CN102134278A - 圆环病毒基因工程黏膜免疫亚单位疫苗的制备及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于涉及一种用于预防猪圆环病毒感染的融合蛋白以及该融合蛋白的制备方法及其应用。具体而言，本发明涉及一种融合蛋白，该融合蛋白包含圆环病毒PCV2主要膜蛋白capsid protein的亚单位、大肠杆菌不耐热病毒B亚单位、T细胞抗原表位及纯化标签，本发明还涉及该融合蛋白的制备方法和药学应用。

Description

圆环病毒基因工程黏膜免疫亚单位疫苗的制备及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地说，本发明涉及用于黏膜免疫的融合蛋白，用于预防猪圆环病毒，其由圆环病毒PCV2主要膜蛋白capsid protein的亚单位、大肠杆菌不耐热毒素B亚单位、T细胞抗原表位及纯化标签序列组成，及其制备方法及应用。

背景技术

猪圆环病毒2型(PCV-2)是1991年加拿大的Harding J和Clark E等学者最早发现。仔猪断奶后多系统衰竭综合征(PMWS)的主要病原是PCV-2，此外，猪皮炎与肾炎综合征、增生性坏死性肺炎、猪呼吸道综合征、繁殖障碍、先天性颤抖等疫病都与PCV-2相关联。PCV2及其相关的猪病死亡率10％～30％不等，较严重的猪场在暴发本病时死淘率高达40％，给养猪业造成严重的经济损失。猪对PCV2具有较强的易感性，感染猪可自鼻液、粪便等废物中排出病毒，经口腔、呼吸道途径感染不同年龄的猪。怀孕母猪感染PCV2后，可经胎盘垂直传播感染仔猪。公猪精液可能是另一种传播途径。用PCV2人工感染试验猪后，其他未接种猪的同居感染率是100％，这说明该病毒可水平传播。猪在不同猪群间的移动是该病毒的主要传播途径，也可通过被污染的衣服和设备进行传播。

猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2，PCV2)为无囊膜的单股负链DNA病毒，属圆环病毒科(Circoviridae)成员。其基因组为单股环状DNA。猪圆环病毒(Porcine circovirus，PCV)为圆环病毒科圆、环病毒属成员，可分为不致病的圆环病毒1型(PCV-1)和致病的圆环病毒2型(PCV-2)两个血清型。

国内目前的PCV2疫苗都是全病毒灭活疫苗，有很好的免疫原性。其他商品化的PCV2灭活疫苗直至到2006年才正式获得许可证。2006年在富道动物公司的PCV2疫苗(Suvaxyn)在美国第1个获得了完整的许可证。2007年9月，梅里亚PCV2灭活疫苗首次在欧洲获得批准文号。全球一共有5家商品化的PCV2疫苗。其中梅里 亚研发的PCV2疫苗(Circovace)为全病毒灭活苗，适用于母猪免疫；勃林格殷格翰动物保健公司的PCV2疫苗(CircoFlex)和英特威/先灵葆雅动物保健公司的PCV2疫苗(Circumvent)属于亚单位苗；富道动物保健公司的PCV2疫苗(Suvaxyn)则属于嵌合病毒灭活苗。另外还有一家韩国的公司亦拥有该疫苗。国内新型疫苗的研制比国外稍慢一些。灭活疫苗在使用中都存在病毒重组形成新毒株的可能，因此有一定的潜在危险；在亚单位疫苗方面，主要是将PCV2基因组中编码免疫原性蛋白的OR F2片段插入到昆虫杆状病毒中，通过培养昆虫杆状病毒即可快速、大量获得具备免疫原性的PCV2核衣壳蛋白，再将其制备成疫苗，大量田间试验表明该类疫苗可为仔猪提供良好的免疫保护(勃林格殷格翰动物保健公司的PCV2疫苗CircoFlex和英特威/先灵葆雅动物保健公司的PCV2疫苗Circumvent)：另一类是嵌合病毒灭活苗，原理是用PCV-2的ORF2片段置换不致病的PCV1中的ORF2片段，即获得了PCV1-PCV2嵌合病毒，具有与PCV-2类似的免疫原性(富道动物保健公司)，试验中发现活苗中的嵌合病毒易被母源抗体中和，遂将其灭活制得PCV-1-PCV-2嵌合灭活苗。迄今，多批试验表明，嵌合病毒灭活苗可为猪群提供较好的免疫保护，特别在抑制病毒、减少病毒血症方面具有显著的优势。

近年兴起的黏膜免疫，不仅可以产生很强的抗体应答，而且还能产生较好的细胞免疫效果。黏膜免疫需要有黏膜佐剂分子，已经证实霍乱毒素B亚单位(本文简称为CTB)、大肠杆菌不耐热毒素B亚单位(本文简称为LTB)均是良好的佐剂分子(Lycke N，European J.of Immunol，1992；22：2277-2281)。此外，Blanco的研究发现，含有T细胞表位的多肽能增强Th细胞的活性，并协同诱导机体产生抗病毒抗体(Blanco E，J Virol.2001；75(7)：3164-74)。

目前，尚没有见到针对PCV的黏膜免疫疫苗，为了有效预防圆环病毒，人们迫切需要一种新型、高效的疫苗来预防圆环病毒。本发明提供了提供了一种新的能用于黏膜免疫的融合蛋白及其疫苗组合物，其能预防圆环病毒的感染。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种新的能用于黏膜免疫的融合蛋白及其疫苗组合物，其能预防圆环病毒的感染。本发明还提供了含有所述融合蛋白的药物组合物，如疫苗组合物。此外，本发明还提供了编码所述融合蛋白的多核苷酸以及制备该 融合蛋白的方法等。

