KR101506979B1 - 전형적 돼지 콜레라 바이러스에 대한 키메릭 백신 항원 - Google Patents

전형적 돼지 콜레라 바이러스에 대한 키메릭 백신 항원 Download PDF

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Abstract

본 발명은 전형적인 돼지 콜레라를 발생시키는 바이러스(CSFV)에 대한 키메릭 백신 항원에 관한 것이다. 상기 백신 항원은 세포성 면역계뿐만 아니라 체액성 면역계를 자극하는 단백질 분자에 결합하는 바이러스성 서브유닛에 기초한다. 키메릭 항원은 본 발명의 기초를 구성하는 키메릭 분자의 정확한 삼차원 폴딩을 보증하는 발현 시스템에서 생성될 수 있다. 상기 백신 항원을 포함하는 백신 조성물은 CSFV에 대한 전체 보호를 부여하는, 백신화된 돼지에서 강력한 초기 면역 반응을 유도한다. 결과적으로 생성된 백신 조성물은 암퇘지로부터 자손으로의 바이러스 전이를 예방한다. 키메릭 항원 및 또한 결과적으로 생성된 백신 조성물도 돼지에서의 예방 용도를 위해 백신으로서 건강한 동물에게 적용할 수 있다
돼지 콜레라, 키메릭 백신 항원, E2 당단백질

Description

전형적 돼지 콜레라 바이러스에 대한 키메릭 백신 항원{CHIMERIC VACCINE ANTIGENS AGAINST CLASSICAL SWINE FEVER VIRUS}
본 발명은 동물 건강, 특히 세포성 및 체액성 면역계를 자극할 수 있는 단백질에 결합된 전형적 돼지 콜레라 바이러스(Classic Swine Fever Virus; CSFV)의 바이러스 서브유닛을 포함하는 신규한 키메릭 항원에 관한 것으로, 이는 돼지에서 상기 바이러스에 대한 유력하고 빠른 면역 반응을 전개한다.
전형적 돼지 콜레라(Classic Swine Fever; CSF)는 고도의 감염성 특성 및 세계적인 분포로 알려져 있으며, 돼지에서 가장 중대한 질병으로 간주되고 월드 애니멀 헬스 오가니제이션(World Animal Health Organization)의 신고된 질환 목록에 포함된다. 이러한 질환의 병인 제제인 CSFV은 플라비바리대 과로부터의 페스트바이러스 속의 바이러스이다. 이는 지질 외피, 40 내지 60 nm의 직경 및 육각형 대칭성을 가지며 유전 물질로서 단일 사슬 리보핵산(RNA)을 갖는 바이러스임이 알려져있다(Kummerer et al. (2000). The genetic basis for cytopathogenicity of pestviruses . Vet. Microbiol. 77:117-128; Moenning et al. (2003). Clinical signs and epidemiology of Classical Swine Fever; a review of new Knowledge. Vet. Journal 165:11-20).
CSF는 고도의 전염성 질환으로 이의 급성 형태에서 열, 모세혈관의 변성, 내부 기관의 괴사 및 사망이 존재한다. 열, 운동성 감소 및 식욕부진의 발생하는 첫 번째 임상 신호는 2 내지 6일의 항온 기간 후에 나타나며, 날짜가 지날 때마다 더 나빠지고 체온은 42℃에 이를 수 있다. 또한, 혈액의 8000/mm3보다 적은 백혈구류의 수치를 갖는 백혈구 감소증이 발병한다. 돼지에게 또한 결막염, 변비에 이어 마지막 단계에서 설사, 구토, 운동 공동작용의 감소, 경련 및 근육 부전마비가 나타난다. 복부 전체, 주둥이, 귀 및 다리의 내부 부분을 통해 확산된 붉은 피부색이 분명해진다. 태아 경우의 대부분에서 뇌의 조직병리학은 상당한 혈관신생을 갖는 비 화농성 뇌염을 보인다(Moenning et al. (2002) Clinical Signs and Epidemiology of Classical Swine Fever. A review of new knowledge. Vet. Journal 161:1-10).
CSFV는 감염 동안에 면역억제제로서 작용하며(Susa et. Al. (1992) Pathogenesis of Classical Swine Fever: B-lymphocyte deficiency caused by Hog Cholera virus. J. Virol. 66:1171-1175) 중화 항체의 검출은 감염 후 2 및 3주째에 시작된다(Laevens et. Al. (1998). An experimental infection with a classical swine fever virus in weaner pigs. II. The use of serological data to estimate the day of virus introduction in natural outbreaks. Vet. Q. 20: 46-49). 감염의 최종 단계는 순환계 뿐만 아니라 림프 조직에서 림프구 B의 두드러진 감소와 관련된다(Susa et al. (1992). Pathogenesis of Classical Swine Fever: B-lymphocyte deficiency caused hog cholera virus. J. Virol. 66: 1171-1175). 질병에 걸린 돼지 대부분은 감염 후 10 및 20일 사이에 95% 이상의 사망률로 사망한다. CSF에 대한 사후 심사 병변 특성은 주요 기관 시스템에서 점상출혈을 갖는 출혈 소인(hemorrhagic diathesis)에 속한다. 이들은 신장, 방광 및 림프관 신경절에서 일반적이며 이들은 또한 비장, 후두, 점막 및 장막에도 나타날 수 있다(Mouwen et al. (1983) Atlas of Veterinary Pathology, Bunge, Utrecht The Netherlands).
경태반 감염은 CSF의 다른 임상 형태이다; 이러한 경우에서 바이러스는 임신한 암퇘지의 태반을 통해 태아를 감염시킬 수 있다. 이러한 감염의 결과는 유산, 사산, 미이라화, 기형, 약한 돼지의 출생 및 기관 분화의 문제일 수 있다. 감염이 발생한 임신 시간에 따라, CSFV 면역-저항성 새끼가 암퇘지를 통한 감염(수직 감염)의 결과로서 태어날 수 있다. 돼지 새끼는 혈류의 바이러스는 죽을 때까지 감염된 상태 및 혈류내 바이러스 존재를 유지하며, 가축 무리에서 안정된 CSFV 전파 병소를 생성한다(Moenning et al, (2003) Clinical Signs and Epidemiology of Classical Swine Fever: a review of new knowledge. Vet. Journal 165:11-20). CSF에 관련된 사망률은 개발도상국의 경제 및 사회 상황의 손해에 영향을 미치는, 감염된 나라에서의 경제적 문제에 기여한다. 이러한 이유에서, 돼지 고밀도 및 바이러스의 높은 유병률을 갖는 나라에서 백신화에 기초한 제어 프로그램을 공급하는 것이 필수적이 되었다. 돼지 생산이 유럽, 미국 및 캐나다와 같이 정부에 의해 주로 보조되는 선진국에서, 살생처분방식에 의한 박멸 방법이 적용된다. 그러나, 비용이 매우 많이 들고 이러한 나라들에서 여전히 가능한 가축유행병에 감염되기 쉽 다.
유럽 연합(EU)은 CSFV가 동물지방병인 동유럽 국가의 비 백신화 정책, 이의 지리학적 접근 및 고밀도의 돼지 집단에 의해 새로운 CSFV 가축유행병의 재-출현의 고위험 지역으로 간주된다. 이러한 지역에서 새로운 가축유행병의 출현에 관련된 문제 중 하나는 CSF가 내피 감염된 야생 수퇘지의 존재이다(Laddomada (2000) Incidence and control of CSF in wild boars in Europe. Vet. Microb, 73:(121-30). 감염 지역으로부터 질병이 없는 지역까지 돼지 수출의 제한 및 전체 전염성 집단의 위생적 희생을 포함하는, 유럽 연합 내부에서 이행된 제어의 만장일치 프로그램에도 불구하고 새로운 가축유행병의 출현이 나타났다(van Oirschot (2003) Vaccinology of Classical Swine Fever: from lab to field. Vet Microbiol, 96:367-384). 그 후에, 감염 및 바이러스 전이에 대해 보호를 보증하는, 초기의 안전한 면역 반응을 유도하는 백신을 개발하려는 필요성이 시급하다.
완전한 바이러스에 기초한 CSFV에 대한 백신이 개발되었다: 크리스탈 바이올렛 또는 포르말린-불활성화 바이러스를 갖는 백신(Biront et al. (1988) Classical swine fever related infections. Liess B.M. Ed. Martinus Nijhoff Publishing, Boston:181-200), 신라크(Sinlak) 균주(Baibikov et al. RU 2182495) 및 and the 라피니지드 차이니즈(Lapinizied Chinese) 균주(Dahle et. Al(1995) Assessment of safety and protective value of a cell culture modified strain C vaccine of hog cholera/classical swine fever virus. Berl-Munch. Tieraztl.Wsch, 108:20-25)와 같은 토끼에서의 이동을 통해 약화되는 바이러스를 갖는 백신 또는 토끼, 기 니아피그 및 돼지로부터 유래한 조직 배양에서 약화된 바이러스를 갖는 백신(Kachiku et al. JP 73001484; Terpstra et al. (1990) Development and properties of a cell culture produced for hog cholera based on Chinese strain. Ditsh. Tierarztl.Wsch. 97: 77-79). 이러한 유형의 백신은 감염되기 쉬운 동물에 접종되어 새로운 CSF 발생을 일으키는 활성 바이러스의 절편을 포함하는 가능성에 의해 위험을 구성한다. 게다가, 일부 경우에서 불활성화가 바이러스의 면역원성 특성에 영향을 미치므로 보호성 면역학적 반응을 얻기위해 반복성 면역화가 요구된다.
