gln Ser Gly Phe Asn Gln Ala Ile Cys Leu
100 105 110
Ile Arg Thr Thr Ala Gly Leu Leu Glu Tyr Gln Ile Tyr Leu Asp Tyr
115 120 125
Leu Gln Asn Glu Tyr Glu Gly Asn Gln Glu Asn Val Arg Asp Leu Arg
130 135 140
Lys Asn Ile Arg Thr Leu Ile Gln Ile Leu Lys Gln Lys Ile Ala Asp
145 150 155 160
Leu Ile Thr Thr Pro Ala Thr Asn Thr Asp Leu Leu Glu Lys Met Gln
165 170 175
Ser Ser Asn Glu Trp Val Lys Asn Ala Lys Ile Ile Leu Ile Leu Arg
180 185 190
Asn Leu Glu Asn Phe Leu Gln Phe Ser Leu Arg Ala Ile Arg Met Lys
195 200 205
<210> 20
<211> 624
<212> DNA
<213> 牛(Bovine)
<400> 20
atgaactccc gcttcacaag cgccttcact ccattcgctg tctccctggg gctgctcctg 60
gtgatgactt ctgctttccc taccccgggt cccctgggag aagatttcaa aaatgacacc 120
accccaggca gactacttct gaccactcca gagaaaaccg aagctctcat taagcgcatg 180
gtcgacaaaa tctctgcaat gagaaaggag atatgtgaga agaatgatga gtgtgaaagc 240
agcaaggaga cactggcaga aaataagctg aatcttccaa aaatggagga aaaggacgga 300
tgcttccaat ctgggttcaa tcaggcgatt tgcttgatca gaaccactgc tggtcttctg 360
gagtatcaga tatacctgga ctacctccag aacgagtatg agggaaatca ggaaaatgtc 420
agggatttga ggaaaaatat cagaacactg atccagatcc tgaagcaaaa gatcgcagat 480
ctaataacca ctccagccac aaacactgac ctgctggaga agatgcagtc ttcaaacgag 540
tgggtaaaga acgcaaagat tatcctcatc ctgagaaacc ttgagaattt cctgcagttc 600
agcctgagag ctattcggat gaag 624

Claims (10)

1.牛传染性鼻气管炎病毒多表位重组嵌合蛋白，其特征在于，由破伤风毒素通用T细胞表位多肽P2，牛传染性鼻气管炎病毒gB上的抗原表位gB-A、gB-B，牛传染性鼻气管炎病毒gC上的抗原表位gC-A、gC-B，牛传染性鼻气管炎病毒gD上的抗原表位gD-A、gD-B、gD-C以及牛IL-6之间通过刚性Linker串联而成；
其中，P2、gB-A、gB-B、gC-A、gC-B、gD-A、gD-B、gD-C和IL-6的氨基酸序列分别如SEQ IDNO:3、15、17、11、13、5、7、9和19所示。
2.根据权利要求1所述的重组嵌合蛋白，其特征在于，其结构为：P2-(gD-A)n-(gD-B)n-(gD-C)-(gC-A)n-(gC-B)-(gB-A)n-(gB-B)-IL-6；
其中，n为1-3之间的整数。
3.根据权利要求2所述的重组嵌合蛋白，其特征在于，n为3。
4.根据权利要求1所述的重组嵌合蛋白，其特征在于，所述刚性Linker为AAYAAY。
5.根据权利要求1所述的重组嵌合蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
6.聚核苷酸，其特征在于，所述聚核苷酸编码权利要求1-5任一项所述重组嵌合蛋白。
7.编码权利要求4所述重组嵌合蛋白的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
8.含有权利要求6所述聚核苷酸或权利要求7所述基因的生物材料，所述生物材料为重组DNA、表达盒、转座子、质粒载体、病毒载体或工程菌。
9.权利要求1-5任一项所述重组嵌合蛋白在制备牛传染性鼻气管炎病毒亚单位疫苗中的应用。
10.牛传染性鼻气管炎病毒亚单位疫苗，其特征在于，有效成分为权利要求1-5任一项所述重组嵌合蛋白。
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