在第一个方面，本发明提供了一种用于黏膜免疫的融合蛋白，其含有圆环病毒PCV2主要膜蛋白capsid protein的亚单位、大肠杆菌不耐热毒素B亚单位(LTB)和T细胞抗原表位。其中，所述圆环病毒PCV2主要膜蛋白capsid protein的亚单位指的是具有免疫原性的圆环病毒PCV2主要膜蛋白capsid protein的亚单位中的主要多肽或其具有基本相同免疫原性的功能等价物，优选是圆环病毒PCV2主要膜蛋白capsid protein的亚单位SEQ ID No.4。所述的LTB指的是大肠杆菌不耐热毒素B亚单位或其具有基本相同黏膜佐剂功能的功能等价物，优选是如SEQ ID No.6所示的氨基酸序列或其功能等价物。所述的T细胞抗原表位指的是能够能增强Th细胞活性的抗原表位，优选是如SEQ ID No.8所示的氨基酸序列或其功能等价物。

本文中所用的术语“融合蛋白”是指多个蛋白质或多肽分子连接到一起所形成的新的蛋白质或多肽或其药学上可接受的盐。连接可以通过公知的遗传工程或化学合成方法来进行，优选通过遗传工程方法，即通过重组DNA技术来实现多个蛋白质或多肽分子的融合。本发明的融合蛋白中亦可包括一些化学修饰部分，如水溶性聚合物。优选水溶性聚合物要为药学上可接受的聚合物，如聚乙二醇，葡萄糖，聚乙烯醇，乙二醇/丙二醇共聚物，丙二醇同源共聚物，多聚氨基酸等。它们可以延长融合蛋白的体内代谢时间，加速生物体对融合蛋白的吸收，增强融合蛋白的稳定性等。当用基因工程手段表达本发明的融合蛋白时，根据生产中所使用的宿主细胞的不同，如原核(细菌细胞)或真核(酵母细胞、植物细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞、哺乳动物乳腺反应器)，本发明的融合蛋白可以是糖基化的、也可以是非糖基化的。“药学上可接受的盐”指适于与人或动物的组织接触，而无过多的毒性、刺激或变态反应等的盐。药学上可接受的盐是本领域熟知的。

本文中所用的术语“功能等价物”指的是与原有多肽或蛋白质的活性基本相同的变异体多肽。该变异体多肽是在原有多肽或蛋白质序列中变异一个或几个氨基酸残基而获得的多肽，优选是变异一个至五个氨基酸残基而获得的多肽，更优选是变异一个至三个氨基酸残基而获得的多肽。变异可以通过缺失、插入和/或用其他氨基酸取代序列上的原氨基酸残基来实施。本领域技术人员知晓，通过改变已 知多肽的编码基因序列并将其导入表达载体，可以制备出取代、插入或添加了氨基酸残基的多肽，这些方法广泛记载于《分子克隆实验指南》(北京：科学出版社，2002年)等本领域公知的文献中。在变异的氨基酸残基中，优选变异为与原氨基酸残基侧链性质相似的其他氨基酸，从而更得以保持原有功能活性。侧链性质相似的氨基酸分别有疏水性氨基酸(A、I、L、M、F、P、W、Y、V)、亲水性氨基酸(R、D、N、C、E、Q、G、H、K、S、T)、脂肪族侧链的氨基酸(G、A、V、L、I、P)、含羟基侧链的氨基酸(S、T、Y)、含硫原子侧链的氨基酸(C、M)、含羧酸和酰胺侧链的氨基酸(D、N、E、Q)、含碱性基团侧链的氨基酸(R、K、H)、含芳香族侧链的氨基酸(H、F、Y、W)。

本文中所用的术语“基本相同”指的是功能等价物的活性相对于与原有多肽或蛋白质的活性基本不减弱，优选活性可降低不到30％，更优选可降低不到10％，最优选不减弱。目前已经存在大量检验诸如免疫原性、黏膜佐剂功能或增强Th细胞活性能力的实验方法，必要时也可根据本发明实施例所述的具体方法，通过诸如基因工程手段将原有多肽或蛋白质部分替换为相应的功能等价物，由此来选出合适的功能等价物。

优选在本发明第一方面的融合蛋白中，所述的圆环病毒PCV2主要膜蛋白capsid protein的亚单位的氨基酸序列选自SEQ ID No.4，其中所述的大肠杆菌不耐热毒素B亚单位的氨基酸序列为SEQ ID No.6；其中所述的T细胞抗原表位的氨基酸序列为SEQ ID No.8。

更优选，本发明第一方面的融合蛋白进一步含有纯化标签和/或接头肽。纯化标签(Tag)通常为特定的蛋白质或连续的几个氨基酸序列，其可以与相应结合物质产生特异性结合。因而当融合蛋白中含有纯化标签时，可以较容易地利用其结合性质来对融合蛋白进行纯化和鉴定。目前已经有很多纯化标签可以使用，有些已经商品化了，如His标签、FLAG标签、Myc标签、β-半乳糖苷酶标签、蛋白A标签、GST(谷胱甘肽硫转移酶)标签等。本发明的纯化标签优选是His标签，更优选是氨基酸序列为SEQ ID No.10所示的氨基酸序列。接头肽(也称“连接子”)是起连接融合蛋白中各活性成分的不超过20个氨基酸残基大小的肽，其本身并不具有融合蛋白中各活性成分的作用。优选接头肽不超过10个氨基酸残基大小。本 发明可使用接头肽连接在本发明中的圆环病毒PCV2主要膜蛋白capsid protein的亚单位、大肠杆菌不耐热毒素B亚单位和纯化标签之间，也可以不使用连接肽而让上述活性成分直接。例如，本领域的技术人员所公知的接头肽的序列有：