약화된 독력을 갖는 생 백신의 특정 경우에서, 이들은 부분적 약화 또는 독력 복귀가 일어날 잠재적 위험을 갖는다. 어떤 경우에서 이들은 감염되기 쉬운 동물에게 접종되어 가축 무리에서 감염, 임상 질환 및 CSF의 확산을 일으키는 병원성 바이러스 입자를 생성할 것이다. 이러한 문제점들은 질병이 확산된 고도로 감염되기 쉬우며 감염된 새끼인 태아를 바이러스가 감염시킬 수 있으므로 임신한 암퇘지에서 더 큰 위험성이 있다.
C 차이니즈 균주, PAV 20 균주, 티에르발(Thierval) 균주 및 IFFA/A-49 균주와 같은, 약화될 것으로 증명된 CSFV에 기초한 백신이 있다(Bjorlund, H.JV. et. Al (1998) Molecular characterization of the 3'noncoding region of classical swine fever virus vaccine strains. Virus Genes 16: 307-312, Launais et al. (1978) Hog Cholera Virus: Active immunization of piglets with the Thiverval strain in the presence and absence of calostral passive immunity. Vet. Microbiology 3:31-43). 이러한 균주는 이들이 백신화된 동물 및 천연 바이러스로 감염된 동물 사이의 구별을 허용하지 않는 불편함을 가지므로, 질병이 동물지방병인 나라에서만 사용된다. 이러한 균주들로 백신화된 동물은 감염된 동물에서와 같이, 혈청학적 시험에서 동일한 반응을 나타낸다. 약화된 바이러스에 기초한 백신과 함께 발생된 특이 항체 항-CSFV는 CSF에 의한 감염의 진단을 방해한다. 진단은 편도선에서 감염성 바이러스의 면역-검출에 의해 실시되며 백신 바이러스 균주의 증식이 편도선에서 일어난다. 이러한 이유로, 약화된 균주는 박멸 프로그램에 사용하기에 적합하지 않다. 프로인트 아쥬반트로 제형화된, LK-VNIIVVM 균주로의 백신화 및 정제된 균주 시-밍(Shi-Myng)으로의 추가 과-면역화는 다른 실시예이다. 그러나, 40-45개 위치에서의 면역화는 100마리 동물이 매일 백신화시켜야 한다는 백신화 캠페인에는 적합하지 않다(Balashova et al. RU2183972).
전체 바이러스를 포함하는 이러한 백신으로의 면역화는 또한 CSFV에 의해 발생하는 감염 및 소 바이러스성 설사 바이러스(Bovine Viral Diarrhea Virus; 약자로 BVDV) 및 보르더 병 바이러스(Border Disease Virus; 약자로 BDV)와 같은 돼지를 감염시킬 수 있는 페스트바이러스 속의 다른 멤버에 의해 발생하는 감염 중에서 차별적인 진단을 방해한다(Dahle et al. (1991) Clinical Post Mortem and Virological Findings after Simultaneous Inoculation of Pigs with Hog Cholera and BVD Virus. J. Med. Vet. 38: 764-772).
전체 바이러스에 기초한 백신의 불편함을 피하기 위해, 서브유닛 상에 기초한 변이체로서 또는 재조합 방식으로 수득된 바이러스성 단백질로 완전히 무해한 백신을 사용하는 것이 적합하다. 이러한 변이체는 바이러스 균주의 재도입으로부터 가축무리를 보호할 수 있고 또한 단순한 혈청학적 방법으로 백신화 동물 및 감염된 동물 사이의 구별을 허용한다. 이러한 센스에서, 바이러스 서브유닛에 기초한 백신이 개발되었다. 바이러스 외피의 E2 당단백질(Bourna et al. (2000) Duration of the onset of the herd immunity induced by E2 subunit vaccine against classical Swine Fever virus. Vaccine 18: 1374-1381)과 같은 바이러스 단백질을 포함하는 백신이 안전한데, 이는 이들의 사용이 독력의 복귀의 어떠한 위험성도 포함하지 않고 진단도 방해하지 않기 때문이다. 이러한 백신은 발생한 항원이 바이러스 세그먼트에 대해서만 반응성이므로 감염된 동물 및 백신화 동물 사이의 구별을 가능하게 한다. 그래서, 이들은 CSF 박멸 프로그램에 사용하기 좋다.
원핵생물에서 E2 단백질을 발현하는 여러 재조합 백신 및 이러한 단백질의 합성 펩티드에 기초한 백신이 개발되었다(Chen et al. WO 200232453). 이러한 경우에서 단백질은 글리코실화되지 않았으므로 이의 면역원성 및 보호 능력이 영향을 받지 않는다. 다른 백신 후보제는 돼지 가성광견병 바이러스(Peeters et al. (1997). Biologically safe, non-transmissible pseudorabies virus vector vaccine protects pigs against both Aujeszky's disease and classical swine fever. J. Gen. Virol. 78: 3311-3315), 천연두 돼지 바이러스(Gibbs et al. US62117882) 및 돼지 아데노바이러스(Nagy et al. WO200183737)와 같은 원핵생물 세포에서 E2의 이종성 유전자의 발현을 위한 바이러스 벡터를 사용한다. 이러한 경우에서, 야생형 바이러스로의 바이러스 감염은 같은 혈청형의 바이러스 벡터에 대 항하는 중화 항체를 생산한다. 그러므로, CSFV에 대한 면역 반응의 유도가 영향을 받는다. 또한, 돼지 가성광견병 바이러스 상 및 돼지 천연두 바이러스에 기초한 바이러스 벡터는 제어성 문제 때문에 이러한 바이러스로부터 자유로운 선고된 나라에 적용될 수 없다. 또한, 백신 바이러스가 벡터로서 사용되나 세계 보건 기구로부터의 규정이 이의 사용을 저지한다(Meyeers et al. EP 1087014).
근세포 및 골세포에서 E2 단백질의 발현을 위한 나출 디옥시리보핵산(desoxyribonucleic acid; DNA)에 기초한 백신은 나출 DNA로의 트랜스펙션이 매우 비효율적이므로 더 높은 농도의 DNA가 반응을 유도하기 위해 요구되므로 불편하다. 이 백신은 이의 적용을 저지하는 강한 규정성 제어에 따른다(Audonnet et al. WO 20152888).
바쿨로바이러스에 의해 매개되는 곤충 세포 발현 시스템에서 항원으로서 E2-CSFV의 생산은 가능한 대안을 야기한다(Van-Rjin et al. (1999). An experimental marker vaccine and accompanying serological diagnostic test both based on enveloped glycoprotein E2 of classical swine fever virus. Vaccine, 17: 433-440; Kretzdorn et al. US 20040028701). 이 시스템에서 재조합체 E2는 비글리코실화 동형에 대한 이의 면역원성을 증가시키는, 당단백질로서 생성된다. 바콜루바이러스가 추가로 불활성화되고 돼지에서 병원성 효과는 없었다. 그러나, 감염에 대한 효과적인 보호는 백신화 후 3주 후에 유도되며 자궁내 감염에 대해 완전한 보호를 나타낸다. 그러므로, CSF 보호에서 중요한 문제점은 백신화 및 감염된 동물 중에서 구별되는 진단을 허용하는 서브유닛 재조합체 백신이 없어 임신한 암퇘지로부터 그 의 새끼로 경태반 전이를 차단하는 백신화 후에 이른 보호를 생성할 수 없다는 것이다.
본 발명은 상기 언급된 문제점을 해결한다. 새로운 백신은 CSFV 감염으로부터 돼지를 보호하는 초기 면역 반응이 나타나도록 하는, 면역계-자극 분자에 결합하는 바이러스성 서브유닛을 포함하는 키메릭 항원을 포함한다. 제안된 해결책의 다른 이점은 키메릭 항원에서 바이러스성 단백질과 결합하는 자극 분자의 면역-증강 효과에 의해, 감염된 임신한 암퇘지로부터 새끼에게로의 바이러스 전이를 차단한다는 것이다.
특히, 본 발명은 CSFV 외피로부터 E2 당단백질을 주요 성분으로서 갖는 CSF에 대항하는 키메릭 항원에 관한 것이다. E2 당단백질의 외부 세그먼트를 초기 세포성 면역 반응의 자극 및 더 높은 CSFV 중화 항체 역가의 유도 둘 다를 증가시키기 위해, 면역계-자극 단백질(본 발명에서 "분자성 아쥬반트"로 명명됨)에 결합된 면역원으로서 사용된다.