(1)、Ala_n，n＝2-10

(2)、Gly_n，n＝2-10；

(3)、Gly_n-Ser，n＝2-10

(4)、(Gly_n-Ser)_m，m＝2-3；n＝2-10

(5)、Gly_n-Ser-Gly_m，m＝0-10；n＝0-10

(6)、Gly_n-Pro-Gly_m，m＝0-10；n＝0-10

(7)、(Ala-Gly)n，n＝1～10；

(8)、(Gly-Ala)n，n＝1～10；

(9)、Gly_n-Ala-Gly_m，m＝0-10；n＝0-10

(10)、Ala_n-Gly-Ala_m，m＝0-10；n＝0-10

(11)、上述序列的任意组合形式。

本发明第一方面的融合蛋白优选含有一个圆环病毒PCV2主要膜蛋白capsidprotein的亚单位、一个T细胞抗原表位、1个大肠杆菌不耐热毒素B亚单位和1个纯化标签，其中纯化标签连接在大肠杆菌不耐热毒素B亚单位的C端。本发明的融合蛋白优选含有圆环病毒PCV2主要膜蛋白capsid protein的亚单位和一个T细胞抗原表位，本发明的融合蛋白含有圆环病毒PCV2主要膜蛋白capsid protein的亚单位的一个具有广泛代表性的亚单位分子和一个T细胞抗原表位。融合蛋白中各活性成分的排列次序(其中，ORF代表圆环病毒PCV2主要膜蛋白capsidprotein的抗原亚单位，T代表T细胞抗原表位，Tag代表纯化标签)可以是如下次序：ORF-T-LTB-Tag

另外优选，本发明第一方面的融合蛋白的氨基酸序列

a)如SEQ ID No.2所示；

或b)是对SEQ ID No.2所示的序列插入、缺失或取代一个或几个氨基酸残基而得的氨基酸序列。

本领域技术人员知晓，通过改变已知多肽的编码基因序列并将其导入表达载体，可以制备出取代、缺失或插入了氨基酸残基的多肽，这些方法广泛记载于《分子克隆实验指南》(北京：科学出版社，2002年)等本领域公知的文献中。

在第二个方面，本发明提供了一种核酸分子，其编码本发明第一个方面所述的融合蛋白。在本文中，“多核苷酸”、“核酸”、“核酸分子”、“核苷酸序列”可以相互替换使用，均指一个含意。本发明的多核苷酸，可以是DNA形式，也可以是RNA形式，优选DNA形式。DNA形式包括天然cDNA和人工合成的cDNA，DNA可以是编码链或模板链。通过常规技术，如PCR方法、重组法或人工合成的方法，本领域技术人员可以很容易获得本发明的编码融合蛋白的核苷酸序列或其片段。这些序列一旦获得，就可以将其克隆入载体，再转化或转染入相应的细胞，然后通过常规的宿主细胞进行增殖，从中分离得到大量的核苷酸序列。优选本发明的核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

在第三个方面，本发明提供了一种载体，其含有本发明第二个方面所述的核酸分子。本文中的术语“重组表达载体”、“表达载体”，有时仅称“载体”，在此可以交互替换使用，是指本领域中常用的细菌质粒、粘粒、噬菌粒、酵母质粒、植物细胞病毒、动物病毒及其它各种病毒载体。本发明中适用的载体包括但不限于：在细菌中表达用的载体(原核表达载体)、在酵母中表达用的载体(如毕赤酵母载体、汉逊酵母载体等)、在昆虫细胞中表达的杆状病毒载体载体、在哺乳动物细胞中表达用的载体(痘苗病毒载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺伴病毒载体等)、在植物中表达用的植物病毒载体以及在哺乳动物乳腺中表达用的各种载体。总之，只要能在宿主细胞中稳定复制，任何质粒和载体都可使用。优选表达载体包含选择标记基因，如细菌的氨苄青霉素抗性基因、四环素抗性基因、卡那霉素抗性基因、链霉素抗性基因、氯霉素抗性基因；酵母菌的新霉素抗性基因、Zeocin抗性基因，酵母菌的缺陷选择标志，如His，Leu，Trp等；真核细胞的新霉素抗性基因、Zeocin抗性基因、二氢叶酸还原酶基因及荧光蛋白标记基因等。在一优选实施方式中，所述表达载体为大肠杆菌表达载体。本领域技术人员可利用DNA重组技术等一系列技术，构建含本发明所述编码融合蛋白的DNA序列、合适的转录和翻译调控序列、启动子及选择性标记基因等特定元件的表达载体。上述载体可用来转化、转染合适的宿主细胞，以便获得所需要的融合蛋白。

在第四个方面，本发明提供了一种宿主细胞，其特征在于，所述细胞已用本发明第三个方面所述的核酸分子转化或转染。宿主细胞可以是原核细胞，也可以 是真核细胞，如，细菌细胞、酵母细胞、植物细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞等。宿主细胞在转化或转染含本发明所述编码融合蛋白的基因序列后，即构成工程化细胞或细胞株，可用于生产所需融合蛋白。本领域技术人员能够恰当地选择适当的载体、宿主细胞，并熟知如何将载体高效地转化或转染入宿主细胞中，所用方法包括但不限于：氯化钙法、电穿孔法用于细菌细胞，电穿孔法和原生质体融合法用于酵母细胞，脂质体包裹、磷酸钙共沉淀、电融合法以及显微注射法用于哺乳动物细胞等真核细胞。