본 발명의 특정 실시형태에서, 면역계-자극 단백질은 CD154 분자의 세포외 세그먼트 또는 알파 인터페론이다.
키메릭 단백질에 기초한, 본 발명의 백신 항원은 105 DL50 으로 항원투여되었을 때(CSFV 감염된 동물의 50%의 죽음을 유발하는 바이러스의 투여량), 면역화 후 첫 번째 주 이후에 백신화된 돼지에서 보호를 보증한다. 이러한 보호는 키메릭 항원에서 결합하는 요소와의 조합에 직접적으로 관련된, CSFV에 대한 강한 세포성 면역 반응에 의해 매개된다. 백신화에 이은 두 번째 주에 나타나는, 중화 항체 유도에서의 시간 감소가 또한 관찰된다. 이는 백신화된 돼지에서 CSFV에 대항하는 보호를 증가시키는데 기여한다. 면역화된 동물은 임상 질환의 증거를 나타내지 않으며 CSFV는 이러한 바이러스로 항원투여한 후 일정 날에 신체 체액으로부터 분리될 수 있다.
E2-분자성 아쥬반트 키메릭 항원은 암퇘지로부터 그의 태아로까지 CSFV 전이를 예방한다. 이러한 단백질은 임신한 암퇘지에서 CSFV의 105 DL50으로 항원투여한 후 임상 질환의 발생을 지연시키고 모체에서뿐만 아니라 태아에서도 바이러스 증식을 허용하지 않는 초기 보호를 유도한다.
바람직한 실시형태에서, 키메릭 백신 항원은 CSFV의 E2 당단백질의 세포외 세그먼트(또는 도메인)의 아미노산 서열을 필수적으로 포함하는 것을 특징으로 하고 Seq ID No. 1로서 서열목록에 나타나며; Seq ID No. 2로서 돼지로부터의 CD154 분자의 세포외 세그먼트로 나타난다. 키메릭 백신 항원은 이러한 아미노산 서열을 필수적으로 포함하나, 또한 CSFV의 모든 분리체로부터 E2의 세포외 세그먼트를 포함한다.
본 발명의 다른 양상은 키메릭 항원이 재조합체, 합성 방식에 의해 또는 화학적 접합에 의해 수득될 수 있다는 것이다. 본 발명의 특정 실시형태에서, E2his (6개 히스티딘의 꼬리에 융합된 E2의 세포외 세그먼트) 및 분자성 아쥬반트를 포함하는 키메릭 단백질에 기초한 변이체는 융합 단백질로서 생성된다. 이러한 목적으로, Gly4Ser (4G4S)의 4번 반복된 유닛 및 면역계의 자극 분자를 포함하는 스페이서 펩티드를 E2his의 C-말단의 끝에 첨가했다. 4G4S 펩티드의 삽입은 폴리펩티드 사슬로의 특정 정도의 경감을 허용한다. 이는 천연 구조와 유사한 삼차 구조와 융합된 단백질을 수득하기 위한 단백질 구조의 정확한 삼차 구조 폴딩을 보증한다. 본 발명의 목적인, 백신 항원 중 하나는 분자성 아쥬반트로서, C-말단에 융합된 돼지 CD154 분자의 세포외 도메인을 갖는다(E2his-CD154).
현재까지, 생물반응기로서 동물에서 발현 시스템에 의해 매개되는 CSFV에 대항하는 재조합 백신 후보제의 생산은 조사되지 않았다. 그럼에도 불구하고, 삼차 구조의 정확한 폴딩을 갖는 글리코실화 재조합 단백질을 발현하기 위한 유선(mammary gland)의 능력은 높은 면역원성 및 보호 능력을 갖는 E2 당단백질을 생산하기 위한 적합한 발현 시스템을 구성한다. 아데노바이이러스 벡터에 의해 매개되는, 반추동물의 유선에서의 일시적인 발현 시스템은 빠르고 간단한 방식으로 재조합 단백질의 높은 발현 수준을 얻기 위한 도구를 구성한다(Toledo et al., WO 2004/034780). 이 방법은 CSF의 소멸을 위한 백신 프로그램을 적용하기 위한 목적을 갖는 E2 재조합체의 생성에 매우 유용하다.
본 발명의 구체화에서, 본 발명의 백신 항원 목적은 유전적으로 변이된 포유동물의 유방 외피 세포에서 발현되며 젖분비 과정 동안에 젖에서 분비된다. 재조합 키메릭 분자는 트렌스제닉 포유동물의 젖에서 또는 아데노바이러스 벡터가 사용되는 비 트렌스제닉 포유동물의 유선 상피의 직접적 형질전환에 의해 생산된다. 본 발명의 다른 구체화에서, 키메릭 백신 항원은 유전적으로 변이된 효모에서 생산된다. 이러한 항원은 키메릭 유전자 및 발현을 허용하는 조절성 서열로 형질전환된 효모의 배양 배지에서 배양 배지로 재조합 단백질이 분비되어 수득된다.
천연 CSFV의 E2 단백질은 바이러스 외피 상에서 동형이량체로서 나타나며 쇄간 디설피드 가교에 의해 안정화된다. 이는 중화 및 보호 항체가 동형이량체 상에 존재하는 구조적 에피토프에 대항하여 생산됨을 결정한다. 본 발명에서 개발된 백신 항원은 이러한 재조합 단백질의 정확한 폴딩을 허용하는 발현 시스템에서 생산된다. 유전적 구조의 설계는 융합 단백질의 삼차 구조의 비-변경을 보증한다. 재조합 백신 항원은 금속 이온으로의 친화성의 단순 크로마토그래피 단계에 의해 쉽게 정제된다.
유전적 구조의 설계, 발현 시스템의 사용 및 정제 과정의 상대적 간단성은 본 발명에 기재된 CSFV에 대항하는 백신 항원이 바이러스성 E2 단백질과 유사한 항원성 및 면역원성 특성을 유지함을 보증한다. 피치아 파스토리스(Pichia pastoris) 또는 염소의 유선과 같은 발현 시스템에서 생산되는, 키메릭 분자로의 면역화는 강력한 초기 면역 반응을 이끌어낸다. E2의 세포외 도메인은 중화 및 보호 항체의 생성을 위한 구조적 에피토프를 제공하는 동형이량체를 발생시킨다. CD154로부터의 세그먼트는 백신화된 돼지의 면여계를 자극하여 백신화 이후 첫 번째 주 이후에 CSFV로부터 동물을 보호하는 세포성 면역 반응을 생성하는, 분자성 아쥬반트로서 작용한다. 스페이서 펩티드를 포함하는, 키메릭 단백질에서의 두 분자의 조합은 각 분자의 정학한 폴딩을 보증한다. 사용된 발현 시스템은 재조합 단백질이 이의 비글리코실화 동형으로 발현됨을 허용한다. 이는 또한 적절한 삼차 구조를 갖는 분자를 수득하도록 돕는다.
본 발명의 다른 양상은 E2 당단백질의 세포외 도메인 및 분자성 아주반트를 포함하는 상기 언급된 키메릭 항원을 포함함을 특징으로 하는, CSFV에 대항하는 면역 반응을 생성하는 능력을 갖는 백신 제형에 관한 것이다. 이러한 백신 제형은 CSF를 예방하고 돼지 무리에서 CSFV 감염에 의해 생성되는 물질 및 경제적 손실을 피하기 위한 목적으로 전신 또는 점막 경로를 통해 동물에게 투여될 수 있다.
도 1. 환원 조건 하에서, Ad-E2his-sec 아데노바이러스 벡터로 형질도입된 PK-15 세포에서의 E2his 발현의 SDS-PAGE에 의한 분석. (A) SDS-PAGE, 1열: 형질도입된 세포로부터의 배양 배지, 2 열: 비처리 세포로부터의 배양 배지, MWM: 분자량 마커. (B) 히스티딘 꼬리에 직접적으로 대항하는 모노클로날 항체를 사용한 웨스턴 블롯팅에 의한 E2his의 면역-확인, 1 열: 형질도입된 세포로부터의 배양 배지, 2 열: 비처리 세포로부터의 배양 배지, 3 열: 히스티딘 꼬리에 대한 양성 대조, MWM: 분자량 마커. (C) CSFV 감염된 돼지로부터의 폴리클로날 혈청을 사용한 웨스턴 블롯팅에 의한 E2his의 면역 확인, 1 열: 비처리 세포로부터의 배양 배지, 2 열: Ad-E2his로 형질도입된 세포로부터의 배양 배지, MWM: 분자량 마커.