在第五个方面，本发明提供了制备本发明第一个方面所述融合蛋白的方法，其包括以下步骤：用本发明第四个方面的宿主细胞表达本发明第一个方面所述的融合蛋白，并分离所述的融合蛋白。获得的工程细胞可以通过常规方法培养、诱导来表达所需要的融合蛋白，包括发酵过程和纯化工艺。上述表达的蛋白可在细胞内、细胞膜上或分泌到细胞周质、细胞外。根据需要，可利用融合蛋白的物理的、化学的以及其它生物学特性，进行分离纯化。方法包括但不限于：裂菌(超声波裂菌、渗透压裂菌)，离心，盐析，分子筛色谱，离子交换色谱，吸附色谱(亲和层析、金属鏊合层析)，反向色谱，高效液相色谱，毛细管电泳，制备性等电聚焦以及常规的变性、复性处理等，这些方法均是本领域技术人员所熟知的。

在第六个方面，本发明提供了一种用于黏膜免疫的药物组合物，其包括本发明第一个方面所述的融合蛋白以及药学上可接受的载体，能预防圆环病毒的感染。对于本领域普通技术人员来说，已经有很多公知的方法能将蛋白质或多肽活性成分与药学上可接受的载体制备成药物组合物。本文中使用的药学上可接受的载体指无毒的填充剂、稀释剂、佐剂或其他制剂辅料。根据本领域的公知技术，可以根据治疗目的、给药途径的需要将药物组合物制成各种剂型，优选该组合物为单位剂量形式，如片剂、胶囊、粉剂、乳液剂、注射剂、喷雾剂型或作为饲料添加剂的剂型。优选该药物组合物为注射剂型、喷雾剂型或作为饲料添加剂的剂型。这些组合物包含不同缓冲液内容(如磷酸盐缓冲液、Tris-HCl缓冲液)、相应的离子强度和pH值，以及其它物质(如聚乳酸、甘露醇等)。也优选该药物组合物为疫苗组合物，优选进一步含有佐剂，如福氏完全佐剂、福氏不完全佐剂、CpG序列等。

在第七个方面，本发明提供了本发明第一个方面所述的融合蛋白在制备预防圆环病毒的药物中的应用。在第八个方面，本发明提供了本发明第五个方面所述的药物组合物在制备预防圆环病毒的药物中的应用。在本发明的一个优选实施方式中，通过对实验动物以特定剂量黏膜给药，有效地保护了实验动物。

附图说明

下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。

图1为含有融合蛋白编码基因的表达载体pPICBMDORFLTB的示意图。

图2显示了重组表达载体pPICBMDORFLTB用EcoRI+XbaI酶切后的电泳结果，其中左边为酶切产物，右边为DNA分子量标准(从下到上依次对应：200bp、400bp、750bp、1kb、1.5kb、2kb)。

图3显示了融合蛋白编码基因的表达产物的纯化和分析鉴定结果，其中左边第1道为蛋白分子量标准，第2道为发酵培养液上清，第3道为用60％饱和度硫酸铵沉淀纯化后的样品，第4道为用金属鏊合层析纯化后的样品；右边第1道为用金属鏊合层析纯化后的样品的Western印迹的结果，右边第2道为配制成制剂后的样品的Western印迹的结果。

图4A分别为血清(A)、肺冲洗物(B)和鼻冲洗物(C)的抗VP1-LTB的IgG抗体的曲线，其中分三种不同的免疫途径，具体图例如下：(■-■)为肌肉注射；(○-----○)为鼻饲；(▲—-—-—▲)为口服，该图用于显示活性测定/动物实验分析的结果。

图4B分别血清(A)、肺冲洗物(B)和鼻冲洗物(C)中的抗ORF-LTB的IgA抗体曲线，其中分三种不同的免疫途径，具体图例如下：(■-■)为肌肉注射；(○-----○)为鼻饲；(▲—-—-—▲)为口服，该图用于显示活性测定/动物实验分析的结果。

本发明引用了公开文献，这些文献是为了更清楚地描述本发明，它们的全文内容均纳入本文进行参考，就好像它们的全文已经在本文中重复叙述过一样。

为了便于理解，以下将通过具体的实施例对本发明进行详细地描述。需要特别指出的是，这些描述仅仅是示例性的描述，并不构成对本发明范围的限制。依据本说明书的论述，本发明的许多变化、改变对所属领域技术人员来说都是显而易见了。

具体实施方式

以下所述实验方法，没有具体说明的，均按照《分子克隆实验指南》，2002年，第三版，科学出版社)所述方法进行。

实施例一融合蛋白基因的来源

整个融合蛋白的编码基因按大肠杆菌偏好的密码子人工设计，并分两段(按编码蛋白从氨基端到羧基端的顺序，分别命名为ORF片段(其具有序列为SEQ IDNo.1中第1-807位的核苷酸序列)、PLTB片段(其具有序列为SEQ ID No.1中第802-1116位的核苷酸序列)交由上海英俊生物技术公司合成，SEQ ID No.1中1117-1185位的核苷酸序列是由Invitrogen公司的载体pPICZalpha A的1277-1340位的核苷酸序列提供的。OFD片段两端分别设计了EcoRI(5’端)和BamHI(3’端)限制性内切酶位点，PLTB片段两端分别设计了BamHI(5’端)和XbaI(3’端)限制性内切酶位点。上海英俊生物技术公司把这四个片段合成好后分别克隆到pMD18T载体上，转化大肠杆菌，分别提取测序正确后，把这四个含有分别命名为pMD18T-ORF、pMD18T-PLTB重组质粒的大肠杆菌寄给本公司。