도 2. E2his 발현 조건 및 Ad-E2his-sec 및 Ad-E2hisCD154-sec 아데노바이러스 벡터로 형질도입된 PK-15 세포에서의 E2his-CK154의 분석. 배양 배지에서의 단 백질은 비환원 조건 하에서 SDS-PAGE에 의해 분리되었다. 대상 분자의 면역-확인을 CSFV의 E2 단백질(Mab-1G6)에 대한 모노클로날 항체(Mab)를 사용한 웨스턴 블롯팅으로 실행했다. 1 열: Ad-E2his-sec 벡터로 형질도입된 세포로부터의 배양 배지, 2 열: Ad-E2hisCd154-sec 벡터로 형질도입된 세포로부터의 배양 배지, MWM: 분자량 마커.
도 3. Ad-E2his-sec 벡터로 형질도입된 염소의 젖에서 E2his의 발현의 동역학. 착유가 이루어지는 각 날에 상응하는 유청 시료로부터의 단백질을 비 환원 조건에서 SDS-PAGE로 분리했다. E2his의 면역-확인을 Mab-1G6을 사용하는 웨스턴 블롯팅으로 분석했다. PK 열: Ad-E2his-sec 벡터로 형질도입된 PK-15 세포의 배양 배지에서 발현된 E2his의 양성 대조, C- 열: 비처리 염소로부터의 유청 시료, 1-8 열: 아데노바이러스 형질전환에 이은 8일간의 착유의 각각에 상응하는, Ad-E2his-sec 벡터로 형질도입된 염소로부터의 유청 시료.
도 4. Ad-E2hisCd154-sec로 형질도입된 염소의 젖에서 E2his-CK154의 발현의 동역학. 착유의 각각의 날에 상응하는 유청 시료에 존재하는 단백질을 비 환원 조건에서 SDS-PAGE로 분리했다. E2his-CD154 분자의 면역-확인을 Mab-1G6을 사용하는 웨스턴 블롯팅으로 실시했다. 1-5 열: 아데노바이러스 형질도입에 이은 5일간의 착유 각각에 상응하는 Ad-E2hisCD154-sec 벡터로 형질도입된 염소로부터의 젖 혈청 시료, C- 열: 비처리 염소로부터의 유청 시료, PK 열: Ad-E2hisCD154-sec 벡터로 형질도입된 PK-15 세포의 배양 배지에서 발현된 E2his-CD154의 양성 대조.
도 5. 비환원 조건에서의 SDS-PAGE에서 분리된 E2his의 순도 및 확인. 단백 질이 Ad-E2his-sec 벡터로 형질도입된 염소의 젖에서 발현되며 이온 금속 친화성 크로마토그래피로 정제했다. (A) 다른 단계의 정제의 SDS-PAGE. (B) Mab 1G6을 사용한 웨스턴 블롯팅에 의한 면역-확인. 1 열: Ad-E2his-sec 벡터로 형질도입된 PK-15 세포의 배양 배지에서 발현된 E2his의 양성 대조, 2 열: 비처리 염소로부터의 유청 시료, 3 열: 크로마토그래피에서 초기 물질로서 취득된, Ad-E2his-sec 벡터로 형질도입된 염소로부터의 유청 시료, 4 열: 매트릭스에 결합하지 않은 물질, 5 열: 20 mM 이미다졸로 세척, 6 열: 50 mM 이미다졸로 세척, 7 열: 200 mM 이미다졸에서 용출.
도 6. CSFV의 유독한 균주로 감염된 돼지의 혈청에 존재하는 항체에 의한 E2his 백신의 두 동형의 항원성 인식의 비교. Ad-E2his-sec 아데노바이러스 벡터로 형질전환된 염소의 젖으로부터 정제된 E2his를 환원 조건(단량체) 및 비환원 조건(동형이량체)에서 전기영동 및 웨스턴 블롯팅 검정으로 분석했다. (A) SDS-PAGE. (B) CSF 감염된 돼지의 폴리클로날 혈청을 사용한 웨스턴 블롯팅, 1 열: 비환원 조건에서 분리된 E2his, 2 열: 환원 조건에서 분리된 E2his.
도 7. E2his 백신 항원의 단일 투여량으로 백신화된 돼지의 두 그룹에서 수득된 중화 항체의 동역학, 항체역가를 중화 퍼옥시다제-연결 검정에 의해 결정했다. 그룹 A에게 30 ㎍/동물의 투여량을 접종하고 그룹 B에게 50 ㎍/동물의 투여량을 접종했다. 두 그룹에 105DL50 의 CSF 바이러스 투여량으로 백신화된 후 3주에 항원투여했다. 결과는 상호적 역가의 기하학적 평균으로서 나타냈다.
도 8. E2-CD154 항원(그룹 D 및 E) 및 E2his(그룹 F)로 백신화한 후 5일에 돼지로부터 분리된 림프구를 사용한 림프증식 검정. 결과는 자극 인덱스(SI)로서 나타냈으며, 자극된 배양의 분 당 카운트(cpm)의 수치 및 비처리 대조 배양의 cpm의 수치 사이의 비율로서 규정된다. SI = 2를 유도하는 림프증식 반응은 양성으로서 간주된다. CSFV로 처리된 배양에서의 증식 뿐만 아니라 CSFV 및 돼지 CD4 도메인에 대항하는 Mab로 처리된 배양에서의 증식의 저해를 평가했다.
도 9. E2-CD154(그룹 D 및 E) 및 E2his(그룹 F) 항원으로 백신화된 돼지로부터의 혈청을 사용하는, PK-15 세포에서의 항바이러스 활성 검정. 결과는 역가의 기하학적 평균 역수로서 나타냈다.
도 10. 50 ㎍/동물의 투여량을 사용하는, E2-CD154(그룹 H) 및 E2his (그룹 I) 항원으로 백신화된 돼지의 두 그룹에서 수득된 중화 항체의 동역학. 항체 역가를 중화 퍼록시다제-결합 검정으로 결정했다. 결과를 상호 역가의 기하학 평균으로서 나타냈다.
실시예 1: CSFV E2 및 돼지 CD154 의 세포외 도메인을 코드하고 pMOS - E2his - CD154 플라스미드를 클로닝하는 유전자 세그먼트의 증폭.
363개 아미노산의 E2의 세포외 도메인을 코드하는 유전자 세그먼트를 네셔널 센터 포 바이오테크놀로지 인포메이션(National Center for Biotechnology Information; NCBI)의 데이타베이스에서 기탁 번호 AJ704817인, 쿠바 CSFV 분리 "마가리타(Margarita)" 균주의 바이러스성 게놈으로부터, 역전사 및 폴리머라제 사 슬 반응(reverse transcription and polymerase chain reaction; RT-PCR)으로 증폭시켰다. 3' 올리고에서 항원의 쉬운 정제를 허용하기 위해 6개 히스티딘의 꼬리에 대한 코딩 서열을 포함한다.
210개 아미노산의 돼지 CD154의 세포외 도메인에 대한 코딩 서열이 서열 패턴과 같은 돼지 수스 스크로파(Sus scrofa)(NCBI 기탁 번호 AB040443)의 CD154 유전자를 수득하는 화학 합성에 의해 얻었다. 이러한 분자에 대한 코딩 서열의 5' 말단에서 Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (4G4S)의 4회의 반복 유닛의 펩티드에 대해 코딩하는 영역을 포함한다. pMOS-BLUE 플라스미드(Amersham, USA)에서의 서브클로닝을 통해 합성 서열(4G4S-CD154)을 E2his의 코딩 서열에서 6개 히스티딘의 꼬리 바로 뒤에 삽입했다. pMOS- E2his-CD154 플라스미드를 수득했다.
실시예 2: 포유동물 세포에 대한 분비 시그널을 갖는 E2his 및 E2his - CD154 분자의 유전자 구성.
RT-PCR에 의해 수득된, E2his에 상응하는 서열을 플라스미드 pAEC-SPT의 Bgl II-EcoR V 부위에 삽입했다(Herrera et al. (2000) Biochem. Byophys Res. Commun. 279:548-551). 그러므로, 벡터 pE2his-sec를 인간 조직 플라스미노겐 활성제(htPA)의 분비 시그널에 앞서고 인간 사이토메갈로바이러스(CMVP)의 초기 직접 프로모터(early immediate promoter) 아래에 있는 E2his에 대한 코딩 서열을 포함한채로 수득됐다.
pMOS-BLUE 벡터에서 서브클로닝된, E2his-CD154에 상응하는 서열을 플라스미 드 pAEC-STP에서 엔도누클레아제 Bgl II-Sal 에 대한 제한 부위에 삽입했다. 그러므로, htPA의 분비 시그널에 앞서고 PMCV의 전사 조절 아래의 E2his-CD154에 대한 서열을 포함하는 벡터 pE2hisCD154-sec를 수득했다.
실시예 3: 포유동물 세포에 있어서 분비 시그널을 갖는 E2his 및 E2his - CD154 에 대한 코딩 서열을 포함하는 재조합 아데노바이러스 벡터의 생성.
불완전 복제를 갖는 아데노바이러스 벡터(Ad-△E1, △E3)를 AdEasy 시스템 가이드(AdEasytm-Vector system, Quantum Biotechnologies, EE.UU)에 기재된 바와 같이 생성했다. 플라스미드 pAdTrack-CMV를 전이 벡터로서 사용한다.
htPA (E2his-sec)의 시그널 분비를 갖는 E2his에 대한 코딩 서열을 Nco I 및 EcoR V 제한 엔도누클레아제로의 효소 절단에 의해 플라스미드 pEhis-sec로부터 추출하고 이를 pAdTrack 벡터의 EcoR V 제한 부위에 삽입했다. PCMV의 전사 조절 하의 E2his의 분비가능한 변이체를 갖는 재조합 pAdT-E2his-sec를 수득했다.
분비가능한 E2his-CD154에 대한 코딩 서열을 Nco I and Sal I 제한 엔도누클레아제로의 효소 절단에 의해 플라스미드 pE2hisCD154-sec 로부터 추출하고 이를 pAdTrack 벡터의 Kpn I-Xho I 제한 부위에 삽입했다. PCMV의 전사 조절 하의 E2his-CD154sec를 갖는 재조합체 pAdT-E2hisCD154-sec를 수득했다.
전이 아데노바이러스 벡터인, pAdT-E2his-sec 및 pAdT-E2hisCd154-sec를 재조합체 아데노바이러스성 게놈을 생성하기 위해 Pme I 제한 엔도누클레아제로의 효소 절단에 의해 선형화시켰다. 각 선형 벡터를 E. coli(Escherichia coli) BJ5183 균주에서 pAdEASY-1 벡터로 개별적으로 공동-전기천공했다. pAd-E2his-sec 및 pAd-E2hisCD154-sec 벡터 둘 다의 재조합 게놈을 상동성의 재조합으로 수득했다. 이들 중 하나는 E2his-sec에 대한 코딩 서열을 포함하고 다른 하나는 E2his-CD154-sec의 분자에 대한 코딩 서열을 포함한다. 둘 다의 경우에서 이들은 PCMV의 전사 조절 하에서 유지된다.
재조합체 아데노바이러스 게놈을 Pac I 엔도누클레아제로 추가로 절단하고 HEK-293A 진충세포주에서 개별적으로 전이시켜 감염성 비리온을 수득했다. 두 아데노바이러스 벡터를 생성했다: Ad-E2his-sec 및 Ad-E2hisCD154-sec. 벡터를 1x1012 콜로니 형성 유닛/mL (CFU/mL)의 역가가 수득될 때까지, HEK-293A 세포주에서 독립적으로 증폭시키고 이를 CsCl 기울기에서 이중 원심분리하여 정제했다. 벡터를 저장 완충용액(10mM Tris pH 8.0, 2 mM MgCI2, 4% sacarose)에 대항하여 추가로 투석하고 -70 ℃에서 유지시켰다. 포유동물 세포를 형질전환시키고 배양 배지로 E2his 및 E2his-CD154의 분자의 발현 및 분비를 매개하기 위한 Ad-E2his-sec 및 Ad-E2hisCD154-sec 아데노바이러스 벡터의 능력을 PK15 돼지 세포주에서 감염 검정에 의해 확인했다. 감염된 세포의 배양 배지에 존재하는 단백질 시료를 비환원 조건에서 소듐 도데실-폴리아크릴아미드 겔(SDS-PAGE)로 분리시켜 CSFV(αE2-1G6)의 E2에 대한 모노클로날 항체를 갖는 웨스턴 블롯팅으로 분석했다 (도 1 및 2).
E2his 및 E2his-CD154 glycoproteins proved 당단백질의 분자량 분석은 이들이 이량체 및 삼량체 동형에 상응함을 증명한다. 도 2의 1열에서, E2-CD154의 이량 체(180 kDa) 및 삼량체(270 kDa)에 상응하는 두 밴드가 관찰됐다.
실시예 4: 젖에서 E2his 및 E2his - CD154 의 생산을 위한 염소 유선 상피의 원위치 형질도입.
발현 카세트 E2his 및 E2his-CD154으로의 유방 상피 형질전환에서, Ad-E2his-sec 및 Ad-E2hisCD154-sec 재조합체 아데노바이러스 벡터가 사용됐다. 둘 다의 경우에서, 벡터를 유두의 채널을 통해 젖통의 직접 주입에 의해 유즙이 분비되는 염소의 유선에 접종했다. 아데노바이러스 벡터를 재조합체 단백질의 발현을 허용하는 유방 상피를 구성하는 분비 상피 세포에 감염시켰다.
1일 당 1L의 생산 평균을 갖는, 두 번째 달의 자연적 유즙 분비에 있는 염소를 사용했다. 암컷은 아데노바이러스 벡터로 형질전환하기 위해 젖통으로부터 젖이 제거될 때까지 처음으로 젖을 짰으며, 뒤이어 등삼투압 식염수 용액을 유두의 채널을 통해 직접적으로 저장기로 주입하여 유선의 총 세척을 보증하는 젖통의 소프트 메시지(soft massage)를 만들었다. 식염수 용액을 젖통의 소모적인 유즙분비에 의해 제거하고 과정을 2회 반복했다. 그 후에, 아데노바이러스 접종원을 36 mM의 EGTA를 포함하는 식염수 용액에 109 CFU/mL의 역가로 주입했다. 각 젖통에 대한 주입 부피는 변경가능하며 젖통의 수용량에 따라, 저장기를 완전히 채우도록 한다. 주입 후에 폐포의 분비제 상피 세포까지 이르는 선(gland)에서 방식으로 아데노바이러스 접종원의 상동성 분포를 촉진하기 위해 젖통 메시지에 적용했다. 아데노바이러스 접종물을 유즙분비 후 24시간에 제거했다. 저장기 상 또는 유관 내에서 잔 유물 아데노바이러스 벡터를 제거하기 위한 목적으로, 유선을 식염수 용액의 주입을 통해 흘러가게 한다.
형질전환된 동물로부터의 젖을 수집한 후 20시간째에 수동 유즙분비가 시작된다. 2일간의 유즙분비가 12시간 간격으로 실행됐다. 수집된 젖을 -70 ℃에서 보관했다. 젖에서의 E2his 및 E2his-CD154 재조합체 단백질의 발현 동역학을 각 시료에서 분석했다(도3 및 4). 이는 재조합체 단백질의 분자 크기가 이량체 및 삼량체 동형에 상응함을 증명한다. 각 동물에서 5.22 g의 평균 산출량을 갖는, 접종 후 2-8일째에 E2his의 1.03 g/L의 평균 발현이 얻어졌다. 재조합체 분자 E2his-CD154에서 동물 당 3.04 g의 평균 산출량을 갖는, 0.73 g/L의 평균 발현을 얻었다.
실시예 5: 염소젖으로부터 E2his 및 E2his - CD154 항원의 정제.
E2his 및 E2his-CD154 재조합체 백신 항원 각각을 포함하는 각 유즙분비일로부터의 시료를 혼합하여 4 ℃에서 30분간 15,000 g에서 원심분리했다. 수용성 상(유청)을 분리하고 지방 상을 폐기했다. 수집된 혈청을 1:4의 비율로 유즙 분리 완충용액(10 mM Tris-HCl, 10 mM CaCl2 , pH: 8.0)에 희석했다. 혼합물을 30분간 얼음상에서 냉각시키고 4 ℃에서 30분간 15,000 g에서 원심분리했다. 상청액 및 침전물을 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯팅 검정으로 분석했다. 이러한 재조합체 단백질의 대부분 백분율이 수용성 상에 존재하나 침전물은 카제인을 포함함을 결정했다.
대상 재조합체 항원(E2his 및 E2his-CD154)을 포함하는 혈청 분획을 0.8 μM 및 0.4 μM (Millipore)의 막에서 순차적인 여과로 정화하고 Ni-NTA-아가로스 매트 릭스(Qiagen, USA)로 충진된 XK16 정제 컬럼(Amersham, USA)에 추가로 적용시켰다. 100 mM 인산염 완충용액, 20mM 이미다졸, pH 7.2 (일차 세척) 및 100mM 인산염, 50mM 이미다졸, pH 7.2 (이차 세척)으로 2회 세척했다. 세척 후, 대상 단백질을 100mM 인산염 완충용액, 200 mM 이미다졸, pH 7.2에서 용출시켰다. 순수한 분획에 상응하는 피크를 10 mm 인산염 완충용액, pH 7.2에 대해 투석했다(도 5).
염소젖으로부터의 E2his 및 E2his-CD154의 정제 과정은 둘 다의 백신 항원에서와 같다. 두 단백질을 90% 이상의 순도 수준으로 수득했다. E2his를 70%의 회수율로 수득하였으며 E2his-CD154의 경우에서 58%의 회수율로 수득했다. 정제된 단백질을 단백질 응집 형성을 측정하기 위해 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯팅 검정으로 분석했다. 젖에서 생성된 E2his의 이량체 동형(동형이량체)가 CSFV 감염된 돼지로부터의 폴리클로날 혈청에 의해 효과적으로 인지됨을 측정할 수 있으며, 이는 이의 특정 구성이 분자 항원성을 증가시킴을 나타낸다(도 6).