实施例二融合蛋白酵母表达载体的构建

将含有命名为pMD18T-ORF、pMD18T-PLTB重组质粒的四个大肠杆菌菌株，接种到含氨苄青霉素50mg/L的10mlLB培养基中，将含有毕赤酵母分泌表达载体pPICZalpha A(购自Invitrogen公司)的大肠杆菌菌株，接种到含25mg/L Zeocin低盐LB培养基中，37℃振荡培养过夜，次日按照Qiagen公司质粒提取试剂盒使用手册，分别提取质粒。含融合片段编码基因的重组质粒分别用片段两端对应的限制性内切酶进行处理，毕赤酵母分泌表达载体pPICZalpha A用EcoRI和XbaI处理，具体处理条件：10μl反应体系，体系内加入2μl质粒，各限制性内切酶分 别使用5个活性单位(New England biolabs)，加入10×缓冲液1μl，用去离子水补齐，37℃酶切2小时。酶切结束后，加1μl 200mM EDTA终止反应。在1％琼脂糖凝胶电泳中，电泳30分钟。在紫外灯下，分别切下电泳凝胶中载体pPICZalphaA对应的约3.6kb条带和ORF片段各自对应的约800bp条带，以及PLTB各自对应的约300bp条带，按照Qiagen公司凝胶回收试剂盒说明书进行胶回收。按照载体和片段1∶1～3的比例将4个片段和表达载体混合，反应体系15μl，由T4DNA连接酶进行连接，4℃或16℃连接过夜。按照常规方法(氯化钙法)转化大肠杆菌Top10F’感受态细胞，铺于含Zeocin 25mg/L的低盐LB平板，37℃倒置过夜。

低盐LB的配制：蛋白胨10g，酵母抽提物5g，氯化钠5g，加水900ml溶解，用1N氢氧化钠调节pH值到7.5，补水到1000ml，高压灭菌；

低盐LB平板的配制：蛋白胨10g，酵母抽提物5g，氯化钠5g，琼脂15g，加水900ml溶解，用1N氢氧化钠调节pH值到7.5，补水到1000ml，高压灭菌，待冷却至55～60℃时，加入Zeocin至终浓度25mg/L，铺平板，保存于4℃备用；

挑取平板上的单克隆，接种于低盐LB培养基中，过夜培养，按照常规方法提取质粒，EcoRI和XbaI进行双酶切鉴定。酶切鉴定阳性的克隆(鉴定结果见图2)，留存甘油菌种，储存于超低温冰箱中。同时进行序列测定，以确保克隆正确无误。筛选得到的酵母分泌表达载体命名为：pPICBMDORFLTB(见图1)。

实施例三融合蛋白表达菌株的构建与筛选

接种上述阳性克隆至50ml含25mg/L Zeocin低盐LB培养基中，8-12小时后，转接于500-1000ml含25mg/L Zeocin低盐LB培养基中，过夜培养，大量提取质粒，备用。

线性化DNA的制备：在100μl反应体系中，加入20μg上述提取的DNA，加入Pme I 20∪(New England biolabs)，去离子水补齐。37℃酶切3小时。取2μl酶切产物，1％琼脂糖凝胶电泳，观察酶切是否完全。确认线性化完全后，将余下的酶切产物加入2μl 200mM EDTA，终止反应。

线性化DNA的纯化：在上述酶切体系中，加入100μl去离子水，加入等体积酚/氯仿，剧烈振荡混匀，13000rpm高速离心10分钟，将上层转入新管，加入1/10 体积3M醋酸钠，再加入2.5倍体积无水乙醇，混匀，-70℃冰箱中放置1小时，4℃离心，13000rpm，15分钟，弃液体，以80％乙醇洗涤一次，空气中晾干，重新溶解在10μl去离子水中，准备电融合。

酵母菌感受态细胞的准备：在5ml YPD培养基中接种Pichia pastoris宿主菌(购自Invitrogen公司)KM71H、GS115和X-33，30℃振荡培养过夜，次日转接入500ml新的YPD培养基中，转接量约0.1～0.5ml(根据酵母菌生长状态)，30℃继续培养，直至OD₆₀₀达到1.3～1.5为止。离心收菌，4℃条件下，1500rpm，离心8分钟，弃上清，以预冷的500ml无菌去离子水，重新悬浮，再次离心，条件同上，以250ml预冷的无菌去离子水，重新悬浮，离心，再以20ml预冷的无菌去离子水，重新悬浮，离心，最后重新用1ml预冷的1M山梨醇悬浮，置冰上，待用。

酵母菌的电融合：将80μl上述感受态细胞与5μl(约10μg)线性化DNA混合均匀，转入预冷的0.2cm电融合杯中，冰上放置5分钟。电融合条件如下：1500V，25μF，20Ω。电击后，立即加入1ml预冷的1M山梨醇，混合，再转入一个15ml培养管中，30℃孵育2小时。取200μl分别铺于含不同浓度Zeocin的YPDS平板上(含Zeocin 200μg/ml，500μg/ml，1000μg/ml)，倒置，30℃培养2天。

培养基和平板准备：

YPD培养基：900ml水中溶解10g酵母抽提物，20g蛋白胨(peptone)，高压灭菌，待冷却至55～60℃时，加入100ml 20％葡萄糖(Dexture)，储存于4℃。

YPDS平板(含Zeocin 100μg/ml为例)：900ml水中溶解10g酵母抽提物，20g蛋白胨(peptone)，182.2g山梨醇，20g琼脂，高压灭菌，待冷却至55～60℃时，加入100ml 20％葡萄糖(Dexture)，加入1ml 100mg/ml的Zeocin，铺平板，储存于4℃。

克隆筛选：挑取各高浓度Zeocin平板上的克隆10个，接种于100ml BMGY培养基中，30℃振荡培养16～18小时，当OD₆₀₀达到2～6之间时，离心收菌，3000g，8分钟，弃上清，用20ml BMGY培养基重新悬浮，继续培养，并加入100％甲醇0.1ml至终浓度0.5％，每隔24小时补加一次，每次0.1ml。在加入甲醇后的48小时、72小时和144小时，分别取样2ml，离心，取上清50μl，与等量的SDS-PAGE2x载样缓冲液混合，100℃煮沸10分钟，13000rpm，离心10分钟，取15μl，行 10％SDS-PAGE，考马斯亮蓝染色，观察结果。挑取高表达克隆进行表型鉴定。用PCV2阳性血清进行Western鉴定，用GM₁-ELISA进行LTB部分结构和功能检测(见图3)。最后筛选得到高效分泌表达融合蛋白疫苗的工程菌，命名为：pPICBMDORFLTB/GS115。

实施例四工程菌的发酵

对高效分泌表达融合蛋白疫苗的工程菌pPICBMDORFLTB/GS115的生长表达条件进行了优化，确定了有利于工程菌生长和表达的培养基、补料培养基、碳源(0.5％甘油)、培养基和补料培养基的碳氮比、pH(4～7，较佳的为5.0)、诱导剂甲醇的最适浓度范围(0.5％)等。成功的建立了工程菌pPICBMDORFLTB/GS115的溶氧反馈高密度发酵工艺，使疫苗的理论分泌表答水平达到0.8～1.3克/升发酵液。

实施例五融合蛋白的纯化

发酵上清中的重组疫苗蛋白在近中性环境中，用30～75％饱和度硫酸铵沉淀；沉淀的蛋白用10～50mM pH7.0～9.0的Tris-HCl充分复溶；然后用金属鏊合亲和层析进行进一步纯化，分离介质一般选用Co²⁺、Zn²⁺或Gu²⁺金属鏊合亲和分离介质，可以采用pH梯度洗脱和咪唑梯度洗脱，一般选择咪唑梯度洗脱；经过纯化的目的蛋白再经过脱盐柱或透析处理进行脱盐并将重组疫苗蛋白的缓冲液换成PBS；再通过稀释或浓缩将重组疫苗蛋白调整到合适浓度后，进行制剂配制，再过滤除菌，最后分装，或直接储藏备用，或真空冷冻干燥后储藏备用。

具体实施中的纯化工艺为：发酵上清中的重组疫苗蛋白在近中性环境中，用60％饱和度硫酸铵沉淀；沉淀的蛋白用20mM pH7.0～9.0的Tris-HCl充分复溶；然后用Zn²⁺金属鏊合亲和分离介质，采用咪唑梯度洗脱，一般选择咪唑梯度洗脱；经过纯化的目的蛋白再经过脱盐柱脱盐并将重组疫苗蛋白的缓冲液换成PBS；再通过稀释或浓缩将重组疫苗蛋白调整到合适浓度后，进行制剂配制，再过滤除菌，最后分装，或直接储藏备用(纯化结果见图3)。经过该工艺处理后的重组疫苗蛋白，蛋白纯度大于95％，终产率在0.6～0.9克/升发酵液，终产品达到无菌无热源， 而且稳定性良好。后又通过PCV2阳性血清ELISA(检测抗原部分)和GM₁-ELISA(检测LTB部分)跟踪检测，确定的疫苗冻干和稳定保护剂，建立了冻干工艺。

实施例六重组粘膜疫苗免疫对SPF猪的免疫效力研究

将8周龄SPF猪随机分为组，10只/组，第一组经口、鼻腔分两等份接种200微克(1mL，0.2mg/mL)重组疫苗，第二组经颈部肌肉注射接种200微克(1mL，0.2mg/mL)重组疫苗，第3组为对照组，注射1mL PBS溶液。2周后，同等剂量同样方法加强免疫一次，再过2周，同等剂量再加强免疫一次。最后一次免疫7天后，采用肌肉注射和皮下注射，每只猪分别用100倍的半数致死剂量的圆环强毒进行攻毒。观察四肢是否出现症状，连续观察14天。

将4周龄SPF级Balb/c雌性小鼠随机分为组，20只/组，采用鼻饲、口服和肌肉注射3种不同的粘膜免疫途径。对于鼻饲和口服免疫，每只小鼠免疫2微克(20μL，0.1mg/mL)重组粘膜疫苗免疫；对于肌肉免疫，每只小鼠免疫2微克(100μL，0.02mg/mL)重组粘膜疫苗。2周和4周后，同等剂量分别加强免疫一次。每次免疫后，隔14天采用眼睛或者心脏采血，分离血清。用剪刀剪开鼻腔，用500μl PBS(含1％BSA)冲洗鼻腔，收集鼻冲洗物。剖开胸腔，用眼科镊子取出肺，用500μlPBS(含1％BSA)冲洗肺部，收集肺冲洗物；将收集到的鼻冲洗物和肺冲洗物12000rpm离心5min，取上清-70℃保存备用。

利用ELISA检测小鼠血清、鼻冲洗物和肺冲洗物中的抗ORF-LTB IgG和IgA抗体。用纯化的ORF-GST(终浓度1μg/mL)，利用原核表达载体pGEX-6P-1表达)包被酶标板(Nunc，Denmark)；用2.5％Casein封闭后，加倍比稀释的血清、鼻冲洗物和肺冲洗物。加羊抗鼠IgG-HRP(辣根过氧化物每)(sigma)二抗检测IgG抗体，加羊抗鼠IgA-HRP(sigma)二抗检测IgA抗体。用OPD作为底物显色。2M H₂SO₄终止反应，酶标仪490nm判读。IgG和IgA终点的判断采用文献(O′Dowd et al.1999)报道的方法进行，即血清中IgG抗体终点＝免疫血清的最大稀释度≥2(没有免疫的正常小鼠血清)；鼻或者肺冲洗物中IgG抗体终点＝冲洗物最大稀释度≥2(没有免疫的正常小鼠鼻或者肺冲洗物)。