실시예 6. 피치아사스토리스 메틸영양체 효모에서의 발현 벡터의 구성.
pPS10 P. 파스토리스 발현 벡터를 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae) 전환효소 수크로스(Suc2)에 대한 분비 시그널의 3' 말단에서 대상 코딩 서열을 삽입하기 위해 Nae I 제한 엔도누클레아제로 절단했다. PCR에 의해 증폭된 E2 코딩 서열을 pPS10 플라스미드의 Nae I 제한 부위 상에 삽입했다. E2his-CD154 코딩 서열을 Sma I-EcoR V 제한 엔도누클레아제로 효소 절단하여 pMOS-E2his-CD154 플라스미드로부터 제거하고 pPS10의 Nae I 제한 부위 상에 삽입했다. 이리하여, pPS-E2his 및 pPS-E2his-CD154 플라스미드를 수득했다. 두 분자 모두의 코딩 서열을 S. 세레비시애로부터의 Suc2의 분비 시그널에 결합시키고 이를 P. 파스토리스 효모 알코올 옥사다제 효소(alcohol oxidase enzyme; AOX1) 프로모터의 전사 조절 하에서 유지시켰다.
재조합체 플라스미드를 Pvu II 제한 엔도누클레아제로 선형화시키고 이들을 P. 파스토리스 MP36 균주의 일렉트로콤피던트 세포(electrocompetent cell)에서 전기천공하였다. 이리하여, 플라스미드 pPS-E2his 및 pPS-E2his-CD154로 안정하게 형질전환된 P. 파스토리스 MP36 균주의 여러 클론이 생성됐다. 이 균주는 히스티딘의 영양요구성 돌연변이이므로, 재조합체 효모는 이의 영양요구성 선별을 허용하는, His+ 표현형을 획득한다.
점 블롯팅(Dot blotting) 검정에 의해 초기에 확인된 재조합체 효모를 또한 Muts-His 표현형(메탄올의 낮은 사용율)을 나타내는, P. 파스토리스 AOX1 유전자의 치환을 통해 발생할 수 있는 삽입 패턴을 측정하기 위해 서던 블롯팅으로 분석했다. AOX1의 유전적 치환은 효모의 게놈에 존재하는 5'AOX1 프로모터 영역과 3'AOX1 영역 및 플라스미드에서 존재하는 다른 5'AOX1 프로모터 영역과 3'AOX1 영역 사이의 재조합에 의해 발생하며, 이는 AOX1 유전자 코딩 영역의 제거를 야기한다. Muts 표현형을 갖는 재조합체 효모는 AOX2 유전자 상에서 알코올 옥시다제 효모의 생성을 뒷받침하지만 메탄올에서의 이의 성장율은 낮다. 또한, 표현형 Mut+-His 삽입 패턴은 치환에 의해 수득될 수 있다.
E2his 및 E2his-CD154 변이체에 대한 코딩 서열은 메탄올에 의해 유도될 수 있는, AOX1 프로모터 조절 제어 하에 유지된다. P. 파스토리스는 낮은 수준의 단백질을 분비하며 이의 배양 배지는 보충 단백질을 필요로 하지 않으므로, 이종 단백질이 배지에서 분비된 총 단백질의 대부분을 구성함(80% 이상까지)을 예상할 수 있다. 재조합체 단백질 생산은 5L의 발효기 내에서 실시된다. 발현의 유도는 5일간 배양에 메탄올을 첨가하여 이루어지며 재조합체 단백질을 발효 배양 배지에서 수득했다. E2his가 0.143 mg/mL의 수준으로 재조합체 효모 배양 배지에 분비됐다. E2his-CD154의 경우에서, 0.122 mg/mL 발현 수준으로 얻어졌다.
실시예 7: 피치아 파스토리스 배양 배지로부터의 E2his 및 E2his - CD154 항원의 정제.
발효 산물을 액체 상으로부터 바이오매스를 분리하기 위해 4oC에서 30분 동안 10,000 g로 원심분리했다. 배양 배지를 0.8 μM 및 0.2 μM 막(Millipore) 상에서 여과하고 이를 Ni-NTA 아가로스 매트릭스(Qiagen, USA)로 충진된 XK16 정제 컬럼(Amersham, USA)에 적용시켰다. 100 mM 인산염 완충용액, 30 mM 이미다졸, pH 7.2로 세척하고 대상 단백닐을 100 mM 인산염 완충용액, 200 mM 이미다졸, pH 7.2로 용출시켰다. 순수한 분획을 인산염 완충용액 10 mM에 대해 투석했다. 유전적으로 형질변환된 P. 파스토리스 효모의 발효의 상청액으로부터 E2his 및 E2-CD154의 정제 과정은 백신 항원 둘 다에서와 동일하다. 두 단백질을 95% 보다 높은 순도 수준으로 수득했다. E2his를 83%의 회수율로 수득했으며 E2his-CD154의 경우에 78%의 회수율로 수득했다.
실시예 8: 분비가능한 E2his 변이체로 백신화된 돼지의 보호 실험.
CSFV에 대한 음성 혈청학을 갖고 비-백신화 및 CSF가 없는 무리에 속하는 약 20 kg 무게의 24마리 돼지를 이 검정에 사용했다. 돼지를 각 8마리의 그룹으로 분배하고 이들을 임의로 물 및 먹이가 있는 분리된 세 실험실(A, B and C)에서 사육했다.
그룹 A 및 그룹 B로부터의 동물들에게 E2his 항원을 포함하는 백신 제형을 동물 당 30 ㎍의 단일 투여량(그룹 A) 및 50 ㎍의 단일 투여량(그룹 B)으로 면역화시키고 그룹 C를 위약으로 면역화시켰다. 항원을 유중수적(water-in oil) 에멀젼 내로 제형화하고 목에 근육내 경로로 2 mL 주사로 접종했다. 1:1(V/V) 비율의 아쥬반트 및 인산염 식염수 용액으로 구성된된 위약을 동일한 조건으로 접종했다. 면역화 후 삼주째에 모든 동물을 상동성 CSFV "마가리타" 균주를 갖는 105DL50 을 근육내 주입하여 항원투여했다.
E2his 백신 제형으로의 접종은 일반 임상적 파라미터의 변경이 관찰되지 않았다는 점에서, 부작용을 나타내지 않는다. 1/50(현저한 보호성)보다 높은 중화 항체의 역가를 면역화의 두 번째 주 이후에 백신화된 그룹에서 얻었다. 세 번째 주 이후에 역가는 1/1600 - 1/6400까지 증가했지만(도 7) 백신화된 그룹(A 및 B) 사이에서 면역 반응에서의 차이는 관찰되지 않았다. 백신화된 돼지에서 열 또는 질환의 임상 증상이 발병하지 않았으며 항원투여 후에 림프구로부터 바이러스 분리체가 만 들어지지 않았다. 그러나, 위약 그룹에서는 열, 출혈 및 비-화농성 뇌염을 포함하는 질환의 모든 임상학적 증상을 나타냈다. 이 그룹에서 바이러스 분리가 항원투여 후 4일째로부터 사망일까지 나타났다. 여기에서, 이는 제안된 백신화 계획으로 30 ㎍의 투여량으로 투여된, E2his 제형으로 백신화된 어린 돼지는 임상학적 증상 및 CSFV 감염으로부터 보호됨이 유지됨을 증명한다.
실시예 9. 분비가능한 E2his 항원으로 백신화된 임신한 암퇘지에서의 수직 보호 실험.
CSF 질환 또는 백신화 경력(3년 전)이 없는 무리로부터 CSFV에 대해 혈청학적으로 음성인 10마리 암퇘지를 사용했다. 어릴 때 이후 발정 주기를 호르몬 치료로 유발시키고 3일 후에 모든 암퇘지를 인공수정했다. 인공수정은 면역화와 동시에 실시했다. 5마리 암퇘지의 그룹을 취하여 실시예 7에 기재된 백신 제형 2 mL(그룹 B)를 근육내 주입으로 목에 투여했다. 남은 5마리 암퇘지를 음성 대조군으로서 1:1(V/V) 비율의 2 mL 아쥬반트 및 식염수 용액으로 구성된 위약을 주입했다. 백신화된 그룹에게 21일 후에 추가항원자극을 실시했다. 임신한 암퇘지에서 임상 삼징후(온도, 심장 펄스 및 호흡률)을 측정하여 연구하고 CSFV에 대한 중화 항체의 검출 및 혈액학에 대한 매주 혈액 추출을 실시했다. 두 달 후 임신한 암퇘지에게 상동성 CSFV "마가리타" 균주의 105 DL50 을 근육내 주입으로 항원투여했다. 항원투여 후 3 및 5일째에 말초 혈액 림프구로부터의 바이러스 분리를 CSFV의 존재를 검출하기 위해 실시했다. 항원투여 후 2주째에 암퇘지를 희생시키고 태아를 형태학적 및 해부학적-병리학적 분석 및 바이러스 분리 검정을 위해 제거했다. 실험 동안에 암퇘지가 물 및 먹이에 임의로 접근하도록 했다.