保护率＝[(攻毒对照组死亡率一疫苗免疫组死亡率)/攻毒对照组死亡率]× i00％]。

实验结果显示：

血清、鼻冲洗物和肺冲洗物中的抗ORF-LTB IgG抗体如图4A所示。对肌肉免疫和鼻饲免疫来说，血清和冲洗物中的抗体水平比口服免疫各组都要高。

血清、鼻冲洗物和肺冲洗物中的抗ORF-LTB的IgA抗体如图4B所示。对肌肉免疫和鼻饲免疫来说，血清和冲洗物中的抗体水平比口服免疫各组都要高。其中鼻饲产生的IgA抗体最高。

采用肌肉注射、鼻饲、口服三种不同的免疫途径分别免疫猪3次后，用100倍的半数致死剂量的圆环病毒进行攻毒，保护率如表1所示。肌肉注射免疫效果最好，保护率即可达到100％；鼻饲免疫保护率可达80％，而口服免疫最高保护率只有70％。对照组用PBS免疫，攻毒后全部死亡。

表1.重组VP1-LTB融合蛋白免疫后对受试动物(猪)的保护效应

免疫途径	保护率(n＝10)
		肌肉注射	(10/10)100％
鼻饲	(8/10)80％
		口服	(7/10)70％

序列表

<110>青岛宝麦德生物医药科技有限公司

<120>圆环病毒亚单位疫苗及其应用

<160>10

<210>1

<211>1185

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>圆环病毒亚单位疫苗DNA编码序列

<222>(1)…(1185)

<400>

gaattcaacg gtatcttcaa cactagattg tccagaactt ttggttacac tatcaagaga actactgtta agactccatc 80

ttgggctgtt gatatgatga gattcaacat caacgacttc ttgccaccag gtggtggttc taacccaaga tccgttccat 160

tcgagtacta cagaatcaga aaggttaagg ttgagttctg gccatgttct ccaatcactc aaggtgatag aggtgttggt 240

tcttctgctg ttatcttgga tgacaacttc gttactaagg ctactgcttt gacttacgat ccatacgtca actactcttc 320

cagacatact atcactcaac cattctctta ccattccaga tacttcacac ctaaaccagt tcttgattct actattgatt 400

acttccaacc aaacaacaag agaaaccagt tgtggttgag attgcagact gctggtaacg ttgatcatgt tggtttgggt 480

actgctttcg agaactctat ctacgatcaa gagtacaaca ttagagttac tatgtacgtt cagttcagag agttcaactt 560

gaaagatcca ccattgaacc catccttcga gagatttgag atctttccaa aggaagttga tatgttgaga ttcaagttgg 640

atgacttcgt tccaccaggt tcttttgaga gattcgaaat ctttccaaag gaaggtgttg gttctactgc tgttatcttg 720

gatgataact tcgttccagg tggttctggt ggttctttcg aaagattyga aatctttcca aaggagccag gtggttctgg 800

tggatccgct ccacaaacta tcactgagtt gtgttctgag tacagaaaca ctcaaatcta cactatcaac gacaagattt 880

tgtcctacac tgagtctatg gctggtaaga gagagatggt catcattact ttcaagtctg gtgaaacttt ccaagttgag 960

gttccaggtt ctcaacatat cgattctcag aagaaggcta ttgagagaat gaaggatact ttgagaatca cttacttgac 1040

tgagactaag attgataagt tgtgtgtttg gaacaacaag actccaaact ccattgctgc tatctctatg aagaatctag 1120

aacaaaaact catctcagaa gaggatctga atagcgccgt cgaccatcat catcatcatc attga                 1185

<210>2

<211>394

<212>蛋白质

<213>人工设计

<220>

<221>圆环病毒亚单位疫苗DNA编码序列

<222>(1)…(394)

<220>

<221>PCV2亚单位氨基酸序列(SEQ.ID.No.4)

<222>(3)…(246)

<220>

<221>连接肽

<222>(247)…(251)

<220>

<221>T细胞抗原决定族氨基酸序列

<222>(252)…(263)

<220>

<221>连接肽

<222>(264)…(269)

<220>

<221>LTB氨基酸序列

<222>(270)…(372)

<220>

<221>Tag氨基酸序列

<222>(373)…(394)

<400>

EFNGIFNTRL SRTFGYTIKR TTVKTPSWAV DMMRFNINDF LPPGGGSNPR SVPFEYYRIR 60

KVKVEFWPCS PITQGDRGVG SSAVILDDNF VTKATALTYD PYVNYSSRHT ITQPFSYHSR 120

YFTPKPVLDS TIDYFQPNNK RNQLWLRLQT AGNVDHVGLG TAFENSIYDQ EYNIRVTMYV 180

QFREFNLKDP PLNPSFERFE IFPKEVDMLR FKLDDFVPPG SFERFEIFPK EGVGSTAVIL 240

DDNFVPGGSG GSFERXEIFP KEPGGSGGSA PQTITELCSE YRNTQIYTIN DKILSYTESM 300

AGKREMVIIT FKSGETFQVE VPGSQHIDSQ KKAIERMKDT LRITYLTETK IDKLCVWNNK 360

TPNSIAAISM KNLEQKLISE EDLNSAVDHH HHHH*                            394

<210>3

<211>732

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>PCV2亚单位DNA编码序列

<222>(1)…(732)