백신은 임신한 모든 암퇘지에 대해서 무해하며 면역화 후 유산이나 임상적 변화가 나타나지 않았다. 백신화된 동물은 1:50 내지 1:51200 사이의 역가를 갖는 CSFV에 대한 특정 중화 항체를 나타냈다. 백신화된 그룹으로부터의 암퇘지는 항원투여 후 완전히 건강한 상태를 유지한다. 이러한 동물들은 열, 백혈구감소증, 혈소판증가증 또는 그외 CSF 임상 징후를 나타내지 않았다.
형태학적 및 병리학적 해부에 위한 분석은 백신화된 암퇘지로부터의 태아가 일반 크기이며 조직병리학적 병변을 나타내지 않았음을 측정할 수 있도록 한다. CSFV는 항원투여 후 추출된 어미의 혈액 시료 또는 희생된 태아 기관이나 혈액 모두에서 백혈구로부터 분리되지 않았다.
위약 그룹으로부터의 암퇘지는 항원투여 후에 열 및 백혈구감소증를 나타냈다. 암퇘지 중 한마리는 항원투여 후 8일째에 유산했으며 항원투여 후 9일째에 희생됐다. 적은 크기, 미이라화, 거비증, 신장 및 방광에서의 심각한 점상출혈 및 비 화농성 뇌염과 같은 병리학적 징후가 항원투여 후 2주째에 희생된 암퇘지로부터의 태아 및 유산된 태아에서 관찰되었다. CSFV는 이 그룹의 태아로부터의 혈액 및 모든 기관에서 분리됐다. E2his 백신 제형으로의 돼지 백신화는 암퇘지로부터 새끼로의 CSFV 전이를 예방한다.
실시예 10: E2his - CD154 백신 제형으로 백신화된 돼지에서 초기 보호 실험.
6 마리 돼지의 4개 그룹 각각을 취하고(실시예 8에서와 동일한 조건임) 백신 제형을 하기 양의 항원으로 적용했다: 50 ㎍의 E2his-CD154 (그룹 D), 80 ㎍의 E2his-CD154 (그룹 E), 50 ㎍의 E2his (그룹 F). 그룹 G 를 위약으로서 처리했다. 항원을 "유중수적" 에멀젼으로 제형화하고 2 mL를 IM 주입으로 접종했으며, 위약 그룹을 단백질 없는 아쥬반트로 접종했다. 백신을 단일 투여량으로 적용했다. 동물에게 면역화 후 8일째에 105DL50 CSFV "마가리타" 균주로 IM 접종을 통해 항원투여했다. 임상 징후를 실험 기간 동안에 매일 기록하고 혈액학적 분석 및 중화 항체를 위한 혈액 추출을 매주 실시했다. 또한, 백신화 후 1, 3, 5 및 7일에 혈액 시료를 수득하여 림프증식성 및 "혈청에서의 항바이러스 활성" 검정에 의한 세포성 면역학적 반응을 검정하였다.
백신화 후, 접종 부위에서 일반적인 임상학적 징후가 관찰되고 부작용은 관찰되지 않았다. 증가된 림프구 계수가 E2-CD154 항원으로 백신화된 동물(Groups D and E)로부터의 림프구 배양 및 림프구증식성 검정에서 피토헤마토글루티닌 마이토젠에서 관찰됐다. 이 반응은 면역 반응이 T 핼퍼 림프구에 의해 매개됨을 나타내는, CD4 도메인에 대한 Mab로 차단되었다. 검정 동안에 그룹 F 및 G(위약)의 동물의 림프구 시료는 마이토젠 또는 CSFV 둘 다에 반응하지 않는다(도 8).
높은 인터페론 알파 역가가 그룹 D 및 E에서 E2-CD154 항원으로의 백신화 후 3, 5 및 7일에서의 시료에서 관찰되었다. 그러나, 실험 기간 동안 E2his 항원으로 백신화한 동물 (그룹 F) 및 위약 그룹 (G)에서 인터페론은 검출되지 않았다. 전이성 위장염 바이러스에 대한 "항바이러스 활성 검정"을 PK-15 세포 상에서 실행했 다. 그룹 D 및 E에서 1:512의 항바이러스 활성 역가가 수득되었다; 그럼에도 불구하고, 항바이러스성 보호는 위약 그룹 및 E2his 면역화 돼지로부터의 시료에서 검출되지 않았다(도 9). 이러한 실험으로 CD154 분자에 결합하는 E2 항원이 CD154 면역자극 활성에 관련된 CSFV에 대한 세포성 면역 반응을 증강시킴을 측정했다.
실시예 11: E2his 및 E2his - CD154 를 포함하는 백신 제형의 단일 투여량으로 백신화된 돼지의 중화 항체 동역학의 비교.
CSFV에 대한 혈청학적으로 임성이고 및 CSF 질환 또는 백신화 경력(3년 전)이 없는 무리로부터의 대략 20 kg 무게의 6마리 돼지를 이 검정에 사용했다. 동물들에게 임의로 물 및 먹이를 제공했다.
각 동물을 그룹 H에서 50 ㎍의 E2his-CD154; 그룹 I에서 50 ㎍으로 백신화시키고 그룹 J는 위약으로 처리했다. 항원을 "유중수적" 에멀젼으로 제형화시키고 2 mL를 IM 주입으로 접종시켰으며, 위약 그룹에게 단백질 없이 아쥬반트를 접종했다. 단일 투여량을 적용시키고 중화 항체의 수준을 면역화 후 5주 동안 중화 과산화물 결합 검정(neutralization peroxide linked assay; NPLA)으로 측정했다.
중화 항체를 면역화 후 두 번째 주 이후에 E2-CD154 및 E2 his로 백신화된 그룹 (H 및 I)에서 1:50 이상의 역가(현저한 보호성)로서 측정했다. 실험 동안 위약 그룹에서 항체는 검출되지 않았다. 그룹 H(E2-CD154 항원)의 동물의 중화 항체 역가는 면역화 후 두 번째 주에 E2his 항원으로 면역화된 그룹에서보다 더 높다. 이러한 결과는 그룹 의 동물에서 체액성 반응의 더 높은 자극을 제안한다(도 10).
50 ㎍의 투여량 수준에서 E2his-CD154 백신 제형이 E2his 백신 제형에 비해 안전하고 면역원성이며 백신화된 돼지에서의 초기에 체액성 반응을 유도한다고 결론지었다.
실시예 12: E2his - CD154 백신 제형으로 백신화된 임신한 암퇘지에서 수직 보호 실험.
같은 건강 상태를 가지며 실시예 8에 사용된 암퇘지의 같은 기원을 갖는 10마리의 암퇘지를 선별했다. 어릴 때 이후로 발정 주기를 호르몬 치료로 유도하고 3일 후에 모든 암퇘지를 인공수정했다. 동시에, 5 마리 암퇘지의 그룹을 목 상에, 귀 뒤 IM 주입하여 2 mL의 E2his-CD154 백신 제형으로 면역화시켰다(80 ㎍/동물; 그룹 E에 대해 실시예 10에서 사용된 조성물). 남아있는5 마리 돼지에게 위약으로서 아쥬반트를 면역화했다. 임신한 암퇘지에서 임상 삼징후(온도, 심장 펄스 및 호흡률)을 측정하여 연구하고 CSFV에 대한 중화 항체의 검출 및 혈액학을 위해 매주 혈액 추출을 실시했다. 임신 두 달 후 동물에게 CSFV "마가리타" 균주의 105 DL50을 항원투여했다. 항원투여 후 3 및 5일째에 추출된 혈액으로부터 바이러스혈증을 실험했다. 2주 후에, 암퇘지를 희생시키고 태아를 바이러스학적, 형태학적 및 병리학적 분석을 위해 제거했다. 실험 동안에 암퇘지가 물 및 먹이에 임의로 접근하도록 했다.
면역화 후 유산 케이스 또는 그외 CSF 임상 징후가 관찰되지 않았다. 그러므로, 단일 면역화에서 E2his-CD154 백신 제형은 임신한 암퇘지에서 안전하다. 백신화된 동물은 CSFV에 대해 1:50 내지 1:16 000의 특이 중화 항체 역가를 나타낸다.