<400>

aacggtatct tcaacactag attgtccaga acttttggtt acactatcaa gagaactact gttaagactc catcttgggc 80

tgttgatatg atgagattca acatcaacga cttcttgcca ccaggtggtg gttctaaccc aagatccgtt ccattcgagt 160

actacagaat cagaaaggtt aaggttgagt tctggccatg ttctccaatc actcaaggtg atagaggtgt tggttcttct 240

gctgttatct tggatgacaa cttcgttact aaggctactg ctttgactta cgatccatac gtcaactact cttccagaca 320

tactatcact caaccattct cttaccattc cagatacttc acacctaaac cagttcttga ttctactatt gattacttcc 400

aaccaaacaa caagagaaac cagttgtggt tgagattgca gactgctggt aacgttgatc atgttggttt gggtactgct 480

ttcgagaact ctatctacga tcaagagtac aacattagag ttactatgta cgttcagttc agagagttca acttgaaaga 560

tccaccattg aacccatcct tcgagagatt tgagatcttt ccaaaggaag ttgatatgtt gagattcaag ttggatgact 640

tcgttccacc aggttctttt gagagattcg aaatctttcc aaaggaaggt gttggttcta ctgctgttat cttggatgat 720

aacttcgttc ca                                                                           732

<210>4

<211>244

<212>蛋白质

<213>人工合成

<220>

<221>PCV2亚单位氨基酸序列

<222>(1)…(244)

<400>

NGIFNTRLSR TFGYTIKRTT VKTPSWAVDM MRFNINDFLP PGGGSNPRSV PFEYYRIRKV  60

KVEFWPCSPI TQGDRGVGSS AVILDDNFVT KATALTYDPY VNYSSRHTIT QPFSYHSRYF  120

TPKPVLDSTI DYFQPNNKRN QLWLRLQTAG NVDHVGLGTA FENSIYDQEY NIRVTMYVQF  180

REFNLKDPPL NPSFERFEIF PKEVDMLRFK LDDFVPPGSF ERFEIFPKEG VGSTAVILDD  240

NFVP                                                               244

<210>5

<211>309

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>LTB DNA编码序列

<222>(1)…(309)

<400>

gctccacaaa ctatcactga gttgtgttct gagtacagaa acactcaaat ctacactatc aacgacaaga  70

ttttgtccta cactgagtct atggctggta agagagagat ggtcatcatt actttcaagt ctggtgaaac  140

tttccaagtt gaggttccag gttctcaaca tatcgattct cagaagaagg ctattgagag aatgaaggat  210

actttgagaa tcacttactt gactgagact aagattgata agttgtgtgt ttggaacaac aagactccta  280

attccattgc tgctatctct atgaagaat                                               309

<210>6

<211>103

<212>蛋白质

<213>猪(Pocine)

<220>

<221>LTB氨基酸序列

<222>(1)…(103)

<400>

APQTITELCS EYRNTQIYTI NDKILSYTES MAGKREMVII TFKSGETFQV EVPGSQHIDS QKKAIERMKD 60

TLRITYLTET KIDKLCVWNN KTPNSIAAIS MKN                                         103

<210>7

<211>36

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>T细胞抗原决定族DNA编码序列

<222>(1)…(36)

<223>y＝t或c

<400>

tctttcgaaa gattygaaat ctttccaaag gagcca 36

<210>8

<211>11

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>T细胞抗原决定族氨基酸序列

<222>(1)…(12)

<400>

SFERXEIFPKEP 12

<210>9

<211>66

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>Tag DNA编码序列

<222>(1)…(66)

<400>

ctagaacaaa aactcatctc agaagaggat ctgaatagcg ccgtcgacca tcatcatcat catcat  66

<210>10

<211>22

<212>多肽(Polypeptide)

<213>人工设计

<220>

<221>Tag氨基酸序列

<222>(1)…(22)

<400>

LEQKLISEED LNSAVDHHHH HH 22

Claims (15)

1.一种用于黏膜免疫的融合蛋白，其中包含圆环病毒PCV2主要膜蛋白capsidprotein的亚单位、大肠杆菌不耐热病毒B亚单位、T细胞抗原表位及纯化标签。

2.权利要求1所述的融合蛋白，其中所述的圆环病毒PCV2主要膜蛋白capsidprotein的亚单位的氨基酸序列选自SEQ ID No.4；其中所述的大肠杆菌不耐热毒素B亚单位的氨基酸序列为SEQ ID No.6；其中所述的T细胞抗原表位的氨基酸序列为SEQ ID No.8。

3.权利要求1或2所述的融合蛋白，其进一步含有纯化标签和/或接头肽。

4.如权利要求3所述的融合蛋白，其中所述的纯化标签的氨基酸序列为SEQ IDNo.10所示的氨基酸序列。

5.如权利要求3所述的融合蛋白，其含有一个圆环病毒PCV2主要膜蛋白capsidprotein的亚单位、一个T细胞抗原表位、1个大肠杆菌不耐热毒素B亚单位和1个纯化标签，其中纯化标签连接在大肠杆菌不耐热毒素B亚单位的C端。

6.如权利要求3所述的融合蛋白，其氨基酸序列

a)如SEQ ID No.2所示；

或b)是对SEQ ID No.2所示的序列插入、缺失或取代一个或几个氨基酸残基而得的氨基酸序列。

7.一种核酸分子，其编码权利要求1-6之任一所述的融合蛋白。

8.权利要求7所述的核酸分子，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

9.一种载体，其含有权利要求7或8所述的核酸分子。

10.一种宿主细胞，其特征在于，所述细胞含有权利要求9所述的载体，或者所述细胞已用权利要求7或8所述的核酸分子转化或转染。

11.一种制备权利要求1所述融合蛋白的方法，其包括，用权利要求10的宿主细胞表达权利要求1-6之任一所述的融合蛋白，并分离所述的融合蛋白。

12.一种用于黏膜免疫的药物组合物，包括权利要求1-6之任一所述的融合蛋白以及药学上可接受的载体。

13.权利要求12所述的药物组合物，其为注射剂型、喷雾剂型或作为饲料添加剂的剂型。

14.权利要求1-6之任一所述的融合蛋白在制备预防圆环病毒的药物中的应用。

15.权利要求12所述的药物组合物在制备预防圆环病毒的药物中的应用。

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