항원투여 후에, 백신화된 암퇘지에서 열, 백혈구감소증 또는 혈소판증가증이 관찰되지 않았다. 이 그룹에서 태아는 보통 크기를 나타내고 생물형태계측 및 병리학적 해부학 분석에 의해 결정된, 조직병리학적 병변이 발견되지 않았다. CSFV는 백신화된 어미로부터 항원투여후 수득된 혈액 시료로부터의 백혈구에서 발견되지 않았으며 이의 태아의 기관 또는 혈액에서도 발견되지 않았다.
위약 그룹의 암퇘지는 항원투여 후에 열, 백혈구감소증 및 식욕부진을 나타낸다. 이 그룹으로부터의 태아는 감소된 크기를 가지며 거비증, 신장 및 방광에서의 점상출혈, 소화관에서의 괴사, 내부 기관에서의 심각한 출혈 및 비 화농성 뇌염과 같은 CSF에 비교할만한 조직병리학적 병변을 보인다. CSFV는 이 그룹의 태아로부터의 모든 기관 및 혈액으로부터 분리되었다. 평가된 스케줄로 적용되는, E2his-CD154 백신 제형으로의 임신한 암퇘지 백신화는 암퇘지로부터 새끼로의 CSFV 전이를 예방한다.
SEQUENCE LISTING <110> CENTER FOR GENETIC ENGINEERING AND BIOTECHNOLOGY <120> CHIMERIC VACCINE ANTIGENS AGAINST CLASSIC SWINE FEVER VIRUS. <130> PPC-E2 <140> <141> <150> CU 2006- 0052 <151> 2006-02-28 <160> 2 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 363 <212> PRT <213> Classical Swine Fever Virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(363) <223> Polypeptide sequence of the 363 aa corresponding to the E2 CSFV extracellular segment <400> 1 Lys Val Leu Arg Gly Gln Val Val Gln Gly Val Ile Trp Leu Leu Leu 1 5 10 15 Val Thr Gly Ala Gln Gly Arg Leu Ala Cys Lys Glu Asp Phe Arg Tyr 20 25 30 Ala Ile Ser Ser Thr Asn Glu Ile Gly Leu Leu Gly Ala Glu Gly Leu 35 40 45 Thr Thr Thr Trp Lys Asp Tyr Asp His Asn Leu Gln Leu Asp Asp Gly 50 55 60 Thr Ile Lys Ala Ile Cys Thr Ala Gly Ser Phe Lys Val Ile Ala Leu 65 70 75 80 Asn Val Val Ser Arg Arg Tyr Leu Ala Ser Leu His Lys Gly Ala Leu 85 90 95 Pro Thr Ser Val Thr Phe Glu Leu Leu Phe Asp Gly Thr Ser Pro Ser 100 105 110 Ile Glu Glu Met Gly Asp Asp Phe Gly Phe Gly Leu Cys Pro Phe Asp 115 120 125 Thr Ser Pro Val Val Lys Gly Arg Tyr Asn Thr Thr Leu Leu Asn Gly 130 135 140 Ser Ala Phe Tyr Leu Val Cys Pro Ile Gly Trp Thr Gly Val Ile Glu 145 150 155 160 Cys Thr Ala Val Ser Pro Thr Thr Leu Arg Thr Glu Val Val Lys Thr 165 170 175 Phe Arg Arg Glu Lys Pro Phe Pro His Arg Lys Asp Cys Val Thr Thr 180 185 190 Thr Val Glu Asn Glu Asp Leu Phe Tyr Cys Arg Leu Gly Gly Asn Trp 195 200 205 Thr Cys Val Lys Gly Glu Pro Val Ile Tyr Thr Gly Gly Leu Val Lys 210 215 220 Gln Cys Arg Trp Cys Gly Phe Asp Phe Asn Glu Pro Asp Gly Leu Pro 225 230 235 240 His Tyr Pro Ile Gly Lys Cys Ile Leu Ala Asn Glu Thr Gly Tyr Arg 245 250 255 Ile Val Asp Ser Thr Asp Cys Asn Arg Asn Gly Val Val Ile Ser Thr 260 265 270 Glu Gly Ser His Glu Cys Leu Ile Gly Asn Thr Ser Val Lys Val His 275 280 285 Ala Leu Asp Glu Arg Leu Gly Pro Met Pro Cys Arg Pro Lys Glu Ile 290 295 300 Val Ser Ser Glu Gly Pro Val Arg Lys Thr Ser Cys Thr Phe Asn Tyr 305 310 315 320 Thr Lys Thr Leu Arg Asn Lys Tyr Tyr Glu Pro Arg Asp Ser Tyr Phe 325 330 335 Gln Gln Tyr Met Leu Lys Gly Glu Tyr Gln Tyr Trp Phe Asp Leu Asp 340 345 350 Val Thr Asp His His Ser Asp Tyr Phe Thr Glu 355 360 <210> 2 <211> 210 <212> PRT <213> Sus scrofa <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(210) <223> CD154 extracellular domain of 210 aa obtained taking as a sequence pattern the CD154 gene of pig "Sus scrofa" (AB040443). <400> 2 Lys Ile Glu Asp Glu Arg Asn Leu His Glu Asp Phe Val Phe Ile Lys 1 5 10 15 Thr Ile Gln Arg Cys Lys Gln Gly Glu Gly Ser Leu Ser Leu Leu Asn 20 25 30 Cys Glu Glu Ile Arg Ser Gln Phe Glu Asp Leu Val Lys Gly Ile Met 35 40 45 Gln Ser Lys Glu Val Lys Lys Lys Glu Lys Ser Phe Glu Met His Lys 50 55 60 Gly Asp Gln Asp Pro Gln Ile Ala Ala His Val Ile Ser Glu Ala Ser 65 70 75 80 Ser Lys Thr Ala Ser Val Leu Gln Trp Ala Pro Lys Gly Tyr Tyr Thr 85 90 95 Leu Ser Thr Asn Leu Val Thr Leu Glu Asn Gly Arg Gln Leu Ala Val 100 105 110 Lys Arg Gln Gly Ile Tyr Tyr Ile Tyr Ala Gln Val Thr Phe Cys Ser 115 120 125 Asn Arg Asp Ala Ala Gly Gln Ala Pro Phe Ile Ala Ser Leu Cys Leu 130 135 140 Arg Ser Pro Ser Gly Ser Glu Arg Ile Leu Leu Arg Ala Ala Asn Thr 145 150 155 160 His Ser Ser Ser Lys Pro Cys Gly Gln Gln Ser Ile His Leu Gly Gly 165 170 175 Val Phe Glu Leu Gln Pro Gly Ala Ser Val Phe Val Asn Val Thr Asp 180 185 190 Pro Ser Gln Val Ser His Gly Thr Gly Phe Thr Ser Phe Gly Leu Leu 195 200 205 Lys Leu 210 1

Claims (12)

  1. (a) 전형적 돼지 콜레라 바이러스(CSFV, Classical Swine Fever virus) 외피의 E2 당단백질의 세포외 세그먼트; 및
    (b) 분자성 아쥬반트로서 기능하는 면역계-자극 단백질;을 포함하고,
    상기 면역계-자극 단백질은 CD154 분자의 세포외 세그먼트이고, 상기 CD154 분자의 세포외 세그먼트는 포유동물로부터 유래된 것을 특징으로 하는 전형적 돼지 콜레라 바이러스에 대한 키메릭 백신 항원.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서,
    (Seq. ID. No. 1)로 표시되는 상기 전형적 돼지 콜레라 바이러스 외피의 E2 당단백질의 세포외 세그먼트의 아미노산 서열; 및
    (Seq. ID. No. 2)로 표시되는 CD154 분자의 세포외 세그먼트의 아미노산 서열;을 포함하는 것을 특징으로 하는 전형적 돼지 콜레라 바이러스에 대한 키메릭 백신 항원.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 키메릭 백신 항원은 재조합체, 합성 방식에 의해 또는 화학 접합을 통해 수득됨을 특징으로 하는 키메릭 백신 항원.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 키메릭 백신 항원은 비 트렌스제닉 포유동물의 유선의 직접적 형질전환에 의해서 수득되고,
    상기 유선의 직접적인 유전적 형질변환은 아데노바이러스 벡터를 사용하여 실행됨을 특징으로 하는 키메릭 백신 항원.
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 제1항에 있어서,
    상기 키메릭 백신 항원은 유전적으로 변이된 트렌스제닉 포유동물의 젖으로부터 개시되어 수득하는 것을 특징으로 하는 키메릭 백신 항원.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 키메릭 백신 항원은 유전적으로 변이된 효모로부터 개시되어 수득하는 것을 특징으로 하는 키메릭 백신 항원.
  10. 제1항, 제3항 내지 제5항 및 제8항 내지 제9항 중 어느 한 항의 키메릭 백신 항원을 포함하고, 전형적 돼지 콜레라 바이러스(CSFV)에 대항하는 보호적 면역 반응을 생성할 수 있는 백신 제형.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 백신 제형은 전신적 또는 점막 경로를 통하여 동물에게 투여하는 것을 특징으로 하는 백신 제형.
  12. 삭제
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